用于乳頭狀瘤病毒的多核苷酸疫苗的制作方法

專利名稱：用于乳頭狀瘤病毒的多核苷酸疫苗的制作方法
相關的其它申請這是1994年6月30日提交的，現(xiàn)正在決定中的U.S.S.N.08/268.424的部分繼續(xù)。發(fā)明領域本發(fā)明涉及新的藥物產品的生產和使用一種核酸，當它被直接導入活的脊椎動物組織中時，可誘導一種特異性識別乳頭狀瘤病毒的免疫反應。發(fā)明背景乳頭狀瘤病毒(PV)感染可在包括人，綿羊，狗，貓，兔，猴，蛇和牛的各種動物中發(fā)生。乳頭狀瘤病毒感染上皮細胞，一般地在感染部位誘發(fā)良性的上皮或纖維上皮瘤。乳頭狀瘤病毒是種屬特異性的感染原，例如，人乳頭狀瘤病毒一般不感染人以外的動物。
依據(jù)它們感染的宿主，可將乳頭狀瘤病毒劃分為不同的組。根據(jù)DNA序列的同種性可進一步將人乳頭狀瘤病毒(HPV)劃分為超過60種類型(綜述，參見乳頭狀瘤病毒和人類癌癥，H.Pfister(ed.)，CRC Press，Inc.，1990)。乳頭狀瘤病毒感染可誘導類型特異性的免疫原性反應，其中針對一種類型的乳頭狀瘤病毒的感染的中和免疫不會賦于對另一種類型的乳頭狀瘤病毒的免疫。
人不同類型的HPV引起不同的疾病。HPV類型1，2，3，4，7，10和26-29在正常和免疫損傷個體中都引起良性疣。HPV類型5，8，9，12，14，15，17，19-25，36和46-50在免疫損傷個體中引起扁平(flat)疣損害。HPV類型6，11，34，39，41-44和51-55引起非惡性的生殖道濕疣。HPV類型16和18引起生殖道上皮發(fā)育不良并且與大多數(shù)的原位和侵襲性的子宮頸癌，陰道癌，外陰和肛管癌相關。
動物系統(tǒng)中的免疫學研究證明針對乳頭狀瘤病毒抗原的中和抗體的產生可抑制同源病毒的感染。由于不能在體外培養(yǎng)乳頭狀瘤病毒而使有效的人乳頭狀瘤病毒疫苗的進展緩慢。尤其是由于缺少合適的用于直接研究HPV的動物宿主而使有效的HPV疫苗進展緩慢。
抗體對乳頭狀瘤病毒的中和是類型特異性的并且依賴于病毒表面組成性的表位。
乳頭狀瘤病毒是小的(50-60nm)，非包被的，二十面體DNA病毒，它編碼早期和晚期基因。病毒基因組的開放讀碼框(ORF)被稱為E1到E7和L1到L2，其中“E”指早期而“L”指晚期。L1和L2編碼病毒殼體蛋白。E1～E3和E5～E7與病毒復制和轉化功能相關。
L1蛋白是主要的含殼蛋白，分子量為55-60K。L2蛋白是次要的含殼蛋白，它預期的分子量約是55K而聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的表觀分子量是75～100K。電子顯微鏡和免疫學數(shù)據(jù)提示大多數(shù)L2蛋白位于L1蛋白的內部。L2蛋白在不同的乳頭狀瘤病毒中是高度保守的，特別是C末端的10個堿性氨基酸。在不同的乳頭狀瘤病毒中L1ORF是高度保守的。
L1和L2基因己被用于產生可有效用于預防以及治療乳頭狀瘤病毒感染的重組蛋白質。Zhou等將HPV類型16的L1和L2基因克隆入痘苗病毒載體并用重組載體感染CV-1哺乳動物細胞以產生病毒樣(Virus-like)顆粒(VLP)。這些研究表明HPV類型16L1和L2蛋白在上皮細胞中的表達對VLP的裝配是必需的也是充分的。L1蛋白單獨表達或L2蛋白單獨表達或者用含L1和L2基因的單個重組痘苗病毒載體兩次感染細胞都不能產生顆粒。
