專利名稱：具免疫抑制活性的單克隆抗體片段的制作方法
II類主要組織相容性復合物(MHC)分子可結合抗原肽片段，并將它們呈遞給輔助(CD4+)T細胞(“Th”細胞)(參考文獻1)。對II類MHC分子具特異性的單克隆抗體(mAb)已被證實是在體外Th細胞反應中效力極高的選擇性抑制劑(參考文獻2)。自從發現它們之后，它們已被視為用于自身免疫疾病(如類風濕性關節炎)的選擇性免疫抑制治療的有效藥物。最初的活體研究表明，這些mAb對Th細胞的有益作用介導了異源-和自身免疫的反應(參考文獻3-6)。然而在某些情況下，把II類MHC特異性mAb的活體實驗應用與導致實驗室靈長類動物死亡的未預料到的并發癥聯系起來了(參考文獻7、8)。后一觀察結果阻礙了人們對MHC特異性mAb免疫調節作用進一步研究的興趣。據最近的出版文獻所描述，II類MHC在轉基因小鼠體內表達降低10倍造成了因無效的抗原呈遞而引起的Th細胞的無反應性(參考文獻19)。這表明了II類MHC表達的降低與活體模型中的免疫抑制有關系。
依據本發明，已令人驚奇地發現，具有下調HLA-DR表達能力的mAb的單價mAb片段(Fab)可以自身下調這種HLA-DR表達而不引起mAb本身或mAb二價片段[F(ab)′2]的細胞毒性。因此本發明的Fab片段是無細胞毒性副作用的有效II類MHC特異性免疫抑制化合物。
在更詳細描述本發明之前，先簡要描述下列附圖
圖1DR結合性競爭肽和DR特異性mAb對EBV轉化的B細胞系Priess的作用。
圖2mAb L243對LG2的調控和細胞毒性作用時間過程。
圖3在除去mAb之后L243對LG2的調控和細胞毒性作用的持續時間。
圖4在與DR特異性mAb L243及其片段共培養之后，HLA-DR表達對不同APC群體的下調作用。
圖5DR特異性Fab片段濃度的不斷增加對EBV轉化的B細胞系LG2的作用。
圖6L243及其片段的延長性共培養對LG2細胞的作用。
圖7EBV-LCL細胞毒性對DR-交聯的依賴性。
圖8DR下調作用對靜止B細胞和單核細胞/巨噬細胞的選擇性。
圖9DR下調作用對B細胞胚細胞的選擇性。
圖10DR下調作用對LG2細胞的選擇性。
圖11由mAb引起的DR下調作用的同種異型非選擇性。
圖12由1-1C4 Fab引起的對TS-10細胞的泛II類下調作用。
圖13LG2和Priess細胞與L243及其片段的共培養引起TNFα分泌增加不足。
圖14Th細胞抑制和DR下調所需要的抗體濃度。
圖15抗DR mAb和Fab片段對固定性APC引起的抗原呈遞的作用。
圖16抗原負載對mAb、Fab和肽頡頏物的作用。
圖17Fab和肽對抗原劑量-反應曲線的相對作用。
圖18II類頡頏物對正在進行的Th細胞反應的作用。
對HLA-DR[類型“DR”的人的白細胞抗原；II類主要組織相容性復合物(MHC)分子]具特異性的某些單克隆抗體(mAb)可以下調白細胞[其是約90％的抗原呈遞細胞(“APC”)]表面HLA-DR分子的表達。同樣的mAb還可以抑制人的Th細胞克隆的活化，后者需要由HLA-DR分子引起的抗原呈遞。與目前所使用的肽頡頏物相比，這些mAb的抑制效力要高出幾百至幾千倍(參見下列表1)。這種HLA-DR表達的下調和Th細胞活化的抑制是一種可引起免疫抑制的藥物活性。這種免疫抑制可用于治療自身免疫疾病，特別是類風濕性關節炎。
依據本發明，已令人驚奇地發現，具有下調HLA-DR表達能力的mAb的單價、抗原結合性mAb片段(Fab)可以自身下調這種HLA-DR表達而不引起mAb本身或mAb二價片段[F(ab)′2]的細胞毒性。因此本發明的Fab片段是無細胞毒性副作用的有效II類MHC特異性免疫抑制化合物。這樣，本發明含有抗HLA-DR mAb的Fab片段，其中所述完整的mAb對抗原呈遞細胞具細胞毒性并可下調剩余抗原呈遞細胞上的HLA-DR的表達。這樣的mAb可抑制Th細胞的活化。從其中衍生出本發明Fab片段的mAb都結合在HLA-DR的第一區域中。
