摩拉克氏菌的主要外膜蛋白cd的制作方法

專利名稱：摩拉克氏菌的主要外膜蛋白cd的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，特別涉及來源于摩拉克氏菌的主要外膜蛋白，其生產方法和用途。
背景技術：
中耳炎是兒童早期最常見的一種疾病，大約20％的小孩在七歲之前得過至少一次中耳炎。慢性中耳炎可導致小孩聽力，說話和認知方面的損害。它是由肺炎鏈球菌(約50％)，非定型的流感嗜血桿菌(30％)及粘膜炎摩拉克氏菌(布蘭漢氏球菌)(約20％)，感染引起的。僅在美國，治療中耳炎每年要花費10到20億美金用于抗生素和外科手術，比如扁桃體切除術、腺切除術和鼓膜切開插管。由于中耳炎發生在一生中語言技能迅速發展的階段，與學習和聽覺尤其相關的發育障礙已被證明存在于經常患中耳炎的小孩中。
粘膜炎摩拉克氏菌主要聚生于呼吸道，主要是一種粘膜細菌病原體。通過培養鼓膜穿刺術獲得的中耳流體的研究表明粘膜炎摩克拉氏菌導致了20％的中耳炎。(參考文獻1-此申請從始至終，許多圓括號中提及的參考文獻都更完全描述了本發明相關的領域的狀況。每個引用的詳細參考文獻信息可在說明書的末尾，權利要求的前面找到，這些參考文獻的內容在此引入作為本發明內容參考)。
粘膜炎摩拉克氏菌引起的中耳炎的發生正在增加。由于阻止肺炎球菌和流感嗜血桿菌引起的中耳炎的方法已得到發展，粘膜炎摩拉克氏菌作為一種中耳炎的病因的相對重要性估計將進一步增加。
粘膜炎摩拉克氏菌亦是成年人下呼吸道感染的一個重要因素，特別是慢性支氣管炎和肺氣腫(參考文獻2、3、4、5、6、7和8)。粘膜炎摩拉克氏菌亦在小孩和成年人中引起竇炎(參考文獻9、10、11、12和13)并且時常引起侵害性疾病(參考文獻14、15、16、17、18和19)。
同其他革蘭氏陰性菌一樣，粘膜炎摩拉克氏菌的外膜由磷脂，脂多糖(LPS)，和外膜蛋白(OMPS)組成。8種粘膜炎摩拉克氏菌在OMPS已被鑒定為主要成分。這些蛋白用字母A至H表示，以OMP A開始，其分子量為98kDa，到OMP H，其分子量為21kDa(參考文獻20)。
在粘膜炎摩拉克氏菌中已鑒定的主要OMPS中，一個表觀雙聯體被命名為CD，是一種熱可修飾蛋白。室溫下其分子量為55kDa而在還原條件加熱分子量為60kDa。一種用CD特異的單克隆抗體的研究證明此蛋白暴露于表面并在各種各樣的粘膜炎摩拉克氏菌中是保守的(參考文獻21)編碼CD的基因最近由Murphy等人克隆并在大腸桿菌中得到表達(參考文獻22)。粘膜炎摩拉克氏菌的30種分離株限制酶切圖譜和相應于CD基因序列的寡核苷酸探針在Southern雜交分析中顯現相同的帶型，表明CD基因的序列是保守的。
所以，粘膜炎摩拉克氏菌的熱可修飾蛋白CD是一種表面暴露、保守的蛋白，包含至少兩個存于所有研究過的粘膜炎摩拉克氏菌的表位(參考文獻21)，CD蛋白的特性表明此蛋白在診斷和疫苗接種抵抗由粘膜炎摩拉克氏菌或其他產生CD蛋白或產生一種能誘導產生特異與CD蛋白反應抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病中有用途。
提供純化的CD蛋白(和純化方法)以用作抗原，致免疫制劑如疫苗，其他抗原和免疫原載體以及生產診斷試劑都將是十分有好處的。
發明概述本發明是涉及純化的粘膜炎摩拉克氏菌的外膜蛋白CD的提供及CD蛋白的純化方法。
根據本發明的一個實施方案，提供一種可從粘膜炎摩拉克氏菌分離的分離后并純化，非變性的外膜蛋白CD。這種CD蛋白基本上處于天然構象狀態(因而基本上具有摩拉克氏菌株CD蛋白的免疫原性特征)并且可從一種粘膜炎摩拉克氏菌株分離，比如從粘膜炎摩拉克氏菌4223或RH408分離。這樣分離及純化的CD蛋白基本上不含有摩拉克氏菌的非CD外膜蛋白，磷脂和脂多糖。
本發明亦提供一種免疫原性的組合物，此組合物包含具免疫效應量的此處所提供的外膜蛋白。這種免疫原性組合物可用來制作疫苗以在體內給予宿主針對如下疾病提供保護，由可產生CD蛋白的疫原菌導致的疾病或由可產生一種能在宿主體內誘導產生特異性與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病。具體地說，細菌病原體是粘膜炎摩拉克氏菌。
本發明的免疫原性組合物可制作成一種微粒，膠囊，ISCOM或脂質體制劑。這種免疫原性組合物亦可與靶向分子組合在一起輸送到免疫系疫系統的特定細胞或粘膜表面。一些靶向分子包括B12菌株和細菌毒素的片斷，如WO 92/17167所述(Biotech Australia Pty有限公司)，和單克隆抗體，如美國專利No.5,194,254中所述(Barber等人)。本發明的免疫原性組合物(包括疫苗)可進一步包含至少一種其他的免疫原性和免疫刺激性物質，而這個免疫刺激性物質可至少為一種佐劑。
用于本發明的合適的佐劑包括(但不限于)磷酸鋁、氫氧化鋁、QS21、Quil A，衍生物和其組分，ISCOM基質、磷酸鈣、氫氧化鈣、氫氧化鋅、一種糖脂類似物，以及一種氨基酸的十八烷基酯、一種胞壁酰二肽、多聚磷腈、ISCOPRP、DC-Chol、DOBA和一種脂蛋白或其他佐劑來誘導Thl反應。聯合使用佐劑的特別好處在共同未決的美國專利申請系列和261,194號中有所描述，此申請于1994年6月16日提交，轉讓給其受讓人，其內容在此引入作為參考。
本發明更進一步的方面是提供一種在宿主中產生免疫反應方法， 即在包括給宿主施用本文提供的免疫有效量的免疫原性組合物，這種免疫反應可是體液介導或細胞介導的免疫反應。此免疫反應可為由產生CD蛋白或產生一種能在宿主體內誘導產生特異性與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌病原體所導致的疾病提供免疫保護。可被施與要保護的宿主包括包含人的靈長目動物。
本發明另一個方面是提供一種抗體，此抗體特異于CD外膜蛋白并可用此處所提供的免疫原性組合物免疫宿主誘導產生。
本發明的另一個方案是提供一種鑒定方法，可在一個樣品中測定特異于粘膜炎摩拉克氏菌外膜CD蛋白的抗體的存在。此方法包括如下步驟(a)將此處所提供的CD蛋白與樣品在一定的條件下接觸反應產生復合物，此復合物包括CD蛋白及任何上述在樣品中與其特異反應的抗體；并且(b)測定復合物產生。
本發明的另一方面，本發明還提供一種測定樣品中CD蛋白存在的方法，包括如下步驟(a)用此處提供的免疫原性組合物免疫受試驗者，產生特異于CD蛋白的抗體；
(b)將樣品與抗體接觸產生包括樣品中的CD蛋白及上述CD蛋白特異抗體的復合物；并且(c)測定復合物的產生。
此CD蛋白可以是粘膜炎摩拉克氏菌株或一種細菌的一部分，這些菌均可產生CD蛋白或產生一種能誘導宿主體內產生特異性與CD蛋白反應的抗體的蛋白。
