DszD在紅球菌IGTS8為DBT脫硫中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：DszD在紅球菌IGTS8為DBT脫硫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)礦物燃料的生物脫硫技術(shù)已經(jīng)被研究了半個(gè)多世紀(jì)。這些研究工作的目標(biāo)一直是開發(fā)以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的在燃燒之前從礦物燃料，如煤、原油、和石油級(jí)份中除硫的方法。開發(fā)脫硫方法的動(dòng)力是由于礦物燃料中硫含量越來(lái)越大，而且限制排放硫的規(guī)定也越來(lái)越嚴(yán)格。參閱Monticello等人的“Practical Consideration in Biodesulfurization ofPetroleum”(IGT’s 3d Intl.Symp.on Gas，Oil，Coal and Env.Biotech.，(Dec.3-5，1990)New Orleans，LA.)。
為了給礦物燃料脫硫，已經(jīng)研制了許多生物催化劑和方法，包括在美國(guó)專利第5,356,801，5,358,870，5,358,813，5,198,341，5,132,219，5,344,778，5,104,801，和5,002,888中介紹的那些催化劑和方法，在此通過(guò)引述將它們的內(nèi)容并入本文。經(jīng)濟(jì)分析指出，限制這些技術(shù)商品化的原因之一是需要提高反應(yīng)速度和生物催化劑的特異活性，如涉及脫硫反應(yīng)的細(xì)菌和酶的特異活性。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)告的反應(yīng)速度和特異活性(每克生物催化劑每小時(shí)除去的硫)比在最佳工業(yè)技術(shù)中需要的速度和活性要低得多。所以，需要提高生物催化劑的壽命和特異活性。
本發(fā)明概述本發(fā)明有關(guān)于最近發(fā)現(xiàn)的從紅球菌IGTS8中提純的一類蛋白質(zhì)能使與礦物燃料脫硫有關(guān)的兩種單氧合酶(DszC和DszA)活化。無(wú)論是DszC還是DszA在被提純到均質(zhì)程度時(shí)都失去了酶活性，但是，在添加了這種補(bǔ)充的蛋白質(zhì)(在此稱之為DszD)時(shí)，酶的活性得以恢復(fù)。這種蛋白質(zhì)的作用被認(rèn)為是將NADH的氧化作用與底物分子的氧合作用結(jié)合起來(lái)。搜尋序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)DszD與另一種最新識(shí)別的紅球菌屬蛋白質(zhì)，即ThcE是等價(jià)的，這種蛋白質(zhì)是在有莠去津(農(nóng)藥)、硫代氨基甲酸酯除草劑和伯醇存在時(shí)誘發(fā)的。根據(jù)序列相似性，ThcE似乎是III族醇脫氫酶的一員，即氧化還原酶，特指與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶。DszD單體的分子量近似為50,000(以SDS-PAGE測(cè)定)，但是，按高壓液相色譜的尺寸篩析色譜法(HPLCsize exclusion chromatography)其行為象多倍體蛋白質(zhì)(十倍體)。DszD對(duì)DszC和DszA的活化作用遵循飽和動(dòng)力學(xué)。
因此，本發(fā)明與由于在生物催化劑或反應(yīng)介質(zhì)中添加氧化還原酶而加快礦物燃料的微生物脫硫速度這一發(fā)現(xiàn)有關(guān)。本發(fā)明被歸結(jié)成一種提高含有機(jī)硫化物的礦物燃料脫硫速度的方法，該方法包括下述步驟(a)使礦物燃料接觸包含能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑(如DszA、DszB和/或DszC)和增速劑量的氧化還原酶的水相，借此形成礦物燃料與水相的混合物；(b)使步驟(a)形成的混合物保持在借助生物催化劑足以使有機(jī)硫分子中碳硫鍵斷裂的條件下，借此獲得有機(jī)硫含量降低的礦物燃料；(c)將降低了有機(jī)硫含量的礦物燃料從所得到的水相當(dāng)中分離出來(lái)。
本發(fā)明還涉及用增速劑量的氧化還原酶提高由DszA和/或DszC催化的反應(yīng)速度。例如，這可以借助向生物催化劑中添加氧化還原酶或借助在生物催化劑中造成氧化還原酶的表達(dá)或過(guò)度表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組微生物，該微生物包含一種或多種重組DNA分子，這些重組DNA分子將給生物催化劑和氧化還原酶編碼，其中所述生物催化劑能夠在含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫工藝中催化一個(gè)或多個(gè)步驟。
本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物包括(a)在包含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫工藝中能催化一個(gè)或多個(gè)步驟的生物催化劑，和(b)氧化還原酶。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是在離子交換色譜分級(jí)后DszC和DszA活性的圖示說(shuō)明。將DszC(15μg)添加到每個(gè)級(jí)份中，并檢驗(yàn)從DBT到DBTO和DBTO2的轉(zhuǎn)換。將DszA(5μg)添加到每個(gè)級(jí)份中，并檢驗(yàn)從DBT磺酸內(nèi)酯到BHBP的轉(zhuǎn)換。還檢驗(yàn)了內(nèi)源的DszC的活性。
圖2是在Superdex 75尺寸篩析色譜分級(jí)后DszC活性的圖示說(shuō)明。將DszC(15μg)添加到每個(gè)級(jí)份中，并檢驗(yàn)從DBT到DBTO2的轉(zhuǎn)換。在Superdex 75尺寸篩析色譜之后DszA的活性。將DszA(5μg)添加到每個(gè)級(jí)份中，并檢驗(yàn)從DBT磺酸內(nèi)酯到BHBP的轉(zhuǎn)換。
圖3是說(shuō)明DszD純化過(guò)程的SDS-PAGE(14％的丙烯酰胺)的電泳凝膠圖。帶1給出分子量標(biāo)準(zhǔn)(Biorad，200，116，97.4，66，45，31，21.5，和14.5kDa)；帶2是粗細(xì)胞溶胞物；帶3是Q-瓊脂糖處理之后；帶4是Toyopearl-DEAE處理之后；帶5是MonoQ處理之后；帶6是Superdex 75處理之后。
圖4說(shuō)明伴隨著DszD添加劑量遞增DszC活性的變化。用劑量遞增的DszD滴定劑量固定(0.33nmol)的DszC。
圖5說(shuō)明伴隨著DszD添加劑量遞增DszA活性的變化。用劑量遞增的DszD滴定劑量固定(0.16nmol)的DszA。