依據本發明可使用的三種下調性mAbs的實例是LB3.1(小鼠IgG2b，泛-DRα1-特異性；參考文獻9-10)；L243(小鼠IgG2a，泛-DRα1-特異性；參考文獻10-11；ATCC登記號HB55)；SFR3-DR5(大鼠IgG2b，DRB1*110X-特異性；參考文獻13；ATCC登記號HB-151)。
此外，可通過如實施例22中所述的常規方法來產生能另外下調HLA-DQ和-DP的HLA-DR下調性mAb，1-1C4(小鼠IgG2a，β鏈特異性；參考文獻14)。這樣，本發明也包括上述mAb的Fab片段。
與下調性mAbs抑制Th細胞活化的能力相一致，5種非下調性mAbs，CCCL20[小鼠IgG2b，對三種DRB1(β鏈)等位形式(DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*0404)具特異性；參考文獻12]和8D1、9F1、9F2、10F12(所有四種小鼠IgG1)只能極弱地或完全不能抑制Th細胞的活化。
活性的mAb對B淋巴母細胞樣細胞和小部分正常活化的B細胞具有細胞毒性。同這些mAb一樣，這些mAb的二價F(ab)′2片段可介導下調作用但也具有細胞毒性。不過，依據本發明，這些mAb的Fab單價片段可釋放細胞毒性，但令人驚奇地保留了親代mAb的下調特性。
可通過任何常規方法來生產出獲得本發明Fab片段所用的抗HLA-DRmAb，例如一般由Kohler和Milstein首先描述的程序。把這種抗原注射進大鼠或小鼠、兔子、綿羊等(優選為小鼠)體內，可以通過從這種免疫動物中回收抗體產生細胞和使以常規方法獲得的所述細胞不斷增殖來制備出單克隆抗體，常規方法如與骨髓瘤細胞，如小鼠骨髓瘤細胞，SP2/0-SP2/0-Ag 14-細胞[ATCC No.CRL 1581；ATCC No.CRL 8287]融合[產生抗體的一般性指導參見如“抗體-實驗室手冊”，Harlow和Lee編著，冷泉港實驗室出版社(1988)]。隨后可通過常規程序(如放射免疫、酶免疫或斑點免疫結合或免疫熒光測定)來篩選這種雜交瘤培養物的上清液中的單克隆抗體(mAb)。通過常規層析程序可從雜交瘤上清液中提純mAb，例如可通過離子交換層析、結合在固體支持物上的蛋白質A、抗免疫球蛋白抗體或抗原或其部分的親和層析、HPLC等方法。依據本發明所使用的mAb的生產如實施例22所述。
為了能依據本領域熟悉的方法大量生產mAb，可將分泌所需抗體的雜交瘤注射進小鼠的腹腔內，該鼠在注射前曾進行過如用姥鮫烷的預處理。可通過在一只小鼠體內生成的腹水腫瘤來生產約100mg的mAb。可通過上述方法來提純由這種腫瘤所產生的腹水液中的mAb。
可通過已知方法(如Ouchterlony免疫擴散方法)依據其亞類對mAb進行表征。本領域的人們還知道，mAb可通過修飾用于多種用途，或生產出其仍具結合抗原能力的片段。如可通過用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶解mAb來產生出這些片段。
生產本發明中mAb所用的免疫原優選為HLA-DRβ-鏈[如參見WO92/10589；生物化學雜志262，8748-8758(1987)；序列信息也可得自序列數據庫，例如Genback(Intelligenetics，加利福尼亞，美國)，歐洲生物信息科學研究所(Hinxton Hall，劍橋，英國)，NBRF(喬治湯大學，醫學中心，華盛頓DC，美國)和Vecbase(威斯康星大學，生物技術中心，麥迪遜，威斯康星，美國)；可通過本領域目前已知的方法來使用這些序列以生產用于本發明單克隆抗體的制備所需的抗原]，可通過常規方法，如SDS-PAGE進行純化。
