干細胞因子和可溶性白介素－6受體在血細胞生成多能性細胞體外擴增中的應用的制作方法

專利名稱：干細胞因子和可溶性白介素－6受體在血細胞生成多能性細胞體外擴增中的應用的制作方法
本申請是1994年11月16日提交的美國專利申請，序列號08/340559的部分繼續。發明背景本發明涉及白介素-6，可溶性白介素-6受體和干細胞因子在細胞擴增中的組合應用。具體地說，本發明涉及血細胞生成祖細胞/干細胞體外擴增中這些因子的組合應用。發明領域白介素-6(IL-6)的受體系統包括兩個功能上不同的鏈一個配體結合鏈(IL-6R)和一個非配體結合但傳導信號的鏈(gp130)。gp130鏈與IL-6R/IL-6復合物相連，導致高親和性IL-6結合位點和信號傳導(1-4)的形成。已證明一種細胞外的，可溶性形式的白介素-6受體(sIL-6R)可通過膜錨定的gp130介導IL-6信號傳導。sIL-6R和IL-6的復合物(sIL-6R/IL-6)可與在IL-6R陰性和IL-6R陽性細胞上都表達的gp130相連。該連接引起gp130的同源二聚體化和JAK-STAT通路的活化從而導致細胞應答(4-8)。
已表明IL-6可與IL-3和干細胞因子(SCF)一起協同作用增強人血細胞生成祖細胞的擴增并支持休眠小鼠血細胞生成祖細胞的集落形成(9-11)。但是對gp130信號通路在人血細胞生成中的作用卻知之甚少。
最近由于各種臨床應用的需要而對血細胞生成祖細胞的體外擴增極感興趣，這些臨床應用包括基因治療，骨髓移植(BMT)的增強作用以及BMT的替換等。盡管還有以前應用各種細胞因子或基底細胞的組合擴增細胞數目的報道，祖細胞，特別是多能祖細胞所達到的擴增程度仍是相當低的。這表明原始細胞的分化和耗盡發生在擴增培養中(12-15)。最近的研究證明IL-6和sIL-6R的組合通過gp130信號過程的活化而支持多能胚胎干(ES)細胞的自我更新(16)。
IL-6的純化，克隆和應用是已知的(EP220574,1987年5月6日公開；Revel等；WO88/00206,1988年1月14日公開，Clark等.)。對sIL-6R純化和克隆，以及它與IL-6在例如細菌感染，燒傷和創傷等疾病中的組合應用也已有報道(EP413908,1991年2月27日公開，Novick等；JP 89271865；Yamasaki等，科學，241:825-828,1988)。SCF是一種早期作用血細胞生成因子。對SCF的純化，克隆和應用已有報道(參見PCTWO91/05795，題目為“干細胞因子”)。SCF的應用已被描述為可增強骨髓的移植作用和骨髓恢復以及對白細胞減少癥和血小板減少癥的治療。還描述了IL-6與SCF的組合應用，但以前未有SCF,IL-6和sIL-6R在血細胞生成祖細胞的擴增中的組合應用的報道。
發明概述本發明證明了可溶性IL-6受體(sIL-6R)和IL-6與干細胞因子(SCF)一起的組合可支持人血細胞生成多能性細胞的體外擴增。當單獨與SCF組合時，sIL-6R或IL-6二者都不能有這種作用。
多能性細胞可從臍帶血，外周血或骨髓獲得。多能造血細胞包括通過CD34篩選得到的祖細胞和/或干細胞或通過去除可增殖的細胞而功能性選擇的干細胞。
細胞因子可以以試劑盒的形式提供，其中試劑盒包括不同細胞因子的獨立的容器，或一種或多種細胞因子可以以裝在單一的容器中的混合物的形式提供。
另外，該細胞因子的組合可在缺乏促紅細胞生成素(EPO)時可支持來自純化的人血細胞生成干細胞的紅細胞樣細胞的增殖，分化和終端成熟。當與SCF單獨組合時，sIL-6R和IL-6二者在缺乏促紅細胞生成素時都沒有這種作用。
研究證明sIL-6R,IL-6和SCF組合的方法可從血細胞生成干細胞(如CD 34+細胞)產生紅細胞樣細胞。細胞因子的效應在無血清培養中也已得到了確證。sIL-6R,IL-6和SCF的組合在甲基纖維素培養中從CD34+細胞形成了含大量成熟紅細胞樣細胞的一定數目的紅細胞樣細胞簇和紅細胞樣集落。向培養物中加入抗gp130單克隆抗體完全阻止了紅細胞樣細胞的產生，其中加入抗促紅細胞生成素抗體不能影響從CD34+細胞產生紅細胞樣細胞。
該結果證明在缺乏促紅細胞生成素時，可從血細胞生成祖細胞產生成熟的紅細胞樣細胞。綜合前述的人血清含可檢測水平的sIL-6R,IL-6和SCF的報道(26-28)，很可能正常紅細胞生成在生理上是由兩個不同的通路調控的一種為促紅細胞生成素介導的信號通路和一種新的SCF信號通路結合gp130的機制。
附圖簡述

圖1示在指定的因子組合下培養的多能性細胞集落形成的結果。
圖2示IL-6存在(○)或不存在(●)下不同sIL-6R濃度下祖細胞的擴增，以及在sIL-6R的存在(○)或不存在時(●)不同IL-6濃度下祖細胞的擴增。
圖3示在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實心棒)補加鑒定的因子或因子組合的祖先細胞的擴增。
圖4示在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實心棒)時在SCF的存在下補加有各種因子組合時含血清和無血清培養物中祖細胞的擴增。
圖5示不同濃度的抗人gp130單克隆抗體(A)和抗人IL-6R單克隆抗體(B)對總的祖細胞(○)和CFU-Mix(●)擴增的影響。