圖6表示ThcE(DszD)基因的DNA序列和假定的氨基酸順序。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在石油的提煉和精煉技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“有機(jī)硫”通常被理解為有一個(gè)或多個(gè)硫原子(被稱為雜原子)通過(guò)共價(jià)鍵連接在碳?xì)涔羌苌系挠袡C(jī)分子。這些硫原子可以直接連到碳?xì)涔羌苌?例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)碳-硫鍵)，也可以以取代基(例如硫酸酯基)的形式連接在分子的碳?xì)涔羌苌?。這類具有一個(gè)或多個(gè)硫雜原子的有機(jī)分子通常被統(tǒng)稱為“有機(jī)硫化物”。這些化合物的碳?xì)洳糠挚梢允侵宓?、芳族的，或者一部分是脂族的，另一部分是芳族的?br> 有一個(gè)或多個(gè)硫原子借助碳-硫原子鍵直接或間接連接到碳?xì)涔羌苤信彽奶荚由希@樣的環(huán)狀或稠合多環(huán)有機(jī)硫化物被統(tǒng)稱為“含硫雜環(huán)”。鑒于含硫雜原子的五元芳環(huán)，將存在于許多類型含硫雜環(huán)中的硫統(tǒng)稱為“噻吩硫”。噻吩是最簡(jiǎn)單的含硫雜環(huán)，它的組成是C4H4S。
已知含硫雜環(huán)對(duì)于常規(guī)脫硫處理，如加氫脫硫過(guò)程(HDS)是穩(wěn)定的。含硫雜環(huán)可以有比較簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu)，也可以有比較復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在復(fù)雜的雜環(huán)中，在多稠合芳環(huán)中，其中的一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以是雜環(huán)。隨著分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的增加，脫硫的難度也增大。這就是說(shuō)，在復(fù)雜的含硫雜環(huán)(如硫芴，DBT，C12H8S)中難處理的特性(refractory behaviors)最為明顯。
DBT是含硫雜環(huán)，它具有多重芳環(huán)的稠合結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中兩個(gè)六元芐環(huán)在一個(gè)五元噻吩環(huán)的兩側(cè)。在加氫脫硫后殘留在礦物燃料的精煉中間產(chǎn)品和可燃產(chǎn)物中的大部分有機(jī)硫是噻吩硫。這種殘留的噻吩硫作為DBT及其衍生物存在，而且有一個(gè)或多個(gè)烷基或酰基接在一側(cè)或兩側(cè)芐環(huán)的一個(gè)或多個(gè)碳原子上。在相關(guān)技術(shù)中，人們將DBT本身作為模型化合物，以說(shuō)明那類包括DBT及其衍生物的化合物在涉及噻吩硫的反應(yīng)中的行為。參閱Monticello和Finnerty的文章，AnnualReviews in Microbiology，vol.39pp371-389(1985)，位于pp372-373。DBT及其衍生物能夠解釋具體的原油、煤和瀝青中總硫含量的顯著百分比。例如，已經(jīng)有報(bào)道認(rèn)為，這些含硫雜環(huán)占據(jù)了西得克薩斯原油總硫含量中的高達(dá)70wt％，在中東原油總硫含量中占據(jù)了40wt％。因此，DBT作為模型化合物被認(rèn)為是與在礦物燃料，例如特殊地理位置的原油、煤或?yàn)r青，各種精煉的中間產(chǎn)品以及由它們制成的燃料產(chǎn)品等中發(fā)現(xiàn)的各種形式的噻吩硫非常相關(guān)的(同上)。DBT及其衍生物的另一個(gè)特征是在釋放到環(huán)境中之后將長(zhǎng)期存在，沒(méi)有顯著的生物降解。參閱Gundlach等人的文章，發(fā)表在Science，vol.221，pp122-129(1983)上。所以，從礦物燃料或其他的含有機(jī)硫化物的含碳物質(zhì)中除去這些有機(jī)硫化物是符合需要的。
適合按照本發(fā)明進(jìn)行脫硫處理的礦物燃料或含碳物質(zhì)是包含有機(jī)硫的礦物燃料或含碳物質(zhì)。這種礦物燃料被稱為“基質(zhì)礦物燃料”。包含豐富的噻吩硫的基質(zhì)礦物燃料，特別適合按照這里介紹的方法脫硫。這種基質(zhì)礦物燃料的實(shí)例包括產(chǎn)于Cerro Negro或Orinoco的重原油、產(chǎn)于Athabascan的焦油和其它類型的瀝青；石油的精煉級(jí)份，如輕循環(huán)油、自然通風(fēng)燃燒的重柴油、一號(hào)柴油；以及在原產(chǎn)地(如Pocahontas #3、Lewis-Stock、Australian Glencoe或Wyodak coal)用煤制造的液體。
生物催化脫硫(BDS)是借助生物催化劑在有機(jī)硫化物中(最好是有選擇地)造成碳-硫鍵氧化斷裂，從有機(jī)硫化物，包括難處理的有機(jī)硫化物，如含硫雜環(huán)中切除、釋放或除去硫。BDS處理從上述難處理有機(jī)硫化物中得到的是脫硫的碳?xì)涔羌芤约盁o(wú)機(jī)硫物質(zhì)，這兩部分物質(zhì)很容易借助已知技術(shù)(如分餾或水萃取)彼此分開。例如，在經(jīng)受BDS處理時(shí)DBT“轉(zhuǎn)變成”羥基聯(lián)苯。
BDS是借助生物催化劑實(shí)施的。生物催化劑包括一種或多種非人體生物(例如重組的和未重組的、存活的和非存活的微生物)，它們從功能上表達(dá)一種或多種酶，并單獨(dú)地或彼此合作控制除硫過(guò)程，借助所述化合物中的硫的氧化和(或)碳-硫鍵斷裂從有機(jī)硫化物(包括含硫雜環(huán))中除硫；從這些生物獲得的一種或多種酶；或是這些生物和酶的混合物。在礦物燃料或其它含碳物質(zhì)脫硫過(guò)程中呈現(xiàn)一種或多種需要的生物催化活性的生物在這里被稱為Dsz+。缺乏這種活性的生物在這里被稱為Dsz-?！吧锎呋瘎痹谶@里被定義為在有適當(dāng)?shù)膮f(xié)同因子和(或)協(xié)同酶存在時(shí)將擁有催化一種或多種反應(yīng)能力的生物或來(lái)源于該生物的物質(zhì)。
本發(fā)明涉及從含有機(jī)硫分子的含碳材料如礦物燃料中脫硫的改進(jìn)方法，該方法包括將增速劑量的氧化還原酶添加到能使含碳材料脫硫的生物催化劑中。
在這里使用的生物催化劑通常在技術(shù)上是已知的。幾位研究者已經(jīng)報(bào)告了天然細(xì)菌經(jīng)遺傳基因誘發(fā)變異變成能使DBT降解代謝的突變種系。參閱Kilbane，J.J.的文章，Resour.Cons.Recycl.，Vol.3，pp69-79，(1990)、授權(quán)給Isbister，J.D.和R.C.Doyle的美國(guó)專利第4,562,156號(hào)(1985)、以及Hartdegan，F(xiàn).J.等人的文章，Chem.Eng.Progress，pp 63-67(1984)。在這些突變種中許多品種在使DBT脫硫方面并無(wú)特異性。因此，借助這種微生物脫硫?qū)p失一部分燃料熱值。Isbister和Doyle報(bào)告了一種假單胞菌屬的變異種系似乎能有選擇地使DBT脫硫。