細菌來源的重組牛乳頭狀瘤病毒L1和L2已有生產。針對重組細菌蛋白的中和血清與天然病毒有低水平的交叉反應，主要是因為天然和細菌來源的蛋白在構型上不同。
已用表達HPV16L1或HPV16L2ORF的重組桿狀病毒感染昆蟲SF9細胞并且產生了重組的L1和L2蛋白。Western印跡分析表明桿狀病毒來源的L1和L2蛋白與抗HPV16的抗體反應。也已證明可用重組啤酒糖酵母菌株生產HPV16L1和HPV16L2蛋白。
因為細胞毒T淋巴細胞(CTL)在小鼠和人中都能識別來源自保守的內部病毒蛋白的表位并且被認為對針對病毒的反應是重要的，因此努力開發(fā)對不同病毒株可提供異種保護的CTL疫苗。
已知當其T細胞受體識別了與MHCI類分子相關的病毒多肽時，CD8+CTL即可殺死病毒感染的細胞。這些多肽源自內源合成的病毒性蛋白質，而不管這些蛋白質在病毒內的定位或功能如何。因此，CTL通過識別保守的病毒性蛋白質的表位來提供毒株間的交叉保護作用。當MHCI類分子相關而被CTL識別的多肽源自那些位于或穿過細胞質或內質網的蛋白質。因此，一般說來，進入內體(endosomal)處理過程的外源蛋白(如MHCII類分子呈遞的抗原的事情)，不能有效引起CD8+CTL反應。
產生CTL反應的努力包括用復制載體在細胞內產生蛋白質抗原或者曾致力于將肽導入胞質溶膠中。這兩種方法都有局限性而減少了其作為疫苗的實用性。逆轉錄病毒載體對能做為融合蛋白表達但同時又要保持重組病毒復制能力的多肽的大小和結構有限制，并且載體如痘苗在接下來的免疫反應中的效率可能會受到針對載體本身的免疫反應的損害。另外，病毒性載體和修飾的致病原有其固有的危險性而限制了其在人中的應用。而且，對呈遞的肽表位的選擇依賴于個體MHC抗原的結構，因此，肽疫苗由于其在雜交繁殖的群體中的MHC單元型的多樣性而只有有限的效率。
已經證明，在肌肉內接種多核苷酸構建體，即編碼蛋白質的DNA質粒，可在原位的肌肉細胞中產生蛋白質。通過使用編碼病毒蛋白質的cDNA質粒，可提供抗后繼攻擊的同種保護作用的抗體反應即可發(fā)生。使用多核苷酸疫苗(PNV)產生抗體可導致抗體反應持續(xù)時間的增加并可提供具有適當?shù)姆g后修飾及天然蛋白質構象(相對重組蛋白質)的一種抗原。在PNV免疫后在體內產生的病毒蛋白質可以采取其天然構象形式，因而引起病毒中和抗體的產生。用這種方式產生CTL反應的優(yōu)點是不使用活的潛在的致病原載體或減毒病毒即可提供對交叉株的保護作用。
Benvenisty等報道通過腹膜內，靜脈內或肌內導入小鼠中的CaCl2沉淀的DNA可被表達。最近，有人報道在小鼠中肌內(i.m.)注射DNA表達載體，結果是肌肉細胞吸收DNA并表達DNA所編碼的蛋白質(J.A.Wolff等，1990；G.Ascadi等，1991)。已證明所注射的質粒被保持在染色體外并且是不復制的。隨后在大鼠，魚和靈長目的骨骼肌和大鼠的心肌中肌內注射之后的持續(xù)表達即有報道。用核酸作為免疫原的技術在WO90/11092(1990年10月4日)中有報道，其中裸露的多核苷酸被用于免疫脊椎動物。
該方法并不限于肌內注射。例如，將用編碼牛生長激素(BGH)的DNA包被的金微粒導入小鼠的皮膚，結果在小鼠中產生抗BGH抗體。一種噴射注射器(jet)已被用于轉染活動物的皮膚，肌肉，脂肪和乳房組織。Donnelly，Ulmer和Liu等對各種核酸的導入方法做了綜述(Imnunologist，220，1994)。
