專利名稱：改進的清潔組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有非天然的氨基酸序列的新的α-淀粉酶突變體，這些突變體的氨基酸序列中其前體α-淀粉酶的一個或多個殘基，特別是易氧化的氨基酸殘基，被其它氨基酸所取代。本發明的突變酶具有改變的穩定性/活性特點，包括但不限于改變的氧化穩定性、改變的pH特性范圍、改變的特異活性和/或熱穩定性。
背景技術：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)大多隨機地水解淀粉的內α-1，4-糖苷鍵，產生小分子量的麥芽糖糊精。α-淀粉酶具有相當的商業價值，被用于淀粉加工的初始階段(液化)；用于酒精生產；用作為洗滌劑基質中的清潔劑；以及用于紡織工業中的淀粉脫漿工藝。α-淀粉酶產生于包括芽孢桿菌屬和曲霉菌屬在內的廣泛的微生物，而大多數商業淀粉酶產自如地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，或嗜熱脂肪芽孢桿菌等細菌。近年來，因其熱穩定性及其至少在中性和弱堿性的pH特性范圍，商業用途上優選的酶一直是來自地衣芽孢桿菌。
先前已有的研究利用DNA重組技術揭示對于淀粉酶的催化活性重要的殘基和/或揭示不同淀粉酶活性位點中特定氨基酸的修飾效果(Vihine，M.etal.(1990)J.Bichem.107；267-272；Holm，L.etal.(1990)Protein Engineering 3181-191；Takase，K.etal.(1992)Biochemica et Biphysica Acta，1120281-288；Matsui，I.et al.(1992)Febs Letters Vol.310，No.3 pp.216-218)；以及揭示對于熱穩定性重要的殘基(Suzuki，Y.et al.(1989)J.Biol.Chem.26418933-18938)；一個小組利用這種方法在一地衣芽孢桿菌淀粉酶的不同的組氨酸位點誘導突變，在組氨酸殘基進行取代的基本原理是，相比較其它類似的芽孢桿菌屬的淀粉酶，地衣芽孢桿菌的淀粉酶(已知是熱穩定的)具有更多的組氨酸，因而，提示我們置換組氨酸可能會影響該酶的熱穩定性(Declerck，N.et al.(1990)J.Biol.Chem.26515481-15488；FR 2 665178-Al；Joyet，P.et al.(1992)Bio/Technology 101579-1583)。
現已發現α-淀粉酶在pH值4-10.5的條件下被過氧化氫和其它氧化劑作用而失活，如本文實施例中所描述的。商業上，α-淀粉酶可以用于極為不同的條件下，如根據其商業應用，既可以用于高pH又可以用于低pH條件。例如，α-淀粉酶可以用于淀粉液化這樣的優選低pH(pH＜5.5)條件的操作工藝。另一方面，淀粉酶可用于商業上洗碗或洗衣用洗滌劑中，其常含有如漂白粉或過酸，且使用于極為堿性的條件下。
為了改變在不同條件下淀粉酶的穩定性與活性，人們發現選擇性地置換、取代或缺失易氧化的氨基酸，如甲硫氨酸，色氨酸，酪氨酸，組氨酸或半胱氨酸，與前體相比較會導致突變酶的特性變化。因為現有商業可得的淀粉酶在不同條件下是不可取(不穩定)的，所以需要一種具有改變的穩定性和/或活性的淀粉酶。這種改變的穩定性(氧化性、溫度或pH特性范圍)，與野生型或前體酶相比，能夠在保持足夠的酶活性的同時達到。這種由于引入此類突變而產生的特性可以是在保持熱穩定性的同時氧化穩定性的變化，或者反過來。此外，在前體淀粉酶序列中以不同的氨基酸取代易氧化的氨基酸或者缺失一個或多個易氧化的氨基酸，可以導致在某一并非對于前體α-淀粉酶來說最優化的pH值下改變的酶活性。換言之，本發明的突變酶由于增強了其氧化穩定性，該酶還可具有改變的pH特性范圍。
發明概述本發明涉及新的α-淀粉酶突變體，它是編碼一種α-淀粉酶的突變DNA序列的表達產物。該突變DNA序列是通過對一種前體α-淀粉酶的一個或多個易氧化的氨基酸殘基的缺失或取代(置換)而衍生得到的。在本發明的一個優選的實施方案中，以不同的氨基酸取代前體α-淀粉酶中的一個或多個甲硫氨酸殘基從而獲得突變體。在本發明的另一個實施方案中，突變體含有對前體α-淀粉酶中的一個或多個色氨酸的取代，或結合對一個或多個甲硫氨酸的取代。這些突變的α-淀粉酶一般通過對編碼天然存在的或重組的α-淀粉酶前體DNA序列進行體外修飾而得到，這些體外修飾使得前體α-淀粉酶氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基發生取代或缺失。
對氨基酸序列中一個或多個氨基酸的取代或缺失可優選地對序列中的一個或多個甲硫氨酸，色氨酸，半胱氨酸，組氨酸或酪氨酸殘基進行置換或缺失，最優選改變的殘基是甲硫氨酸殘基。易氧化的氨基酸殘基可被其它天然存在的20種氨基酸中的任一種所置換。如果設計的效果是要改變氧化穩定性，那么該氨基酸殘基可以用非氧化的氨基酸(如丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，或纈氨酸)或者其它易氧化的氨基酸(如半胱氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，酪氨酸或組氨酸，排列順序從最易氧化到較易氧化)所取代。同樣地，如果設計的效果是要改變熱穩定性，那么可以用其它天然存在的20種氨基酸中的任一種取代(例如，可用半胱氨酸取代甲硫氨酸)。
優選的突變體含有相當于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶中的任意一個甲硫氨酸殘基(+8，+15，+197，+256，+304，+366和+438)的取代。最為優選的置換的甲硫氨酸是相當于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中+197或+15位的甲硫氨酸。優選的置換+197位甲硫氨酸的取代氨基酸是丙氨酸(A)，異亮氨酸(I)，蘇氨酸(T)和半胱氨酸(C)。優選的置換+15位甲硫氨酸的取代氨基酸是亮氨酸(L)，蘇氨酸(T)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，絲氨酸(S)，纈氨酸(V)和異亮氨酸(I)，當然其它的以上未指出的取代氨基酸也可以使用。本發明中兩個特別優選的突變體是M197T和M15L。
本發明的另一個實施方案涉及的突變體含有相當于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的任意一個色氨酸殘基的取代(見圖2)。優選的所置換的色氨酸是相當于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中+138位的色氨酸。一個色氨酸殘基的突變(取代)可單獨進行，或者結合其它易氧化氨基酸殘基的突變進行。特別指出的是，至少一個色氨酸的取代結合至少一個甲硫氨酸的取代所進行的修飾是有利的(例如，雙突變體+138/+197)。
本發明的α-淀粉酶突變體，在過氧化氫和其它氧化劑，如漂白粉或過酸，或者，特別是柔和型氧化劑如氯胺T的存在下，通常顯示出改變的氧化穩定性。具有增強的氧化穩定性的突變酶能用于延長貯存壽命，以及作為與漂白粉、過硼酸鹽、過碳酸鹽或過酸具有相容性的淀粉酶用在洗滌劑產品中。類似地，降低的氧化穩定性對于要求快速高效地消除酶活性的工業過程是很有用的。本發明的突變酶還顯示出更寬的pH特性范圍，如突變體M15L顯示在低pH條件淀粉液化的穩定性，再如突變體M197T在高pH的洗滌劑產品條件下顯示出穩定性。本發明的突變體還顯示出改變的熱穩定性，突變體在高和低溫度下都具有增強的穩定性。可以理解，根據突變酶所要求的最終用途，與其前體相比，突變體的酶學特性的改變(提高或降低)都可以是有利的。
除了淀粉加工和清潔用途外，本發明的變異淀粉酶可用于各種公知的使用淀粉酶的應用，例如，變異酶可用于紡織加工，食品加工，等等。特別指出的是，一種易于被氧化失活的變異酶M197C可以用于在要求加工后徹底去除淀粉酶活性的工藝中，如冷凍食品加工的應用。
本發明的優選的α-淀粉酶突變體來自芽孢桿菌屬菌株，如地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌，最優選的是來自地衣芽孢桿菌。
本發明的另一方面提供了正常產自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的新形式。該新形式，稱作A4型，在分泌的淀粉酶的N端具有4個附加的丙氨酸殘基。(圖4b)。本發明包括α-淀粉酶A4型的衍生物或突變體。就A4型的衍生物或突變體而言，其意味著本發明包括含有一個或多個其它的突變例如一個或多個易氧化氨基酸的突變(取代、置換)的A4型。
在一個組合物方案中，本發明提供了含有所述的α-淀粉酶突變體的洗滌劑組合物，其為液體的，膠狀或粒狀的。特別優選的洗滌劑組合物是僅含有+197位突變體的組合物，或者結合其它酶如內糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶的組合物。此外，應注意的是本發明的組合物可包括具有一個以上的位點特異突變的α-淀粉酶突變體。
在另一個組合物方案中，本發明提供了用于淀粉加工及特別是淀粉液化的組合物。優選地，本發明的淀粉液化組合物含有在位點M15的取代或缺失的α-淀粉酶突變體。另外應理解的是該組合物可含有本領域的熟練技術人員所知的其它組分，包括，例如，抗氧化劑、鈣、離子等。
在方法方面，本發明提供了液化淀粉特別是來自干或濕研磨加工過程的粒狀淀粉漿的方法。通常，在淀粉降解加工的第一步中，淀粉漿經較高的溫度(高至110℃)加熱而明膠化。淀粉漿明膠化后，用α-淀粉酶使之液化和糊精化。這種液化的條件在共同擁有的美國專利申請07/785,624和07/785,623及美國專利5,180,669中有描述，這些文獻引入本文作參考。本發明的液化淀粉的方法包括在淀粉漿中加入有效量的本發明的α-淀粉酶，可以是單獨的也可結合其它賦型劑如抗氧化劑加入，并以合適的溫度和時間作用淀粉漿使淀粉液化。
進一步，本發明還包括編碼本發明的突變的α-淀粉酶(包括A4型及其衍生的突變體)的DNA序列，以及帶有該DNA的表達載體和用該表達載體轉化的宿主細胞。
附圖的簡要描述
圖1表示來自地衣芽孢桿菌(NCIB8061)的α-淀粉酶基因的DNA序列，SEQ IDNO.31，以及導出的翻譯產物(描述于Gray，G.et al(1986)J.Bacter.166635-643.)圖2表示來自地衣芽孢桿菌(NCIB8061)的成熟α-淀粉酶的氨基酸序列，SEQ IDNO.32。