Kilbane報(bào)告了對(duì)混合細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行化學(xué)誘變，借此生產(chǎn)能有選擇地借助氧化途徑使DBT脫硫的細(xì)菌。這種培養(yǎng)物由細(xì)菌組成，這些細(xì)菌可以從天然資源中獲得，例如從污泥、煉油廠的廢水、栽培土壤、煤、焦油污染的土壤等資源中獲取，并且能在DBT連續(xù)脫硫的條件下保持在培養(yǎng)物中。然后，將這種培養(yǎng)物暴露在化學(xué)誘變劑1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍之下。借助這種突變種系培養(yǎng)物，DBT代謝的主要降解產(chǎn)物是羥基聯(lián)苯，硫作為水溶性無(wú)機(jī)硫酸鹽被釋放出來(lái)，分子中的碳?xì)洳糠只旧献鳛閱瘟u基聯(lián)苯完整地被保留下來(lái)。參閱Kilbane，J.J.的文章，Resour.Cons.Recycl.，Vol.3，pp69-79(1990)，在此通過(guò)引述將其并入本文。
Kilbane還從這種混合細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出紅球菌屬的變異種系。這個(gè)變異種系，即IGTS8或ATCC No.53968是本發(fā)明優(yōu)先選用的生物催化劑。Kilbane，J.J.在美國(guó)專利第5,104,801號(hào)中詳細(xì)地介紹了這種變異種系的分離與特征，在此通過(guò)引述將其并入本文。這種微生物已經(jīng)存放在American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Park LawnDrive，Rockville，Maryland，U.S A.20852，under the terms of the BudapestTreaty，并且指定的存放號(hào)為ATCC Deposit No.53968。一種適當(dāng)?shù)腁TCC No.53968生物催化劑制劑是按美國(guó)專利第5,104,801號(hào)介紹的方法制備的一種活微生物和這些微生物的變異種系或衍生物(例如參照美國(guó)專利第5,358,869號(hào))的培養(yǎng)物。在美國(guó)專利第5,132,219、5,344,778和5,358,870號(hào)中介紹的從ATCC No.53968獲得的不含細(xì)胞的酶制劑或其變異種系也可以被使用。這些酶制劑可以被進(jìn)一步純化并使用。
其他的以相同或相似的方式工作的微生物實(shí)例包括在Resour.Conserv.Recycl.，Vol.3，pp69-79中Kilbane介紹的微生物集團(tuán)(幾種微生物的混合物)、Kilbane在美國(guó)專利第5,002,888(1991年3月26日授權(quán))、5,104,801(1992年4月14日授權(quán))、5,344,778、5,132,219、5,198,341、5,344,778、5,356,813、5,356,801、5,358,869、5,358,870(Kilbane在題為“Biodesulfurization”的文章中也有介紹，見(jiàn)Proc.7th Ann.Int’l.Pittsburgh Caol Conf pp373-382)、以及5,198,341號(hào)(1993年3月30日授權(quán))中揭示的微生物、Omori等人在“Desulfurization of dibenzothiophene by Corynebacterium sp.strain SY1”中揭示的微生物(參閱58 Appl.Env.Microbiol.，No.3，pp911-915)、以及Izumi等人揭示的微生物(參閱Applied andEnvironmental Microbiology，vol.60，pp223-226(1994)，這些技術(shù)全部在此通過(guò)引述并入本文。
上述的每種微生物都能在本發(fā)明中起生物催化劑的作用，因?yàn)槊糠N微生物都產(chǎn)生一種或多種參與特定化學(xué)反應(yīng)的酶(蛋白質(zhì)生物催化劑)，借此從難處理的有機(jī)硫化物中將硫去除。上述美國(guó)專利列舉的任何一種微生物的突變衍生物或基因工程衍生物只要能保持適當(dāng)?shù)纳锎呋δ芤捕伎梢宰鳛樯锎呋瘎┦褂谩?br> 在現(xiàn)在介紹的脫硫方法中適合用作生物催化劑或生物催化劑來(lái)源的其它微生物可以借助已知技術(shù)從天然微生物中獲取。如上所述，這些方法包括將從天然來(lái)源，例如從包括污泥、煉油廠的廢水、栽培土壤、煤、焦油污染的土壤等天然資源中獲取的微生物制劑，在以難處理的有機(jī)硫化物如含硫雜環(huán)作為硫的唯一來(lái)源的選擇性生長(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)；將微生物制劑暴露在化學(xué)或物理誘變物；或者使用這些方法的組合。Isbister和Doyle在美國(guó)專利第4,562,156號(hào)(1985年12月31日授權(quán))中，Kilbane在Resour.Conserv.Recycl.，Vol.3，pp69-79(1990)和美國(guó)專利第5,002,888、5,104,801和5,198,341號(hào)中，以及Omori及其合作者在58 Appl.Env.Microbiol.，No.3，pp 911-915(1992)中都詳細(xì)地列舉了這些技術(shù)，在此將這些技術(shù)通過(guò)引述并入本文。
正象前面解釋的那樣，酶是能夠由活細(xì)胞制造的蛋白質(zhì)生物催化劑或酞生物催化劑。酶直接或間接地促進(jìn)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)或一系列化學(xué)反應(yīng)(稱之為路徑)，而其本身在這些反應(yīng)中不被消耗。酶可以包括一種或多種未經(jīng)修飾的、或轉(zhuǎn)譯后、或在合成后被修飾的多肽鏈、片段或部分鏈段，它們?cè)谟羞m當(dāng)?shù)妮o助的協(xié)同酶、協(xié)同因子或協(xié)同反應(yīng)物存在時(shí)都催化需要的反應(yīng)或反應(yīng)系列。與本發(fā)明實(shí)施方案有關(guān)的反應(yīng)或反應(yīng)系列以從難處理的有機(jī)硫化物(如含硫雜環(huán))的碳?xì)涔羌苌锨谐蜃鳛榉磻?yīng)終點(diǎn)。從前為難處理的有機(jī)硫化物的碳?xì)涔羌芑颈３滞暾?。在本發(fā)明中作為生物催化劑使用的微生物或酶，優(yōu)選在生長(zhǎng)時(shí)不消耗上述難處理的有機(jī)硫化物中的碳?xì)涔羌茏鳛樘嫉膩?lái)源。因此，基質(zhì)礦物燃料的燃料熱值不下降。
