編碼羊腺病毒(oav287)的dna及其作為病毒載體的應用的制作方法

專利名稱：編碼羊腺病毒(oav287)的dna及其作為病毒載體的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的全長基因組克隆，它是從澳大利亞綿羊中分離出的良性的腺病毒(OVA287)中獲得的。本發明還涉及從良性羊腺病毒中獲得的新的病毒載體，并且還涉及這些載體向動物傳遞和在動物中表達編碼功能性RNA分子或多肽的核酸序列的應用。
背景技術：
由傳染性病原體和寄生蟲侵染引起的疾病會導致家養動物的健康問題和生產損失，但是對許多傳染性病原體并不存在疫苗。因此，在世界范圍內開展了許多研究工作以開發出新的，可以預防疾病的疫苗。
當從傳染性病原體和寄生蟲中鑒別出一些保護性抗原后，它們若要作為疫苗成功使用需要開發出能夠將這些抗原有效地傳遞給宿主的系統。主要從痘病毒中獲得的多種重組基因表達載體已經被使用，因為它們普遍具有較低的病原性。重組病毒載體感染之后的外源蛋白質表達有可能激發宿主體內保護性的免疫應答反應。
但是，沒有一種病毒載體具有各種情況下所需的所有的屬性。由于一些載體所具有的生物學特性，它們比其它載體更適合某些特殊的目的。例如，常常會發現很難激發有效的具有防病作用的粘膜免疫應答。對人類，腺病毒被口服接種來預防呼吸系統疾病(1)。由于腺病毒的預防作用包括對粘膜表面的保護作用，因此很明顯，它在這方面具有潛力。人的腺病毒也已被用于向肌肉(2)和其它組織傳遞基因。雖然在通常情況下，腺病毒并不將其DNA整合到細胞的基因組中去，然而，DNA持續存在，并且觀察到了蛋白質的長期表達。從這樣的細胞中表達適當的抗原可以產生全身性免疫應答，該應答可以預防同源的致病病原體。
已知的腺病毒基因組都是線性雙鏈DNA分子，每個末端都具有一個反向末端重復序列(ITR)，并且有一個蛋白質共價結合在5’末端的C殘基上(3)。2、5、12和40型人腺病毒的基因組序列和結構已被完全確定，大量其它類型的已被部分確定，包括一些從動物中分離出的(參見Genebank和EMBL核酸數據庫)。2型人腺病毒是第一個要被測序的基因組，但是一般來說，它的基因組的排列被保留在其它被表征的腺病毒中，即早期區域E1-E4和結構蛋白同系物可以在基因組的相似位置被識別出來。具體地說，E1A/E1B區位于基因組左側的末端，E4總是位于基因組右側的末端。早期區域E3總是位于結構蛋白pVIII和尾絲的基因之間，雖然它的大小和復雜程度隨種的不同而變化，舉例來說，它在人腺病毒中為3kb，有至少10個開放閱讀框架，在鼠腺病毒中為大約0.7kb，只有2個明顯開放閱讀框架(4，5)。對于重組病毒的構建來說，E3是一個關鍵區域，因為它是體外復制所非必需的(6)。晚期的L區域從主晚期啟動子開始表達，主晚期啟動子和結合的復合體產生了mRNA系，它編碼大部分結構病毒蛋白。IVa2和IX蛋白看來具有它們自己的啟動子。
雖然有一些可以用于醫療目的的人病毒載體，但是很少有適合于獸醫應用的動物病毒載體。為了獲得一種更加適合的動物病毒載體，本發明人純化了一種從西澳大利亞的綿羊身上分離出的羊腺病毒(OAV287)。該羊腺病毒從血清學角度與7型牛腺病毒有關，但是從遺傳學角度，它不同于牛腺病毒和其它澳大利亞羊分離物，正如在限制性酶圖譜的基礎上進行的羊和牛腺病毒的比較所顯示的(8)。本發明的病毒的基因組排列顯著不同于所有其它已知的腺病毒。本發明的腺病毒的DNA分子適合于用作病毒載體，當用于獸醫學目的時，該載體能夠表達多種多肽。
發明概述第一方面，本發明涉及分離的DNA分子，它包含編碼基本上如

圖1所示的羊腺病毒(OAV287)基因組的核酸序列，或功能等價核酸序列。優選地，核酸序列編碼基本上如圖1所示的腺病毒的基因組。
在本發明第一方面的更優選的實施方案中，DNA分子包含編碼羊腺病毒(OAV287)的基因組的核酸序列，其中去除或改變了腺病毒基因組中的一部分，該部分是天然腺病毒維持或生存所非必需的。
第二方面，本發明涉及一種DNA分子，它包括至少一個15核酸堿基序列，該序列對示于圖1的羊腺病毒(OAV287)基本上是特異性的。在本發明第二方面的優選實施方案中，至少十五個核酸堿基的序列編碼一個羊腺病毒(OAV287)的功能性元件。優選地，該功能性元件選自啟動子、基因、反向末端重復序列、病毒包裝信號和RNA加工信號。羊腺病毒(OAV287)的反向末端重復序列包含該病毒雙鏈DNA基因組的每條鏈上5，末端的最初46個核酸堿基。
第三方面，本發明涉及一種質粒，它包含本發明第一方面或第二方面的DNA分子。優選地，該質粒包含本發明第一方面的DNA分子，其中編碼腺病毒基因組的核酸序列連接于編碼復制啟始區的核苷酸序列，以及編碼標記物的另一核苷酸序列。優選地，編碼標記物的核酸序列編碼一種抗生素的抗性。更優選地，該抗生素是氨芐青霉素。
在本發明第三方面的其他優選實施方案中，編碼腺病毒反向末端重復序列的序列是相連的。
第四方面，本發明涉及一種病毒載體，它包含本發明第一方面的DNA分子，以及至少一段編碼非腺病毒一種或幾種多肽的核苷酸序列。
優選地，編碼一種或幾種非腺病毒多肽的核苷酸序列是從細菌、病毒、寄生蟲或真核細胞中獲得的。更優選地，非腺病毒多肽是輪病毒(rotavirus)VP7sc抗原，寄生蟲多肽是蛇形毛圓線蟲17kD抗原、羊絳蟲45W抗原或來自銅綠蠅PM95抗原。
本發明也涉及病毒載體，該載體包含本發明第一方面的DNA分子，并且至少一個核酸序列編碼功能性RNA分子。本領域的專業人員都知道，功能性RNA分子可以包括信使RNA分子、反義RNA分子或核酶。