圖3表示一組芽孢桿菌屬的α-淀粉酶的一級結構的對比。地衣芽孢桿菌淀粉酶(Am-Lich)，SEQ ID NO.33，描述于Gray，G.et al(1986)J.Bacter.166635-643；解淀粉芽孢桿菌淀粉酶(Am-Amylo)，SEQ ID NO.34，描述于Takkinen，K.et al(1983)J.Biol.Chem.2581007-1013；嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(Am-Stearo)，SEQ ID NO.35，描述于Ihara，H.et al(1985)J.Biolchem.9895-103。
圖4a表示成熟α-淀粉酶變異體M197T的氨基酸序列，SEQ ID NO.36。
圖4b表示來自地衣芽孢桿菌(NCIB8061)的α-淀粉酶的A4型的氨基酸序列，SEQ ID NO.37。數字編排自N末端，開始于四個附加的丙氨酸。
圖5示出質粒pA4BL，其中BLAA指地衣芽孢桿菌的淀粉酶基因，從PstI到SstI；AmpR指來自pBR322的氨芐青霉素抗性基因；CAT指來自pC194的氯霉素抗性基因。
圖6示出來自地衣芽孢桿菌38)、來自枯草芽孢桿菌39)、在pA4BL中的來自地衣芽孢桿菌(SEQ ID NO.40)和在pBLapr中的來自地衣芽孢桿菌41)的信號序列與成熟蛋白的連接部分。
圖7a示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M197L(A4型)用0.88M H2O2在pH5.0，25℃條件下的失活作用。
圖7b示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M197L(A4型)用0.88M H2O2，在pH10.0，25℃條件下的失活作用。
圖7c示出特定淀粉酶(SpezymeAA20)和M15L用0.88M H2O2在pH5.0，25℃條件下的失活作用。
圖8表示M197X盒式突變的產生的示意圖。
圖9表示M197X變異體的表達。
圖10表示M197X變異體在pH5.0，5mM CaCl2，于95℃下5分鐘的熱穩定性。
圖11a和11b表示在自動洗碗洗滌劑中特定的淀粉酶的失活。圖11a表示CascadeTM(一種商業可得的洗碗產品)中特定的淀粉酶在存在或不存在淀粉的條件下于65℃時的穩定性。圖11b表示SunlightTM(一種商業可得的洗碗產品)中特定的淀粉酶在存在或不存在淀粉的條件下于65℃時的穩定性。
圖12表示M15X盒式突變的制備的示意圖。
圖13表示M15X變異體的表達。
圖14表示M15X變異體對可溶淀粉的特異活性。
圖15表示M15X變異體在pH5.0，5mM CaCl2，于90℃下5分鐘的熱穩定性。
圖16表示作為地衣芽孢桿菌野生型酶活性的函數的M15變異體對淀粉和可溶性底物的特異活性、以及pH5.5下噴射(jet)液化特性。
圖17表示用氯胺-T在pH8.0條件下作用時，與變異體M197A(1.7mg/ml)和M197L(1.7mg/ml)相對比，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(AA20，0.65mg/ml)的失活。
圖18表示用氯胺-T在pH4.0條件下作用時，與變異體M197A(4.3mg/ml)和M197L(0.53mg/ml)相對比，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(AA20，0.22mg/ml)的失活。
圖19表示用氯胺-T在pH5.0條件下作用時，與雙變異體M197T/W138F(0.64mg/ml)和M197T/W138Y(0.60mg/ml)相對比，地衣芽孢桿菌的α淀粉酶(AA20，0.75mg/ml)的反應。
圖20表示對摻入自動洗碗洗滌劑(ADD)配制品中的不同的α-淀粉酶的多種突變體在室溫及升溫至65℃時所作的穩定性測試結果。
圖21表示自動洗碗洗滌劑中特定的淀粉酶突變體(與野生型相比)在室溫下經0-30天后的穩定性——以一定時間后所保留的活性百分比計。
圖22表示自動洗碗洗滌劑中特定的淀粉酶突變體(與野生型相比)在38℃及相對濕度80％下經0-30天后的穩定性。
發明的詳細描述據信，用于淀粉液化的淀粉酶可因淀粉漿中的一些活性而使之變成一些失活的形式(見共同擁有的美國申請07/785,624和07/785,623和美國專利5,180,669，1993年1月19日授權，引入本文作參考)。而且，在有氧化劑存在的淀粉酶的應用中，如用于含有漂白粉或過酸的洗滌劑，會導致淀粉酶的部分或完全失活。因此本發明致力于改變淀粉酶的氧化敏感性。本發明的突變酶還可具有改變的pH范圍和/或改變的熱穩定性，這可能因為該酶在低或高pH條件下氧化穩定性的增強而導致。
本文所用的α-淀粉酶包括天然存在的淀粉酶以及重組的淀粉酶。本發明優選的淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，包括本文所述的衍生自地衣芽孢桿菌的A4型，以及真菌的淀粉酶如來自曲霉屬的(例如米曲霉和黑曲霉)的α-淀粉酶。
重組α-淀粉酶是指，編碼天然存在的α-淀粉酶的DNA序列通過修飾產生的突變DNA序列編碼的淀粉酶，該突變DNA序列編碼的α-淀粉酶序列中取代、插入或缺失了一個或多個氨基酸。本文公開了合適的修飾方法，也可見共同擁有的美國專利4,760,025和5,185,258，這些文獻引入本文作參考。
已知在至今已測序的幾乎所有內淀粉酶序列中都存在同源性，范圍從植物，動物到細菌(Nakajima，R.T.et al.(1986)Appl.Microbiol.Biotechnol.23355-360；Rogers，J.C.(1985)Biochem.Biophys.Res.Commun.128470-476)在某些芽孢桿菌屬的淀粉酶中有四個特別高度同源的區域，如圖3所示，其中劃線部分為高度同源的區域。進而，利用序列對比示出了芽孢桿菌屬的內淀粉酶之間的關系(FengD.F和Doolittle，R.F.(1987)J.Molec.Ebil.35351-360)。據計算，嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的淀粉酶的相關序列同源性約為66％，Holm，L.et al(1990)Protin Engineering 3(3)pp 181-191。據計算，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的淀粉酶的相關序列同源性約為81％，Holm，L.et al文獻同上。在將淀粉酶與其它酶比較時，盡管序列同源性很重要，但通常認為結構的同源性也是很重要的。例如，已提示真菌淀粉酶與細菌(芽孢桿菌屬)的淀粉酶具有結構同源性，因此，真菌淀粉酶也涵蓋于本發明中。
α-淀粉酶突變體具有的氨基酸序列來自其前體α-淀粉酶氨基酸序列。前體α-淀粉酶包括天然存在的α-淀粉酶和重組α-淀粉酶(如前面的定義)。α-淀粉酶突變體的氨基酸序列通過取代、缺失或插入一個或多個前體氨基酸序列中的殘基而從前體淀粉酶而衍生得到。這種修飾是對編碼前體淀粉酶氨基酸序列的前體DNA序列進行的，而非直接對前體淀粉酶操作。對前體DNA序列操作的適當方法包括本文公開的和共同擁有的美國專利4,760,025和5,185,258所公開的方法。
本文確定了相當于地衣芽孢桿菌淀粉酶的M197，M15和W138的用于取代或缺失的殘基，如所有的甲硫氨酸、組氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸位點，氨基酸位點數碼(如+197)是指如圖2所示的成熟地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的排列數碼。然而，本發明并不限于這一特定的成熟α-淀粉酶(地衣芽孢桿菌)的突變，而是擴展到含有相當于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶所確定的特定殘基的前體α-淀粉酶。如果它是同源的(即，在初級結構或高級結構上位置對應)或者與地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶特定殘基或該殘基部分相類似(即，具有化學上或結構上相同或相似的結合、反應或作用功能)，那么，這個前體α-淀粉酶的殘基(氨基酸)就相當于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基。
為了確認與一級結構的同源性，前體α-淀粉酶的氨基酸序列可直接與地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶一級序列比較，且特別比較在序列已知的所有α-淀粉酶中均為非變異的一組殘基，如圖3所示。也可通過三級結構來確定等位殘基豬胰α-淀粉酶(Buisson，G.etal.(1987)EMBO J.63909-3916)；來自米曲霉的高淀粉酶A(Matsuura，Y.et al.(1984)J.Biochem.(Tokyo)95697-702)；一種來自黑曲霉的酸性α-淀粉酶(Boel，E.et al.(1990)biochemistry 296244-6249)的晶體結構已有報道，前兩種結構相似。沒有已發表的芽孢桿菌屬α-淀粉酶的結構，雖然有預測其具有葡聚糖酶間的通用超二級結構(MacGregor，E.A.&Svensson，B.(1989)Biochem.J.259145-152)。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌酶的結構與高淀粉酶A的結構類似(Holm，l.et al.(1990)Protein Engineering 3181-191)。圖3所示的四個高度保守區域含有被認為是活性位點部分的許多殘基(Matsuura Y.et al.(1884)J.Biochem.(Tokyo)95697-702；Buisson，G.et al.(1987)EMBO J.63909-3916；Vihinen，M.et al.(1990)J.Biochem.107267-272)包括，按地衣芽孢桿菌的排列數碼，His105；Arg229；Asp231；His235；Glu261和Asp328。
本文所用的表達載體是指這樣的DNA構建物它含有一DNA序列與調控序列相連接，而調控序列能使所述DNA在一適當的宿主中有效表達。該調控序列可包括一個起始轉錄的啟動子，任選的控制這種轉錄的操縱序列，一個編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列，和控制轉錄與翻譯終止的序列。優選的啟動子是枯草芽孢桿菌的aprE啟動子。載體可以是質粒，噬菌體顆粒，或簡單地是一潛在的基因組插入片段。一旦轉化入適當的宿主，該載體可以復制并獨立于宿主的基因組而具有功能，也可以，在某些例子中，整合入宿主的基因組中。在本說明書中，因為質粒是最為常用的載體形式，所以質粒與載體的概念在使用上有時可以互換。但是，本發明意在包括其它具有相當的功能并已為或將為本領域所知的各種形式的載體。