雖然活的微生物(如培養(yǎng)物)可以作為生物催化劑使用，但是這不是必需的。在本發(fā)明中有用的生物催化酶制劑包括借助常規(guī)方法獲得的并能實(shí)現(xiàn)生物催化功能的微生物的溶菌產(chǎn)物、提取物、級(jí)份(fraction)、子級(jí)份(subfraction)或純化產(chǎn)物。一般地說(shuō)，這些酶制劑基本上沒(méi)有完整的微生物細(xì)胞。Kilbane和Monticello在美國(guó)專利第5,132,219(1992年7月21日授權(quán))和5,358,870號(hào)(1992年7月11日提交)等美國(guó)專利中揭示了一些適合在這里使用的酶制劑。Rambosek等人在美國(guó)專利第5,356,813號(hào)中揭示了一些重組微生物和酶制劑，它們是依據(jù)紅球菌屬醑劑ATCC No.53968設(shè)計(jì)的并適合在這里使用。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物催化劑在重組的宿主細(xì)胞中被過(guò)分表達(dá)(overexpressed)，如包含一個(gè)以上基因或基因組拷貝的宿主細(xì)胞。例如，借助紅球菌IGTS8給硫芴脫硫已經(jīng)表明至少涉及三種酶(指定為DszA、DszB和DszC)，其中DszA和DszC現(xiàn)在被當(dāng)作是一氧合酶。這樣，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中生物催化劑包括一種或多種酶，DszA、DszB和/或DszC。
適合在此使用的酶生物催化劑制劑可以被或不被附著在固體載體上，如膜、濾膜、聚合物樹脂、玻璃顆?；虿Ａе?、陶瓷顆粒或陶瓷珠。使用固定的酶制劑有利于生物催化劑與反應(yīng)介質(zhì)分離，例如，有利于將經(jīng)過(guò)處理已經(jīng)除去了難處理的有機(jī)硫化物的礦物燃料分離出來(lái)。
生物催化劑的特異活性是單位質(zhì)量(生物催化劑)的生物催化活性的度量。因此，具體的生物催化劑的特異活性取決于所用的微生物或用作生物催化酶來(lái)源的微生物的性質(zhì)和種類，以及該生物催化劑制劑的制備和/或儲(chǔ)存方法。具體的生物催化劑制劑的濃度可以按具體使用環(huán)境的需要進(jìn)行調(diào)整。例如，在活微生物(如ATCC No.53968)的培養(yǎng)物被用作生物催化劑制劑的場(chǎng)合，可以將適當(dāng)?shù)娜狈Τ螂s環(huán)外的硫的來(lái)源的培養(yǎng)介質(zhì)與適當(dāng)?shù)奈⑸飻v和，然后發(fā)酵，直至達(dá)到需要的培養(yǎng)物密度為止。所得到的培養(yǎng)物可以用補(bǔ)充介質(zhì)或另一種適當(dāng)?shù)木彌_介質(zhì)稀釋，或著借助離心之類方法回收存在于培養(yǎng)物中的微生物細(xì)胞，然后以比原來(lái)培養(yǎng)物更高的濃度重新懸浮。微生物和酶生物催化劑的濃度可以作類似的調(diào)整。用這種方式，可以獲得適當(dāng)體積的具有預(yù)定的特異活性和/或濃度的生物催化劑制劑。
如上所述，已經(jīng)從紅球菌IGTS8提純出來(lái)了一種蛋白質(zhì)(定名為DszD)，它在生物脫硫路徑中使兩種單氧合酶(DszC和DszA)活化并提高它們的活性。這種蛋白質(zhì)的功能被認(rèn)為是將NADH的氧化作用與借助DszC和DszA作用的底物分子的氧合作用結(jié)合起來(lái)。搜尋序列數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)DszD與另一種最近分離出來(lái)的紅球菌屬蛋白質(zhì)即ThcE是等價(jià)的，有報(bào)告說(shuō)后者是在有莠去津(農(nóng)藥)、硫代氨基甲酸酯除草劑和伯醇存在時(shí)誘發(fā)產(chǎn)生的。ThcE是III族醇脫氫酶的一員，或氧化還原酶，特指與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶，并且Nagy等人在Arch.Microbiol.vol.163，pp 439-446(1995)中已經(jīng)做過(guò)介紹，在此通過(guò)引述將其并入本文。DszD單體分子量近似為50,000(按SDS-PAGE)，但是，在高壓液相色譜的尺寸篩析色譜(HPLC sizeexclusion chromatography)上其行為象多倍體蛋白質(zhì)(十倍體)。DszD對(duì)DszC和DszA的活化作用遵循飽和動(dòng)力學(xué)。
依據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，DBT的脫硫可以借助添加氧化還原酶得到增強(qiáng)。適當(dāng)?shù)难趸€原酶包括單氧合酶的還原酶、或醇氧化還原酶，如與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺(NDMA)有關(guān)的醇氧化還原酶(MNO)。已有報(bào)告說(shuō)，III族醇脫氫酶或氧化還原酶使伯醇氧化并使電子受體(如非生理化合物NDMA)還原。它們通常包含有牢固的但不是共價(jià)鍵連接的NAD+的分子，它在醇和電子受體(如NDMA)之間充當(dāng)電子轉(zhuǎn)移的媒體。在這里定義的術(shù)語(yǔ)“氧化還原酶”包括擁有增強(qiáng)和/或激活DszC和/或DszA活性能力的內(nèi)生酶或野生酶(endogenous orwild-type enzymes)、重組產(chǎn)生的酶、融合蛋白質(zhì)(fusion proteins)、活性片段、突變種系或它們的組合。突變種系包括等位基因變異體、氨基酸或位點(diǎn)定向(site-directed)的突變體或衍生物(例如用重組DNA技術(shù)制備的那些產(chǎn)物)。另一種制造突變種系的方法是對(duì)宿主微生物采用其它的物理或化學(xué)的誘變技術(shù)。優(yōu)選從紅球菌屬或紅球菌源，如IGTS8或紅球菌N186/21中分離酶。其它的優(yōu)選方案包括重組氧化還原酶，其中氧化還原酶的氨基酸順序相對(duì)這些酶的氨基酸順序是高度同源的(例如，至少大約90％)。另外，同源的氧化還原酶，如從Amycolatopsis methanolics和Mycobacterium gastri中分離出來(lái)的氧化還原酶就可以被使用。