圖6示在IL-6和SCF存在下不同量的sIL-6R的作用。
圖7示在sIL-6R和SCF存在時不同量的IL-6的作用。
圖8示SCF，IL-6/SCF和sIL-6R/IL-6/SCF在無血清和有血清培養中的作用。
圖9示產生的紅細胞樣細胞的特征。
圖10示在第7,14和21天培養時由不同的因子組合產生的總細胞數，成紅細胞和紅細胞數。IL-3是白介素-3,G-CSF是粒細胞集落刺激因子，和GM-CSF是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。
圖11示抗gp130MAbs(μg/ml)對加入了sIL-6R/IL-6/SCF或EPO/SCF組合的懸浮培養物的作用。
圖13示抗EPO抗體(μg/ml)對加入EPO,EPO/SCF或sIL-6R/IL-6/SCF組合的懸浮培養物的作用。
發明詳述本發明來自對gp130信號通路的潛在作用的觀察結果，該通路可在人血細胞生成干/祖細胞中啟動sIL-6R和IL-6的復合物的活性。本文的結果表明包含sIL-6R和IL-6的gp130信號通路，可在SCF的存在下，極大的刺激人原始血細胞生成祖細胞的體外擴增。
gp130,IL-6信號轉導受體組分，與IL-6配體和IL-6受體(IL-6R)和復合物組合并轉導信號。為了檢測gp130信號通路在血細胞生成祖細胞擴增中的作用，而測定了重組可溶性人IL-6受體(sIL-6R)和/或IL-6與各種細胞因子的組合對CD 34+細胞的作用。
發現在干細胞因子(SCF)的存在下，sIL-6R和IL-6的組合(sIL-6R/IL-6)極大地刺激了血細胞生成祖細胞/干細胞以及CD34+細胞的擴增。sIL-6R和SCF的組合或IL-6和SCF的組合二者都沒有這種結果。在加入sIL-6R/IL-6/SCF之后懸浮培養發生了明顯的多能血細胞生成祖細胞的產生達三周之久。在添加了組合的細胞因子的含血清和無血清培養中都觀察到了有效的集落的形成，特別是多系(multilineage)和未成熟(blast)細胞的形成。最初的血細胞生成祖/干細胞可從任何適應的細胞來源獲得，其中包括胎兒，胎盤，臍帶血，外周血或骨髓。這些多能血細胞生成細胞包括通過CD34+篩選得到的祖和/或干細胞。可任選地，多能血細胞生成細胞可以是通過去除可增殖的細胞而功能性選擇或分離的細胞(Berardi等.,科學，267:104-108,1995)。
本發明證明兩種信號通路，分別由sIL-6R/IL-6和SCF啟始的gp130信號通路和c-Kit信號通路協同增強人血細胞生成祖細胞的體外擴增。已有報道sIL-6R在IL-6的存在下在一些例如BAF-ml30細胞，gp130cDNA-轉染細胞和小鼠破骨細胞中加強激動劑效果(6-8,25)。但是本發現證明在SCF的存在下sIL-6R/IL-6對人原始血細胞生成祖細胞是有效的刺激劑。以前的對體外擴增的報道沒能證明sIL-6R/IL-6/SCF組合對人原始血細胞生成祖細胞的刺激的激動人心的協同效應。
血細胞生成祖細胞的體外擴增對于制備適于包括基因治療和細胞替換的潛在的臨床應用的血細胞生成細胞來說是一個有吸引力的方法。已有報道各種細胞因子的組合可用于祖細胞的擴增(12-15)。一般是將SCF,IL-3和IL-6做為對原始血細胞生成細胞具有最大作用的細胞因子的，并且已將這些因子的組合廣泛地用做血細胞生成祖細胞擴增的基本的和有效地細胞因子序列。但是本發明證明，對原始祖細胞包括CFU-Mix或CFU-Blast的擴增速率來說，sIL-6R,IL-6和SCF的組合(sIL-6R/IL-6/SCF)是優良的(Superior)。
已前的研究是在IL-3,IL-6和SCF與其它一些細胞因子如G-CSF,GM-CSF,IL-1或EPO組合的存在為基礎，培養來自外周血的CD34+細胞。這類研究表明該組合可用于在含血清的懸浮培養物中產生祖細胞(12,13)。盡管以前的與IL-3的組合使CFU-GM大約增加了60倍，但是CFU-Mix沒有擴增且在培養的第14天時，CFU-Mix或BFU-E都未檢測到。這樣的發現表明在這些培養中相對晚期的祖細胞優先擴增。相反地，應用本發明，可在懸浮培養中對多能血細胞生成祖細胞進行有效擴增以及在甲基纖維素培養中大量形成Mix和Blast集落，這表明sIL-6R/IL-6刺激了較早期的原始血細胞生成細胞或甚至是多能干細胞。
向上面的培養物中加入抗gp130單克隆抗體(mAb)或抗IL-6RmAb發現可劑量依賴性抑制懸浮培養中祖細胞的擴增。抗體還完全阻斷了甲基纖維素培養中多系集落的形成。該發現清楚地證明了所觀察到的sIL-6R/IL-6的效應是通過IL-6結合的sIL-6R分子與靶細胞上膜錨定的gp130的相互作用而實現的。
最近的研究表明gp130在細胞上廣泛表達，并且ES細胞通過sIL-6R/IL-6復合物不需要LIF即可維持自我更新(6,16,18)。但形成是不完整的，因為細胞因子受體通常在人CD34+血細胞生成干/祖細胞上表達。當然，SCF地c-Kit受體是存在的，在我們的研究之中，通過免疫染色發現gp130出現在所有的CD34+細胞上，而IL-6R只存在于一小部分CD34+細胞群體上。在IL-6R陽性細胞中sIL-6R/IL-6復合物可增強IL-6信號并且，更重要的是，可通過gp130在通常對IL-6不應答的IL-6R陰性細胞中介導信號。如本研究所揭示的，由于sIL-6R/IL-6只有在SCF的存在下才起作用，gp130和c-Kit在祖細胞上的共表達和對這些信號的共活化導致有潛在臨床應用的血細胞生成祖細胞的大量增殖。