本發明所用的宿主菌株(或細胞)通常為原核或真核宿主并且包括任何能在其中進行α-淀粉酶表達的可轉化的微生物。特別是，衍生α-淀粉酶的同種或同屬的宿主菌株更為適合，如芽孢桿菌屬。優選使用的是α-淀粉酶陰性芽孢桿菌屬(基因已缺失)和/或α-淀粉酶與蛋白酶缺失的芽孢桿菌屬菌株，如Bacillus subtilis菌株BG2473(△amyE，△apr，△npr)。宿主細胞被通過DNA重組技術構建的載體轉化或轉染。這種轉化后的宿主細胞能夠復制編碼α-淀粉酶及其變異體(突變體)的載體，或能夠表達所希望的α-淀粉酶。
優選的是本發明的突變體在發酵時分泌到培養基中。任何合適的信號序列，如aprE信號肽，可用于促進分泌。
本發明的許多α-淀粉酶突變體可以用于配成各種洗滌劑組合物，尤其是洗碗清潔組合物，特別是那些含有已知氧化劑的清潔組合物。本發明的α-淀粉酶突變體可以配成pH在6.5到12.0的公知的粉狀、液體或凝膠狀的洗滌劑。適當的顆粒狀組合物可按共同擁有的美國專利申請07/429,881,07/533,721和07/957,973中所述制備，這些文獻引入本文作參考。這些洗滌劑中的清潔組合物也可含有其它的酶，如已知的蛋白酶、脂酶、纖維素酶、內糖苷酶或其它淀粉酶，還可含有助洗劑、穩定劑或其它本領域熟練人員所知的賦型劑。這些酶的存在形式可以是共顆粒或混合物或者其它本領域熟練人員所知的形式。此外，本發明還注意到多重突變體可以用于清潔或其它應用。例如，一個在+15和+197位改變的突變酶用于清潔產品中可顯示更強的特性；而含有+197和+138位改變的多重突變體可具有改進的特性。用于清潔產品尤其是用于洗碗洗滌劑配制品的特別優選的突變酶，包括但是并不限于M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T；和M15T/W138Y/M197T。
本發明的另一實施方案包括所述的突變α-淀粉酶與其它酶(即蛋白酶、脂酶、纖維素酶等)，優選氧化穩定的蛋白酶的結合。合適的氧化穩定的蛋白酶通常包括遺傳工程化蛋白酶，例如描述于US Re 34606中的(該文獻引入本文作參考)，以及商業可得的酶如DURAZYM(Novo Nordisk)，MAXAPEM(Gist-brocades)和PURAFECT OXP(GenencorInternational，Inc.)。產生這些蛋白酶突變體(氧化穩定的蛋白酶)，尤其是含有在相當于解淀粉芽孢桿菌中M222位點的甲硫氨酸取代的突變體的合適方法，在US Re34606中已有描述。確定其它枯草桿菌蛋白酶中的“相當”位點的合適方法在Re 34606，EP257，446和USSN 212，291中有所提供，這些文獻引入本文作參考。
如前所述，本發明的α-淀粉酶突變體可用于淀粉的液化。淀粉液化，尤其是顆粒狀淀粉漿的液化，典型地是在中性pH條件和高溫條件下進行的。如在共同擁有的美國專利申請07/788,624,07/785,623和美國專利5,180,669中所述，在典型的液化過程中存在某些氧化劑或失活劑，而可能影響到該酶的活性；因此，這些相關專利申請在加工中加入了抗氧化劑以保護該酶。
基于優選的液化加工條件，如在共同擁有的美國專利申請07/788,624和07/785,623和美國專利5,180,669中所述，即在低pH、高溫及可能的氧化條件下，優選的用于液化過程的本發明的突變體包括那些顯示出改變的pH特性范圍(即，低pH范圍，pH＜6和優選地pH＜5.5)，和/或改變的熱穩定性(即，高溫，約90℃-110℃)，和/或改變的氧化穩定性(即，增強的氧化穩定性)的突變體。
因此，本發明提出了一個改進的淀粉液化的方法，該方法包括在pH4到6的條件下通過加入有效量的本發明的α-淀粉酶突變體將從干或濕研磨過程得到的粒狀淀粉漿進行液化；任選地在粒狀淀粉漿中加入有效量的抗氧化劑或其它賦型劑；作用粒狀淀粉漿適當的時間使淀粉液化。
以實施例的方式提供的下列內容并不構成本發明權利要求的范圍的限制。本文所用的縮寫，特別是氨基酸三字符或單字符代碼描述于Dale，J.W.著“細菌的分子遺傳學”，John Wiley & Sons，(1989)附錄B。
實驗實施例1地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的甲硫氨酸殘基的取代α-淀粉酶基因(圖1)克隆自地衣芽孢桿菌NCIB8061菌株，該菌株得自國立工業細菌保藏中心，Aberdeen，Scotland(Gray，G.et al.(1986)J.Bacteriology 166635-643)。將編碼信號序列的后3個殘基、全長的成熟蛋白和終止區的1.72kb的PstI-SstI片段亞克隆到M13MP18。一個合成的終止子通過如下所示形式的合成寡聚核苷酸盒加入到BclI和SstI位點BclI SstI5′ GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT3′3′ TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC5′Seq ID No 1
該形式設計含有解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的轉錄終止子(Wells et al.(1983)Nucleic Acid Research 117911-7925)。
寡聚核苷酸介導的定點誘變基本上按Zoller，M.et al.(1983)Meth.Enzymol.100468-500的方法進行，簡要地，利用表1所列的寡聚核苷酸，以M13單鏈DNA為模板，通過5’磷酸化的寡聚核苷酸引物誘導所希望的突變，以取代地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶中7個甲硫氨酸的每個殘基。每個誘變寡聚核苷酸還引入了一個限制性內切酶位點用以篩選連入的突變子。
表1用于取代地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中甲硫氨酸殘基的誘變的寡聚核苷酸M8A5′-T GGG ACG CTG GCG CAG TAC TTT GAA TGG T-3′Seq ID No 2ScaI+M15L5′-TG ATG CAG TAC TTT GAA TGG TAC CTG CCC AAT GA-3′ Seq ID No 3ScaI+KpnI+M197L5′-GAT TAT TTG TTG TAT GCC GAT ATC GAC TAT GAC CAT-3′Seq ID No 4EcoRV+M256A5′-CG GGG AAG GAG GCC TTT ACG GTA GCT-3′ Seq ID No 5StuI+M304L5′-GC GGC TAT GAC TTA AGG AAA TTG C-3′ Seq ID No 6AfIII+M366A5′-C TAC GGG GAT GCA TAC GGG ACG A-3′Seq ID No 7NsiI+M366Y5′-C TAC GGG GAT TAC TAC GGG ACC AAG GGA GAC TCC C-3′Seq ID No 8StyI+M438A5′-CC GGT GGG GCC AAG CGG GCC TAT GTT GGC CGG CAA A-3′ Seq ID No 9SfiI+粗體字表示寡聚核苷酸引入的變化。編碼的改變在M8A形式中示出，這里+8位的甲硫氨酸(M)改變為丙氨酸(A)。劃線部分表示寡聚核苷酸引入的限制性內切酶位點。
雜交雙鏈分子用以轉染E.coli mutL細胞(Kramer et al.(1984)Cell 38879)，經噬菌斑純化后，用RF1的限制酶切方法分析克隆。陽性克隆用雙脫氧法測序確定(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467)并且將每個PstI-SstI片段亞克隆入E.coli載體，質粒pA4BL。
質粒pA4BL按描述于美國申請860,468(Power et al.)的方法，該文獻引入本文作參考，在來自pS168-1(Stahl，M.L.和Ferrari，E.(1984)J.Bacter.1541513-1515)的aprE基因的+1位點(緊接信號切割位點的第1個氨基酸)引入一個沉默PstI位點。然后將aprE啟動子和信號肽區從pJH101質粒(Ferrari，E.(1984)J.Bacter.1541513-1515)上以HindIII-PstI片段切下，亞克隆入pUC18衍生的質粒JM102(Ferrari，E.和Hoch，J.A.(1989)Bacillus，ed.C.R.Harwood，Plenum Pub.，pp.57-72)。并插入來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的PstI-SstI片段，得到pA4BL，其含有如圖6所示的aprE信號肽-淀粉酶的連接。
轉化入枯草芽孢桿菌pA4BL質粒能夠在E.coli中復制并能夠整合到枯草芽孢桿菌染色體上。含有各種變異體的質粒轉化入枯草芽孢桿菌(Anagnostopoulos，C.和Spizizen，J.(1961)J.Bacter.81741-746)并以Campbell-型機制(Young，M.(1984)J.Gen.Microbiol.1301613-1621)整合到染色體上的aprE位點。枯草芽孢桿菌菌株BG2473為缺失α-淀粉酶(△ampE)和兩個蛋白酶(△apr，△npr)的菌株I168的衍生菌株(Stahl，M.L.和Ferrari，E.，J.Bacter.158411-418和美國專利5,264,366，該文獻引入本文作參考)。轉化后，sacU32(Hy)突變(Henner，D.J.et al.(1988)J.Bacter.170296-300)經PBS-1介導的轉導而導入(Hoch，J.A.(1983)1541513-1515)。
對在枯草芽孢桿菌中的pA4BL表達的淀粉酶的N末端分析顯示，它被加工成在分泌的淀粉酶蛋白的N末端加上4個丙氨酸(“A4型”)。這額外的4個殘基并未對A4型的活性或熱穩定性產生顯著的降低作用，并且在某些應用中具有增強的特性。在后續的實驗中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的正確加工形式和變異體M197T以非常相似的構建方法而得到(見圖6)。具體地，A4型構建物的5’端通過來自pA4BL的EcoRI-SstI片段亞克隆入M13BM20(Boehringer Mannheim)，從而得到如下所示的誘變寡聚核苷酸的編碼鏈模板5′-CAT CAG CGT CCC ATT AAG ATT TGC AGC CTG CGC AGA CAT GTT GCT-3′Seq ID No 10此引物消除了額外的4個N末端丙氨酸密碼子，通過PstI位點的不存在而篩選到正確的形式。將EcoRI-SstII片段亞克隆回pA4BL載體(圖5)從而得到質粒pBLapr。這時，M197T取代可以通過SstII-SstI片段從pA4BL(M197T)上移入互補的pBLapr載體得到質粒pBLapr(M197T)。對在枯草芽孢桿菌中的pBLapr表達的淀粉酶的N末端分析顯示，它被加工成帶有與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶相同的N-末端。