如上所述，能夠在這里使用的氧化還原酶包括那些本領(lǐng)域已知的并能在自然界找到后就能直接使用的氧化還原酶(例如包含蛋白質(zhì)或酶的微生物級(jí)份)、從市場(chǎng)上獲得的或能通過(guò)重組制造的氧化還原酶。例如，DszD的DNA和氨基酸順序已經(jīng)由Nagy等人在ArchMicrobiology，vol.163，pp439-446(1995)中做過(guò)闡述(在圖6中有圖示說(shuō)明)并能夠用于改造適當(dāng)?shù)乃拗魑⑸?，例如本領(lǐng)域已知的并在美國(guó)專利第5,356,801號(hào)中討論過(guò)的那些宿主微生物。DNA序列能夠采用已知的技術(shù)如PCR從適當(dāng)?shù)募t球菌中分離出來(lái)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，氧化還原酶可以借助脫硫微生物(如IGTS8)過(guò)分表達(dá)。例如可以借助誘變實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。適當(dāng)?shù)恼T變劑包括輻射，如紫外輻射，和化學(xué)誘變，如N-甲基-N’-亞硝基胍、羥胺、乙基甲磺酸和亞硝酸。誘變以及找出具有增加了的酶活性的突變種的后續(xù)篩選可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
當(dāng)氧化還原酶是重組體時(shí)，蛋白質(zhì)能被合成并優(yōu)選就地形成過(guò)度表達(dá)(overexpress)，例如借助添加包含一份或多份給氧化還原酶編碼的DNA順序的拷貝的重組體微生物。在特別優(yōu)先的實(shí)施方案中，給氧化還原酶編碼的重組體微生物還擁有一種或多種能夠在礦物燃料的生物脫硫中催化一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)的酶，特別是DszA和/或DszC。例如在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的支配下，給氧化還原酶編碼的DNA可以被轉(zhuǎn)染到IGTS8或另一種能使礦物燃料脫硫的微生物中。在另一個(gè)實(shí)施例中，給氧化還原酶編碼的DNA可以被同時(shí)(例如存在于同一質(zhì)?；蜉d體中)或獨(dú)立地轉(zhuǎn)染到具有給脫硫生物催化劑制劑或酶編碼的DNA的共同宿主細(xì)胞中。例如，在受相同或不同的啟動(dòng)子的支配下，給氧化還原酶編碼DNA可以是給用于礦物燃料脫硫的生物催化劑編碼的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中氧化還原酶的DNA被整合或連接IGTS8的脫硫基因團(tuán)或操縱子中。
將氧化還原酶按增速劑量添加到反應(yīng)混合物當(dāng)中。在此定義的“增速劑量”是與原來(lái)獲得的速度相比能夠大幅度增加生物催化劑的反應(yīng)速度(包括使生物催化劑活化)的劑量。例如，當(dāng)生物催化劑是IGTS8、一種不含細(xì)胞的級(jí)份或其經(jīng)純化的酶制劑時(shí)，氧化還原酶的增速劑量是除了在獲得生物催化劑時(shí)在生物催化劑中固有的氧化還原酶劑量外還包括大幅度增加脫硫速度所需的氧化還原酶劑量。例如，與單獨(dú)使用生物催化劑本身相比，脫硫速度可以至少增加25％、50％或者100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧化還原酶以達(dá)到或接近飽和動(dòng)力學(xué)域值的劑量添加到反應(yīng)介質(zhì)中。
帶有給DszD編碼的DNA序列的微生物能夠在使基因表達(dá)為最大的條件下生長(zhǎng)。例如，包含該基因的紅球菌能夠在有醇(如乙醇、乙醇胺、丙三醇或丙醇)、醛(如丙醛)、硫代氨基甲酸酯(或鹽)或莠去津存在的條件下生長(zhǎng)。這些化合物可以誘導(dǎo)或增加微生物中的基因表達(dá)。
綜上所述，本發(fā)明一方面涉及包含一種或多種給能夠使含有機(jī)硫化物的礦物燃料脫硫的氧化還原酶和/或生物催化劑編碼的基因的DNA分子或其片段。這些DNA分子或其片段可以是經(jīng)過(guò)純化或分離的天然來(lái)源的DNA，也可以是(異種的或外來(lái)的)重組體DNA，例如存在于非人類的宿主生物中的DNA。DNA可以借助已知技術(shù)如PCR分離出來(lái)，以便依據(jù)圖6給出的核苷酸順序設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。
本發(fā)明的重組體DNA分子包括借助化學(xué)或生物手段將一種或多種給能夠有選擇地切斷碳-硫鍵的生物催化劑和氧化還原酶編碼的基因插入到DNA鏈中后所得到的DNA，其中所述基因不是原來(lái)就存在于那個(gè)DNA鏈中的基因。重組體DNA包括任何利用限制性核酸酶、核酸雜化、DNA無(wú)性繁殖、DNA合成等方法或借助所述方法的組合而合成的DNA。構(gòu)建方法可以在Maniatis等人的著作中以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法中找到。
構(gòu)建本發(fā)明的DNA質(zhì)粒合載體的方法包括在Maniatis等人介紹的那些方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法。術(shù)語(yǔ)“DNA質(zhì)?！焙汀拜d體”包括任何有復(fù)制能力的質(zhì)粒和載體，它們能夠具有借助化學(xué)或生物手段插入的外來(lái)的或異源的DNA，并且隨后在變成適當(dāng)?shù)姆侨祟愃拗魃飼r(shí)，能夠表達(dá)外來(lái)的或異源的DNA插入的產(chǎn)物(例如，能夠表示本發(fā)明的生物催化劑和氧化還原酶)。此外，這些質(zhì)粒和載體必須能夠接受包含本發(fā)明的基因(或基因組)的DNA分子或其片段的插入，其中所述基因(或基因組)給生物催化劑編碼。構(gòu)建DNA質(zhì)粒和載體的方法包括Maniatis等人介紹的那些方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它方法。
本發(fā)明的質(zhì)粒包括任何包含給氧化還原酶和/或生物催化劑編碼的基因(或基因組)的DNA片段。術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！卑ㄈ魏文軌蚪柚D(zhuǎn)染或結(jié)合轉(zhuǎn)移到宿主微生物上去DNA片段。構(gòu)建和提取DNA質(zhì)粒的方法包括Maniatis等人介紹的那些方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它方法。
本發(fā)明的重組非人類宿主生物可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員借助各種方法建立。例如，可以使用Maniatis等人說(shuō)明的電穿孔方法。術(shù)語(yǔ)“非人類宿主生物”包括任何能夠攝取和表達(dá)外來(lái)的DNA、異源的DNA或重組體DNA的非人類的生物體。宿主生物優(yōu)選采用細(xì)菌，更優(yōu)選選用假單胞菌(Pseudonomad)。