實施例實施例1sIL-6R,IL-6和SCF對甲基纖維素培養中CD34+細胞的集落形成的影響。材料方法細胞制備人臍帶血是在正常的，成熟分娩(full-term)中獲得的并根據常規程序收集。在用Silica((IBL,Fujioka,Japan)去除巨噬細胞通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離單核細胞(MNC)。用攜帶抗CD34抗體的磁性珠(DynabeadsM-450CD34；Dynal,Oslo,Norway)與CD34+細胞結合從MNC中純化CD34+細胞，用Dynal Magnetic Particle Concentrator從MNC中分離細胞，以及用DETACHa Bead CD34(Dynal)從珠子中分離所選擇的細胞。根據生產商的說明進行篩選和分離操作。FACS分析確認所分離細胞的85～95％是CD 34陽性的(Ortho Diagnostics Systems,Westwood,MA)。
受體和細胞因子。
如前所述，重組人IL-6和sIL-6R的克隆，表達和純化已被很好的特征描述(17,18)。人SCF(Amgen；Thousand Oaks,CA)，人IL-3，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和促紅細胞生成素(EPO)(Kirin Brewery Co.Ltd.；Tokyo,Japan)，和人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(Chugai Pharmaceutical Co.；Tokyo,Japan)被用于評價各種細胞因子組合對細胞的作用。所有的細胞因子都是純的重組分子并使用其可在人血細胞生成細胞的甲基纖維素培養中的最優應答的濃度。其濃度是SCF 100ng/ml,IL-3200U/ml,EPO 2U/ml，和G-CSF和GM-CSF 10ng/ml。
懸浮培養應用已知技術將純化的CD34+細胞培養在懸浮培養物中(21,22)。培養混合物包含2000CD34+細胞，α-培養基(ICN FlowiICN BIOMEDICALS,Inc.,Costa Mesa,CA)，20％胎牛血清(FBS；Hy Clone,UT)，1％結晶的和去離子化的級分V牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和不同的細胞因子的組合。在37℃在充滿5％CO2,5％O2和90％N2的飽和濕度的空氣中將1ml培養混合物培養在24孔組織培養板的每個孔中(Nunc,Kamstrup,Denmark)。無血清懸浮培養物由2％純化BSA(Sigma),10μg/ml胰島素，200μg/ml轉鐵蛋白(Sigma),10-5M巰基乙醇(Eastman)和40μg/ml低密度脂蛋白(Sigma)代替了FBS和BSA(22)。
每隔一周，去掉一半培養體積減少培養物，然后用重新配制的含同樣的細胞因子組合的培養基替代。洗滌并計數所收集的培養基中的細胞(12-15)。通過在克隆甲基纖維素測試中進一步培養一部分擴增細胞而對在每個時間點上培養物中產生的血細胞生成祖細胞總數進行了評測。對實施例3的阻斷研究，在培養的最開始時加入了抗gp130mAb或抗IL-6RmAb。
克隆培養將在懸浮培養中的接種的CD34+細胞和其后代以對CD34+細胞500細胞/ml和對培養的細胞2×103～10×103細胞/ml的濃度在甲基纖維素培養中平行培養三份(23)。培養混合物含細胞，α-培養基，0.9％甲基纖維素(Shinetsu.Chemical.CO.,Tokyo,Japan)，30％FBS,1％BSA,5×105M硫基乙醇和各含或不含sIL-6R的細胞因子組合。將1ml含細胞的培養混合物接種在每個35mm Lux標準的非組織培養皿中并在充有5％CO2的飽和濕度的空氣中在37℃下培養。除了用1％純BSA,300μg/ml人轉鐵蛋白，160μg/ml刀豆卵磷脂(Sigma)和96μg/ml膽固醇(NacalaiTesque Inc.,Kyoto,Japan)代替BSA和FBS之外，無血清甲基纖維素培養物含與管血清的培養相同樣的成份(11)。
SCF,IL-3,IL-6,EPO和G-CSF的組合被用于確定在懸浮培養的各個時間點上產生的各種祖細胞。根據已知的標準，所有培養都平行進行三份并在第14天時收獲(10,11,23)。
結果圖Ⅰ示在所示因子組合存在下，來自培養的多能性細胞的結果。在第14天獲取集落。集落數是三次平行培養的平均值±標準誤。(用于克隆類型的縮寫如下GM，粒細胞-巨噬細胞集落；Meg，巨核細胞集落；B，紅細胞樣細胞簇；Blast，未成熟細胞集落；Mix，混合血細胞生成集落；和GEMM，粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落)。將每種細胞因子與1280ng/mlSIL-6R,50ng/mlIL-6和/或100ng/mlSCF組合使用。