第五方面，本發明涉及向靶細胞傳遞具有編碼一種或幾種非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子的方法，該方法包括用本發明第四方面的病毒載體感染靶細胞，這樣，編碼一種或幾種多肽的DNA分子被表達，并且該一種或幾種多肽由靶細胞產生。
第六方面，本發明涉及向動物傳遞具有編碼一種或幾種非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子的方法，該方法包括給動物施用本發明第四方面的病毒載體，使該病毒載體感染動物的至少一個細胞，并且被感染的細胞表達編碼一種或幾種多肽的DNA分子，同時產生一種或幾種多肽。優選地，動物是食草動物，更優選地，食草動物是綿羊。
本發明也涉及向動物傳遞具有編碼功能性RNA分子的核酸序列的DNA分子的方法，該方法包括給動物施用本發明第四方面的具有編碼功能性RNA分子的核酸序列的病毒載體，使該病毒載體感染動物的至少一個細胞，并且被感染的細胞表達編碼功能性RNA分子的DNA分子，同時產生該功能性RNA分子。
這里所使用的術語“功能等價核酸序列”包括羊腺病毒(OAV287)DNA分子中較小的變化，由于DNA密碼的簡并性，這些變化并不會導致編碼不同病毒多肽的分子的產生。而且，該術語包括這樣的DNA密碼的變化，這些變化會導致所編碼的多肽的改變，但是這些改變基本上不會影響這些病毒多肽的生物活性。
這里使用的術語“功能元件”包括編碼啟動子、基因、反向末端重復序列、病毒包裝信號和RNA加工信號的核酸序列。本領域的專業人員應知道，從羊腺病毒(OAV287)獲得的編碼這些功能元件的特異性序列可能在其它系統(包括質粒和非羊腺病毒載體)中是有用的。
為了使本發明的特征能夠被更清楚地理解，其優選方式將用以下的實施例和附圖描述。
附圖的簡要說明圖1是OAV287基因組的核酸序列，開始于左側ITR的第一堿基。
圖2顯示了用Ad2進行同源檢測得到的OAV287基因的排列。標有問號的區域是嘗試性的確定，因為缺少明顯的同源性。
圖3顯示了OAV287的假定的E1區中的主要開放閱讀框架。星號顯示了可能的啟始密碼子的位置。一個編碼加工過的結構蛋白的以前未識別的基因(p28kD)在互補鏈上被編碼。
圖4顯示了OAV287區域中可能包含E3的開放閱讀框架。但是，因為pVIII和尾絲基因之間的間隙只有197個核苷酸，E3是缺少的。該圖還指出了以后插入ApaI/NotI多聚連接子的位點。
圖5顯示了OAV287的可能的E3區中的主要開放閱讀框架。星號顯示了可能的啟始密碼子的位置。該圖還指出了被末端填充和再連接修飾的SalI位點，以及后來基因組中插入多聚連接子序列的，沒有失去感染性的改變的位點。
圖6描述質粒(pOAV287Cm)的構建，該質粒包含一個在SalI位點插入了pACYC184序列的OAV287基因組的全長克隆。實心區域表示OAV287序列，交叉網格表示的序列來自質粒pUC13或Bluescribe M13+(AMPR)，打點區域表示的序列來自pSELECT(TetR)，空心區表示的序列來自pACYC184(CmR)。該圖只指出了用于質粒構建的關鍵的限制性位點。
圖7顯示了質粒pOAV100、pOAV200、pOAV600和pOAV600S的圖譜。箭頭指示了反向末端重復序列和主要晚期啟動子(MLP)的大致位置。該圖還指示了突變的SalI位點和ApaI/NotI多聚連接子序列插入的位點。光溫育顯示了插入KpnI位點的修飾的Bluescribe基因。線性的、有感染性的基因組(暗溫育)被KpnI切割而除去。
圖8顯示了通過轉染重組質粒pOAV100和pOAV200至CSL503細胞而獲救(rescued)的羊腺病毒OAV100和OAV200的篩選結果。基因組中跨越(A)OAV100中突變的SphI位點和(B)OAV200中ApaI/EcoRV/NotI多聚連接子插入位點的部分用從野生型OAV287中獲得的相應區域進行PCR擴增。擴增產物用SphI(A，泳道3和5)和ApaI、EcoRV、NotI(B，分別為泳道3-5和泳道8-10)切割。(U)指示未被切割的樣品。
圖9顯示用于組裝基因表達盒的質粒pMT的圖譜。包含OAV287主要晚期啟動子和三分(tripartite)引導序列的片段被連接在一起，并且置于插入目的基因所需的多克隆位點的前面。之后是串聯的多聚腺苷酸信號(AATAAA)。
圖10顯示了從相應的感染質粒中獲救的重組病毒的一覽表，以及它們攜帶的基因表達盒。如圖所示，表達盒在OAV基因組中pVIII和尾絲基因之間被插入。
圖11顯示了在通過OAV205和OAV210病毒感染CSL503細胞后，羊絳蟲45W和銅綠蠅PM95抗原分別在這些細胞中的表達(A)和用病毒OAV204感染后，VP7sc在CSL503和牛鼻甲細胞中的表達(B)。(I)感染的細胞，(U)未感染的細胞。(M)指示顯示大小的標記蛋白。
圖12顯示了在用OAV206病毒感染后，VP7sc在(A)CSL503細胞和(B)兔腎和牛鼻甲細胞中的表達。(I)感染的細胞，(U)未感染的細胞。(M)指示顯示大小的標記蛋白。
發明描述方法OAV287的生長和純化1985年從綿羊中分離出的病毒從西澳大利亞大學農業系動物健康實驗室的R.L.Peet處獲得。分離的病毒在綿羊胚胎肺細胞(CSL503)中生長，準備貯存前在固體覆蓋層下進行兩次蝕斑純化。用以前描述過的方法(18，22)從CSL503中純化病毒。用蛋白酶K切割病毒，從中提取DNA。