在生物催化脫硫階段，包含有含硫雜環(huán)的含碳物質(zhì)或礦物燃料與生物催化劑和氧化還原酶混合。生物催化劑、氧化還原酶以及含碳物質(zhì)(如礦物燃料)的相對(duì)劑量可以調(diào)整，以適應(yīng)具體的生產(chǎn)條件或滿足脫硫處理后對(duì)物質(zhì)中殘留的硫含量的具體要求。在給定數(shù)量的底物中加入的生物催化劑制劑的數(shù)量將取決于具體的生物催化劑和氧化還原酶的性質(zhì)、濃度和特異活性，以及在底物中存在的無(wú)機(jī)硫化物和有機(jī)硫化物的性質(zhì)和相對(duì)豐度和所要達(dá)到的脫硫程度。
依據(jù)本發(fā)明的礦物燃料脫硫方法涉及兩個(gè)方面。第一，宿主生物或由它獲得的生物催化制劑和氧化還原酶與待脫硫的礦物燃料接觸。這可以在具有或不具有攪拌設(shè)備或混合設(shè)備的任何適宜的容器中完成?；旌衔飶氐谆旌喜⒈Ｓ銐蜷L(zhǎng)的時(shí)間，以便允許切斷有機(jī)硫化物中大量的碳-硫鍵，借此生產(chǎn)脫硫的礦物燃料。在一個(gè)實(shí)施方案中，用含有生物或酶成分和礦物燃料的水性培養(yǎng)物生產(chǎn)一種水乳液或微滴乳液，該乳液在生物催化劑切斷碳-硫鍵時(shí)允許生物在乳液中繁殖。
溫度、混合比和脫硫速度等變量將根據(jù)所用的生物催化劑和/或氧化還原酶變化。這些參數(shù)可以通過(guò)常規(guī)的試驗(yàn)確定下來(lái)。
幾種適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)脫硫速度和脫硫程度的技術(shù)是已知的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易獲得這些技術(shù)?；€和時(shí)間歷程樣品可以從保育的混合物中制備并測(cè)定礦物燃料中殘留的有機(jī)硫。例如，可以利用X-射線熒光計(jì)(XRF)或原子發(fā)射光譜(火焰光度計(jì))監(jiān)測(cè)正在經(jīng)受生物催化處理的樣品中硫從有機(jī)硫化物(如DBT)中消失的過(guò)程。最好借助氣相色譜之類的方法首先將這些分子成分分離出來(lái)。
本發(fā)明的方法和生物催化組合物(包括重組體微生物)對(duì)早期揭示的脫硫方法作出了重大的出乎意料的改進(jìn)。已經(jīng)表明，在體外由純化的DszA和DszC蛋白質(zhì)催化的反應(yīng)由于添加氧化還原酶而被激活。依據(jù)文獻(xiàn)中最新的觀點(diǎn)這是特別出乎意料的，這些觀點(diǎn)認(rèn)為FAD直接與DszC鍵合(Denome等人，J.Bacteriol.，vol.176，pp 6707-6716，1994)并且認(rèn)為NADH是該系統(tǒng)需要的唯一的協(xié)同因子(Ohshiro等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，vol.118，pp341-344，1994)。其它人提出DszA、DszB和DszC是唯一能夠?qū)⒁l(fā)生的脫硫反應(yīng)作出響應(yīng)的酶(Piddington等人，Appl.Env.Microbiol.，vol.67，pp468-475，1995)。
在脫硫反應(yīng)不受任何機(jī)理或理論限制的情況下，據(jù)信該反應(yīng)路徑如下
其中，氧化還原酶被認(rèn)為是一個(gè)短的電子遷移鏈，它將還原當(dāng)量的電子從NADH(或其他的電子供體)提交給酶DszC和/或DszA(可能是氧化還原酶的生理電子受體)。酶DszC被認(rèn)為是負(fù)責(zé)生物催化從DBT變成DBTO2的氧化反應(yīng)。而酶DszA被認(rèn)為是負(fù)責(zé)從DBTO2變成PPS(酚基苯基亞硫酸酯)的氧合反應(yīng)。
特別優(yōu)選的是將協(xié)同因子FMN以及電子供體NADH或NADPH添加到反應(yīng)介質(zhì)中。按照已知的方法添加NADH或NADPH再生系統(tǒng)也是優(yōu)選的，該再生系統(tǒng)適合將NAD+變成NADH。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例紅球菌IGTS8的生長(zhǎng)在2000ml搖動(dòng)的燒瓶中放入500ml富養(yǎng)的介質(zhì)，讓冷凍的紅球菌IGTS8在30℃的該介質(zhì)中生長(zhǎng)48小時(shí)，其中紅球菌的品系為CPE-648并且包含Piddington等人介紹的質(zhì)粒pENOK3(參閱Appl.Environ.Microbiol.，vol.61，pp468-475，1995)，其基因型為DszA-、DszB-、和DszC+。在15升的NBS發(fā)酵桶中放入相同的介質(zhì)，用上述的培養(yǎng)物接種(接種物4％)。讓這種培養(yǎng)物在30℃生長(zhǎng)48小時(shí)，同時(shí)控制pH值(在6.8至7.3之間)、攪拌和被溶解的氧(＞50％飽和)。最后，將5％的接種物轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵桶(300升Chemap)中，桶中包含基礎(chǔ)鹽介質(zhì)(basal salts medium)、0.5g/L的Ivanhoe防沫劑、8g/L的乙醇和1.5mM的二甲基亞砜。讓該培養(yǎng)物生長(zhǎng)45小時(shí)，光密度達(dá)到11，并且在運(yùn)行的第一個(gè)24小時(shí)中的加倍時(shí)間為4.3小時(shí)。借助Westfalia離心機(jī)濃縮該細(xì)胞懸浮液，得到大約2.5公斤濕的細(xì)胞糊。純化前在-70℃下儲(chǔ)存這種細(xì)胞糊。DszD的提純將上述方法培養(yǎng)的紅球菌的濕細(xì)胞糊150g重新懸浮到25mM NaPi緩沖液A中，該緩沖液pH值為7.5，包含100mM NaCl、0.5mM DTT、1mM PMSF和DNAse。細(xì)胞懸浮液在French壓力艙(壓力20,000psi.)中通過(guò)兩次，然后以30,000×g的加速度離心45分鐘(5℃)，以除去未破細(xì)胞和細(xì)胞碎片。所有后續(xù)的色譜步驟都是在4℃利用Pharmacia FPLC系統(tǒng)完成的。將上層清液導(dǎo)入用含有100mM NaCl的緩沖液A平衡的Q-瓊脂糖柱(2.6cm×20cm)。接下來(lái)用相同的緩沖液充分淋洗該色譜柱，直至淋洗液的OD280接近零為止。以5ml/分鐘流速用線性梯度為NaCl從100mM至500mM的緩沖液A展柱180分鐘，并且每個(gè)級(jí)份收集10ml。將這些顯示DszD活性的級(jí)份匯集起來(lái)并對(duì)緩沖液A透析過(guò)夜。將透析物導(dǎo)入用緩沖液A平衡的ToyopearlDEAE-650M柱(2.6cm×10cm)。以4ml/分鐘流速用NaCl線性梯度為0至200mM的緩沖液A中展柱90分鐘，并且每個(gè)級(jí)份收集4ml。將這些包含DszD活性的級(jí)份匯集起來(lái)并對(duì)緩沖液A透析過(guò)夜。將透析物導(dǎo)入用緩沖液A平衡的Pharmacia MonoQ柱。以0.5ml/分鐘流速用線性梯度為從160mM至300mM的NaCl展柱30分鐘，每個(gè)級(jí)份收集0.5ml。