實施例2甲硫氨酸變異體的氧化穩定性地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶，如SpezymeAA20(可從Genencor International，Inc.商購)，在過氧化氫存在下很快失活(如7)。搖瓶培養枯草芽孢桿菌表達各種甲硫氨酸變異體，粗上清經硫酸銨分流純化。將20％飽和硫酸銨上清提高至70％飽和硫酸銨，α-淀粉酶沉淀出，然后重新懸浮。變異體在pH5.0，25℃暴露于0.88M過氧化氫。地衣芽孢桿菌α-淀粉酶其他6個甲硫氨酸位點的變異體依然被過氧化物所氧化，而在+197位點取代的變異體(M197L)則表現出對過氧化物氧化作用的抗性(見圖7)。然而，如下文詳細描述的進一步的實驗表明，雖然一個變異體在pH5.0 25℃時可能易于氧化，但是它在不同的條件下(即，液化)可能顯示改變的/增強的特性。
實施例3在197位點的所有可能的變異體的構建所有M197的變異體(M197X)從A4型通過盒式誘變產生，如圖8所示1)用定點誘變(通過M13上引物延伸)產生M197A，所用的誘變寡聚核苷酸如下M197A5′-GAT TAT TTG GCG TAT GCC GAT ATC GAC TAT GAC CAT-3′EcoRV+ClaI- Seq ID No 11這里，還插入了EcoRV位點(密碼子200-201)以替代ClaI位點(密碼子201-202)。
2)然后用引物LAAM12(表II)在密碼子186-188處引入另一個沉默限制位點(BstBI)。
3)所得的M197A(BstBI+，EcoRV+)變異體隨后亞克隆(PstI-SstI片段)人質粒pA4BL，而所得的質粒用BstBI和EcoRV酶切，通過電洗脫從瓊脂糖凝膠上分離含載體的大片段。
4)每種合成的引物LAAM14-30(表II)分別與大部分互補的通用引物LAAM13(表II)退火。得到的誘變盒在+197位編碼所有其余天然存在的氨基酸，將誘變盒逐個連接入上面所制備的載體片段。
表II用于盒式誘變產生M197X變異體的合成寡核苷酶LAAM12 GG GAA GTT TCG AAT GAA AAC G Seq ID No 12LAAM13 X197bs Seq ID No 13(EcoRV) GTC GGC ATA TG CAT ATA ATC ATA GTT GCC GTT TTC ATT (BstBI)LAAM14 I197 Seq ID No 14(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG ATC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM15 F197 Seq ID No 15(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TTC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM16 V197 Seq ID No 16(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GTT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM17 S197 Seq ID No 17(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AGC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM18 P197 Seq ID No 18(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CCT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM19 T197 Seq ID No 19(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG ACA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM20 Y197 Seq ID No 20(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM21 H197 Seq ID No 21(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM22 G197 Seq ID No 22(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GGC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM23Q197 Seq ID No 23(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG CAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM24N197 Seq ID No 24(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AAC TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM25K197 Seq ID No 25(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM26D197 Seq ID No 26(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GAT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM27E197 Seq ID No 27(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG GAA TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM28C197 Seq ID No 28(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TGT TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM29W197 Seq ID No 29(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG TGG TAT GCC GAC (EcoRV-)LAAM30R197 Seq ID No 30(BstBI) CG AAT GAA AAC GGC AAC TAT GAT TAT TTG AGA TAT GCC GAC (EcoRV-)
誘變盒設計在連接時消除EcoRV位點，因此，E.coli轉化子的質粒可根據此單一位點的消失而篩選出。此外，盒中通用基礎(bottom)鏈中含有一個移碼和一個NsiI位點，因此，由此鏈衍生的轉化子可通過篩選單一位點NsiI的存在而除去，從而在任何情況下均不會導致活性淀粉酶的表達。
限制性分析陽性克隆經測序確認并轉化入枯草芽孢桿菌進行搖瓶培養表達(圖9)。然后，每一M197X突變體的特異活性通過可溶性底物試驗進行確定。以下試驗方法所獲得的數據列于表III。
可溶性底物試驗根據Megazyme(Aust.)Pty.Ltd.提供的終點試驗試劑盒進行效率試驗將每一小瓶底物(對硝基苯基麥芽七糖，BPNPG7)溶解于10ml無菌水，再以試驗緩沖液(50mM順丁烯二酸鹽緩沖液，pH6.7，5mM氯化鈣，0.002％Tween20)稀釋1至4倍。在一小容器中790μl的底物加入10μl的淀粉酶于25℃進行試驗。75秒后，根據410nm的光吸收的變化率來測量水解率。該試驗線性率最大至0.4吸收單位/分鐘。
淀粉酶的蛋白濃度利用標準牛血清白蛋白通過基于Bradford，(M.(1976)Anal.Biochem.72248)方法的Bio-Rad試驗(Bio-Rad Laboratories)進行測量。
淀粉水解試驗應用了檢測SpezymeAA20α-淀粉酶活性的標準方法。該方法在USSN 07/785,624的實施例1中有詳細的描述。天然的淀粉遇碘呈藍色，而當它水解成較小的糊精分子時則不呈藍色。底物為5g/L的溶于磷酸鹽緩沖液(pH6.2，42.5g/L磷酸二氫鉀，3.16g/L氫氧化鈉)中的可溶性Lintner淀粉。樣品加入25mM的氯化鈣，并于30℃孵育，以產生陰性碘顯色的時間來測量活性。活性以每克或每ml的力規分(liquefons)(LU)記錄，其按如下的公式計算LU/ml或LU/g＝(570×D)/(V×t)這里LU＝力規分單位V＝樣品體積(5ml)t＝糊精化的時間(分鐘)D＝稀釋倍數＝稀釋體積/加入酶的ml或g
表III特異活性(相當于AA20值的％)α-淀粉酶可溶性底物 淀粉SpezymeAA20100 100A4型 105 115M15L(A4型)93 94M15L 85 103M197T(A4型) 75 83M197T 62 81M197A(A4型) 88 89M197C 85 85M197L(A4型) 51 17實施例 4M15L變異體的鑒定按照前面實施例的方法制備的變異體M15L并不顯示出增加的淀粉酶活性(表III)，并且仍然被過氧化氫所失活(圖7)。然而，它卻在淀粉的噴射液化，尤其在低pH條件下，顯示出增加的特性，如下面的表IV所示。
淀粉液化的典型操作是使用一個水浴加熱器M103-M蒸汽噴管，它在混合倉后面配備有2.5升的延遲圈和一個終端反壓閥。淀粉用一個Moyno泵加入噴管，而減至90-100psi的蒸汽由一個150psi的蒸汽管線提供。溫度探頭設置在水浴加熱蒸汽噴管之后、反壓閥之前。