在含血清的培養中，sIL-6R,IL-6,sIL-6R/IL6或SCF單用僅誘導小數目的集落。與IL-6或SCF單獨添加相比，IL-6和SCF的組合增強GM和Blast集落的形成。在所觀察到的添加sIL-6R,IL-6和SCF的培養中最大的集落的產生達到接種率的50％。向IL-6和SCF組合中添加sIL-6R使總集落形成數目增加了4.2倍。sIL-6R/IL-6/SCF誘導的集落數目比用IL-3大11.3倍，比用GM-CSF大5.2倍，比用G-CSF大5.4倍。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培養中除了一定數目的Meg集落和紅細胞樣細胞簇之外，還形成了相當數目的大尺寸的Blast集落和Mix集落，其中主要是GEMM。多于60％的sIL-6R/IL-6/SCF誘導的集落是GEMM和Blast集落，其中IL-3,GM-CSF和G-CSF誘導的集落是GM集落。
為了排除FBS中一些未知因子的可能影響，還進行了無血清培養。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培養中再次看到很明顯的集落形成。向IL-6和SCF的組合中加入sIL-6R使總集落數增加了17.5倍。除了Meg集落和紅細胞樣細胞簇(erythroid burst)之外，該組合還刺激了大量的Mix和Blast集落的形成。在其它因子組合時，沒有集落或僅有很少GM集落形成。
如圖Ⅰ所示當sIL-6R/IL-6與其它因子一起被組合測試時，在有血清培養中觀察到了sIL-6R/IL-6和IL-3,GM-CSF或G-CSF之間輕微的協同作用。但在無血清培養時，未發現sIL-6R/IL-6和這些因子之間的協同作用。該結果提示sIL-6R/IL-6與SCF特異地協同刺激CD34+祖細胞的增殖。
實施例2sIL-6R,IL-6和SCF對懸浮培養中血細胞生成多能性細胞的作用。
在各種濃度的sIL-6R與SCF單用或IL-6/SCF組合進行組合之下，對CD34+細胞在含血清的懸浮培養中進行了研究。在培養14天之后對來源于培養物的祖細胞進行了評測。圖2示應用sIL-6R/IL-6/SCF組合時2000含840個祖細胞(SCF10ng/ml)CD34+細胞在含血清的懸浮培養中培養14天后，祖細胞擴增結果。圖2A示在IL-6(50ng/ml)存在(○)或不存在(●)時不同濃度下的sIL-6R下祖細胞的增加。圖2B示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存在(●)下不同濃度的IL-6時祖細胞的增加。如圖1A所表明的，對應于sIL-6R的濃度總的祖細胞急劇增加。當應用低至80ng/ml的濃度的sIL-6R時，仍可檢測得到這種增加。當應用1280ng/ml濃度的sIL-6R時，這種增加達到大約70倍的平臺。
但當缺乏IL-6時，sIL-6R不能擴增全部祖細胞。看來祖細胞的最佳擴增依賴于IL-6的濃度。當在sIL-6R的存在下使用大于50ng/ml的IL-6濃度時，得到了祖細胞的最大擴增(增加63倍)(圖2B)。相反地，在缺乏sIL-6R時，使用甚至當IL-6的濃度大于50ng/ml時的IL-6與SCF的組合；也僅有大約10倍的祖細胞的增加。這些結果證明sIL-6R只有在與IL-6組合時，才是功能性的并能在CD34+細胞中轉導增殖信號。這些結果還表明1280μg/mlsIL-6R和50ng/mlIL-6在含有SCF的懸浮培養中是祖細胞擴增的最佳濃度。
為了更詳細地檢測sIL-6R/IL-6對血細胞生成祖細胞擴增的作用，而進行了三個星期的含血清和無血清的懸浮培養(與其它因子組合添加有sIL-6R和IL-6)，其中每周分析一次祖細胞的擴增。在添加了單因子或因子組合的懸浮培養在第7天(空白棒)，第14天(斜線棒)和第21天(實心棒)時從含684祖細胞的2000CD34+細胞的總的祖細胞的產生的結果。數據來自單一的一次實驗。在另外4個實驗中也得到了類似的結果。
在只添加了IL-6或sIL-6R的培養中，祖細胞的數目慢慢減少，且在第14天或21天時已基本檢測不到祖細胞。sIL-6R/IL-6或SCF單用對祖細胞的擴增都沒有顯著的效果。在添加了SCF和IL-6的細胞中在第7天，14天，21天時祖細胞總數分別增加了8.5倍，14倍，和12倍。相反地，sIL-6R,IL-6和SCF的組合極大地增加了祖細胞的擴增。動力學研究表明祖細胞總數的增加直到第14天，接著減少直到第21天。當與預擴增(Pre-expansion)值相比較時，在第7,14，和21天時祖細胞的總的增加分別是44倍，61倍和33倍。FACS分析觀察到第14天總的CD34+細胞大約增加了80倍。
對甲基纖維素測試中不同亞型的擴增的祖細胞的每周的分析表明，在sIL-6R,IL-6和SCF的存在下，所有類型的祖細胞包括GM集落形成單位(CFU-GM)、紅細胞樣細胞簇形成單位(BFU-E),CFU-Blast和CFU-Mix在三周的培養中持續不斷的產生，盡管在其它因子的組合時很難檢測得到Mix集落。CFU-Mix在第7天和14天分別大約增加了60倍和80倍。有趣的是，在sIL-6R,IL-6和SCF的存在下在無血清懸浮培養的第21天仍獲得了相當數目的CFU-Mix，增加了40倍。