將顯示了DszD活性的級(jí)份合并，并利用Amicon微型濃縮器濃縮至0.2ml(截至分子量為10kDa)。然后將濃縮后的樣品加到用含100mM NaCl的緩沖液A平衡的Pharmacia Superdex 75尺寸篩析色譜柱。用相同的緩沖液以0.2mL/分鐘流速洗脫，每個(gè)級(jí)份收集0.2ml。將包含DszD活性的級(jí)份匯集起來(lái)并利用微型濃縮器濃縮，在使用前該蛋白質(zhì)保存在冰上。對(duì)最終的制劑作SDS-PAGE分析(14％的聚丙烯酰胺)，結(jié)果呈現(xiàn)單一譜帶，單體的分子量近似為50,000Da。酶測(cè)定DszD的活性是借助監(jiān)測(cè)在受DszC和DszD聯(lián)合催化時(shí)由DBT產(chǎn)生的DBTO和DBTO2進(jìn)行測(cè)量的。DszC是從上述的E.coli表達(dá)系統(tǒng)獲得的。該測(cè)定(在25mM的NaPi中、pH值為7.5，100mM NaCl和0.5mM DTT)包含DszC(6至15μg)、3mM的NADH、10μM的FMN、100μM的DBT，和包含DszD的樣品。允許測(cè)試混合物在30℃并以300rpm的速度搖動(dòng)的條件下保育一段時(shí)間(通常是15至60分鐘)。借助添加乙腈(至50％)中止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物借助反相HPLC進(jìn)行分析。DszD對(duì)DszA的激活借助相同的方法進(jìn)行檢驗(yàn)(DszA同樣從上述的E.coli獲取)，不同的是底物換成DBT的磺內(nèi)酯，產(chǎn)物是2，2’-二羥基聯(lián)苯(BHBP)。結(jié)果DszD的純化圖1表示來(lái)自第一陰離子交換柱(Q-瓊脂糖)的各個(gè)級(jí)份的DszD活性分布。從這些數(shù)據(jù)可以看到活性在級(jí)份20附近開始，一直延續(xù)到級(jí)份60附近。在這些反應(yīng)中DszC和DszA都被激活，而且內(nèi)源的DszC的活性也出現(xiàn)在這些級(jí)份中(注意級(jí)份40至50)。級(jí)份40至60被匯集起來(lái)，進(jìn)一步在Toyopearl-DEAE上分離。與Q-瓊脂糖柱相似的活性圖可以在Toyopearl-DEAE后面的色譜圖上看到，所不同的是在較低的鹽濃度下淋洗到活性物，內(nèi)源的DszC的活性出現(xiàn)在比較靠后的級(jí)份中(在級(jí)份40中有少量的活性)。這進(jìn)一步從Western分析結(jié)果得到證實(shí)，該結(jié)果表明DszC淋洗峰值在級(jí)份45至50之間(數(shù)據(jù)未示出)。級(jí)份15至35被匯集到一起，加到MonoQ柱。來(lái)自這個(gè)柱的活性級(jí)份被匯集起來(lái)，濃縮并借助色譜法在Superdex 75 FPLC柱上進(jìn)一步分離。這個(gè)柱的活性分布示于圖2。這張圖表明在相同的級(jí)份中DszA和DszC都被蛋白質(zhì)激活。SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3)表明最終的制劑由分子量近似為50,000的單一的多肽組成。利用HewlettPackard 1050高壓液體色譜系統(tǒng)中的TosoHaas TSK3000SW尺寸篩析柱得到的分析結(jié)果表明單一的蛋白質(zhì)淋洗峰在質(zhì)量接近50,000Da處，說(shuō)明天然蛋白質(zhì)最可能是十倍體(decamer)。
DszD對(duì)DszC和DszA的激活作用圖4表明DszD對(duì)DszC的激活作用遵循飽和動(dòng)力學(xué)。當(dāng)DszD對(duì)DszC的比例增加時(shí)，可以觀察到DBTO2形成率也增加。初始的形成率隨DszDDszC變化的曲線表明達(dá)到了飽和。圖5表明DszA被同一制劑激活的結(jié)果?？梢钥吹较嗤男Ч丛谔砑痈嗟腄szD時(shí)，DszA的反應(yīng)速度增加。
DszD的氨基酸順序DszD從屬于氨基末端的順序并且獲得了下面的順序(一個(gè)字母的氨基酸縮寫)H2N-AIELNQIWDFPIKEFHPFPRALMGVGAHDIIGVEAKNGFKRTLLM-COOH(序列號(hào)3)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果是與紅球菌屬蛋白質(zhì)ThcE的順序100％地吻合(參閱Nagy等人，Arch.Microbiol.，vol.163，pp 439-446，1995)。圖6列舉了DNA順序與假想的氨基酸順序。這種蛋白質(zhì)與在其它的涉及醇的氧化和電子受體的還原有關(guān)的格蘭氏陽(yáng)性生物中找到的醇(N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺(NDMA))氧化還原酶是高度同源性的。在這種生物(體)中的生理電子受體是未知的。等同物本領(lǐng)域的技術(shù)人員人將知道或者通過(guò)不多的例行試驗(yàn)就能確定許多與本文介紹的具體實(shí)施方案等價(jià)的方案。這些方案和其他等價(jià)方案都在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提高包含有機(jī)硫化物的礦物燃料的脫硫速度的方法，該方法包括(a)使礦物燃料與水相接觸，其中水相包含能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑和增速劑量的氧化還原酶，借此形成礦物燃料與水相的混合物；(b)使步驟(a)形成的混合物保持在生物催化劑足以使有機(jī)硫分子中的碳-硫鍵斷裂的條件下，借此獲得降低有機(jī)硫含量的礦物燃料；以及(c)將有機(jī)硫含量較低的礦物燃料從得到的水相當(dāng)中分離出來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氧化還原酶是III型醇脫氫酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氧化還原酶是與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氧化還原酶來(lái)源于紅球菌屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法進(jìn)一步包括添加NADH或NADPH和核黃素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述礦物燃料是液烴。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中碳-硫鍵的斷裂是借助氧化途徑完成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中能夠使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑是微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中微生物包含一種重組DNA分子，這種分子給一種或多種能使碳-硫鍵斷裂的酶編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中重組DNA分子衍生自紅球菌ATCC53968。