本發明的又一個方案是提供一種診斷試劑盒測定一個特異性與CD蛋白反應的樣品中抗體的存在，包括(a)此處提供的CD蛋白；(b)使CD蛋白與樣品接觸產生包含CD蛋白及任何上述存在于樣品中的抗體的復合物的方法；以及(c)測定復合物產生的方法。
本發明亦提供檢測樣品中CD蛋白存在的診斷試劑盒，包括(a)此處提供的CD蛋白的特異性抗體；(b)使抗體與樣品接觸以產生包含CD蛋白及CD特異抗體的復合物的方法；以及(c)測定復合物產生的方法。
本發明在另一方面，亦提供一種產生疫苗的方法，此疫苗可抵抗由產生CD蛋白或產生一種可在宿主體內誘導產生與CD蛋白特異反應的抗體的蛋白的細菌病原體所引起的疾病，包括將此處提供的免疫原性組合物施給測試宿主來確定其組分的相當量，給藥頻率以賦予抵抗由產生CD蛋白及產生一種誘導宿主體內產生特異性與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病的能力。本發明提供的方法還包括將免疫原性組合物制成一種適于施給所試宿主的型式，此型式與上述確定量和施與頻率一致，所試宿主可為人。
本發明可進一步提供一種生產特異于摩拉克氏菌株外膜CD蛋白的單克隆抗體的方法，包括(a)將此處提供的免疫原性組合物施與給至少一個小鼠產生至少一個免疫小鼠；(b)從至少一種免疫小鼠取出B淋巴細胞；(c)以此小鼠取出B淋巴細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，因而產生雜交瘤；
(d)克隆產生選擇性抗CD蛋白抗體的雜交瘤；(e)培養此產生抗CD蛋白抗體的克隆；然后(f)以培養物中分離抗CD蛋白抗體。
本發明的另一個方案是提供一種以產生CD蛋白的菌株中分離和純化外膜CD蛋白的方法，包括如下步驟(a)提供大批量菌株的細胞；(b)破碎細胞獲取細胞裂解液；(c)將細胞裂解液分斷形成第一次上清和沉淀，此第一次上清包括大量可溶性細菌蛋白；(d)將上述第一次上清與上述第一次沉淀分離；(e)抽提第一次沉淀去除基本上所有可溶蛋白和除CD蛋白外的其它膜蛋白，產生次級上清和包含CD蛋白的抽提后的沉淀；(f)將上述次級上清與沉淀分開；(g)將抽提后的沉淀溶解產生溶解的抽提物；(h)分級分離溶解的抽提物產生一個包含CD蛋白的上清和可丟棄的沉淀；然后(i)把包含CD蛋白的上清與可丟棄的沉淀分開。
產生CD蛋白的細菌菌株可是一種粘膜炎摩拉克氏菌。細胞裂解液和溶解的抽提物都可用離心來分級分離。選擇性抽提初級沉淀的步驟可包含至少一種(包括多種)去污劑抽提。抽提后的沉淀可用一種包含一種去污劑和一種溶劑的緩沖液在一定溫度下，處理和溶解一定時間以產生溶解的抽提物。緩沖液pH值范圍為7-8.5，包括0.1～2％重量的去污劑，比如Triton X-100，并含有約3-gM尿素作為溶解劑，如4M。溶解可在40°-70°，10-120分鐘發生效應。
包含CD的上清通常接著通過透析去除去污劑和溶劑，以提供非變性狀態CD蛋白的更進一步純化液。
本發明的進一步的一個方面是提供一種非凝集的粘膜炎摩拉克氏菌株，其具有粘膜炎摩拉克氏菌RH 408(ATCC標示號第55,637號)的鑒別特征。此種非凝集菌株對于在大規模發酵罐中生長可能存在的成塊問題具有特別的優越性。此非凝集菌株可用于測定一種抗血清的抗摩拉克氏菌的抗菌劑活性方法，作為本發明又一方面，它包括由抗血清行使的補體介導的對于預選定的非凝集菌株細胞的殺傷；和測定由上述抗血清殺傷的預選細胞數的比例，作為上述抗摩拉克氏菌的抗菌劑活性的量度。
本發明的優點包括一一種用于分離、純化產生CD蛋白菌株，包括粘膜炎摩拉克氏菌的外膜CD蛋白的簡單的方法，一一種分離并純化以一種摩拉克氏菌株分離的非變性的外膜CD蛋白；以及一用于特異鑒別摩拉克氏菌及進而受感染的宿主的診斷試劑盒和免疫試劑。
附圖簡述本發明可參照附圖，從下面的描述中得到進一步理解，其中

圖1是根據本發明的一個實施方案，從粘膜炎摩拉克氏菌中純化CD蛋白方法的流程圖；圖2表示用SDS-PAGE對分離和純化的CD蛋白的分析；圖3表示用完整的粘膜炎摩拉克氏菌免疫后小鼠體內CD蛋白特異抗體的產生；圖4表示用分離純化后的CD蛋白免疫后小鼠體內CD蛋白特異抗體的產生；圖5為一個免疫印跡，表明在許多種粘膜炎摩拉克氏菌中CD蛋白的抗原保守性；圖6表示用整個粘膜炎摩拉克氏菌或分離純化的CD蛋白免疫后小鼠體內產生的IgG抗體各亞型情況的比較；圖7表示用流式細胞術測定的通過用完整的粘膜炎摩拉克氏菌或分離純化的CD蛋白免疫后產生的小鼠抗血清與粘膜炎摩拉克氏菌表面的CD蛋白的結合力；圖8用免疫印跡來證明通過用純化分離的CD蛋白免疫產生的小鼠抗CD抗血清特異性區分粘膜炎摩拉克氏菌與其他引起中耳炎細菌病原體的能力。
發明詳述在本申請中，術語“一種摩拉克氏菌株的一種外膜蛋白”用于定義粘膜炎摩拉克氏菌外膜蛋白CD的一個家族，它們具有并包括在氨基酸序列上有變異的蛋白質，包括在不同摩拉克氏菌株中天然存在的變異。在本申請中，如果第一種蛋白質與第二種蛋白質有免疫相關性和/或有相同功能，第一種蛋白即是第二種蛋白的“功能類似物”。功能類似物可以是，例如此蛋白一個片段或取代、添加或其缺失突變體。
本發明提供一種新技術，可用來制備基本上純化的CD外膜蛋白。任何產生CD蛋白或產生一種能誘導產生特異識別CD蛋白抗體一個片段或其類似物的蛋白的抗血清，均可方便地用來制備分離和純化的外膜蛋白CD。本發明包括重組方法產生的CD蛋白和其保留有CD蛋白致免疫特性的類似物。細菌通常是一種細菌病原體，特別是一種摩拉克氏菌株，比如粘膜炎摩拉克氏菌。此菌株通常與以臨床來源或從細菌保藏中心得到，合適的粘膜炎摩拉克氏菌株可包括粘膜炎摩拉克氏菌4223和RH 408。
參照圖1，根據本發明一個實施方案繪制的一個以粘膜炎摩拉克氏菌中純化CD蛋白的方法的流程圖，完整細胞在傳統的緩沖條件下裂解產生細胞裂解液。離心裂解液產生一個應棄去的上清，里面含有約95％的可溶蛋白，和一個沉淀(PPT1)，此沉淀被選擇性地去污劑抽提，去掉殘余的可溶蛋白和除CD蛋白外的外膜蛋白，同時去掉其他雜質， 包括磷脂和脂多糖。這種選擇性抽提可在任何常規方式下實行。其中一個此類方法可包括多種去污劑對沉淀的抽提。更詳細些來說，初級去污劑抽提可采用Triton X-100，基本上去掉殘余的可溶蛋白，然后離心形成進一步沉淀(PPT2)，上清同樣棄之。此Triton X-100的抽提可用濃度為約0.2-1％的Triton X-100進行，緩沖系統pH在7-8.5之間，通常用pH 8.0的Tris。
對于PPT2進一步的去污劑抽提可使用十二烷基磺酸鈉(SDS)或其他方便的去污劑，比如脫氧膽酸鈉，通過一步或多步來去除基本上除CD蛋白以外的所有外膜蛋白以及其他雜質，然后離心形成沉淀(PPT3)，再次棄掉上清。此步抽提可使用去污劑濃度約為0.1-1％重量比的溶液，更高濃度可能使得CD蛋白部分溶解，造成產物丟失，因而避免使用。去污劑溶液通常在緩沖條件下使用，如使用pH7-8.5的緩沖液，通常用pH8.0的Tris。