淀粉漿通過谷物濕磨機獲得，并在兩天之內使用。用去離子水將淀粉稀釋至所需的固體級別，并用2％NaOH或飽和Na2CO3調節淀粉的pH值。典型的液化條件為淀粉 32％-35％的固體鈣 40-50ppm(加入30ppm)pH值 5.0-6.0α-淀粉酶 12-14LU/g淀粉干基重淀粉以約350ml/分鐘引入噴管。噴管的溫度保持在105-107℃。淀粉的樣品從噴管蒸煮器轉至95℃的第二階段液化并保持90分鐘。
第二階段液化后，立即通過確定樣品的葡萄糖效價(DE)并測試生淀粉的含量而測量淀粉液化的程度，這些都按照《谷物提純聯合會的會員公司的標準分析方法》(第六版)中描述的方法進行。通常在上述給出的條件及pH6.0的條件下進行處理后，淀粉將變化為DE值約10的液化淀粉且不含有生淀粉。以本發明的突變體進行的淀粉液化測試的結果提供在表IV中。
表IV在淀粉液化中變異體M15L(A4型)和M15L的特性pH 90分鐘后的DESpezyme AA20 5.9 9.9M15L (A4 form)5.9 10.4Spezyme AA20 5.2 1.2M15L (A4 form)5.2 2.2Spezyme AA20 5.9 9.3*M15L 5.9 11.3*Spezyme AA20 5.5 3.25**M15L 5.5 6.7**Spezyme AA20 5.2 0.7**M15L 5.2 3.65***三次實驗的平均值**兩次實驗的平均值實施例5M25X變異體的構建大體按照前面實施例3中描述的方法，所有的M15變異體(M15X)都通過盒式誘變在天然的地衣芽孢桿菌中產生，如圖12中所概括的。
1)利用定點誘變(通過引物在M13上延伸)在M15密碼子兩側引入單一的限制性位點以利于誘變盒的插入。具體地，利用下面所示的兩個寡聚核苷酸，在第11-13位密碼子引入一個BstBI位點并在第18-20位密碼子引入一個MscI位點M15XBstB1 5′-G ATG CAG TAT TTC GAA CTGG TAT A-3′BstB1 Seq ID No 48M15XMsc1 5′-TG CCC AAT GAT GGC CAA CAT TGG AAG-3′Msc1Seq ID No 492)然后，通過將誘變淀粉酶(BstB1+，MSc1+)的SfiI-SstII片段亞克隆入質粒pBLapr，構建M15X盒式誘變的載體。所得到的質粒再經BstBI和MscI酶切并從聚丙烯酰胺凝膠上電洗脫分離較大的載體片段。
3)誘變盒的制備與M197X變異體的一樣。將合成的寡聚核苷酸，每個編碼一種第15位密碼子的取代，與一通用基礎引物退火。誘變盒與載體經正確的連接，MscI位點被消除，從而可利用該位點的丟失來篩選陽性轉化子。通用基礎引物含有單一SnaBI位點，從而可利用SnaBI位點的篩選來去除那些衍生自該通用基礎引物的轉化子。該引物還含有一個移碼，從而可消除那些衍生自該通用基礎引物的突變體的淀粉酶的表達。
合成的誘變盒列于表V，總體的盒式誘變策略示意于圖12。
表V用以盒式誘變產生M15X變異體的合成的寡聚核苷酸M15A (BstB1) C GAA TGG TAT GCT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 50M15R (BstB1) C GAA TGG TAT CGC CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 51M15N (BstB1) C GAA TGG TAT AAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 52M15D (BstB1) C GAA TGG TAT GAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 53M15H (BstB1) C GAA TGG TAT CAC CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 54M15K (BstB1) C GAA TGG TAT AAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 55M15P (BstB1) C GAA TGG TAT CCG CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 56M15S (BstB1) C GAA TGG TAT TCT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 57M15T (BstB1) C GAA TGG TAC ACT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 58M15V (BstB1) C GAA TGG TAT GTT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 59M15C (BstB1) C GAA TGG TAT TGT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 60M15Q (BstB1) C GAA TGG TAT CAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 61M15E (BstB1) C GAA TGG TAT GAA CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 62M15G (BstB1) C GAA TGG TAT GGT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 63M15I (BstB1) C GAA TGG TAT ATT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 64M15F (BstB1) C GAA TGG TAT TTT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 65M15W (BstB1) C GAA TGG TAC TGG CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 66M15Y (BstB1) C GAA TGG TAT TAT CCC AAT GAC GG (Msc1) Seq ID No 67M15X (Msc1) CC GTC ATT GGG ACT ACG TAC CAT T (BstB1) Seq ID No 68(基礎鏈)劃線部分表示在15位的氨基酸密碼子的變化在某些情況中進行了保守取代以防新的限制性位點的引入。
實施例6M15X變異體的小型液化試驗按實施例5的方法制備的帶有M15取代的11種α-淀粉酶變異體，與SpezymeAA20(可從Genencor International，Inc.商購)對比，在一個小型液化系統中于pH5.5條件下進行液化反應并進行活性試驗。小型液化系統含有一個不銹鋼鋼圈(直徑0.25英寸，體積約350ml)配有一距離前端約12英寸的7英寸長的靜態混合器，和一個在后端的30psi的反壓閥。該鋼圈除了兩端均浸于甘油-水浴中，此浴器配有溫度控制器使其保持在105-106℃。
含有酶的淀粉漿攪拌下保持懸浮，通過一個活塞驅動計量泵以70ml/min導入反應圈中。從反應圈尾部收集的淀粉被轉入第二級處理(95℃90分鐘)。第二級處理后立刻測定液化淀粉的DE值，如實施例4中所述。其結果見圖16。
實施例7M197X變異體的鑒定如圖9所示，M197X(A4型)變異體所表達的α-淀粉酶活性(可溶性底物試驗所測量)的范圍很大。通過在上清中加入2倍體積的乙醇使之沉淀并重新懸浮而對淀粉酶進行部分純化。然后它們在含5mM氯化鈣的10mM乙酸緩沖液pH5.0中，于95℃加熱5分鐘進行熱穩定性的篩選；A4野生型在孵育后保持其28％的活性。對于M197W和M197P，我們無法從上清中回收活性蛋白。根據測序，發現M197H變異體含有第二個突變，N190K。M197L在另一實驗中測試，它是熱穩定性最低的變異體之一。在淀粉酶活性與熱穩定性之間顯示出很大的相關性，地衣芽孢桿菌淀粉酶在保持活性或增強熱穩定性方面受限于其在197位所能容納的殘基半胱氨酸和蘇氨酸在這些條件下優選地具有最大的熱穩定性，而丙氨酸和異亮氨酸具有中等的穩定性。然而，在+197位的其它取代導致的低熱穩定性可以有利于其它的應用。此外，不同的+197位的取代可能具有其它的有利特性，如改變的pH特性范圍或改變的氧化穩定性。例如，M197C變異體易于被空氣氧化失活但具有增強的熱穩定性。相反，與M197L變異體相比，M197T和M197A在pH5至pH10時對過氧化物的失活作用保持有抗性(圖7)的同時，不僅保持高的熱穩定性(圖10)，還具有高活性(表III)。
實施例8在洗滌劑配制品中的穩定性和特性M197T(A4型)，M197T和M197A(A4型)的穩定性在自動洗碗洗滌劑(ADD)基質中進行測量。將2ppm的SavinaseTM(一種蛋白酶，可從Novo Industies商購，是一種普遍用于ADD的酶)加入到兩種可商購的含有漂白粉的ADDCascadeTM(Procter andGamble，Ltd.)和SunlightTM(Unilever)，在65℃對淀粉酶變異體和TermamylTM(熱穩定的α-淀粉酶，可得于Novo Nordisk，A/S)進行失活計時。兩種情況下使用的ADD產品的濃度相當于“預浸漬”條件每升水加14克產品(每加侖硬度7克)。正如所見到的(圖11a和圖11b)，兩種形式的M197T變異體都比TermamylTM和M197A(A4型)具有大得多的穩定性，后兩種在第一次試驗前已失活。按下面的方法所作的測定中，在存在或不存在淀粉的條件下均可顯示出其穩定性的優點。在5ml的ADD和SavinaseTM中加入淀粉酶，于試管中預熱，振蕩后，用可溶性底物試驗測定作為時間函數的活性。標“+淀粉”的試管內壁烤有spaghetti淀粉(140℃，60分鐘)。結果見圖11a和圖11b。
實施例9M15X變異體的鑒定所有的M15X變異體都在Bacillus subtilis中繁殖，其檢測的表達水平見圖13。淀粉酶通過20-70％的硫酸銨分流而分離并部分純化。這些變異體對于可溶性底物的特異活性按實施例3所述方法測試(圖14)。許多M15X淀粉酶的特異活性高于SpezymeAA20。通過在含有5mM氯化鈣的50mM乙酸緩沖液pH5中于90℃加熱淀粉酶5分鐘，對變異體進行小型熱穩定性試驗(圖15)。在試驗中大多數變異體與SpezymeAA20的表現一樣。測試那些在試驗中顯示出合理的穩定性的變異體(合理的穩定性是指保持至少60％的SpezymeTMA20的熱穩定性)對淀粉的特異活性以及在pH5.5時的液化特性。最感興趣的那些突變體可見圖16所示。M15D，N和T，以及L，在pH5.5條件下的液化中的特性超過了SpezymeAA20，并且在可溶性底物試驗和淀粉水解試驗中具有增加的特異活性。