這些結果揭示sIL-6R/IL-6與SCF在血細胞生成祖細胞的擴增中協同作用。在后面的實驗中，測試了在SCF的存在下，sIL-6R/IL-6與其它包括IL-3和G-CSF的早期作用細胞因子的組合。
本研究還將sIL-6R,IL-6和SCF的組合與以前用做擴增標準的研究的IL-3,IL-6和SCF組合進行了對比。應用sIL-6R/IL-6/SCF的總的祖細胞的擴增是應用IL-3,IL-6,SCF組合的擴增的1.5倍。
圖4描述了在含血清和無血清兩種培養中不同細胞因子組合的CFUMix的產生。最初的培養混合物中包括包含786祖細胞和188CFU-Mix的2000CD34+細胞。在第7天(空心棒)，第14天(斜線棒)，第21天(實心棒)在SCF的存在下向培養物中添加不同的因子組合。數據示一次實驗的結果。在另兩個實驗中得到了類似的數據。
sIL-6R,IL-6和SCF組合使CFU-Mix在含血清的培養中，在第7天，14天分別大約增加了60倍和80倍，而在無血清培養中分別使其在第7,14天增加了大約49倍和68倍。由IL-3,IL-6和SCF組合產生的祖細胞主要是粒細胞和/或巨噬細胞系，而CFU-Mix在有血清培養中的第14天只擴增了約30倍，而在無血清培養的第14天只擴增了約10倍。向sIL-6R,IL-6和SCF的組合中加入IL-3不增加CFU-Mix的擴增。奇怪地是，向組合中加入G-CSF看來對擴增有負影響。這些結果證明sIL-6R,IL-6和SCF的組合是一個有新的擴增組合，特別是對原始祖細胞的擴增。
實施例3抗gp130mAb和抗IL-6RmAb對多能性細胞擴增的影響。
為了證明了gp130參與了sIL-6R/IL-6復合物介導的血細胞生成祖細胞擴增，而測評了小鼠抗人gp130mAb和抗人sIL-6RmAb對祖細胞擴增的作用。
抗體的制備抗人gp130單克隆抗體(例如GPX7,GPX22和GPZ35)的制備是已知的(2,19)。這三個抗體識別gp130受體上不同的表位并且是已知可通過抑制IL-6誘導的gp130與IL-6受體的連接而抑制IL-6介導的生物反應。還制備了抗人IL-6RmAb(PM1)(20)。已知PMl可通過抑制IL-6R與IL-6的結合而抑制IL-6介導的生物反應。
已發現在含血清的懸浮培養中加入抗gp130mAbs可劑量依賴性地抑制總的祖細胞的擴增。圖5示當向培養物中加入不同濃度的抗人gp130mAb(A)和抗人IL-6R mAb(B)時，在含sIL-6R,IL-6和SCF的培養中所得到的總祖細胞(○)和CFU-Mix(●)的擴增，以及在含IL-3和SCF的組合(△)時總祖細胞數。將不含mAb的培養做為對照實驗。數據示在每個用mAb處理的培養中產生的祖細胞數時對照中產生的祖細胞數的比例，并以對照的百分數(％)表示。
在1μg/ml的抗gp130mAb濃度時，CFU-MTX的擴增被完全阻斷了，其中看來mAb對IL-3和SCF組合洗導的擴增有很少或無影響。向培養物中加入抗IL-6RmAb引起同樣的抑制表現，除了較低的效率之外，在所觀察的10μg/ml(圖5B)的濃度完全取消了CFU-Mix的擴增。抗IL-6R抗體還對IL-3和SCF組合的刺激的擴增無影響。相反地，抗EPO抗體抑制了SCF和EPO誘導的擴增，但對IL-6R,IL-6和SCF誘導的擴增無影響(數據未示出)。在無血清的懸浮培養和甲基纖維素培養中獲得了同樣的結果。
紅細胞樣細胞的生產研究還進一步對gp130信號通路對人造血生祖細胞紅細胞樣細胞的產生的影響進行檢測。正常人血細胞生成祖/干細胞是從臍帶血單核細胞分離的并在IL-6和SCF以及各種濃度的sIL-6R的一起存在下培養。發現總細胞數以劑量依賴的方式增加。這種增加在sIL-6R的濃度低至80ng/ml時即可檢測得到并在1280ng/ml時出現平臺。圖6示在IL-6和SCF的存在下應用各種量的sIL-6R的一次實驗的結果。
總細胞數的分析表明，在sIL-6R的濃度超過1280ng/ml時，在培養的第7,14，和21天總細胞數分別增加了30倍，650倍和900倍。但在缺乏IL-6時，sIL-6R不能使總細胞數增加。這些結果清楚地表明只有在與IL-6組合時，sIL-6R才是有功能的并能在CD34+細胞中轉導增殖信號。
IL-6的劑量反應研究也表明總細胞數劑量依賴性地增加。在1280ng/mlsIL-6R的存在下應用50-100ng/ml濃度的IL-6得到了最大的細胞數(圖7)。但在缺少sIL-6R時，IL-6只產生小的細胞數目的增加，甚至其用量大于50ng/ml時也是如此。這些結果提示在帶有SCF的含血清的培養中，1280ng/ml的sIL-6R和50ng/ml的IL-6對來自純化干細胞的總細胞的擴增來說可能是一個有效的組合。當使用純化自人骨髓的CD34+細胞時，也觀察了sIL-6R,IL-6和SCF組合時總細胞數的擴增(未示出數據)。