施用于PPT1至形成產物PPT3的去污劑抽提可在一個合適的溫度范圍內進行，如4℃-30℃左右。雖然上述選擇性抽提步驟包括不同的去污劑抽提，此選擇性抽提過程亦可只使用一種具合適的選擇抽提能力的去污劑。
選擇性抽提細胞裂解產物后獲得固體沉淀PPT3包含CD蛋白和剩余細胞殘渣，但基本上不含其他細菌蛋白和雜質。然后CD蛋白從固體沉淀中溶解并與細胞殘渣分開，比如離心如此得來的溶液。此溶解步驟可先使用去污劑溶液分散固體沉淀，然后用一種蛋白溶解試劑，如尿素來溶解懸浮的CD蛋白，通過離心去掉細胞殘渣。
用于分散沉淀PPT3的去污劑溶液可以是任何方便的去污劑，如Triton X-100，濃度0.1-2％重量比，在pH7-8.5的緩沖系中。使用的溶解試劑的量應該至少足以溶解基本上所有懸浮的CD蛋白。例如，當使用尿素時，可使用濃度為3-8M。溶解步驟可用升溫來加速進行，比如40℃至70℃左右，并且維持時間至少足以基本上完全溶解CD蛋白，如10-120分鐘。
把CD蛋白溶液與細胞殘渣沉淀分開以后，溶解試劑可用任何合適的步驟去除，比如合適條件下透析，以獲取一個CD蛋白溶液。通過此步驟，分離純化的非變性的外膜蛋白存在于水相中。CD蛋白的水溶液可根據目的用途使用合適的濃度，通常約100-200μg/ml。進一步的溶液濃度可用任何方便的步驟得到。
參照圖2，表示用如圖1圖解表示的方法純化的CD蛋白，用SDS-PAGE電泳分析來分析CD蛋白的純度。在圖2中，第2道表示粘膜炎摩拉克氏菌的細胞裂解液；第3道表示用50mM Tris，pH8.0處理細胞裂解液并離心后包含95％可溶蛋白的上清；第4和第5道分別表示通過在50mM Tris pH8.0緩沖系中用一個和二個去污劑抽提處理并離心得到的上清。第6道表示純化的CD蛋白，其具有該蛋白已知的分子量(為55660kDa)。此處提供的純化外膜CD蛋白的方法產生至少70％純的CD蛋白制劑。圖2中第6道的制劑根據密度掃描至少為95％純。
根據圖3和4，表示本發明中分離純化的外膜蛋白在小鼠中的免疫原性。圖3表示用整個粘膜炎摩拉克氏菌免疫后小鼠體內CD特異抗體的產生。圖4表示用本發明中的純的CD蛋白免疫后特異抗體的產生。從這些數據中可看出，純化的CD蛋白具有高的免疫原性能力。并且具有與當CD蛋白作為細菌的一部分呈遞給免疫系統時相仿的免疫原性。
當用作免疫原性組合物(包括疫苗)的一個成分和診斷方案中的抗原時，此處描述的純化的CD蛋白應該有利于產生識別或中和大多數粘膜炎摩拉克氏菌的抗體。參照圖5(A部)，圖示為一個免疫印跡，表示用此處提供的純化的CD蛋白免疫后產生的抗CD的抗血清識別從各種來源分離的粘膜炎摩拉克氏菌外膜蛋白CD的能力。測試的粘膜炎摩拉克氏菌株如下道粘膜炎摩拉克氏菌 來源2 純化的CD 本發明3 4223 中耳流質4 5191 中耳流質5 59痰6 25240 ATCC 252407 135 中耳流質8 585 血液9 3 痰10 8185 鼻咽圖5(B部)亦表明通過用完整的滅活的粘膜炎摩拉克氏菌免疫后得到的免疫血清顯示出與純化的CD蛋白(2道)粘膜炎摩拉克氏菌(第3-10道)高的反應活性。這表明CD蛋白是粘膜炎摩拉克氏菌中一個高效的致免疫蛋白。
參照圖6，顯示通過完整的滅活的粘膜炎摩拉克氏菌或分離純化的CD蛋白免疫后，鼠體內產生的抗CD的IgG亞類的比較。最明顯的反應是IgG1和IgG2同種型。進一步可看出，通過完整的滅活的粘膜炎摩拉克氏菌或純化的CD蛋白來免疫獲得的IgG亞類情況非常相似，表明此處描述的分離純化的CD蛋白基本上處于其天然構象狀態。
參照圖7，顯示流式細胞儀對抗CD的抗血清與粘膜炎摩拉克氏菌的結合的分析。用分離純化的CD蛋白免疫后產生的收集的鼠與抗CD的抗血清與天然粘膜炎摩拉克氏菌的結合力(A部分)幾乎等同于用完整的粘膜炎摩拉克氏菌免疫產生的抗粘膜炎摩拉克氏菌抗血清(B部分)。結合是粘膜炎摩拉克氏菌特異的，因為同樣的抗血清并不顯示對不產生CD蛋白的流感嗜血桿菌的明顯結合(D部分)。比較來看，收集的鼠抗流感嗜血桿菌抗血清則與流感嗜血桿菌強烈結合(E部分)。
C部分與F部分分別表示未免疫血清與粘膜炎摩拉克氏菌和流感嗜血桿菌的結合基本上沒有。這一流式細胞儀分析表明用分離純化的CD蛋白免疫得到的抗CD抗體識別天然粘膜炎摩拉克氏菌的表面的CD蛋白，并進一步證明此處提供的CD蛋白基本上處于其天然構象狀態。
在本發明的一個實施方案中，此處提供的分離純化的CD蛋白可用于產生特異區別粘膜炎摩拉克氏菌和其他引起中耳炎的細菌病原體的抗體。因而參照圖8，圖示的免疫印跡表明用此處提供的CD蛋白免疫產生的抗CD抗血清的特異反應活性。分析的細菌如下道細菌 來源1粘膜炎摩拉克氏菌 135 中耳流質2粘膜炎摩拉克氏菌 5195 中耳流質3粘膜炎摩拉克氏菌 4223 中耳流質4非定型流感嗜血桿菌中耳炎分離物5非定型流感嗜血桿菌中耳炎分離物6非定型流感嗜血桿菌中耳炎分離物7肺炎鏈球菌ATCC 63048肺炎鏈球菌ATCC 63069肺炎鏈球菌ATCC 6314圖8顯示的結果清楚表明了此處提供的CD特異的抗血清區分和鑒定引起同樣臨床病癥疾病的病原體的用途。
下面表1顯示的結果表明用此處提供的CD蛋白免疫后產生的小鼠或豚鼠抗CD抗血清溶解兩種不同粘膜炎摩拉克氏菌的能力。結果顯示用菌株4223分離的CD蛋白免疫獲得的兩種血清針對來源于粘膜炎摩拉克氏菌4223的同源非凝集粘膜炎摩拉克氏菌，以及異源的非凝集菌株Q8(Dr，M.G.Bergeron贈送，Laval大學中心醫院，Foy街，魁北克)具有殺菌效應。豚鼠免疫血清中的殺菌劑效價是很高的(1∶1，024)。鼠抗CD抗血清的殺菌活力針對兩種菌株約為1∶128。這與用完整的滅活粘膜炎摩拉克氏菌免疫獲得的抗血清的效價相仿。此處提供的分離純化的CD蛋白產生殺菌抗體的能力是體內利用CD蛋白作為疫苗的證據，證明其可用作疫苗抵抗由粘膜炎摩拉克氏菌或其他產生CD蛋白或產生誘導產生特異識別CD蛋白抗體的蛋白的細菌病原體所導致的疾病。
因而，依據本發明的另一個方面，將提供一種疫苗抵抗摩拉克氏菌或其他產生CD蛋白或產生一種能誘導產生特異識別CD蛋白的抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病。此CD蛋白包括一定具免疫效應量的此處所提供的CD蛋白及一個生理上可接受的載體。此處提供的CD蛋白亦可用作半抗原。脂多糖的載體蛋白，或用來制造針對與CD蛋白無關的抗原決定簇的疫苗的多肽的載體蛋白。