基因組片段的克隆在下文述及的工作中使用的用于處理、修飾和轉化質粒DNA的分子生物學技術在(9)以及相似的出版物中被描述。OAV287的DNA用包括BamHI、SphI、SmaI和SalI在內的不同的限制性內切酶切割，以推斷這些位點的位置(18)。
腺病毒基因組中有一個蛋白共價結合到線性雙鏈DNA的每個末端(24)。分別約為8kb和4kb的BamHI A和D片段被確定為末端基因組片段，因為它們在瓊脂糖凝膠中的遷移依賴于病毒DNA用蛋白酶K的預消化。大小分別為6.2、5.1、3.4和1.1kb的內部BamHI片段B、C、E和F在瓊脂糖凝膠中被分開，它們被回收并用標準的連接和轉化方法克隆進BamHI切割后的pUC13(9)。為了克隆末端BamHIA和D片段，病毒DNA(10μg)用蛋白酶K(在pH8.0，包含1mM EDTA和0.5％SDS的10mMTris/HCl中有50μg/ml)在65℃消化60分鐘以除去末端蛋白。DNA用苯酚/氯仿提取兩次，用乙醚提取一次，用乙醇沉淀回收。然后3’末端(未知序列)在pH8.0的緩沖液中存在dATP(100μM)的情況下，在37℃用T4 DNA聚合酶(5單位，Toyobo，東京，日本)對核酸外切割15分鐘，該緩沖液中包含Tris Hcl(50mM)、氯化鎂(7mM)、2-巰基乙醇(7mM)和BSA(10μg/ml)。DNA再次用上述苯酚提取和乙醇沉淀的方法純化。為了除去單鏈末端區并形成平末端，該DNA在用苯酚/氯仿提取和用乙醇沉淀之前，用1個單位的綠豆核酸酶(Pharmacia，North Ryde，澳大利亞)在37℃切割10分鐘，緩沖液pH為4.6，其中包含醋酸鈉(30mM)、氯化鈉(50mM)以及氯化鋅(1mM)。最后，DNA用BamHI(Pharmacia)切割，并用低融點瓊脂糖電泳分離片段。BamHI A和D片段在轉化到大腸桿菌JM109之前被切下，用NACS色譜柱(BRL，Gaithersburg，Md)回收，開連接到BamHI/HincII剪切的Bluescribe M13+質粒(Stratagene，La Jolla，Ca)上。確定出帶有所需大小的片段的陽性克隆，將它們進行限制性切割并通過核苷酸測序與從基因組DNA直接得到的部分已經確定的序列比較來確認其正確性。這說明三個3’末端核苷酸在克隆過程中被除去。
OAV287基因組的核苷酸測序OAV287基因組的全序列是通過使用Sanger法(25)和由供應商提供的不同的試劑盒來測定BamHI片段A-F的序列來確定的。嵌套缺失是用雙鏈嵌套缺失試劑盒(Pharmacia)為五個最大的片段構建的。使用標準引物對其測序。在新確定的序列基礎上，用DNA合成儀(AB1，391型)合成其它的核苷酸引物。用這種方法既測定了整個基因組兩條鏈的序列，也測定了片段之間的結合區的序列。
OAV287基因組的誘變為了構建一個全長的OAV287克隆以及隨后對它進行修飾以建立例如pOAV200和pOAV600的質粒的某種突變體。基因組相關的部分被亞克隆進Bluescribe(Stratagene，La Jolla，Ca)或類似的質粒中，它允許單鏈DNA獲救。之后，有可能將雙鏈DNA用于誘變。合成所需的寡聚核苷酸序列，并對它進行磷酸化處理，然后按照Muta-gene Phagemid(Biorad Labs，Ca)或Altered Site II(Promega，Wi)誘變試劑盒的生產廠家的說明，將其用作引物。突變的確定一般是通過使用適當的限制性酶切割的方法或核苷酸測序的方法，或兩種方法同時使用。通過使用適當的單一限制性位點，將含有導入突變的基因組片段亞克隆，以構建更大的質粒，例如pOAV200。
OAV287全長基因組克隆的構建末端BamHI A和D片段(克隆進Bluescribe M13+)分別被誘變修飾，以加入在克隆過程中丟失的核苷酸和KpnI位點。KpnI位點的最后一個堿基在每個基因組反向末端重復序列的5’末端摻入C。這樣產生了質粒pAK和pDK(圖6)。
基因組左側大約21.5kb的序列是從BamHI B和D片段以及大約13kb的SphI A片段構建的。克隆進pUC13的基因組BmHI B片段通過誘變修飾(GCATGC變至GCATCC)在8287位去除了SphI位點，產生pUC13B。修飾的片段通過用BamHI切割釋放出來，并被克隆進pDK，后者已經用BamHI剪切并被去磷酸化。攜帶重組質粒pDBM(圖6)的克隆通過使用跨越BamHI B/D結合區的寡聚核苷酸篩選來確定。將SphI A片段(大約13kb)克隆進pSELECT(Promega)的SphI位點形成pSESPH。該片段在其左側末端附近包含一個在pDBM中常見的SmaI位點。從pDBM中獲得的KpnI/SmaI片段被亞克隆進也已被KpnI/SmaI剪切的pSESPH從而形成pSELLH，這是一種基于pSELECT的，包含了OAV287 DNA左側大約21.5kb序列的質粒。