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑是不含細(xì)胞的部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑是紅球菌ATCC53968的不含細(xì)胞的部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中生物催化劑包括來(lái)自能使碳-硫鍵斷裂的微生物的一種或多種酶或酶的部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中微生物是紅球菌ATCC53968。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑和氧化還原酶是借助一種微生物重組生產(chǎn)的。
16.一種DNA分子，該分子包括給氧化還原酶編碼的DNA和給能使包含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫的生物催化劑編碼的DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNA分子，其中氧化還原酶是III型醇脫氫酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNA分子，其中氧化還原酶是與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNA分子，其中氧化還原酶來(lái)源于紅球菌屬。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的DNA分子，其中給生物催化劑編碼的DNA分子來(lái)源于紅球菌ATCC53968。
21.一種包含重組DNA分子的微生物，其中所述的微生物編碼a)氧化還原酶，和b)一種或多種生物脫硫酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微生物，其中氧化還原酶是III型醇脫氫酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微生物，其中氧化還原酶是與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微生物，其中給氧化還原酶編碼的DNA來(lái)源于紅球菌屬。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其中給一種或多種生物脫硫酶編碼的DNA來(lái)源于紅球菌ATCC53968。
26.一種組合物，包括(a)氧化還原酶；和(b)能使包含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫的生物催化劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中氧化還原酶是III型醇脫氫酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中氧化還原酶是與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的氧化還原酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中給氧化還原酶編碼的DNA來(lái)源于紅球菌屬。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中生物催化劑是紅球菌ATCC53968或它的酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包括核黃素和NAD或NADH。
32.一種用于增加含有機(jī)硫化物的含碳物質(zhì)的反應(yīng)速度的方法，該方法包括下述步驟(a)使礦物燃料與水相接觸，其中水相包含能使碳-硫鍵斷裂的生物催化劑和增速劑量的氧化還原酶；(b)使步驟(a)形成的混合物保持在生物催化劑足以使有機(jī)硫化物反應(yīng)的條件下。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中氧化還原酶是III型醇脫氫酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中氧化還原酶是與N，N’-二甲基-4-亞硝基苯胺有關(guān)的醇氧化還原酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中氧化還原酶來(lái)源于紅球菌屬。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中生物催化劑是單氧合酶。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中生物催化劑是DszA或DszC。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，該方法進(jìn)一步包括添加NADH或NADPH和核黃素。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中含硫化合物是取代的或未取代的硫芴。
全文摘要
本發(fā)明涉及在生物催化劑中添加氧化還原酶能增加礦物燃料脫硫反應(yīng)速度這一新發(fā)現(xiàn)。該發(fā)明可歸結(jié)為一種提高含有機(jī)硫化物的礦物燃料的脫硫速度的方法,該方法包括下述步驟:(a)使礦物燃料與水相接觸,其中水相包含能使碳－硫鍵斷裂的生物催化劑和增速劑量的氧化還原酶,借此形成礦物燃料與水相的混合物;(b)使步驟(a)形成的混合物保持在生物催化劑足以使有機(jī)硫分子中碳硫鍵斷裂的條件下,借此獲得有機(jī)硫含量較低的礦物燃料;(c)將有機(jī)硫含量較低的礦物燃料從最后的水相當(dāng)中分離出來(lái)。該發(fā)明還涉及包含一種或多種重組DNA分子的突變微生物,其中重組DNA分子將給用于包含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫的生物催化劑和氧化還原酶編碼。該發(fā)明進(jìn)一步涉及一種組合物,該組合物包括(a)能使包含有機(jī)硫分子的礦物燃料脫硫的生物催化劑和(b)氧化還原酶。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1198187SQ95197963
公開日1998年11月4日 申請(qǐng)日期1995年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月21日
發(fā)明者科文·A·格雷, 查爾斯·H·司夸爾斯, 丹尼爾·J·蒙蒂卡羅 申請(qǐng)人:能量生物系統(tǒng)公司