此處提供的CD蛋白可用作一種診斷試劑，一種抗原或用來產生抗CD的抗體。制作疫苗的抗原。這些疫苗可抵抗各種摩拉克氏菌和其他產生一種能誘導特異識別CD抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病；CD蛋白還可用來檢測由摩拉克氏菌和其他此類菌引起的感染。
在本發明另外的實施方案中，此處提供的CD蛋白可用作一種載體分子來制備嵌合體分子和偶聯疫苗(包括糖聯合體)以抵抗細菌病原體。包括有莢膜細菌。因而糖聯合體如本發明中的可用來抵抗由任何帶有多糖抗原包括脂寡聚糖(LOS)和PRP的細菌引起的疾病和感染。此類細菌病原體包括諸如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、傷寒沙門氏菌、變異鏈球菌、新型隱球酵母、克雷白氏桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌。特殊的可與CD蛋白偶聯的抗原和獲得此類偶聯物的方法在已公開的PCT申請wO 94/12641中有描述。此專利已轉讓給其受讓人其內容在此引入以為參考。
在另一個實施方案中，CD蛋白的載體功能可用來，比如誘導針對腫瘤細胞的異常多糖，或產生抗腫瘤的抗體，此抗體可與化療或生物活性試劑上偶聯。
本發明擴展至把從一種摩拉克氏菌株可分離部分的分離純化的非變性外膜CD蛋白用作一種活性的藥物。特別是作為一種抵抗摩拄克氏菌感染的疾病的疫苗的活性成分。
對本領域的技術人員顯而易見的，本發明的各種實施方案可運用于疫苗、診斷、治療比如摩拉克氏菌和其他能誘導產生特異識別CD抗體的細菌病原體感染和產生免疫球蛋白試劑等領域中。此類用途的進一步非限制性討論在下面進一步提出。
1.疫苗制劑及用途適于用作疫苗的免疫原性組合物可從此處公開的CD蛋白制備。優選地，抗原物質被廣泛地透析去掉不需要的小分子量分子并且/或者凍干燥以便更易制成需要的載體。此免疫原性組合物在一個受試者內誘導免疫反應，產生抗體，包括抗CD抗體和具調理作用或殺菌作用的抗體。如果免疫受試者受到摩拉克氏菌或其他類產生的蛋白能誘導特異識別CD蛋白的抗體的細菌的攻擊，此抗體便結合并滅活細菌。進一步來說，調理素作用或殺菌的抗CD抗體可通過兩種可選擇機制來提供保護。
免疫原性組合物包括疫苗可制作注射劑、液體溶液或乳劑。CD蛋白可與之可配伍的藥學上可接受的賦形劑相混合，此類賦形劑包括水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇及他們的組合使用。免疫原性組合物和疫苗可進一步包含附加物質，如濕潤或乳化劑、pH緩沖劑、或佐劑來增強其效應。免疫原性組合物和疫苗可非胃腸道給藥，如皮下或肌內注射。可替代地，根據本發明制成的免疫原性組合物可制成并以一種引起粘膜表面免疫反應的方式運送。這樣以來，免疫原性組合物可通過鼻或口腔通道(胃內)施給粘膜表面。可替代地，其它給藥方式包括栓劑和口服制劑都是可行的。對于栓劑來說，粘合劑和載體可包括諸如聚亞烷基二醇或甘油三酯。此類栓劑可從包含約0.5-10％優選為1-2％的活性成分的混合。口服制劑可包括通常使用的初始劑如藥物級糖、纖維素和碳酸鎂。這些組合物可采取以下形式溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉劑，其中包括約1-95％的CD蛋白，優選約20-75％。
此致免疫制劑和疫苗采用適合于制劑劑量的方式給藥，并采用具治療、保護和免疫原性的量。給藥的量決定于受治療的個體，包括，比如個體免疫系統合成抗體的能力，以及在需要時，產生細胞介導的免疫的能力。需要給藥的活性成分的精確量依賴于醫師的判斷。然而，合適的劑量范圍可輕易地為本領域技術人員所確定，而且可能在每次免疫時為微克級CD蛋白。起始給藥劑量與促進劑量的用藥方式亦是不同的，但可包括一次起始給藥和隨后的給藥。劑量亦決定于給藥的途徑而且將隨宿主的大小而變化。
根據本發明的一種免疫原性組合物的CD蛋白的濃度通常大約為1-95％，包含僅一種病原體的抗原物質的疫苗是一種單價疫苗。包含幾種病原體抗原物質的疫苗為組合疫苗，亦屬于本發明。此類聯合疫苗包括，比如，來自不同病原體或同一病原體不同菌株，或來自不同病原體的組合。
如果抗原與佐劑一同給藥則免疫原性可大大增加，通常使用一種0.05-0.1％的磷酸鹽緩沖鹽溶液。佐劑能增強抗原的致免疫力但其自身不一定具免疫原性。佐劑發揮功能可通過將抗原滯留在給藥的局部位點，以產生一個庫(depot)效應來促進抗原緩慢、持續的釋放到免疫系統的細胞中。佐劑亦可吸引免疫系統的細胞到抗原庫并刺激此類細胞產生免疫反應。
免疫刺激劑或佐劑已使用多年來提高宿主對諸如疫苗的免疫反應。內源性佐劑，如脂多糖，通常是已殺死或毒性減弱的細菌的成分被用作疫苗。外源疫苗是免疫調節劑，通常非共價地結合到抗原上并配制來提高宿主免疫反應。這樣，增強對于非腸道運送的抗原的免疫反應的佐劑被鑒別出來。然而一些這樣的佐劑有毒性并能導致不必要的副作用，使得他們不適用于人和許多動物。事實上，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(通常指明礬)被常規用作人和獸類疫苗的佐劑。明礬增加對于白喉和破傷風類毒素化合物的抗體反應的效能已完善地建立而且一種乙肝表面抗原疫苗已用明礬作佐劑。雖然明礬對于一些應用的用法已完善地建立，它仍有缺陷。比如，明礬對于流感疫苗無效而且不能持續誘發細胞介導免疫。在小鼠中，明礬佐劑的抗原誘導的抗體主要是IgG1同種體，它對于某些疫苗試劑提供的保護并不為最佳。
廣譜的外源佐劑可引起對抗原很強的免疫反應。這些包括皂素與膜蛋白抗原的復合物(免疫刺激復合物)，帶礦物油的普朗尼克聚合物，礦物油中的殺死的分枝桿菌，弗氏完全佐劑，細菌產物如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂質A和脂質體類化合物。
為了有效地誘導體液免疫反應(HIR)和細胞介導免疫(CMI)，免疫原應在佐劑中乳化。許多佐劑有毒，誘導肉芽瘤，急性及慢性炎癥(弗氏完全佐劑，FCA)，細胞裂解(皂素和普朗尼克聚合物)，致熱原性，關節炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)，雖然FCA是一種非常好的佐劑并在科研中廣泛應用，由于其毒性而沒有被批準在人類和獸類疫苗中使用。
理想的佐劑合乎需要的特征包括(1)無毒性；(2)刺激長期免疫反應的能力；(3)操作的簡單性和長期貯存的穩定性；(4)如果需要的話，能引起對于不同途徑施予的抗原的細胞介導的免疫和體液免疫反應；(5)與其他佐劑的協同作用；
(6)選擇性與抗原呈遞細胞作用的能力；(7)特異性誘導適當的TH1和TH2的細胞特異的免疫反應的能力；以及(8)選擇性增加抵抗抗原的適宜的抗體同種型水平(如IgA)的能力。