基因組的右側末端是由包含基因組右側大約8.6kb序列的pAK構建的，并且覆蓋了SphI A片段。pAK被SalI剪切，并被連接到SalI剪切的pACYC184上以形成pACm(圖6)，pACYC184是一個4.24kb的質粒，它包含編碼氯霉素(Cm)抗性基因和DNA復制的啟始點。該質粒用SphI和KpnI剪切以產生摻入pACYC184序列的基因組右側片段。它被連接到由pSELLH制備的大約21.5kb的左側KpnI/SphI片段以產生最終質粒pOAV287Cm(圖6)。該質粒在大腸桿菌體內穩定地復制，因此沒有為進行進一步研究而繁殖病毒以獲得基因組DNA的必要。質粒pOAV287Cm中的重組基因組與野生型病毒基因組的不同在于SphI位點中的單位點突變(8287位堿基)，在SalI位點有pACYC184序列以及在反向末端重復序列中加入GTAC序列。但是，在SalI位點插入pACYC184序列破壞了兩個功能未知的重要的開放閱讀框架。如果其中任何一個基因產物是復制所必需的，那么pOAV287Cm在轉染后就不能生產傳染性的病毒。為了避免這一潛在的問題，pOAV287Cm被進一步修飾。首先，將Bluescribe M13質粒(Stratagene，La Jolla，Ca)用HindIII剪切，然后平末端。再將線性質粒用SmaI剪切，連接平末端并轉化。所得的質粒包含一個氨芐青霉素抗性基因和復制啟始位點，缺少SalI和SphI位點但是保留了單一KpnI位點。該質粒被KpnI剪切并連接到KpnI剪切過的pOAV287Cm上。篩選并培養具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性的質粒。它們中的一個用SalI剪切以釋放pACYC184序列，然后再連接和轉化。所得質粒pOAV100包含插入基因組反向末端重復序列之間的KpnI位點的氨芐青霉素抗性基因和復制啟始位點(圖7)。在氨芐青霉素(200μg/ml)存在的情況下，該質粒在大腸桿菌JM109內穩定復制。為進行轉染研究，生長了大量的質粒。
DNA的轉染和病毒獲救(rescue)為了確定重組的基因組克隆是否有感染性，將pOAV100用KpnI剪切以釋放線性病毒基因組，并使用LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)將DNA轉染進CSL503綿羊胚胎肺細胞。溶液(A)包含質粒DNA(2-10μg)和300ulEMEM(包含HEPES+谷氨酰胺)，但是沒有胎牛血清(FCS)，溶液(B)包含LIPOFECTAMINE(10μl)+300μl EMEM(包含HEPES+谷氨酰胺)，但是沒有FCS，溶液(A)和溶液(B)合并，輕輕混合并在室溫溫育45分鐘。在60mm佩特里培養皿中的亞匯合的CSL503細胞用沒有FCS的3mlEMEM(加HEPES和谷氨酰胺)清洗。沒有FCS的EMEM(加HEPES和谷氨酰胺)(2.4ml)加入溶液A和B的混合液，輕輕混合并加入清洗過的CSL503細胞。細胞在37℃、5％二氧化碳的環境中溫育5小時。溫育介質改成加FCS(10％)的完全EMEM，細胞在37℃、5％二氧化碳的環境中溫育，直到可以觀察到病毒斑或細胞病變為止(7-15天)。
為了確認從轉染pOAV100和pOAV200中獲救的病毒是來自于那些質粒，用PCR擴增野生型OAV287、OAV100和OAV200病毒基因組的一部分。對于OAV100，使用的是在8287-8292位堿基跨越突變的SphI位點區域的引物對。對于OAV200，引物對跨越了pVIII和尾絲基因之間ApaI/NotI多聚連接子的插入位點。在每種情況下，野生型OAV287 DNA作為對照被擴增。從野生型OAV287擴增所得的DNA用SphI剪切，而從OAV100擴增所得DNA的不剪切(圖8A)。同樣地，OAV200 DNA用ApaI、EcoRV和NotI剪切，因為OAV287 DNA不剪切(圖8B)。其它病毒類似地以限制性酶切割表征。
MLP/TLS元件的確定和pMT的構建用如下方法和(17)所描述的方法確定OAV287 TLS元件。存在于OAV287感染的CSL503細胞中的信使RNA利用與IIIa或尾絲基因互補的引物，通過逆轉錄被復制成cDNA。被認為屬于TLS外顯子1的引物于是與用于PCR的每個cDNA引物配對。DNA被成功地擴增、克隆和測序。這樣確定了TLS外顯子2和3(它們分別相當于圖1的8083-8145和8350-8412堿基)以及TLS外顯子1的3’邊界，后者位于圖1的5044堿基。然后使用第二PCR方案以獲得適合于組裝進pMT的MLP和TLS片段。被認為包含有MLP的圖1中核苷酸4861和5023之間的區域通過PCR被擴增，使用了在5’末端加入ApaI序列的高敏感度(plus sense)的引物，以及在5012位堿基的突變點引入NdeI位點的3’低敏感度(minus sense)引物。同樣地，TLS的擴增使用了在5012位堿基引入了NdeI位點的高敏感度引物和一個與堿基8396-8412互補的低敏感度引物，它在PCR產物的3’末端加入了一個HindIII位點。PCR片段分別用ApaI/NdeI和NdeI/HindIII切割，然后將片段克隆進用ApaI/HindIII剪切過的Bluescribe SK+(Stratagene)質粒。所得的質粒用HindIII/NotI切割，一個具有HindIII/NotI末端的合成的寡聚核苷酸和圖9所示的序列被克隆以產生質粒pMT。目的基因于是被克隆進NCS中方便的限制性位點。基因表達盒被作為ApaI/NotI片段亞克隆進pOAV200或獲救成感染性病毒。