有可能在含血清的培養中所觀察的到的sIL-6R/IL-6組合的作用是由于其與污染胎中血清(FBS)的未知因子結合作用的結果，而只僅僅是sIL-6R/IL-6/SCF單獨組分的結果。為了排除這種可能性，對無血清懸浮培養的CD34+臍帶血細胞進行了研究。令人奇怪地是當與有血清培養相比較時，觀察到了sIL-6R,IL-6和SCF之間比含血清時更大的協同作用(圖8)。用sIL-6R,IL-6和SCF的組合的無血清培養使總細胞數在第7,14和21天時分別增加了38倍，530倍和2200倍。已證明SCF采用，或其與IL-6組合應用培養細胞甚至到第21天時也只擴增2.2或7.5倍。這些結果清楚地排除了未知因子的可能影響并證明了在SCF的存在下，sIL-6R確實誘導了血細胞生成干細胞的擴增。
對擴增細胞的細胞離心制品進行了各種細胞化學和免疫化學染色。這些細胞的分化細胞計數表明主要存在的是未成熟細胞，例如CD34+臍帶血細胞培養7天時結果(圖9a)。有意思的是，當應用sIL-6R,IL-6和SCF組合時，在培養的第14天，在含血清和無血清的懸浮培養中都觀察到了一定數目的紅血母細胞。通過聯苯胺染色和應用抗血型糖蛋白A(圖9b)和血紅蛋白a(圖9c)的免疫染色對紅細胞樣細胞的特征進行了確定。一些紅細胞樣細胞分化到了幼紅細胞和有核紅(ennucleated)細胞階段。在培養的第21天，大多數紅細胞樣細胞分化到了幼紅細胞階段，并且觀察到了許多有核紅細胞。
通過對細胞離心甩片上血型糖蛋白A陽性細胞出現率和總細胞數的計算而得到了紅細胞樣細胞的絕對數目。在圖10中出示了對加入了不同的細胞因子組合的無血清培養中紅細胞樣細胞的絕對數目的每周的分析結果。
sIL-6R,IL-6和SCF組合不僅與其它組合相比顯著地刺激了總細胞數的產生，而且刺激了紅細胞樣細胞的產生。在培養2周之后，該組合產生的大約79％的細胞是紅細胞樣細胞(即E-未成熟細胞和紅細胞)。在培養3周之后，該組合產生的大約69％的細胞是紅細胞樣細胞。在含sIL-6R和IL-6與IL-3或GM-CSF的組合的培養中觀察到了小數目的紅細胞樣細胞，這提示gp130信號傳導在紅細胞樣細胞體外產生中起了作用。
除了這些包含促紅細胞生成素的組合之外，在加入了其它組合的培養物中檢測不到紅細胞樣細胞。與促紅細胞生成素單用相比，sIL-6R,IL-6和SCF所產生的紅細胞樣細胞在培養的第14天大約是它的5倍，在培養的第21天時大約是它的115倍(圖10)。與促紅細胞生成素，sIL-6R和IL-6的組合相比，sIL-6R/IL-6/SCF組合所生產的紅細胞樣細胞總數是在培養的第14天時它的大約4.1倍，而在培養的第21天時是大約38.3倍。在CD34+骨髓細胞的含血清和無血清培養中部觀察到了sIL-6R/IL-6/SCF組合對紅細胞樣細胞產生的作用(數據未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的組合的懸浮培養中，大量紅細胞樣細胞的產生可能來自于CD34+骨髓細胞的含血清和無血清培養中部觀察到了sIL-6R/IL-6/SCF組合對紅細胞樣細胞產生的作用(數據未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的組合的懸浮培養中，大量紅細胞樣細胞的產生可能來自于CD34+細胞群體中未成熟紅細胞樣祖細胞的增殖，分化和成熟。為了確證這種可能性，而對CD34+細胞的甲基纖維素克隆培養進行了研究。向培養物中加入了單獨的促紅細胞生成素，組合的促紅細胞生成素/IL-6或促紅細胞生成素/sIL-6R/IL-6組合。表1示將500個CD34+臍帶血細胞培養14天得到的結果。
表1紅細胞樣細胞簇混合紅細胞樣集落EPO 57.7±14.8 0EPO/IL-6 63.0±3.5 0EPO/sIL-6R/IL-665.0±7.6 9±6.1sIL-6R,IL-6和SCF的組合，在缺乏促紅細胞生成素時，不僅刺激了紅細胞樣細胞簇，而且還刺激產生了大量的大的混合紅細胞樣集落。在所有的混合紅細胞樣集落中都含有許多包含紅細胞的成熟紅細胞樣細胞(圖9f和和圖9g)。sIL-6R/IL-6/SCF組合從500個CD34+臍帶血細胞中產生了27.2±5.8紅細胞樣細胞簇和122.3±21.8混合紅細胞樣集落。相反，在只加入SCF或SCF與IL-6的組合的培養中既沒有觀察到紅細胞樣細胞簇，也沒有觀察到混合紅細胞樣集落。還在無血清培養中對應用sIL-6R/IL-6/SCF組合時臍帶血和骨髓干細胞中紅細胞樣細胞簇和混合紅細胞樣集落的產生進行了確證(數據未出示)。當用sIL-6R/IL-6/SCF組合培養含成熟紅細胞樣祖細胞的骨髓單核細胞(即集落形成單位一紅細胞樣的)時，觀察到了一定數目的紅細胞樣集落。這些結果強有力的提示sIL-6R/IL-6/SCF不僅可支持CD34+細胞群體中未成熟紅細胞樣祖細胞而且可支持骨髓單核細胞中成熟紅細胞樣祖細胞的增殖，分化，和終端成熟。
為了進一步檢測調節紅細胞生成的替代通路的可能性，我們測定了不同的抗體對細胞發育的影響。對下面的抗體的作用進行了研究阻斷sIL-6R/IL-6復合物和細胞表面gp130相互作用的抗gp130mAb(GPX7,GPX22和GPX35)(19,29)；阻斷IL-6和IL-6R之間相互作用的抗IL-6RmAb,(20)；和阻斷CD34+細胞紅細胞樣細胞發育的抗促紅細胞生成素中和抗體。向含sIL-6R/IL-6/SCF組合的懸浮培養中加入抗gp130mAb完全阻止了紅細胞樣細胞的產生(圖11)。但是抗gp130抗體對促紅細胞生成素依賴的紅系細胞的產生無影響。