1989年8月8日授與Lockoff等人的美國專利4,855,283中講述了作為免疫調節劑或佐劑的糖脂類似物，包括N-糖酰胺類、N-糖基脲類和N-糖基氨基甲酸酯類，他們均在糖殘基上有一個氨基酸替換。因而，Lockhoff等人(美國專利4,855,283和參考文獻27)報道與天然存在的糖脂結構類似的N-糖脂類似物，比如鞘糖脂和糖基甘油三脂，能以單純性皰疹病毒疫苗和假性狂犬病毒疫苗的方式誘導強烈免疫反應。一些糖脂已從長鏈烷基胺和脂肪酸合成，它們都通過異頭碳原子直接與糖相連，以模仿天然存在的脂殘基的功能。
授予Moloney的美國專利已轉讓給受讓人，在此引入作為參考。此專利中講述到，當與破傷風類毒素和甲醛水溶液滅活的I、II、III型炎髓灰質炎病毒疫苗混合時，鹽酸十八烷基酪氨酸(OTH)具有佐劑的功效。同樣，Nixon-George等(參考文獻24)報道芳香族氨基酸的十八烷基酯與重組乙型肝炎表面抗原混合，增強了宿主對于乙型肝炎病毒的免疫反應。
合成肽的脂化亦被用來增加其免疫原性。因而，Wiesmuller(參考文獻25)描述了一種其序列與口蹄疫病毒蛋白類似的肽，此肽與一種佐劑三棕櫚酰-δ-甘油酰-半胱氨酰絲氨酰絲氨酸偶聯，該佐劑是來源于革蘭氏陰性菌的脂蛋白N-末端部分的合成類似物。Deres等(參考文獻26)進一步報道了體內用合成的脂肽疫苗啟動病毒特異的細胞毒T淋巴細胞。此疫苗包括來源于流感病毒核蛋白的經修飾的合成肽，連接于一個脂肽N-棕櫚酰-S-〔2，3-雙(棕櫚酰氧基)-(2RS)-丙基-〔R〕-半胱氨酸(TPC)。
2.免疫分析本發明的CD蛋白可用作產生抗CD抗體的免疫原，作為免疫分析的抗原包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)，酶聯免疫吸附實驗(RIAS)和其他本領域已知的用于檢測抗細菌，抗摩拉克氏菌和抗CD抗體的非酶聯抗體結合分析的方法。在ELISA分析中，CD蛋白被固定于一個選定的表面，一個可結合蛋白的表面如一個聚苯乙烯微量滴度板的孔內。洗去未完全吸附的CD蛋白以后，一種非特異蛋白如牛血清白蛋白(BSA)的溶液被結合到此選定表面牛血清白蛋白對測試樣品來說是抗原性為中性的，此步驟將固定表面的非特異吸附位點封閉，因而減少了抗血清對于表面非特異結合的背景。
固定CD蛋白的表面然而與某種樣品如臨床或生物材料接觸，通過導致免疫復合物(抗原抗體)形成的方式測試。此步可包括把樣品用稀釋劑稀釋，如用BSA溶液，牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)/吐溫液。然后樣品被溫育2-4小時，溫度可在25℃-37℃之間。溫育后，接觸樣品的表面被沖洗以去掉非免疫復合物材料。沖洗步驟包括用溶液PBS/吐溫或硼酸鹽緩沖液沖洗。當測試樣品與結合的CD蛋白形成免疫復合物及沖洗后，免疫復合物的發生，甚至其量可通過將復合物與特異性結合一抗的二抗反應來確定。如果測試樣品來源于人，則二抗為一特異結合人類免疫球蛋白，通常為IgG的抗體。為了提供檢測方法，二抗可帶有一種附加活性，如與合適的產色底物孵育后能產生不同顏色程序的酶促活性。然后可通過用如分光光度計來測定顏色產生的程度來定量。
3.生物保藏此處描述和引用的一種粘膜炎布蘭漢氏球菌菌株RH 408依據布達佩斯條約并在此申請提交以前，已經被保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，此單位位于美國馬里蘭州，Rockville 12301 Parklaun路。粘膜炎布蘭漢氏球菌RH 408已被按登記號55,637登記并于1994年12月13日提交。在基于此美國專利申請的專利授權后，保藏的菌株樣品可對大眾公開。此處描述和要求權利的發明并不被限制在保藏菌株范圍內，因為保藏的實施方案只作為本發明的一個說明。任何等同或類似的菌株，如其不凝集并具有與此申請中描述的同樣特征，都包括在本發明的范圍之內。
實施例以上公開概括介紹了本發明。參照下面特異的實施例，我們可獲得一個更全面的理解。這些實施例僅僅是為了說明而不是限制本發明的范圍的。形式的改變和等同物的替換均被認為是可很容易被提示或實現的。此處雖然引入了特殊的術語，但此類術語是為了描述的目的而不是限制的目的。此內容里使用但并未詳述的分子遺傳學、蛋白質生化和免疫學方法及這些實例在科學文集里有充分報道，并且是本領域里技術人員所能做到的。實施例1此實施例闡明了粘膜炎摩拉克氏菌的生長。
粘膜炎摩拉克氏菌株4223接種入20毫升腦心浸液(BHI)肉湯。37℃，通風情況下培養過夜。在鐵離子限制條件下的生長，1毫升過夜培養物接種入20毫升含20μM EDDA的BHI肉湯中在37℃培養3-4小時。生長在對數中期的細菌(A578＞0.5)通過10000×g離心20分鐘收集，沉淀物用來提取實施例3中的CD蛋白。實施例2此實施例闡明了粘膜炎摩拉克氏菌的非凝集菌株(RH 408)的產生。
粘膜炎摩拉克氏菌4223接種入幾個含20毫升BHI肉湯培養基的燒瓶內，37℃孵育并170轉/分振搖過夜。5毫升每一個過夜培養物被轉入到單獨的1毫升小管內，室溫靜置3-8小時，使細菌沉淀。如上所述，100μl澄清的培養基上清被用來接種25毫升BHI肉湯，然后于37℃孵育過夜。這種傳代共重復六次，對于每一次過夜培養物，用25微升澄清的培養基來接種25ml BHI肉湯。非凝集細菌培養物通過每隔3小時測定A578來鑒定，以將傳代菌株的沉淀速率與原始菌株4223的沉淀速率進行比較。將凝集的突變體，包括粘膜炎摩拉克氏菌RH 408，在3小時間隔期內不聚集。在BHI瓊脂板上，RH 408菌株有所有非凝集菌株的克隆形態。實施例3這一實施例闡明了CD蛋白的抽提和純化。
CD蛋白通過圖1中描述的步驟從粘膜炎摩拉克氏菌中分離。如實施例1中描述的一樣，每250ml培養物的粘膜炎摩拉克氏菌的細胞沉淀，重懸于50mM Tris-HCl，pH8.0，并超聲破碎(3×10分鐘，70％負載周期)。抽提物在20000×g離心，得到的上清包含超過95％的粘膜炎摩拉克氏菌的可溶蛋白，棄之。
殘余沉淀(PPT1)首先用含0.5％Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris，pH8.0溶液40ml抽提一次，然后用含0.5％SDS，50mM Tris，pH8.0溶液40ml抽提兩次。這兩次抽提去掉殘余可溶蛋白和大部分除CD蛋白以外的膜蛋白。