細胞的感染和抗原的表達CSL503和其它的細胞如前所述(21)，以20pfu/細胞的感染多重性感染。感染持續24-60小時。然后細胞在無甲硫氨酸的培養基中溫育，該培養基中存在35S-甲硫氨酸以標記新合成的蛋白。使用針對表達蛋白的特殊抗血清的免疫沉淀反應從細胞裂解液中回收目的蛋白(21)。回收的蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，用放射自顯影法檢測或使用PHOPHORIMAGER(Molecular Dynamics)。
結果為了從分子水平上表征基因組，用Sambrook(9)和類似的出版物中描述的方法，將代表整個OAV287基因組的BarnHI限制性片段克隆進不同的質粒并測序。通過使用嵌套缺失突變組以及由新確定的序列合成的寡聚核苷酸引物，對兩條鏈都測序。
29544個核苷酸的病毒序列(圖1)與人的腺病毒序列相比短許多(大約6.5kb)，但是用它們與它們的Ad2同系物的同源性確定了許多編碼結構蛋白的基因(圖2)。但是，很明顯，與所有目前研究的其他腺病毒相比，羊腺病毒基因組顯示了較多的結構和序列上的不同(圖2)，這種不同既存在于編碼結構蛋白的區域，也存在于編碼非結構蛋白的區域。具體地說，(a)初步被確定為形成E1A/B區的閱讀框架主要基于它們在基因組中的位置而被命名。在44.5kD的開放閱讀框架(orf)和其它腺病毒的大TE1B蛋白之間檢測到很有限的同源性。到目前為止還沒有檢測到OAV287的推定的E1A區的同源性；(b)在其它的腺病毒中，E4區通常位于基因組的右側末端。OAV287的E4？區只有在存在蛋白質序列基元HCHC...PGSLQC的基礎上才被初步確定，該基元被發現于這一區域的18.8kD和30.85kD的開放閱讀框架中。相同或非常類似的基元被發現于人的Ad2和Ad4中的E4 34kD蛋白以及鼠的腺病毒；(c)在其它病毒中被限定為E3區的pVIII末端和尾絲起始點的距離只有197個核苷酸(圖4)。E3區的等價區如果在羊腺病毒中存在的話，它可能包括一組存在于互補DNA鏈上從右至左方向的開放閱讀框架，位于基因組的右側末端(圖2和圖5)。但是，這些序列沒有表現出與任何其它腺病毒的可以檢測到的同源性，這些蛋白質的功能不能從這樣的比較中推知；(d)有一個位于E3？和E4？之間的大約1kb的區域，它具有很高的A/T含量(70.2％)(圖1)。由于任何一條DNA鏈上都沒有編碼在長度上大于大約30個氨基酸的開放閱讀框架，因此該區域不太可能編碼任何蛋白質，除非信使RNA是由非常復雜的拼接過程產生的。該區域在任何其它的腺病毒中沒有已知的等價區；(e)其它的不同之處在病毒的結構蛋白中是顯而易見的。OAV287缺少Ad2蛋白的V和XI的同源性。但是，OAV287具有一個編碼p28kD的全新的基因，它位于E1A？區的互補鏈上(圖2和圖3)。這是一個結構蛋白，通過SDS PAGE電泳確定的表觀分子量為28kD，根據N末端測序的數據，它是從一個更大的前體上切下的。沒有發現該蛋白與數據庫中其它蛋白之間有同源性；(f)在其它大多數的基因組中，VA RNA基因位于末端蛋白和52/55k基因之間。在OAV287中，由于閱讀框架的重疊，沒有留給這些基因的空間。
這些不同之處可以用作強調OAV287分離物與其它人和動物的腺病毒相比的獨特的特點。另外，由于OAV287的非結構蛋白區幾乎沒有顯示出與其它腺病毒中等價區之間有同源性，序列對比不能揭示基因組中可能的非必需區域的特性。而且病毒DNA不能很容易地被操縱以檢測非必需的序列。
本發明人已經制備出一種質粒，它包含羊腺病毒基因組的全長感染性拷貝，其中反向末端重復序列與一個產生特異性限制性酶切位點的短序列連接。還制備出一種質粒，它包含羊腺病毒基因組的全長感染性拷貝，并連接到細菌DNA復制啟始位點和一個標記基因上。OAV287基因組DNA的部分克隆被特異性修飾并插入基因組特異性的SalI位點而初始連接到一個基因上，該基因編碼抗生素抗性和復制啟始點(圖6，并參見方法)。這樣的質粒可以在細菌中生長并更容易被操縱。
環形基因組克隆與存在于Ad5感染的細胞中的(10)和可能存在于OAV287感染的細胞中的天然存在的環的不同之處在于，40個堿基的反向末端重復序列由一個GTAC連接子連接。當反向末端重復序列從頭連到尾時，這個序列與基因組的最后一個和第一個核苷酸(分別為G和C，見圖1)一起，形成了一個單一KpnI位點(GGTACC)。因為其它的腺病毒基因組的3’和5’末端的核苷酸分別是G和C，所以其它的具有以G開始并以C結束的識別序列的位點，例如EcoRI，BamHI，SalI，KasI等，如果是單一的，也將是適合的。具有適合的抗生素抗性，例如ampR抗性基因和復制啟始位點的質粒，可以被插入基因組中的特定位點或其它地方以形成可以在細菌體內繁殖的質粒。在存在200μg/ml的氨芐青霉素的條件下在大腸桿菌JM109和DH5α中繁殖的質粒保留了KpnI位點和插入序列，說明OAV287反向末端重復序列用這種方法連接是穩定的。該方法可能因此被用于處理其它的腺病毒基因組。如果需要，可以除去GTAC連接子序列，并且在用KpnI(或另外的適合的酶)切割并與T4 DNA聚合酶溫育以產生平末端來轉染之前，重新生成真正的末端(9)。
從環形質粒生成線性感染性基因組的方法包括用限制性酶KpnI切割包含OAV287基因組的全長拷貝的環形質粒，以產生具有真正的5’核苷酸dCMP的基因組。線性DNA于是用作為轉染試劑的LIPOFECTAMINE導入CSL503細胞。