本發(fā)明研究多種將核酸導入活組織中以誘導蛋白質表達的方法。本發(fā)明提供了將病毒蛋白質導入抗原處理途徑以產生病毒特異性CTL和抗體的方法。因此，本發(fā)明滿足了對能引起抗病毒性致病原乳頭狀瘤病毒的所預期的預防性免疫反應的特異性治療劑的需要。因此，本發(fā)明提供了編碼人乳頭狀瘤病毒的病毒蛋白質的DNA構建體，它可編碼誘導特異性的CTL和抗體。
針對后繼的病毒攻擊的DNA疫苗接種的保護效率已用編碼一個或多個上述病毒蛋白質的非復制的質粒DNA的免疫接種進行了證實。該方法有其優(yōu)點是因為不需要感染原，不需要病毒顆粒的裝配，并可進行決定簇的篩選。而且，因為在各種類型的乳頭狀瘤病毒中一些基因產物的序列是保守的，針對與獲得克隆基因的毒株同種或異種的不同類型的乳頭狀瘤病毒之隨后攻擊的保護是可行的。發(fā)明概述編碼乳頭狀瘤病毒基因產物的能在被直接導入動物組織中時表達的DNA構建體，是能提供抗乳頭狀瘤病毒感染的免疫保護作用的新的預防性和治療性藥物。附圖簡述

圖1，表示在注射有CRPVL1DNA或L1和L2DNA混合物(y軸)的兔中誘導的病毒中和抗體的反應，以及誘導上述兔產生的相應的ELISA效價。
圖2，注射L1DNA的兔的抗體反應，用給定的任意的選擇劑量1mgL1DNA單次免疫接種的兔抗L1VLP的ELISA效價被示出。注射對照DNA的兔沒有產生可檢測的抗L1VLP抗體。
圖3，L1VLP對用L1DNA免疫接種得到的抗血清的吸收作用。A，正常血清，和用如(15)中天然或變性VLP吸收的免疫血清的病毒中和活性被測試。在攻擊后7周所測的3個攻擊位點的濕疣的平均面積，被示出。B，來自注射L1DNA的兔的免疫血清被天然(圓圈)或變性(方塊)的表達于重組酵母(啤酒糖酵母)菌株的L1VLP連續(xù)吸收三次。在每次連續(xù)吸收之后，用ELISA測定等份血清抗桿狀病毒來源的L1VLP的抗體活性。用被吸收物質的ELISA效價對未吸收血清的最初ELISA效價的百分比做圖。
圖4，測定抗CRPVE2(A)和CRPVE7(b)抗體的ELISA反應。凈反應速率(免疫接種4次后的速率減去同樣稀釋度的免疫接種前的速率)，對每個兔個體來說以mOD/分鐘的形式被示出。發(fā)明詳述編碼乳頭狀瘤病毒的基因產物的能在被直接導入動物組織時表達的DNA構建體，是能提供抗乳頭狀瘤病毒感染之免疫保護作用的新的預防性和治療性藥物。
本發(fā)明提供了當其被直接導入例如美洲產白尾棕色兔和人等脊椎動物時即可誘導編碼的肽在動物組織內表達的多核苷酸。當該肽是在動物中除感染期之外不存在的肽時，例如與乳頭狀瘤病毒(PV)相關的蛋白質時，動物的免疫系統(tǒng)即被激活以產生保護反應。因為這些外源性蛋白質由宿主動物細胞產生，它們即被主要組織相容性復合物(MHC)處理和呈遞。該識別與被相關生物體真實感染時出現(xiàn)的識別相類似，本文所示結果是對可防止強毒性病毒感染的免疫反應的誘導。
如本文所用，多核苷酸指一種含必需的調控元件的核酸，以便在被導入活的脊椎動物細胞后它可指導細胞機器產生由包含該多核苷酸的基因所編碼翻譯產物。本領域的技術人員可從本說明書得知本發(fā)明的多種實施方案。例如，可使用不同的轉錄啟動子，終止子，攜帶者(Carrier)載體或特殊的基因序列。
本發(fā)明提供了這樣的核酸，當其被導入動物組織中后它即可在體內誘導乳頭狀瘤病毒基因產物的表達。因此，例如，將本發(fā)明的DNA構建體注射入兔肌肉中可誘導所編碼基因產物的表達并產生病毒中和抗體。在用美洲產白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒后續(xù)的攻擊中，所用的劑量使所有的對照兔產生了損害，但注射了多核苷酸疫苗的兔卻只有很少的損害。因此，本發(fā)明公開了一種對防止人乳頭狀瘤病毒感染有用的疫苗。