總之，我們從第15位的甲硫氨酸的取代中發現，我們能提供具有增強的低pH液化特性和/或增加的特異活性的變異體。
實施例10色氨酸對氧化的敏感性氯胺-T(N-氯-對-甲苯磺酰亞胺鈉)是一選擇性氧化劑，它在中性或堿性pH條件下氧化甲硫氨酸成甲硫氨酸亞砜。在酸性pH條件下氯胺-T將對甲硫氨酸和色氨酸都進行修飾(Shechter，Y.，Burstein，Y.和Patchornik，A.(1975)biochemistry 14(20)4497-4503)。圖17顯示了pH8.0時氯胺-T對地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的失活作用(AA20＝0.65mg/ml，M197A＝1.7mg/ml，M197L＝1.7mg/ml。數據表明在第197位將甲硫氨酸改變成亮氨酸或丙氨酸，α-淀粉酶的失活可得到抑制。相反，如圖18所示，在pH4.0時M197A和M197L發生失活，但需較多的氯胺-T當量(圖18；AA20＝0.22mg/ml，M197A＝4.3mg/ml，M197L＝0.53mg/ml；200mM乙酸鈉，pH4.0)。這提示在氯胺-T介導的失活作用中色氨酸殘基也有所關聯。色氨酸作圖(tryptic mapping)和接下來的測序顯示第138位的色氨酸被氯胺-T氧化(數據未附)。為了證實這點，如下所示進行了第138位色氨酸的定點誘變。
α-淀粉酶雙突變體W138和M197的制備將一些W138變異體(F，Y和A)制備成帶有M197T(按實施例3制備)的雙突變體。雙突變體的制備按實施例1和實施例3的方法進行。一般說來，從含有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶M197T突變體的1.72kb編碼序列(PstI-SstI)的一個M13M18克隆中制備出負鏈DNA。除用T4基因32蛋白質和T4多聚酶替代klenow酶外，基本上按照Zoller，M.et al.(1983)的方法，利用如下所列的引物進行定點誘變。引物除了設計的突變外，都含有單一位點以對帶有適當突變的克隆進行鑒定。
第138位色氨酸變為苯丙氨酸133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143CAC CTA ATT AAA GCT TTC ACA CAT TTT CAT TTT Seq ID No 42Hind III第138位色氨酸變為酪氨酸133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143CAC CTA ATT AAA GCT TAC ACA CAT TTT CAT TTT Seq ID No 43Hind III第138位色氨酸變為丙氨酸--這一引物還在第138位的上游和下游引入了單一位點。127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142C CGC GTA ATT TCC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC GCA ACA CAT TTT CATBspE I143 144 145 146 147TTT CCC GGG CGC GGC AGSeq ID No 44Xma I突變體通過限制分析鑒定，且W138F和W138Y經DNA測序確定。W138A序列在單一位點BspEI和XmaI位點間有一核苷酸缺失，而其它基因序列正確。含有W138X和M197T雙突變的1.37kb的SstII/SstI片段從M13MP18移至表達載體pBLapr，從而得到pBLapr(W138F，M197T)和pBLapr(W138Y，M197T)。含有單一BspEI和XmaI位點的片段克隆入pBLapr(BspEI，XmaI，M197T)，它可用于克隆帶有第138位其他氨基酸取代的誘變盒。
第138位氨基酸的單突變按照前面實施例中的通用方法，制備了一些W138的單變異體(F，Y，L，H和C)。實施例7的質粒pBLapr(W138X，M197T)中含有M197T突變的1.2kb Asp718-SstI片段被第197位是甲硫氨酸的野生型片段所置換，從而得到pBLapr(W138F)，pBLapr(W138Y)和pBLapr(BspEI，XmaI)。
利用下面的引物將合成誘變盒連接入pBLapr(BspEI，XmaI)載體，制備出突變體W138L，W138H和W138C。
第138位色氨酸變為亮氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC CTA ACA CAT TTT CAT TTT CSeq ID No 45第138位色氨酸變為組氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC CAC ACA CAT TTT CAT TTT CSeq ID No 46第138位色氨酸變為半胱氨酸CC GGA GAA CAC CTA ATT AAA GCC TGC ACA CAT TTT CAT TTT CSeq ID No 47雙突變體M197T/W138F和M197T/W138Y與氯胺-T的反應與野生型進行對比(AA20＝0.75mg/ml，M197T/W138F＝0.64mg/ml，M197T/W138Y＝0.60mg/ml；50mM乙酸鈉，pH5.0)。其結果見圖19所示，第138位色氨酸的誘變使變異體對氯胺-T更具抗性。
實施例11多重突變體的制備按照實施例1，3，5和10的方法制備下列多重突變體M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T以及M15T/W138Y/M197T。其中的某些多重突變體在前面已有示例，例如，W138Y/M197T在實施例10中制備和測試。這些多重突變體通過限制性分析鑒定。
對本發明范圍中的各種多重突變體作為清潔產品(自動洗碗洗滌劑)添加劑時的特性進行了進一步的測試。這些測試詳細描述如下。
穩定性測試在硬度為7gpg的水中制備4000ppm的含有過硼酸鹽和TAED的自動洗碗洗滌劑(ADD)溶液。將上面所述的淀粉酶突變體加入此ADD溶液，使得按照Ceralpha方法(Megazym(Austr.)Pty.Ltd.，Parramatta，NSW，Australia)測得的比率為0.4。一組樣品保持在室溫(21-23℃)30分鐘(不加熱)。第二組樣品加入酶后從室溫加熱到65℃(加熱)。加入酶30分鐘后，測量淀粉酶突變體的活性并計算相對于加入酶時的初活性的活性比(相對活性％)。
如圖20所示的結果表明，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的+197位的甲硫氨酸應加以修飾以獲得在含有ADD+過硼酸鹽+TAED的配制品中的穩定性。
淀粉水解試驗在硬度為7gpg的水中制備4000ppm的含有過硼酸鹽和TAED的自動洗碗洗滌劑(ADD)溶液，并加入三片煮過的肘狀空心面。將上面所述的某種淀粉酶突變體加入此ADD溶液，使得終濃度為5ppm活性酶。試管在50℃加熱30分鐘，通過二硝基水楊酸法，以一葡萄糖標準曲線測量還原糖濃度。結果見表VI
表VI所示的結果表明，與不加酶和野生型α-淀粉酶的對照相比，M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T具有良好的特性。
燕麥粥污漬在碟子中評價地涂上一塊烹熟的混合燕麥糊并于37℃干燥過夜。將碟子置于一個ASKO 770型洗碗機中，用10g含有5％過硼酸鹽、3％TAED和11mg淀粉酶的自動洗碗洗滌劑，于45℃在“快速清洗”檔清洗。碟子在玷污前、玷污后和清洗后稱重，并計算所有碟子上污漬洗除的平均百分率。其數據如表VII所示。
數據表明突變酶所提供的效益大于野生型所提供的。野生型淀粉酶在清除燕麥粥時比不含淀粉酶的ADD多提供20％的清潔效益。
實施例12洗碗清潔組合物將Korex自動洗碗洗滌劑配以1％(w/w)野生型和突變型淀粉酶顆粒，其中加入了5％(w/w)過硼酸鹽一水合物和3％(w/w)TAED。這些配制品的樣品于室溫(21-23℃)或38℃及80％相對濕度條件下放置四周。結果如圖21和22所示。
數據表明按Ceralpha法測量的野生型淀粉酶的活性在洗滌劑中隨儲存時間的增加而降低。在室溫下，突變酶是完全穩定的。在38℃和80％相對濕度的條件下，所有的突變體都比野生型穩定。
將這些突變型淀粉酶配制在自動洗碗洗滌劑中的優點在于，當存在過硼酸鹽和TAED時這些突變體明顯比野生型更為穩定，而且在清洗時除去淀粉食品污漬方面提供了顯著的操作效益。
實施例13氧化穩定性蛋白酶/氧化穩定性淀粉酶的穩定性研究將含有1)野生型蛋白酶和野生型淀粉酶；或者2)按照US Re 34606所述方法制備的對漂白粉穩定的蛋白酶(GG36-M222S)和對漂白粉穩定的淀粉酶(AA20-M15T/W138Y/M197T)的酶顆粒溶于緩沖液(含有0.1M硼酸鈉pH10.2和0.005％Tween80，每種酶的濃度為12.5mg)。在9ml這種溶液中加入1ml蒸餾水或者1ml 30％過氧化氫。該溶液于25℃孵育30分鐘后，測量每種溶液中蛋白酶和淀粉酶的活性并以原活性的％表示。其結果如下表VIII所示。
表VIII
數據表明一種對漂白粉穩定的淀粉酶突變體與一種對漂白粉穩定的蛋白酶突變體的結合使用，兩者都在氧化敏感的氨基酸殘基具有突變，可在抗漂白粉失活作用的配制品中提供蛋白酶和淀粉酶的加和效益。在漂白粉中30分鐘后，對漂白粉穩定的淀粉酶與對漂白粉穩定的蛋白酶的結合使用，能保持其大部分的原有活性；而在同樣的時間內，野生型酶的結合使用導致其80％的原有活性的喪失。
序列表(1)一般信息(i)申請人克里斯托弗·巴內特科林·米欽森斯科特·D·鮑爾(ii)發明名稱改進的清潔組合物(iii)序列數目68(iv)聯系地址(A)地址金內克國際公司(B)街道180 Kimball Way(C)城市South San Francisco(D)州CA(E)國家美國(F)郵政編碼94080(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機類型IBM兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Relase#1.0，#1.25版(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日期(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Horn，Margaret A.