為了用病毒基因組作為載體，有必要識別出基因組中功能上非必需的區域。這些區域可以被取代或刪除以為外源DNA留出空間(11，12)，或者它們可能作為外源DNA的插入位點。在人的腺病毒基因組中，DNA被取代或插入到E1和E3區(13，14，15)，以及基因組右側最末端的E4和反向末端重復序列之間，通常伴隨非必需區域的刪除以使基因組的包裝變得容易(16)。腺病毒可以將基因組包裝到最大比野生型大～6％，可能是由于外殼結構所決定的物理局限性造成的(11)。
OAV287基因組中非必需位點通過插入包含ApaI和NotI限制性位點的多聚連接子序列來識別。該連接子通過定點誘變，被導入pOAV100中的基因組拷貝中如圖1所示的核苷酸22、139和22、130之間，以生成質粒pOAV200(圖7)。它相當于一個在pVIII和尾絲蛋白的基因之間的位于基因間區域的位點，因為它沒有破壞該區域中的RNA加工信號。L4家族的RNA轉錄終止位點位于上游26個核苷酸中，相應地，三分先導序列和尾絲信使RNA之間的拼接結合區位于插入位點下游144個核苷酸中(17)。將pOAV200轉染到CSL503細胞中導致了病毒OAV200的獲救。多聚連接子插入的第二個位點位于圖1中的26,645至26,646堿基之間。它生成了質粒pOAV600(圖7)。該插入位點相當于富含A/T區(圖2)的右側末端，其功能和確切的界限尚未確知。選擇該位點是因為它是轉錄終止位點左側的六核苷酸，該位點是RNA從E3？區開始自右向左轉錄的終止位點(圖2)。這是通過測定RT-PCR擴增的克隆的cDNA的序列來確定的，該cDNA是使用與pVIII/尾絲區的相同的方法得到的(17)。將pOAV600轉染到CSL503細胞中生產出病毒OAV600。
以上的插入方案確定了基因組的兩個區域，它們可以被打斷并產生亞克隆基因表達盒的位點。
其它的非必需位點是通過使用位于圖1中堿基28644-28649的單一SalI位點來確定的。該位點用SalI切割，末端填充，并被重新連接以破壞跨越該位點的閱讀框架。丟失了該位點的質粒pOAV600S(圖7)是用SalI切割來確定的。當pOAV600S被轉染到CSL503細胞后，回收病毒OAV600S。該病毒中SalI位點的缺失是通過將病毒基因組用SalI切割來確認的。由于該SalI位點落入了兩個重要的開放閱讀框架中(它在互補鏈堿基28457和29014之間以及堿基28511和28699之間)，這兩個開放閱讀框架被末端填充和重連接所破壞，所以從這兩個閱讀框架得到的基因產物可能也是非必需的。這組閱讀框架可能因此構成OAV287的E3區，因為在任何其它的腺病毒中沒有其它的基因產物是體外復制所非必需的。這意味著有可能刪除圖2中被標作E3？的整個區域。另外，在其它的實驗中，圖2中被標作E4？區的一個1kb的NotI片段被刪除。該刪除破壞了該區中的幾個閱讀框架。沒有病毒從該質粒中獲救，這意味著它不是非必需的，也就是說，它可能是E4。
許多病毒在異源的宿主中不完全復制，經常進入細胞但是由于復制循環的阻斷，不能產生成熟的病毒顆粒。在重組病毒載體的角度上，這代表了一種所需的安全特性，這種特性所提供的是在外源基因適當的、有效的表達出現之前，復制不被阻斷。OAV287在異源細胞類型中不能高效復制(18)，目前唯一的例外是在牛鼻甲細胞中，在那里病毒的效價與CSL503細胞相比顯著降低。OAV287的重組形式已經被構建，用于確定報告基因的表達是否受控于適當的啟動子的存在。
外源基因的表達要求這些基因被功能性地連接到啟動子上。該啟動子可能是基因組中固有的病毒啟動子，或者是與目的基因一起亞克隆到適當位點上的外源啟動子。驅動基因表達的啟動子一定要在CSL503細胞，以及一定范圍內的優選的其它細胞類型中起作用。在本發明中，最初使用的是一個OAV287基因組啟動子。后來也使用了異源啟動子。在腺病毒中，結構蛋白的表達是被主晚期啟動子(MLP)所驅動。從MLP獲得的RNA轉錄物家族包含一個共同序列元件，即在5’末端的三分引導序列(TLS)。本發明人通過使用RT-PCR擴增mRNA晚期轉錄物以及測定克隆的cDNA的序列，已經從OAV287基因組中確定出了那些包含TLS的序列(17)，該mRNA轉錄物存在于OAV287感染的細胞中。推測一種候選的MLP正好存在于TLS外子1的左側(圖2)。使用PCR技術將MLP和TLS元件亞克隆進單獨的質粒pMT(圖9)中，并與目的基因相連。這些啟動子/基因盒作為ApaI/NotI片段被亞克隆進pOAV200的多聚連接子ApaI/NotI位點。用這種方案構建質粒pOAV203、pOAV204、pOAV205和pOAV210。這些引入的基因分別編碼來自蛇形毛圓線蟲17kD的可溶蛋白、輪病毒VP7sc基因(19)、來自羊絳蟲的45W抗原(20)和來自銅綠蠅的膜蛋白(PM95)。質粒pOAV202包含17kD的抗原，但缺失MLP/TLS元件。這些質粒被轉染進CSL503細胞，并分別以病毒OAV202、OAV203、OAV204、OAV205和OAV210獲救(圖10)。
人巨細胞病毒的即早期IE94啟動子和增強子的也被連接到輪病毒VP7sc抗原基因上，它們在一定范圍內的人和動物的細胞類中起作用(21)。這個基因盒是用HCMV增強子-啟動子區域取代pMT/VP7sc中的MLP/TLS元件來組裝的。該基因盒被插入pOAV200以構建pOAV206。pOAV206被轉染到CLS503細胞中，病毒OAV206獲救(圖10)。