編碼乳頭狀瘤病毒蛋白質的DNA構建體可在動物中引起保護性的免疫反應。如下文將要詳細介紹的，動物的免疫反應包括病毒中和抗體和兔中抗同種類型的乳頭狀瘤病毒之病毒攻擊的保護作用。
在一種實施方案中，疫苗產品將由獨立的編碼例如，乳頭狀瘤病毒L1，L2，E2，E4蛋白的DNA質粒單獨或聯(lián)合起來組成。
預期的相對其他疫苗的優(yōu)點包括但不限于由CTL反應所致的保護廣度增大，抗體的廣度增加，并且保護的持續(xù)時間增加。
在本發(fā)明的一種實施方案中，來自臨床分離物的HPV類型6a，6b，11，16或18蛋白質序列的L1或L2或L1+L2被克隆進入表達載體中。該載體包含一個供DNA聚合酶轉錄用的啟動子，并在HPV編碼序列末端含有一個轉錄終止子。啟動子的例子包括但不限于CMV。轉錄終止子的例子包括但不限于BGH。另外，為了在制備藥物中有所幫助，一種在大腸桿菌中表達的抗生素抗性標記也優(yōu)選包含在該表達載體中。新霉素抗性基因或其他任意的藥理上可接受的抗生素抗性標記也可被使用。另外，為了有助于在原核生物的發(fā)酵中產生高水平的藥物，該載體最好能含有一個復制起點并且是高拷貝好的。各種商業(yè)供應的原核克隆載體即提供了這些優(yōu)點。期望能去除非必需的DNA序列。
因此，本發(fā)明提供了編碼作為免疫原的PV蛋白的表達載體。本發(fā)明提供了一種不需自我復制試劑即可誘導交叉類型的保護性免疫的方法。另外，用DNA免疫接種有其他的優(yōu)點。首先，這種免疫接種方法可用于腫瘤以及感染原，因為CD8+CTL反應對上兩者的病理生理學過程的免疫干擾都是重要的。因此，引起一種抗轉化過程必須的蛋白質的免疫反應可能是一種有效的癌癥預防或免疫治療的方法。其次，在注射編碼一種病毒蛋白質的DNA之后產生針對所表達的蛋白質的抗體提示該技術提供了一種簡便和有效的制備誘導抗體的疫苗的方法。
DNA構建體相對于傳統(tǒng)的蛋白質純化在生產和純化方面的簡化方便了組合疫苗的產生。因此，可以制備，混合和共同施用復合構建體，例如編碼一種或多種類型HPV的L1和L2蛋白的構建體。最后，因為在注射DNA之后蛋白質的表達可以維持一段時間，B和T細胞的記憶持續(xù)可得到增強，從而產生長期的體液和細胞介導的免疫。
所建議的HPV疫苗的局限性強調需要開發(fā)更有效的防止感染和減輕疾病的方法。一種抗保守蛋白質的經改良的CTL反應的產生可提供明顯的長期的交叉反應免疫力。
我們已通過檢測直接抗CRPV抗原的宿主免疫反應證明了兔中PNV構建體的蛋白質表達。這些動物實驗結果表明直接的DNA注射可以提供一種保護人抗HPV感染及疾病的方法。
比較了一定范圍的劑量的免疫原性以便優(yōu)化所用的濃度。預測10，50，100，和200μg的DNA劑量對人是有效的。
人的有效性在接受HPVDNA疫苗的自愿者中被顯示。疫苗的組成，劑量和施用制度是以前述的研究為基礎的。臨床有效性以感染率，疾病評分，和病癥持續(xù)時間表示。將這些臨床研究結果與實驗室對宿主免疫反應和病毒檢測的評價相對比以確定與保護作用相關的替代標記。
制備和純化DNA構建體的分子生物學使制備本發(fā)明的DNA藥物成為可能。盡管標準的分子生物學的技術足以生產本發(fā)明的產品，本文所公開的特異的構建體卻提供了可提供交叉毒株保護作用的新的治療劑。