將以上抽提得到的沉淀(PPT3)用作純化CD的起始材料。沉淀用含0.5％Triton X-100，10mM EDTA的50mM Tris，pH8.0溶液重懸。在重懸液中加入尿素至終濃度為6M，然后懸液60℃加熱30分鐘。溶解CD蛋白。20,000×g離心30分鐘之后，所得上清包含同質的純化的CD蛋白并已與沉淀分開。純化的CD蛋白溶液在pH8.0，50mMTris溶液中透析過夜，去除尿素，然后進一步離心，20000×g，30分鐘，以去除任何可能從溶液中析出的沉降物質。在這些條件下，CD蛋白仍保持溶解狀態。最終制劑的CD蛋白量通過BCA蛋白分析確定為大約100μg/ml，CD蛋白純度通過SDS-PAGE電泳分析和密度測定法確定。(見圖2)圖2顯示的CD蛋白純度大約95％。SDS-PAGE分析確證了生產的CD蛋白具有已知的此蛋白的分子量55-60kDa(參考文獻21)。純化的CD蛋白的特性通過對溴化氰斷裂片斷進行氨基酸序列分析并與發表的序列(參考文獻22)比較來確證。純化的CD蛋白貯于-20℃。實施例4此實施例闡明了用純化CD蛋白對小鼠和豚鼠的免疫。
5只Balblc小鼠每組的多組小鼠在第1、第29和43天，用滅活的粘膜炎摩拉克氏菌(約105細胞)或實施例3中那樣產生的純化的CD蛋白(0.3μg-10μg)，連同AlPO4(1.5mg每次劑量)，分別進行三次皮下注射。在第14、28、42和56天分別采取血樣，用EIAs法分析抗CD抗體的效價。
兩只每組的豚鼠第1天用10μg劑量完全佛氏佐劑乳化的(CFA)純化CD蛋白進行肌內免疫(i.m.)。在第14和29天用同樣劑量在不完全佛氏佐劑(IFA)里乳化的蛋白進行免疫促進。第42天采取血樣分析抗血清的殺菌活性。實施例5此實施例闡明了用來確定小鼠抗血清中抗CD抗體的EIAs方法。
EIAs方法基本按照Panezuffi等描述的進行(參考文獻23)。微量滴度孔用1μg CD蛋白室溫包被16小時，然后滴量度板用0.1％(w/v)的PBS溶解的牛血清白蛋白封閉。小鼠抗血清梯度稀釋，加入孔內，然后室溫孵育1小時。親合純化的羊抗鼠IgG(Fc特異)抗體的F(ab′)2片段交聯上辣根過氧化物酶被用作二抗。反應利用四甲基聯苯胺(TMB/H2O2)發生，吸光值在-種叫Flow Multiskan MCC的微量板閱讀儀上測定450nm波長光吸收(用540nm作為一種參考波長)。抗血清的反應效價用持續顯示吸光值二倍增加的稀釋度與免疫前血清樣品的吸光值的倒數來定義。實施例6此實施例闡明了EIAs法確定小鼠血清中抗CD IgG的亞類。
微量滴度孔用1μg純化的CD蛋白包被免疫原性研究(如實施例4中所述)中的小鼠血清樣品的最后的血被收集并用EIAs測試。大鼠抗小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b抗體交聯于辣根過氧化物酶及交聯于辣根過氧化物酶的兔抗鼠IgG3被用作EIAs的試劑。每種交聯劑的工作稀釋度用純化的抗體亞類確定以避免交叉反應。反應效價用實施例5中描述的方法確定。實施例7此實施例闡明了流式細胞分析法。
用實例1中所述的方法，粘膜炎摩拉克氏菌株RH 408長至約2×108cfu/ml后，每100μl與200μl以1/500比例用含1％BSA的PBS(4mMNa2HPO4·7H2O，1.5mM KH2PO4，140mM NaCl，7mM KCl，pH7.3)稀釋的抗血清混合。流感嗜血桿菌菌株12亦長至2×108cfu/ml，用同樣的抗血清孵育，用作陰性對照。其他對照包括在沒有任何原始抗血清的條件下單獨與交聯劑孵育。第一次孵育過后，細胞用含1％BSA的PBS洗兩次，然后與200μl稀釋的親合純化的羊抗鼠免疫球蛋白-DTAF混合(Jackso免疫研究室，Inc.，Mississaga Ontario)。細菌在4℃與交聯物孵育30分鐘，用PBS/BSA洗兩次，然后重懸于1％的多聚甲醛。
染色過的細菌的熒光用Coulter Elite流式細胞儀分析，每次分析10,000個細菌。一種氬激光被使用，而525nm的發射信號被收集。抗體結合水平用基于對數刻度的熒光平均道數表示。實施例8此實施例闡明了對于粘膜炎摩拉克氏菌的殺菌測試。
血清樣品(25μl)加熱至56℃，并維持30分鐘以去除補體活性，再用含0.1BSA的佛羅那緩沖液(VBS)1∶8稀釋，然后加入到96孔Nure微量滴度板的第一個孔中。抗血清2倍的梯度稀釋液加入到其余各孔中。長至A578＞0.5的細菌用VBS1∶200,000稀釋，25μl細菌懸液加入到每個孔中。一種豚鼠補體(Biowhittaker，Walkersville，MD)用VSA1∶10稀釋并把25μl稀釋液加入到每個孔中起動反應。滴度板37℃孵育60分鐘，然后將50μl每種反應混合物鋪板于含2.2％Mueller-Hinton肉湯和1.5％瓊脂的Mueller-Hinton瓊脂板上。在37℃孵育48小時后，計數克隆來確定殺菌效價(與含免疫前血清的對照相比，能夠殺死大于50％細菌的抗血清的最高稀釋度的倒數)。
公開內容小結在此公開內容的小結中，本發明提供了一種分離并純化的非變性的外膜蛋白CD，它是或與摩拉克氏菌分離的部分相關；本發明亦提供了從細菌菌株中分離此蛋白的方法。任何修改在本發明范圍內都是可能的。
表1抗CD抗血清和抗粘膜炎摩拉克氏菌抗血清對于粘膜炎摩拉克氏菌的殺菌活性粘膜炎摩拉 殺菌效價1動物種類抗原克氏菌株免疫前血清免疫后血清小鼠2CD RH 408 ＜1∶8 1∶128小鼠 CDQ8＜1∶8 1∶128小鼠 全細胞RH 408 ＜1∶8 1∶512小鼠 全細胞 Q8＜1∶8 1∶512豚鼠3CD RH 408 ＜1∶8 1∶1,024豚鼠 CDQ8＜1∶8 1∶1,0241殺菌效價表示為與對照相比能夠殺死50％細胞的最高稀釋度。25只每組的Balb/c小鼠在第1、29和43天用滅活的粘膜炎摩拉克氏菌4223或3μg純化的CD蛋白連同AlPO4進行皮下注射。第54天采取血樣分析殺菌活性。3第1天，兩只每組的豚鼠用10μg劑量以完全佛氏佐劑(CFA)乳化的純化的CD蛋白肌肉(i.m.)免疫。第14和29天，用同樣劑量以不完全佛氏佐劑乳化的CD蛋白促進免疫，第42天采取血樣分析殺菌活性。
參考文獻1.Van Hare，G.F.，P.A.Shurin，C.D.Marchant，N.A.Cartelli，C.E.Johnson，D.Fulton，S.Carlin，and C.H.Kim.粘膜炎布蘭漢氏球菌引起的急性中耳炎生物學和治療。《(感染性疾病綜述》916-27。2.Chapman，A.J.，D.M.Musher，S.Jonsson，J.E.Clarridge，and R.J.Wallace.1985.在粘膜炎布蘭漢氏球菌感染中殺菌抗體的產生。