用上述病毒轉染CLS503和其它細胞，在轉染后不同時刻，細胞用35S-甲硫氨酸標記。目的蛋白通過使用適當的抗血清進行的免疫沉淀反應從細胞的裂解液中回收。回收的蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，并用放射自顯影儀檢測。
當使用OAV202病毒時，用免疫熒光法沒有觀察到蛇形毛圓線蟲17kD的抗原的表達。由于該病毒缺失MLP/TLS元件并只攜帶17kD基因，這一結果表明在pVIII和尾絲基因之間的插入位點的上游或相鄰位置沒有可以驅動基因表達的病毒啟動子。這一情況與使用人的Ad5 E3重組體觀察到的情況形成對比(21)。在這種情況下，插入pVIII基因3’端的無啟動子的基因被表達，可能始自相鄰的E3啟動子或上游的MLP(15，21)。這一結果進一步強調了OAV287基因的獨有性質。攜帶MLP/TLS元件的重組OAV287病毒被檢測出在CLS503細胞中表達。使用OAV204，在轉染后24小時很容易觀察到在轉染的細胞中表達，但沒有在未轉染的細胞中觀察到表達(圖11A)。類似地，當病毒OAV205和OAV210被測試時，分別觀察到24kD的和大約95kD的基因產物(圖11B)。因此很明顯，MLP/TLS元件包含驅動基因在可以自由復制的條件下，在同源細胞系中表達的必要信息。但是，當OAV204用不能在其中有效復制表達的異源的兔腎細胞系檢測時，沒有觀察到VP7sc的表達。雖然比在CLS503細胞中的效價低，在牛鼻甲細胞中有一些復制發生。在后者的細胞中，在用OAV204轉染后檢測到VP7sc的表達(圖11B)。
包含HCMV增強子/啟動子元件的、連接到VP7sc基因上的病毒OAV206被用于檢測異源啟動子在OAV287基因組情況下的功效。在轉染后24-48小時，CLS503細胞用準備表達VP7sc抗原的病毒轉染(圖12A)。使用該病毒，在不能表達的兔腎細胞系和牛鼻甲細胞中也觀察到VP7sc的表達(圖12B)。這些結果表明，為了驅動OAV重組體的基因在不允許表達的細胞中表達，HCMV或相同結構的啟動子可能優于MLP。
一種重組的病毒也被施用到綿羊上。五只綿羊用0.7×108pfu的OAV203在結膜內和鼻內接種。接種后第三天，從一只綿羊的鼻拭標本和兩只綿羊的結膜拭標本中回收病毒，并且通過PCR分析確認重組病毒。動物沒有因為這樣的接種而表現出明顯的不良后果。
本發明的病毒載體可被用于在食草動物中傳遞和表達治療基因。對于一般情況下不感染羊腺病毒的品種，預先存在的免疫力的缺失可能造成有效的感染、基因傳遞和表達。該基因可以編碼疫苗抗原、促進動物產量增加的分子、通過操縱激素應答而改變生產特性的分子以及其它生物活性或治病分子。該病毒在許多非羊細胞中不能高效復制，但是異源啟動子的使用允許基因的傳遞和表達，同時最大限度地降低了病毒傳播到非目標宿主的可能性。由于腺病毒載體的DNA可以在細胞中以非整合的形式存留，通過選擇恰當的啟動子，可以實現長期表達。
參考文獻1.R.B.CouCh等，Am Rev Resp Dis，88，394-403頁(1963)。2.T.Ragot等，自然，361，647-650頁(1993)。3.M.S.Horwitz，《病毒學》，B.N.Fields，D.M.Knipe編著，(拉文出版社，紐約，1990)，1679-1721頁。4.W.S.M.Wold，L.R.Gooding，病毒學，184，1-8頁，(1991)。5.K.S.Raviprakash，A.Grunhaus，M.A.El Kholy，M.S.Horwitz，病毒學雜志，63，5455-5458頁(1989)。6.A.M.Lewis等，病毒學雜志，11，655-664頁(1973)。7.R.L.Peet，W.Coackley，D.A.Purcell，C.W.Robartson，B.M.Micke，AustVet J，60，307-308頁，(1983)。8.M.Benko，A.Bartha，G.Wadell，國際病毒學，29，346-350頁，(1988)。9.J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis編著，《分子克隆實驗室手冊》，(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，1989)。10.F.L.Graham，EMBO雜志，3，2917-2922頁，(1984)。11.F.L.Graham，L.Prevec，《分子生物學方法》，E.J.Murray，J.M.Walker編著，(Humana出版社，Clifton，新澤西，1991)，第7卷，1-19頁。12.F.L.Graham，L.Prevec，《疫苗免疫問題的新進展》，R.W.Ellis編著，(巴特沃斯-海因曼，斯通海姆， Ma，1992)，363-390頁。13.M.Levrero等，基因(Amst)，101，195-202頁，(1991)。14.J.E.Morin等，美國國家科學院院刊，84，4626-4630頁，(1987)。15.G.W.Both等，病毒學，193，940-950頁，(1993)。16.P.K.Chanda等，病毒學，175，535-547頁，(1990)。17.S.V.Vrati，D.B.Boyle，R.Kockerhans，G.W.Both，病毒學，209，出版中，(1995)。18.D.B.Boyle等，獸醫微生物學，41，281-291頁，(1994)。19.M.E.Andrew等，病毒學雜志，64，4776-4783，(1990)。20.K.S.