導入疫苗接受體中的可表達的DNA的量將依賴于在DNA構建體中所使用的轉錄和翻譯啟動子的強度，以及所表達的基因產物的免疫原性。一般說來，一個免疫學或預防學有效的量大約1μg～1mg；并且優(yōu)選約10μg～300μg被直接施用于肌肉組織。皮下注射，真皮內導入，皮肌印跡，以及其他形式的施用方式如腹膜內，靜脈內或吸入給藥也可接受。還可建議提供加強(booster)免疫接種。
該多核苷酸可以是裸露的，即，不與任何蛋白，佐劑或其他可影響接受體免疫系統(tǒng)的藥劑相伴。在這種情況下，期望多核苷酸是一種生理上可接受的溶液形式，例如，但不限于無菌的鹽水或無菌的緩沖鹽水。可選擇地，多核苷酸可以與脂質體，例如卵磷質脂質體或其他本領域已知的脂質體相伴，形成DNA-脂質體混合物，或者DNA可以與本領域已知的佐劑如一種蛋白質或其他載體相伴以加強免疫反應。最好能使用有助于細胞對DNA吸收的試劑，例如，但不限于鈣離子，病毒蛋白質和其他的轉染易化試劑。這些試劑一般稱為轉染易化試劑和藥理上可接受的載體。
用基因比用基因產物免疫接種有幾個優(yōu)點。一個優(yōu)點是可以相對簡單地將天然的或基本天然的抗原呈遞給免疫系統(tǒng)。多核苷酸免疫接種的另一個優(yōu)點是免疫原進入MHCI類途徑并引起細胞毒T細胞反應的潛力。因為多核苷酸免疫接種可引起體液和細胞介導的反應，另一個優(yōu)點即是它提供一種相對簡單的篩選大量的有疫苗潛力的病毒基因和病毒類型的方法。注射多核苷酸的免疫接種還允許通過混合單獨的成份而組裝多成份的疫苗。
如本文所用，術語基因指一般編碼一個分立的多肽的核酸片段。術語藥物和疫苗可替換使用指可用于誘導免疫反應的組合物。術語構建體和質粒也可替換使用。術語載體指可將基因克隆入其中以根據(jù)本發(fā)明的方法使用該基因的DNA。
因此，本發(fā)明的一個實施方案是一種用PV基因，在一種脊椎動物如哺乳動物，包括人中體內誘導免疫反應的方法，其中包括a)分離至少一種PV基因，b)將基因與調節(jié)序列相連以使該基因可操作地與控制序列相連，其中控制序列當被導入活組織中時可指導該基因的轉錄啟始和隨后的翻譯，c)將該基因導入活組織中，并且d)可任選地，用附加的PV基因加強免疫。
本發(fā)明的另一個實施方案可以是一種針對異種類型的PV的保護方法。這可以通過施用免疫學有效量的編碼保守的PV表位的核酸而完成。
本發(fā)明的另一個實施方案中，多核苷酸疫苗編碼另一種PV蛋白，如L1或L2或E1至E7或它們的聯(lián)合。
本發(fā)明的另一個實施方案中，該DNA構建體編碼HPV類型6a，6b，11，16或18蛋白，其中DNA構建體能在被導入動物組織中時在體內表達并誘導抗被編碼的HPV基因的表達產物的免疫反應。包括種類構建體與編碼其他與HPV不相關的多核苷酸的組合也是本發(fā)明所研究的。
編碼HPV基因的DNA構建體的例子包括V1J-L1，V1J-L2，V1J-E1，V1J-E2，V1J-E3，V1J-E4，V1J-E5，V1J-E6，V1J-E7，V1J-E1i＾E4，V1J-E1＾E4-L1，V1J-E2-C在本發(fā)明的特定的實施方案中，DNA構建體編碼CRPVL1蛋白，其中DNA構建體可在被導入動物組織時在體內表達并且誘導抗被編碼的CRPV基因的表達產物的免疫反應。包括這些構建體與編碼與CRPV不相關的其他抗原的多核苷酸的聯(lián)合也是本發(fā)明所研究的。