對于上述對APC具細胞毒性且能下調HLA-DR表達的抗HLA-DR mAb，可通過常規方法進行鑒定。優選的是可依據實施例3對抗HLA-DR mAb進行鑒定，其中把EB病毒轉化的人B淋巴母細胞系(EBV-LCL)用作APC(特別是活化的B細胞)的模型。優選使用每毫升含約105EBV-LCL細胞的至少1ml培養物。用20nM抗HLA-DR mAb來溫育培養物16小時，通過常規方法來確定死細胞的數目以及剩余存活細胞對HLA-DR的表達。為了達到本發明的目的，特對細胞毒性和下調作用做如下定義1)如果在上述條件下，mAb對抗原呈遞細胞具細胞毒性，完整mAb至少殺死25％EBV-LCL的抗原呈遞細胞，優選為至少40％；2)如果在上述條件下，mAb下調抗原呈遞細胞上HLA-DR的表達，其減少EBV-LCL抗原呈遞細胞表面HLA-DR分子的數量，存活至少仍為平均50％。
通過常規免疫熒光法來標記EBV-LCL抗原呈遞細胞以檢測死細胞和測定剩余存活細胞的HLA-DR的表達。使用流式細胞儀(如FACScan，Becton-Dickinson，圣何賽，加利福尼亞)來分析這些細胞，并通過常規方法來計算死細胞的百分比和HLA-DR在剩余細胞上表達的降低，優選使用通常應用流式細胞儀的軟件(如裝備有FACS can細胞計數器的LYSIS II軟件)。
用于篩選具有所需特性的單克隆抗體的EBV-LCL并不關鍵。依據本發明可使用任何常規性EBV-LCL。依據本發明所使用的EBV-LCL的實例有Priess[ECACC(索爾茲伯里，英國)登記號86052111]，LG2[IstitutoNazionale Per La Ricerca Sul Cancro(熱那亞，意大利)登記號G20112301]和TS-10[ECACC(索爾茲伯里，英國)登記號85102911]。
可通過任何常規方法來生產上述mAb的Fab片段。可通過胃蛋白酶對親代mAb的消化和通過本領域熟悉的方法分離Fab片段來生產出Fab片段，如見Andrew和Titus，“免疫球蛋白G的斷裂”，免疫學的現行方案，Goligan等人編著(Greene和Wiley，1994)。因此，這樣的方法和用該方法制備Fab片段也是本發明的目的。優選的是通過能表達編碼所需Fab片段的基因的重組性細胞系來生產出本發明的Fab片段。可通過任何常規方法來生產這樣的重組性細胞系。例如，可通過常規方法從分泌Fab片段親代mAb的雜交瘤中克隆出編碼Fab片段的基因部分。隨后可通過常規方法把Fab片段eDNA摻入一表達載體中，其而后用來轉染適當的細胞系。
本發明的優選Fab片段是“人源化的”，即與直接產生于動物(優選為小鼠)的Fab片段mAb相比，當施用于人體時它們具較少的抗原性。生產本發明的人源化Fab片段的方法并不關鍵。可使用本領域所熟悉的任何常規方法。這些方法依據的是這樣的事實，即任何免疫球蛋白(Ig，如單克隆抗體)都由恒定區和能發生抗原結合的可變區所組成。可變區又由包埋在構架區(每個Ig的輕鏈和重鏈上的3個CDR′s)中的6個互補決定區(“CDR′s”)組成(參考文獻42)。正是CDR′s對mAb的特異性負責。由于mAb是小鼠或其它動物種類來源的，mAb的人源化基本上可通過用具有所需特異性的動物mAb的相應CDR′s置換至少1個但優選為全部6個人免疫球蛋白的CDR′s來進行。這樣，人的Ig就起到了動物CDR′s構架的作用。在這樣的程序中，動物mAb(通常為小鼠)被描述為“供體”，而人Ig則被描述為“受體”。
也可對所述人源化mAb的氨基酸序列進行進一步的“微調”而使人源化mAb的抗原特異性達到最佳化。例如，據國際專利申請
發明者Z·納吉, D·維多維克 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司