(B)注冊號33，401(C)參考/文檔號GC220-3(ix)電子通訊信息(A)電話(415)742-7536(B)電傳(415)742-7217(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度56堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GATCAAAACA TAAAAAACCG GCCTTGGCCC CGCCGGTTTT TTATTATTTT TGAGCT56(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2TGGGACGCTG GCGCAGTACT TTGAATGGT 29(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3TGATGCAGTA CTTTGAATGG TACCTGCCCA ATGA34(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTATTTGT TGTATGCCGA TATCGACTAT GACCAT 36(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CGGGGAAGGA GGCCTTTACG GTAGCT 26(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6GCGGCTATGA CTTAAGGAAA TTGC24(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7CTACGGGGAT GCATACGGGA CGA 23(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8CTACGGGGAT TACTACGGGA CCAAGGGAGA CTCCC35(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CCGGTGGGGC CAAGCGGGCC TATGTTGGCC GGCAAA 36(2)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長度45堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10CATCAGCGTC CCATTAAGAT TTGCAGCCTG CGCAGACATG TTGCT 45(2)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11GATTATTTGG CGTATGCCGA TATCGACTAT GACCAT 36(2)SEQ ID NO.12的信息
(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12GGGAAGTTTC GAATGAAAAC G 21(2)SEQ ID NO.13的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13GTCGGCATAT GCATATAATC ATAGTTGCCG TTTTCATT 38(2)SEQ ID NO.14的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA TCTATGCCGA C 41(2)SEQ ID NO.15的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT TCTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.16的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGG TTTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.17的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA GCTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.18的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC CTTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.19的信息
(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO19CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA CATATGCCGA C 41(2)SEQ ID NO.20的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO20CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT ACTATGCCGA C 41(2)SEQ ID NO.21的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO21CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC ACTATGCCGA C 41(2)SEQ ID NO.22的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO22CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGG GCTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.23的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO23CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGC AATATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.24的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO24CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA ACTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.25的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO25GCAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA AATATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.26的信息(i)序列特征
(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO26CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGG ATTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.27的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO27CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGG AATATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.28的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO28CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT GTATTGCCGA C41(2)SEQ ID NO.29的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO29CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGT GGTATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.30的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO30CGAATGAAAA CGGCAACTAT GATTATTTGA GATATGCCGA C41(2)SEQ ID NO.31的信息(i)序列特征(A)長度1968堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO31AGCTTGAAGA AGTGAAGAAG CAGAGAGGCT ATTGAATAAA TGAGTAGAAA GCGCCATATC 60GGCGCTTTTC TTTTGGAAGA AAATATAGGG AAAATGGTAC TTGTTAAAAA TTCGGAATAT 120TTATACAACA TCATATGTTT CACATTGAAA GGGGAGGAGA ATCATGAAAC AACAAAAACG 180GCTTTACGCC CGATTGCTGA CGCTGTTATT TGCGCTCATC TTCTTGCTGC CTCATTCTGC 240AGCAGCGGCG GCAAATCTTA ATGGGACGCT GATGCAGTAT TTTGAATGGT ACATGCCCAA 300TGACGGCCAA CATTGGAAGC GTTTGCAAAA CGACTCGGCA TATTTGGCTG AACACGGTAT 360TACTGCCGTC TGGATTCCCC CGGCATATAA GGGAACGAGC CAAGCGGATG TGGGCTACGG 420TGCTTACGAC CTTTATGATT TAGGGGAGTT TCATCAAAAA GGGACGGTTC GGACAAAGTA 480CGGCACAAAA GGAGAGCTGC AATCTGCGAT CAAAAGTCTT CATTCCCGCG ACATTAACGT 540TTACGGGGAT GTGGTCATCA ACCACAAAGG CGGCGCTGAT GCGACCGAAG ATGTAACCGC 600GGTTGAAGTC GATCCCGCTG ACCGCAACCG CGTAATTTCA GGAGAACACC TAATTAAAGC 660CTGGACACAT TTTCATTTTC CGGGGCGCGG CAGCACATAC AGCGATTTTA AATGGCATTG 720GTACCATTTT GACGGAACCG ATTGGGACGA GTCCCGAAAG CTGAACCGCA TCTATAAGTT 780TCAAGGAAAG GCTTGGGATT GGGAAGTTTC CAATGAAAAC GGCAACTATG ATTATTTGAT 840GTATGCCGAC ATCGATTATG ACCATCCTGA TGTCGCAGCA GAAATTAAGA GATGGGGCAC 900TTGGTATGCC AATGAACTGC AATTGGACGG TTTCCGTCTT GATGCTGTCA AACACATTAA 960ATTTTCTTTT TTGCGGGATT GGGTTAATCA TGTCAGGGAA AAAACGGGGA AGGAAATGTT1020TACGGTAGCT GAATATTGGC AGAATGACTT GGGCGCGCTG GAAAACTATT TGAACAAAAC1080AAATTTTAAT CATTCAGTGT TTGACGTGCC GCTTCATTAT CAGTTCCATG CTGCATCGAC1140ACAGGGAGGC GGCTATGATA TGAGGAAATT GCTGAACGGT ACGGTCGTTT CCAAGCATCC1200GTTGAAATCG GTTACATTTG TCGATAACCA TGATACACAG CCGGGGCAAT CGCTTGAGTC1260GACTGTCCAA ACATGGTTTA AGCCGCTTGC TTACGCTTTT ATTCTCACAA GGGAATCTGG1320ATACCCTCAG GTTTTCTACG GGGATATGTA CGGGACGAAA GGAGACTCCC AGCGCGAAAT1380TCCTGCCTTG AAACACAAAA TTGAACCGAT CTTAAAAGCG AGAAAACAGT ATGCGTACGG1440AGCACAGCAT GATTATTTCG ACCACCATGA CATTGTCGGC 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Lys65 70 75 80Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr100 105 110Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val115 120 125Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro130 135 140Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe145 150 155 160Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys165 170 175Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg(2)SEQ ID NO.33的信息(i)序列特征(A)長度511個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO33Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe15 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly35 40 45His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His Gly50 55 60Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln Ala65 70 75 80Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe His85 90 95Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu Gln100 105 110Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp115 120 125Val Val Ile Asn His Lyg Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val Thr130 135 140Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly Glu145 150 155 160His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg Gly Ser165 170 175Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His phe Asp Gly Thr Asp180 185 190Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly Lys195 200 205Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu210 215 220Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu Ile225 230 235 240Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly Phe245 250 255Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp Trp260 265 270Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val Ala275 280 285Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys290 295 300Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln Phe305 310 315 320His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu Leu325 330 335Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe Val340 345 350Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val Gln355 360 365Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu Ser370 375 380Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly Asp385 390 395 400Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile Leu405 410 415Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe Asp420 425 430His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala435 440 445Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys450 455 460Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp Ile465 470 475 480Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp Gly485 490 495Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg500 505 510(2)SEQ ID NO.34的信息(i)序列特征(A)長度520個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO34Met Arg Gly Arg Gly Asn Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser15 10 15Phe Arg Leu Val Leu Met Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile20 25 30Thr Lys Thr Ser Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp35 40 45Tyr Thr Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala50 55 60Glu His Leu Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala65 70 75 80Tyr Lys Gly Leu Ser Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu85 90 95Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr100 105 110Gly Thr Lys Ser Glu Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg115 120 125Asn Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala130 135 140Asp Ala Thr Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg145 150 155 160Asn Gln Glu Thr Ser Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe165 170 175Arg Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp180 185 190Tyr His Phe Asp Gly Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg195 200 205Ile Phe Lys Phe Arg Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser210 215 220Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr225 230 235 240Asp His Pro Asp Val Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr245250 255Ala Asn Glu Leu Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His260 265 270Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala275 280 285Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala290 295 300Gly Lys Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val305 310 315 320Phe Asp Val Pro Leu His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly325 330 335Gly Gly Tyr Asp Met Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg340 345 350His Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro355 360 365Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala370 375 380Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr385 390 395 400Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser405 410 415Leu Lys Asp Asn Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala420 425 430Tyr Gly Pro Gln His Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp435 440 445Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu450 455 460Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys465 470 475 480Asn Ala Gly Glu Thr Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr485 490 495Val Lys Ile Gly Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly500 