《感染性疾病雜志》151878-882。3.Hager，H.，A.Verghese，S.Alvarez，and S.L.Berk.1987.粘膜炎布蘭漢氏球菌的呼吸道感染。《感染性疾病綜述》91140-1149。4.McLeod，D.T.，F.Ahmad，M.J.Croughan，and M.A.Calder.1986.粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的支氣管肺感染，臨床癥狀和治療反應。《藥物》31(增補3)109-112。5.Nicotra，B.，M.Rivera，J.I.Luman，and R.J.Wallace.1986.粘膜炎布蘭漢氏球菌作為患慢性肺病的病人下呼吸管道的一種細菌病原體。《國際醫這學學報》。146890-893。6.Ninane，G.，J.Joly，and M.Kraytman.1978.11例經氣管穿刺分析的由粘膜炎布蘭漢氏球菌導致的支氣管肺感染。《英國醫學雜志》。1276-278。7.Srinivasan，G.，M.J.Raff，W.C.Templeton，S.J.Givens，R.C.Gravesand J.C.Mel.1981.粘膜炎布蘭漢氏球菌肺炎，兩例病案報道和其毒解的綜述。《美國呼吸道疾病綜述》。123553-555。8.West，M.，S.L.Berk，and J.K.Smith.1982.粘膜炎布蘭漢氏球菌肺炎，《南方醫學雜志》。751021-1023。9.Brorson，J-E.，A.Axelsson，and S.E.Holm.1976.與上頜竇炎特別相關的粘膜炎布蘭漢氏球菌<粘膜炎奈瑟菌>的研究《斯堪的那維亞感染性疾病雜志》。8151-155。10.Evans，F.O.，Jr.，J.B.Sydnor，W.E.C.Moore，G.R.Moore，J.L.
Manwaring，A.H.Brill，R.T.Jackson，S.Hanna，J.S.Skaar，L.V.
Holdeman，G.S.Fitz-Hugh，M.A.Sande，and J.M.Gwaltney，Jr.1975.
上頜竇炎。《新英格蘭醫學雜志》。293735-739。11.Tinkelman，D.G.，and H.J.Silk.1989.小兒慢性竇炎的臨床及細菌學特征。《美國兒童病雜志》。143938-942。12.Wald，E.R.，C.Byers，N.Guerra，M.Casselbrant，and D.Beste.1989.小兒亞急性竇炎。《兒科學雜志》。11528-32。13.Wald，E.R.，G.J.Milmoe，A.Bowen，J.Ledesma-Medina，N.Salamon，and C.D.Bluestone.1981.小兒急性上頜竇炎《新英格蘭醫學雜志》。304749-754。14.Christensen，J.J.，and B.Bruun.1985.一種產β-內酰胺酶的粘膜炎布蘭漢氏球菌引起的菌血癥《斯堪的納維亞微生物免疫學病理學報》B輯。93273-275。15.Craig，D.B.，and P.A.Wehrle.1983.粘膜炎布蘭漢氏球菌引起的腐敗性關節炎。《風濕病學雜志》。10985-986。16.Gray，L.D.，R.E.Van Scoy，J.P.Anhalt，and P.K.W.Yu.1989.粘膜炎布蘭漢氏球菌引起的傷口感染。《臨床微生物雜志》。27818-820。17.Guthrie，R.，K.Bakenhaster，R.Nelson，and R.Woskobnick.1988.粘膜炎布蘭漢氏球菌膿毒癥，一個病例報道及著作綜述。《感染性疾病雜志》。58907-908。18.Hiroshi，S.，E.J.Anaissie，N.Khardori，and G.P.Bodey.1988.白血病病人中的粘膜炎布蘭漢氏球菌敗血癥。《癌癥》。612315-2317。19.O’Neill，J.H.，and P.W.Mathieson.1987.粘膜炎布蘭漢氏球菌起因的軟膜蛛網膜炎。《澳大利亞、新西蘭醫學雜志》。17241-242。20.Murphy，T.F.1989.粘膜炎布蘭漢氏球菌的表面到達急性細菌病原體表面抗原的一個系統途徑。《兒科感染病雜志》。8S75-S77。21.Sarwar，J.Campagnari，A.A.，Kirkham，C.，and Murphy，T.F.1992.粘膜炎布蘭漢氏球菌的一個抗原性保守，熱可修飾的外膜蛋白的特性。《感染免疫學》。60804-809。22.Murphy，T.F.，C.Kirkham，and A.J.Lesse.1993.主要的熱可修飾外膜蛋白CD在不同粘膜炎布蘭漢氏球菌中是高度保守的。《分子微生物學》。10(1)87-97。23.Panezutti H.，O.James，E.J.Hanson，Y.Choi，R.E.Harkness，M.H.Klein and P.Chong，1993.流感嗜血桿菌b型P1特異的單克隆抗體識別的表面暴露的B細胞抗原決定簇的鑒別。《感染免疫學》。611867-1872。24.Nixon-George et al.，(1990)，《免疫學雜志》。1990，1444798-4802。25.Wiesmuller(1989)，《疫苗》1989，829-33。26.Deres et al.(1989)，《自然》1989，342561。27.Lockhoff，O.糖脂體為一種免疫調節劑合成及特征《英格蘭國際化學》。301611-1620。
權利要求
1.一種可從摩拉克氏菌株分離的分離并純化的，非變性外膜蛋白CD或其功能類似物。
2.權利要求1的CD蛋白，具有所述的摩拉克氏菌中CD蛋白的免疫性特征。
3.權利要求2的CD蛋白，其中摩拉克氏菌株是粘膜炎摩拉克氏菌。
4.權利要求3的CD蛋白，其中菌株是粘膜炎摩拉克氏菌RH 408。
5.權利要求1的CD蛋白，其至少為按重量計約20％純。
6.權利要求5的CD蛋白，其至少為按重量計約95％純。
7.權利要求2的CD蛋白，其為水溶液形式。
8.一種免疫原性組合物，包括免疫有效量的權利要求1的外膜蛋白。
9.權利要求8的免疫原性組合物，制作為體內用藥予宿主的疫苗，以使之抵抗產生CD蛋白的細菌病原體或產生一種能在宿主體內誘導與CD蛋白特異反應的抗體的蛋白的細菌病原體引起的疾病。
10.權利要求9的免疫原性組合物，其中的菌株為一種摩拉克氏菌株。
11.權利要求10中的免疫原性組合物，其中的菌株為粘膜炎摩拉克氏菌株。
12.權利要求11的免疫原性組合物，進一步包括至少一種其他的免疫原性或免疫刺激物質。
13.權利要求12的免疫原性組合物，其中至少一種其他免疫刺激物質為至少于一種佐劑。
14.權利要求13的免疫原性組合物，其中的至少一種佐劑選自磷酸鋁、氫氧化鋁、QS21、Quil A或其衍生物或其組分，磷酸鈣、氫氧化鈣、氫氧化鋅、一種糖脂類似物、一種氨基酸的十八烷基酯、一種胞壁酰二肽、一種脂蛋白、多聚磷腈、ISCOM基質、ISCOPRP、DC-Chol和DDBA。