約翰森等，自然338，585-587頁，(1989)。21.Z.Z.Xu，V.Krougliak，L.Prevec，F.L.Graham，G.W.Both，普通病毒學雜志，出版中，(1995)。22.S.H.Larsen，H D.，病毒學，82，182-195頁，(1977)。23.E.Nakano，D.Panicali，E.Paoletti，美國國家科學院院刊，79，1593-1596頁，(1982)。24.D.M.K.Rekosh，W.C.Russell，A.J.D.Bellet，A.J.Robinson，細胞，11，283-295頁，(1977)。25.F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson，美國國家科學院院刊，74，5463-5467頁，(1977)。
本領域的專業人員知道，在沒有背離本發明的宗旨和范圍的情況下，本發明可能有眾多的變異和/或修改，如特定的實施方案所示。因此，這些實施方案在所有方面應被看作是例示性的和非限制性的。
權利要求
1.一種分離的DNA分子，它包含編碼羊腺病毒(OAV287)基因組的，基本上如圖1所示的核苷酸序列，或功能等價的核酸序列。
2.權利要求1中的DNA分子，其中編碼羊腺病毒基因組的核酸序列基本上如圖1所示。
3.一種分離的DNA分子，它包含編碼羊腺病毒(OAV287)基因組的，基本上如圖1所示的核酸序列，其中腺病毒基因組中對天然腺病毒維持或生存非必需的部分被刪除或改變。
4.一種分離的DNA分子，它包含至少15核酸堿基序列，該序列對于圖1所示的羊腺病毒(OAV287)核酸序列基本上是特異性的。
5.權利要求4中的DNA分子，其中至少15核酸堿基序列編碼羊腺病毒(OAV287)的一個功能元件。
6.權利要求5中的DNA分子，其中功能元件選自啟動子、基因、反向末端重復序列、病毒包裝信號和RNA加工信號。
7.權利要求6中的DNA分子，其中功能元件是具有圖1所示的1-46核酸堿基序列的反向末端重復序列。
8.一種包含權利要求1至7中任一權項的DNA分子的質粒。
9.一種包含權利要求1至3中任一權項的DNA分子的質粒，其中編碼腺病毒基因組或其一部分的核酸序列與編碼復制啟始區的核酸序列以及編碼標記物的另一核酸序列相連。
10.權利要求9中的質粒，其中編碼腺病毒反向末端重復序列的核酸序列是連接在一起的。
11.權利要求9或10中的質粒，其中編碼標記物的核酸序列編碼一種抗生素抗性。
12.一種包含DNA分子的病毒載體，所述DNA分子含有基本上如圖1所示的編碼羊腺病毒(OAV287)基因組的核酸序列或功能等價核酸序列或其一部分，以及編碼一種或幾種非腺病毒多肽的至少一個核酸序列。
13.權利要求12中的病毒載體，其中編碼腺病毒基因組的核酸序列基本上如圖1所示。
14.一種包含DNA分子的病毒載體，所述DNA分子含有基本上如圖1所示的編碼羊腺病毒(0AV287)基因組的核酸序列，以及編碼一種或幾種非腺病毒多肽的至少一個核酸序列，所述腺病毒基因組中對天然腺病毒維持或生存非必需的部分被刪除或改變。
15.權利要求12至14中任一權項的病毒載體，其中編碼一種或幾種多肽的核酸序列編碼從細菌、病毒、寄生蟲或真核細胞中獲得的一種或幾種多肽。
16.權利要求15中的病毒載體，其中非腺病毒多肽是輪病毒VP7sc抗原，寄生蟲多肽是蛇形毛圓線蟲17kD抗原、羊絳蟲45W抗原或來自銅綠蠅的PM95抗原。
17.一種將具有編碼一種或幾種非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子傳遞給靶細胞的方法，該方法包括用權利要求12至16中任一權項的病毒載體感染靶細胞，使編碼這一種或幾種多肽的DNA分子表達，從而使靶細胞生產這一種或幾種多肽。
18.一種將具有編碼一種或幾種非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子傳遞給動物的方法，該方法包括向動物施用權利要求12至16中任一權項的病毒載體，該病毒載體感染動物的至少一個細胞，被感染的細胞表達編碼所述一種或幾種多肽的DNA分子，并生產該一種或幾種多肽。
19.權利要求18中的方法，其中動物是食草動物。
20.權利要求19中的方法，其中食草動物是綿羊。
21.一種包含DNA分子的病毒載體，所述DNA分子含有基本上如圖1所示的編碼羊腺病毒(OAV287)基因組的核酸序列或功能等價的核酸序列或其一部分，以及編碼功能性RNA分子的至少一個核酸序列。
22.權利要求21中的病毒載體，其中功能性RNA分子是反義RNA分子或核酶。
23.一種將具有編碼功能性RNA分子的核酸序列的DNA分子傳遞給動物的方法，該方法包括向動物施用權利要求21或22中的病毒載體，該病毒載體感染動物的至少一個細胞，被感染的細胞表達編碼功能性RNA分子的DNA分子，并生產該RNA分子。
全文摘要
本發明涉及一種分離的DNA分子，它包含羊腺病毒OVA287的基因組、功能等價DNA分子或其部分。本發明還涉及包含該DNA分子的質粒和病毒載體。本發明還涉及編碼一種或幾種多肽的非腺病毒DNA分子向動物，特別是食草動物的傳遞方法。
文檔編號C12N7/01GK1161715SQ95195268
公開日1997年10月8日 申請日期1995年7月26日 優先權日1994年7月26日
發明者G·W·布思, D·B·博伊爾, S·弗拉提 申請人:聯邦科學及工業研究組織