505 510Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Lys515 520(2)SEQ ID NO.35的信息(i)序列特征(A)長度548個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質Val Leu Thr Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Met Phe Leu Leu1 5 10 15Ala Phe Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Cys Pro Thr Gly Arg His Ala20 25 30Lys Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp35 40 45Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala50 55 60Asn Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Ser Leu Pro Pro Ala65 70 75 80Tyr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu85 90 95Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr100 105 110Gly Thr Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala115 120 125Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala130 135 140Asp Gly Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg145 150 155 160Asn Gln Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe165 170 175Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp180 185 190Tyr His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg195 200 205Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp210 215 220Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met225 230 235 240Asp His Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr245 250 255Val Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Gly Leu Lys His260 265 270Ile Lys Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln275 280 285Thr Gly Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile290 295 300Asn Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu305 310 315 320Phe Asp Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly325 330 335Gly Ala Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp340 345 350Gln Pro Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Asn Pro355 360 365Ala Lys Arg Cys Ser His Gly Arg Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr370 375 380Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly385 390 395 400Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys405 410 415Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln420 425 430His Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly435 440 445Val Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly450 455 460Ala Gly Arg Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys465 470 475 480Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn485 490 495Ser Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val500 505 510Trp Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr515 520 525Thr Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp His Glu Pro Arg Leu530 535 540Val Ala Trp Pro545(2)SEQ ID NO.36的信息(i)序列特征(A)長度483個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO36Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu20 25 30Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr100 105 110Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val115 120 125Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro130 135 140Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe145 150 155 160Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys165 170 175Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg(2)SEQ ID NO.37的信息(i)序列特征(A)長度487個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO37Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu1 5 10 15Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp20 25 30Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro35 40 45Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp50 55 60Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys65 70 75 80Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser85 90 95Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly100 105 110Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp115 120 125Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His130 135 140Phe His Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His145 150 155 160Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn165 170 175Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn180 185 190Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp195 200 205His Pro Asp Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala210 215 220Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile225 230 235 240Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr245 250 255Gly Lys Glu Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly260 265 270Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe275 280 285Asp Val Pro Leu His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly290 295 300Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His305 310 315 320Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly325 330 335Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr340 345 350Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly355 360 365Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu370 375 380Lys His Lys Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr385 390 395 400Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr405 410 415Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile420 425 430Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn435 440 445Ala Gly Glu Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val450 455 460Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser465 470 475 480Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg485(2)SEQ ID NO.38的信息(i)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO38Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Thr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phei 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30(2)SEQ ID NO.39的信息(i)序列特征(A)長度33個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO39Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys20 25 30Ser(2)SEQ ID NO.40的信息(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO40Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Ala Ala20 25 30Ala Ala Asn35(2)SEQ ID NO.41的信息(i)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO41Met Arg Ser Lys Thr Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu1 5 10 15Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Asn Leu20 25 30(2)SEQ ID NO.42的信息(i)序列特征
(A)長度33堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO42CACCTAATTA AAGCTTTCAC ACATTTTCAT TTT33(2)SEQ ID NO.43的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO43CACCTAATTA AAGCTTACAC ACATTTTCAT TTT33(2)SEQ ID NO.44的信息(i)序列特征(A)長度66堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO44CCGCGTAATT TCCGGAGAAC ACCTAATTAA AGCCGCAACA CATTTTCATT TTCCCGGGCG 60CGGCAG 66(2)SEQ ID NO.45的信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO45CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCTAACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.46的信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO46CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCCACACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.47的信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO47CCGGAGAACA CCTAATTAAA GCCTGCACAC ATTTTCATTT TC 42(2)SEQ ID NO.48的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO48GATGCAGTAT TTCGAACTGG TATA 24(2)SEQ ID NO.49的信息
(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO49TGCCCAATGA TGGCCAACAT TGGAAG 26(2)SEQ ID NO.50的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO50CGAATGGTAT GCTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.51的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO51CGAATGGTAT CGCCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.52的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO52CGAATGGTAT AATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.53的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID N053CGAATGGTAT GATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.54的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO54CGAATGGTAT CACCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.55的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO55CGAATGGTAT AAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.56的信息(i)序列特征
(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO56CGAATGGTAT CCGCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.57的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO57CGAATGGTAT TCTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.58的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO58CGAATGGTAC ACTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.59的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO59CGAATGGTAT GTTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.60的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO60CGAATGGTAT TGTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.61的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO61CGAATGGTAT CAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.62的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO62CGAATGGTAT GAACCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.63的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO63CGAATGGTAT GGTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.64的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO64CGAATGGTAT ATTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.65的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO65CGAATGGTAT TTTCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.66的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO66CGAATGGTAC TGGCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.67的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO67CGAATGGTAT TATCCCAATG ACGG 24(2)SEQ ID NO.68的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO68CCGTCATTGG GACTACGTAC CATT 2權利要求
1.一種改進的含漂白粉的清潔組合物，所述的改進包括在該含漂白粉的清潔組合物中加入一種突變型α-淀粉酶，該突變型α-淀粉酶為一編碼α-淀粉酶的突變DNA序列的表達產物，該突變DNA序列是通過對一種前體α-淀粉酶的相當于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的M+197位的甲硫氨酸進行取代并對相當于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的M+15或W+138位的一個或多個甲硫氨酸或色氨酸進行取代而得到的。
2.如權利要求1所述的改進的清潔組合物，其中該清潔組合物為一洗碗清潔組合物。
3.如權利要求1所述的改進的清潔組合物，其中突變型α-淀粉酶選自由M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T； M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T組成的一組。
4.如權利要求1所述的改進的清潔組合物，進一步包括一種突變型蛋白酶，該突變型蛋白酶為一編碼蛋白酶的突變DNA序列的表達產物，該突變DNA序列是通過對一種前體蛋白酶的相當于解淀粉芽孢桿菌蛋白酶的M+222位的甲硫氨酸進行取代而得到的。
5.如權利要求4所述的改進的清潔組合物，其中突變型蛋白酶含有選自由丙氨酸、半胱氨酸和絲氨酸組成的一組的取代。
6.如權利要求4所述的改進的清潔組合物，含有選自由M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T組成的一組的一個α-淀粉酶突變體，以及一個選自由M222C，M222S和M222A組成的一組的一個蛋白酶突變體。
7.如權利要求6所述的改進的清潔組合物，其為顆粒狀組合物。
全文摘要
本發明公開了由天然存在的或重組的α-淀粉酶DNA序列而衍生的新的α-淀粉酶突變體。這些突變型α-淀粉酶一般通過對編碼天然存在的或重組的α-淀粉酶DNA序列的前體進行體外修飾而得到，這些體外修飾使得前體α-淀粉酶氨基酸序列中的一個或多個易氧化氨基酸殘基發生取代(置換)或缺失。這些突變型α-淀粉酶與其前體相比，改變了氧化穩定性和/或改變了pH特性范圍和/或改變了熱穩定性。本發明還公開了含有這種淀粉酶的洗滌劑和淀粉液化組合物，以及使用這種淀粉酶的方法。尤為優選的是對來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的MET197或MET15或者TRP138位點的殘基、或者其它微生物來源(芽孢桿菌，曲霉)的α-淀粉酶相應位點進行修飾的α-淀粉酶突變體。
文檔編號C12R1/10GK1158637SQ95194852
公開日1997年9月3日 申請日期1995年8月9日 優先權日1994年8月11日
發明者克里斯托弗·C·巴內特, 科林·米欽森, 斯科特·D·鮑爾 申請人:金內克國際公司