編碼CRPV基因的DNA構建體的例子包括V1J-L1，V1J-L2，V1J-E1，V1J-E2，V1J-E3，V1J-E4，V1J-E5，V1J-E6，V1J-E7，V1J-E1i＾E4，V1J-E1＾E4-L1，V1J-E2-C.
包含該DNA的藥理上有用的組合物可根據(jù)已知的方法如與藥理上可接受的載體混合來配制。這類載體和配制方法的例子可參看雷明頓藥理科學(Remington′s Pharmaceutical Science)。為了形成可適于有效施用的藥理上可接受的組合物，這些組合物應該包含有效量的HPVDNA。
本發(fā)明的治療或診斷組合物以足以治療或診斷PV感染的量。被施用給一個個體，有效量可根據(jù)各種因素如個體的狀況，體重，性別和年齡而變化。其他因素包括給藥方式。一般說來，組合物的給藥劑量范圍是約1微克到1毫克。
藥物組合物可以各種途徑如皮下，局部的，口服和肌內方式提供給個體。
本發(fā)明的疫苗包括HPVDNA，它編碼HPV的重組蛋白質，該蛋白質包含在人宿主內誘導中和抗體形成的抗原決定簇。這些疫苗可以足夠安全的給藥而無臨床感染的危險；無毒副作用；能以有效途徑給藥；是穩(wěn)定的；可與疫苗載體相容。該疫苗可以如口服、非腸道、皮下或肌內的不同途徑給藥，施藥劑量隨個體的狀況，性別、體重及年齡；施藥的途徑；和疫苗的PV類型而變化。該疫苗可以以如膠囊，懸液，酏劑或液體溶液等藥劑形式使用。該疫苗可以與一種免疫學上可接受的載體一起配制。
疫苗以預防或治療上有效的量給藥，也就是說，該量足以產生免疫保護反應。該有效量可以隨PV的類型而變化。疫苗可以以單次或多次劑量的形式給藥。
本發(fā)明的方法使用于防止PV感染的單價或多價疫苗的配制成為可能。使用此方法，即可配制單價PV疫苗，也可配制多價PV疫苗。例如，單價的PHV16型疫苗可由編碼HPV16L1蛋白或L2蛋白或L1+L2蛋白的DNA配制而成。另外，多價HPV疫苗可由編碼來自不同的HPV類型的HPVL1或L2或L1+L2蛋白的DNA混合配制而成。
該DNA可被用于產生抗體。本文所用的術語“抗體”包含多克隆和單克隆抗體，以及其片段，例如可與抗原或半抗原結合的Fv，F(xiàn)ab和F(ab)2片段。
本發(fā)明的PVDNA和抗體可被用于血清定型HPV或CRPV感染以及HPV篩選。HPV和CRPVDNA以及抗體使其可以用于配制適于HPV或CRPV檢測及血清定型的試劑盒。這樣的試劑盒應該包括分隔開的適于互相緊靠承載至少一個容器的承載體(Carrier)。承載體中進一步包含適于檢測各種類型HPV的試劑如HPVDNA或抗HPV抗體。承載體還可包含檢測這類標記的抗原或酶底物等的手段。
下面提供的實施例將進一步說明本發(fā)明，但并不是為了將本發(fā)明局限于這些實施例的具體細節(jié)上。
實施例1疫苗生產用的載體A)V1表達載體V1構建自pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang等.，病毒學雜志.61，1796(1987)]。通過EcoRI切割載體和自我連接而將AKI和DHFR基因去除。該載體在CMV啟動子中不含內含子A，因此它被作為帶有缺失的內部SacI位點的PCR片段而被加入[在B.S.Chapman等.，核酸研究19，3979(1991)中編碼在1855]。PCR反應的模板是pCMVintA-Lux，它是將來自pCMV6a120[參見B.S.Chapman等，ibid.]的含hCMV-IE1增強于(啟動子和內含子A的HindIII和NheI片段連入pBL3的·HindIII和XbaI位點產生pCMVIntBL而制得的。來自RSV-Lux[J.R.de Wet等.，分子細胞生物學，7,725,1987]的.1881個堿基對的熒光素酶基因片段(HindIII-SmaI Klenow補平)被克隆入已用Klenow補平和磷酸酶處理的pCMVIntBL的SalI位點中。