向含sIL-6R/IL-6/SCF組合的培養中加入10mg/ml濃度的抗IL-6RmAb導致了對紅細胞樣細胞產生的幾乎完全的抑制(圖12)。抗IL-6RmAb的低效率可以用可干擾體與IL-6和細胞表面IL-6R之間中和作用的sIL-6R的過量來解釋。相反，盡管抗促紅細胞生成素抗體幾乎全部抑制了促紅細胞生成素依賴的紅細胞樣細胞的產生，它卻不影響sIL-6R/IL-6/SCF組合的紅細胞樣細胞的產生(圖13)。
血細胞生成干細胞的甲基纖維素克隆培養還表明抗gp130mAb，而不是抗促紅細胞生成素抗體，全部阻斷了由sIL-6R/IL-6/SCF組合誘導的紅細胞樣細胞簇和混合紅細胞樣集落形成的發育。這些結果清楚地表明所觀察到的白介素-6配體和可溶性受體之間作用來自IL-6和sIL-6R之間的作用，和所得到的IL-6/sIL-6R復合物與靶祖細胞上膜錨定的gp130相連接的結果。該結果還表明通過gp130信號通路與SCF組合來自未成熟紅細胞樣祖細胞的紅細胞樣細胞的產生與促紅細胞生成素的存在是不相關的。
據信在生理上紅細胞樣細胞的增殖和終端分化是通過促紅細胞生成素受體信號通路而調節的。本發明gp130信號通路與SCF組合可刺激未成熟紅細胞樣祖細胞，在缺乏促紅細胞生成素時增加紅血母細胞和紅細胞。這就提示促紅細胞生成素信號通路對正常人紅細胞樣細胞的增殖，分化和終端成熟不是專一性的。sIL-6R/IL-6/SCF組合顯著地紅細胞樣細胞的產生，以及未加入sIL-6R的干細胞此類產生的缺乏，可以聯想到以前的報道，sIL-6R賦于IL-6對缺少跨膜IL-6R但卻表達gp130的細胞的應答。該理論受到免疫細胞化學染色實驗的支持，實驗證明所有的CD34+細胞和可增殖細胞都表達gp130，但卻有約90％的接受了sIL-6R/IL-6/SCF組合的CD34+細胞對IL-6R染色是陰性的。
已有報道在人血清中對sIL-6R的檢測表明了其生理意義(26)。血清中的sIL-6R就其與IL-6結合并最終刺激gp130的能力來說是有生物活性的(30)。在320ng/mlsIL-6R和25ng/mlIL-6濃度時觀察到了sIL-6R和IL-6組合時使外CD34+細胞紅細胞樣細胞產生的半最大效應。這看來是在生理范圍之內的。IL-6和SCF也可在人血清中檢測得到。與IL-6一樣，可溶性和膜結合形式的SCF都是由骨髓基質細胞產生的，該細胞可固著血細胞生成干細胞并未成熟祖細胞并支持其在骨髓中的增殖(27,28,31,32)。綜合起來，本結果表明，SCF與gp130信號通路相組合，在正常體內促紅細胞生成中起到了重要的作用。
實施例4sIL-6R和IL-6對人血細胞生成干細胞的增殖活性。
方法人臍帶血的獲得是根據常規的指導，從正常成熟分娩中收集的。在用Silica(IBL,Fujioka,Japan)去除巨噬細胞之后用Ficoll-Hypaque密度梯度離心對單核細胞進行了分離。在洗滌之后，以珠子細胞為1∶1的比例將單核細胞與攜帶抗CD34抗體的磁性顆粒(Dynabeads M-450CD34；Dynal,Oslo,Norway)混合。將細胞珠子懸浮液懸浮起來并在4℃培養30分鐘使細胞與珠子結合。在Dynal Magnetic Particle Concentrator中收集得到的珠子/玫瑰花結細胞。根據生產商的說明，從用DETACHaBead CD34(Dynal)陽性選擇的細胞上解離下珠子；必釋放選擇的CD34+細胞。FACS分析分離的CD34+細胞的純度為85-95％(Ortho,USA)。
添加有SCF,IL-3,IL-6，促紅細胞生成素和G-CSF的甲基纖維素培養中的克隆效率是45-55％。應用前述的技術并經過如下的修飾將純化的CD 34+細胞進行懸浮培養(21,22)。培養培養基含2000CD34+細胞，α-培養基，1％結晶的去離子化的牛血清白蛋白(BSA,Sigma)。將1ml培養混合物和不同的重組的人sIL-6R,IL-6和SCF(100ng/ml)的組合在37℃5％CO2,5％O2培養在24孔組織培養板中(Nunc,Kamstrop Denmark)。如前所述產生和應用重組sIL-6R,IL-6和SCF。無血清懸浮培養由2％純的BSA(Sigma),10mg/ml胰島素，200mg/ml轉鐵蛋白，10-5M巰基乙醇(Eastman)和40mg/ml低密度脂蛋白(Nakarai Tesque Inc.,Tokyo)來代替FBS來組成(10)。每隔一周，用含同樣的一系列細胞因子的新鮮培養基替換一半培養基。然后收集一部分細胞，洗滌，在血球計數儀中計數，細胞離心并染色。
結果如上所述，研究的結果被出示于圖10到圖12中。圖10示在IL-6(150ng/ml)的存在(○)或不存在(●)時應用不同濃度的sIL-6R和SCF在培養的第14天，在含血清的懸浮培養中干細胞的生長。圖11示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存時(●)應用不同濃度的IL-6和SCF在培養的第14天，在含血清的懸浮培養中干細胞的生長。圖12示含單獨的SCF，或者SCF和IL-6(50ng/ml)的組合，或者SCF/IL-6和sIL-6R(1280ng/ml)的組合時在含血清和無血清培養中在第7天(空心柱)，第14天(斜線柱)和第21天(實心柱)時干細胞的生長。結果來自三個獨立的實驗。標準方差以誤差棒的方式表達。