15.權利要求14的免疫原性組合物，其中宿主為一種靈長類動物。
16.權利要求15的免疫原性組合物，其中的靈長類動物為人。
17.權利要求9中的免疫原性組合物，制作為微粒、膠囊、ISCOM或脂質體制劑。
18.權利要求9的免疫原性組合物，其與靶分子結合，以將其輸送到免疫系統的特定細胞或粘膜表面。
19.一種摩拉克氏菌的外膜蛋白CD特異的抗體，可通過權利要求8的免疫原性組合物免疫宿主產生。
20.一種在宿主體內產生免疫反應的方法，包括施給宿主免疫有效量的權利要求8的免疫原性組合物。
21.權利要求20的方法，其中免疫反應為一種體液或細胞介導的免疫反應。
22.權利要求21的方法，其中的免疫反應為宿主提供了針對疾病的抵抗力，這些疾病為由產生CD蛋白的細菌病原體或產生一種能誘導在宿主體內產生與CD蛋白特異反應的抗體之蛋白的細菌病原體引起。
23.一種確定樣品中特異與粘膜炎摩拉克氏菌外膜蛋白反應的抗體存在的方法，包括步驟(a)將樣品與權利要求1的CD蛋白在一定條件下接觸，產生包括CD蛋白和樣品中能特異與其反應的任何所述抗體的復合物；以及(b)測定復合物的產生。
24.一種確定樣品中CD蛋白存在的方法，包括步驟(a)用權利要求8的免疫原性組合物免疫受試者，獲得CD蛋白特異的抗體；(b)將樣品與抗體接觸，產生包括任何存在于樣品中的任何CD蛋白和所述CD蛋白特異抗體的復合物；以及(c)測定復合物的產生。
25.權利要求23的方法，其中樣品中的CD蛋白為下列物質一部分(a)一種粘膜炎摩拉克氏菌株或(b)一種產生CD蛋白的細菌或產生一種能在宿主體內誘導產生特異的與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌。
26.一種用于測定樣品中與CD蛋白特異反應的抗體的存在的診斷試劑盒，包括(a)權利要求1的CD蛋白；(b)使CD蛋白與樣品接觸以產生包括CD蛋白和樣品中任何所述抗體的復合物的方法；以及(c)測定復合物產生的方法。
27.一種檢測樣品中CD蛋白存在的診斷試劑盒包括(a)一種權利要求17的抗體；(b)使抗體與樣品接觸以產生包含CD蛋白和CD特異抗體的復合物的方法；以及(c)測定復合物產生的方法。
28.一種產生疫苗的方法，此疫苗可抵抗由產生CD蛋白或產生一種能在宿主體內誘導產生特異與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌病原體感染引起的疾病，此方法包括將權利要求8的免疫原性組合物給藥予測試宿主，確定其組分的相對量和給藥予頻率，以提供針對于疾病的保護，此類疾病由產生CD蛋白或產生一種在宿主體內可誘導出特異與CD蛋白反應的抗體的蛋白的細菌病原體引起；和將免疫原性組合物制成一種適于投藥給所試宿主的形式，此形式按照所述確定的量和投藥頻率要求制成。
29.權利要求28的方法，其中所試宿主為人。
30.一種產生特異于來源于摩拉克氏菌株的外膜蛋白CD的單克隆抗體的方法；包括(a)將權利要求8的一種免疫原性組合物投藥給至少一只小鼠以產生至少一只免疫后小鼠；(b)從上述至少一只免疫后小鼠中取出B-淋巴細胞；(c)把從免疫小鼠中取出的B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，因而產生雜交瘤；(d)將產生選擇性抗CD蛋白抗體的雜交瘤克隆；(e)培養此產生抗CD蛋白抗體的克隆；和(f)從培養物中分離抗CD蛋白抗體。
31.-種從產CD蛋白的細菌菌株生產分離及純化的外膜蛋白CD的方法，包括如下步驟(a)提供此細菌菌株的細胞團；(b)將此細胞團裂解產生細胞裂解液；(c)將此細胞裂解液分級分離，得到初級上清和初級沉淀，上清里含有基本上大部分可溶性細菌蛋白；(d)將所述初級上清與初級沉淀分開；(e)選擇性抽提初級沉淀，基本上去掉所有可溶蛋白和除CD蛋白以外的膜蛋白，并產生次級上清和包含CD蛋白經抽提的沉淀；(f)將此次級上清與經抽提的沉淀分開；(g)溶解此沉淀得到溶解的抽提物；(h)把此溶解的抽提物分級分離，產生含CD蛋白的上清和應棄掉的沉淀；然后(i)將此含CD的上清與欲棄掉的沉淀分開。
32.權利要求31的方法，其中所述細菌菌株為摩拉克氏菌株。
33.權利要求31的方法，其中所述細菌菌株為粘膜炎摩拉克氏菌。
34.權利要求31的方法，其中的細胞裂解液通過離心分級分離，溶解的抽提物亦通過離心來分級分離。
35.權利要求34的方法，其中選擇性抽提初級沉淀的步驟包括至少-種去污劑抽提。
36.權利要求35的方法，其中抽提起始沉淀的步驟包含多種去污劑抽提。
37.權利要求35的方法，其中經抽提的沉淀用-種緩沖液打散并溶解，此緩沖液包含一種去污劑和一種溶劑，在一定溫度下，經過一定時間使經抽提的沉淀溶解，產生溶解的抽提物。
38.權利要求37的方法，其中緩沖液pH約為7至8.5，按重量計約含0.1-2％的去污劑和約3-8M的尿素作為溶劑。
39.權利要求38的方法，其中去污劑為Triton X-100。
40.權利要求38的方法，其中所述溶解在大約40℃-70℃，10-20分鐘條件下發生。
41.權利要求40的方法，包括隨后的將含CD的上清透析以去掉所述去污劑及溶劑，產生進一步的純化的處于非變性狀態的CD蛋白溶液。
42.一種具有粘膜炎摩拉克氏菌RH 408同樣特征的粘膜炎摩拉克氏菌株(ATCC登記55637號)。
43.一種測定抗血清的抗摩拉克氏菌的抗菌活性的方法，包括所述抗血清行使的補體介導的對于預選數量的權利要求40中的非凝集菌株細胞的殺傷作用，和測定由所述抗血清殺傷的預選數量細胞的比例，作為所述抗摩拉克氏菌的抗菌活性的量度。
全文摘要
一種分離并純化的非變性外膜蛋白CD通過一種分離方法得到,此蛋白本身是或相當于一種摩拉克氏菌株,特別是粘膜炎摩拉克氏菌的可分離部分。分離時把大批細菌裂解然后離心形成沉淀,并棄去包含在部分可溶蛋白的上清。此沉淀再選擇性地抽提以去掉剩下的可溶性蛋白。除CD外的其它膜蛋白和其他雜質例如脂多糖和磷脂。剩下的包含CD的沉淀被分散和溶解,然后離心分級分離去掉余下的細胞殘渣。該CD蛋白可用于診斷和免疫原性組合物,特別是在宿主體內施用提供抗疾病保護,該疾病是由于產生CD蛋白或另一種蛋白的細菌病原體引起的,其中該另一種蛋白可在宿主內誘導特異性與CD蛋白反應的抗體。
文檔編號C12R1/01GK1174559SQ95196963
公開日1998年2月25日 申請日期1995年10月23日 優先權日1994年10月24日
發明者Y·P·楊, R·E·哈克尼斯, L·E·邁爾斯, U·麥吉尼斯, M·H·克萊恩 申請人:康諾特實驗室有限公司