實施例5含組合的細胞因子的培養中血細胞生成干細胞紅細胞樣細胞的發育。
方法在第7天和14天用常規方法對懸浮培養的細胞離心制品進行May-Grunwald-Giemsa染色。在第14天，還根據前述的方法(23)用抗血型糖蛋白A(Immuotech Co Marseilles,France)和抗血紅素α-鏈(CosmoBio Co,Tokyo,Japan)的mAb使用堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)方法進行免疫染色。陽性細胞被微紅色顆粒染色。如上所述進行甲基纖維素培養(23,24)。培養培養物含500CD34+臍帶血細胞，a-培養基，0.9％,30％FBS,1％BSA,5×105M巰基乙醇，1280ng/mlsIL-6R,80ng/mlIL-6和100ng/mlSCF。將1ml培養混合物培養在每個35mm Lux標準非組織培養皿中。將細胞在含5％CO2的空氣中在37℃進行培養。
結果研究結果被出示于圖9中。在第7天(圖9a)和14天(圖8d)將懸浮培養的細胞離心制品用May-Grunwald-Giemsa染色。圖9b和9c分別是用抗血型糖蛋白AmAb或抗血紅素αmAb在第14天的對細胞離心制品的免疫染色。在圖9e和9f中分別圖示在用sIL-6R,IL-6和SCF在第14天在甲基纖維素培養中從紅細胞樣細胞中產生的代表性紅細胞樣細胞簇和混合紅細胞樣集落。
實施例6對紅細胞樣細胞產生的抗體效果方法下面的試驗檢測了抗人gp130mAb，抗人IL-6RmAb和抗人促紅細胞生成素抗體對紅細胞樣細胞的產生的作用。如上所述制備了抗人gp130 mAb抗體制品(GPX7,GPX22和GPX35)(2)。簡言之，用重組人可溶性gp130免疫小鼠，并建立了產生抗人gp130mAbGPX7,GPX22和GPX35的雜交瘤。這三個抗體識別gp130上不同的表位，并通過抑制IL-6誘導的gp130與IL-6受體的結合而抑制了IL-6介導的生物應答(2,19)。制備了抗人IL-6R(PMI)mAb(20)。PMI通過抑制IL-6和IL-6受體的結合而抑制了IL-6介導的生物反應。兔抗人促紅細胞生成素抗體(2gGK-5)由Kirin Co.；Japan提供。抗促紅細胞生成素抗體(24mg/ml)中和2U/ml的促紅細胞生成素(34)。
如圖11所示，向人臍帶血干細胞(2000CD34+細胞)中添加了預先確定的最佳濃度的sIL-6R/IL-6/SCF的組合(○)或促紅細胞生成素(2U/ml)和SCF(100ng/ml)的組合(●)。如實施例4所述，觀察了加入或未加入了抗人gp130mAb(圖11)，小鼠抗人IL-6RmAb(PMI)(圖12)或兔抗人促紅細胞生成素抗體(圖13)的含血清的懸浮培養。在培養的開始加入梯度濃度的抗體。將未加入抗體的孔作為對照。在培養14天后，收獲細胞，計數并離心。以總細胞數和離心甩片確定的紅細胞樣細胞的比例為基礎對總的紅細胞樣細胞進行了計算(包括紅血母細胞，幼紅細胞和紅細胞)。所得到了數據代表了在每個用抗體處理了的紅細胞樣細胞時對照孔中的細胞的比例，并以對照的百分比來表示(％)。
權利要求
1．一種體外擴增多能血細胞生成細胞的方法，它包括用含可溶性白介素-6受體，白介素-6，和干細胞因子的細胞因子組合培養細胞。
2．權利要求1的方法，其中將被擴增的細胞得自臍帶血，外周血或骨髓。
3．權利要求3的方法，其中多能血細胞生成細胞是通過CD 34選擇得到的祖和/干細胞。
4．權利要求3的方法，其中的多能血細胞生成細胞是通過去除了可增殖的細胞而功能性選擇的干細胞。
5．權利要求1的方法，其中所說的可溶性白介素-6受體的使用濃度為至少80ng/ml到1280ng/ml。
6．權利要求5的方法，其中所說的白介素-6的使用濃度為至少50ng/ml到100ng/ml。
7．一種物品，它包括根據權利要求1的用于多能血細胞生成細胞擴增的可溶性白介素-6受體，白介素-6和干細胞因子。
8．一種包含如下細胞的細胞群體粒細胞-巨噬細胞集落，巨核細胞集落，紅細胞樣細胞簇，半成熟細胞集落，混合血細胞生成集落和，粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落，這些集落是通過用包括可溶性白介素-6受體，白介素-6和干細胞因子的細胞因子組合培養多能血細胞生成細胞而產生的。
9．一種產生分化的血細胞集落的方法，它包括一種將多能血細胞生成細胞與包含第一種細胞因子，第一種細胞因子的可溶性受體和第二種細胞因子的細胞因子組合組合的體外方法，其中所說的第一和第二種細胞因子通過不同的信號通路刺激細胞的應答。
全文摘要
干細胞因子和可溶性白介素－6受體,白介素－6組合起來,通過gp130信號傳導,支持來自正常人血細胞生成多能性細胞的血細胞的增殖,分化和終端成熟。
文檔編號C12N5/00GK1224461SQ95194868
公開日1999年7月28日 申請日期1995年11月16日 優先權日1994年11月16日
發明者中畑達利 申請人:安姆根有限公司, 東曹株式會社