跨越內含子A的引物是5′引物，5′-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3′；(SEQ ID NO1)3′引物，5′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3′；(SEQ ID NO2)用于去除SacI位的引物是有義引物，SEQ ID35-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′；和反義引物，SEQ ID4，5′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3′將PCR片段用SacI和Bgl II酶切割并插入到已用相同酶切割的載體中。
B)V1J表達載體，SEQ.ID5制造V1J的目的是為了從V1載體中去掉啟動子和轉錄終止元件，以便將其放在一個更確定的上下文中，產生一個更緊湊的載體以及改善質粒的純化產量。
V1J來自載體V1以及可商業(yè)供應的質粒pUC19。用限制性酶SspI和EcoRI消化V1以產生兩個DNA片段。這些片段中較小的含有可控制異種基因表達的CMVintA啟動子和牛生長激素(BGH)轉錄終止元件，該片段被純化自瓊脂糖電泳凝膠。將該DNA片段的末端用T4DNA聚合酶“切成平端”以便易化其與另一個“平末端”的DNA片段的連接。
選擇pUC19用于提供表達載體的“骨架”。已知它有高的質粒產率，序列和功能特征描述詳細并有最小化的大小。我們通過用HaeII限制性酶部分消化而將整個lac操縱子從載體中去掉，該lac操縱子對我們的目的是非必須的而且可能對質粒產率以及異種基因表達有害。將剩下的質粒用瓊脂糖電泳凝膠純化，用T4DNA聚合酶使末端平齊，并用牛小腸堿性磷酸酶處理，然后將其與上述的CMVintA/BGH元件連接，得到了在pUC骨架內啟動子元件有兩種可能的方向的質粒。這些質粒之其中之一在大腸桿菌中很高的NDA產率并被稱為V1J。該載體的結構可通過對連接區(qū)的序列分析而確證并且接下來被證實與V1相比較有相仿的或更高的異種基因的表達。
C)V1Jneo表達載體SEO.ID6必須去除用于攜帶V1J細菌的抗生素篩選的ampr基因，因為氨芐青霉素不能用于大規(guī)模發(fā)酵生產人臨床產品。用SspI和Eam1105I限制性酶消化而將V1I中來自pUC骨架的ampr基因去掉。將剩下的質粒用瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4DNA聚合酶將末端平齊，并且接著用牛小腸堿性磷酸酶處理。將商業(yè)供應的來自轉座子903并且包含于pUC4K質粒中的Kanr基因用PstI限制性酶切割，用瓊脂糖凝膠電泳純化后，并用T4DNA聚合酶末端平齊。將該片段與V1J骨架連接并且產生帶兩個方向的Kanr基因的質粒，它們被稱為V1Jneo#′s1和3。每一種質粒都用限制性酶切分析，連接區(qū)DNA序列測定進行確證，結果表明都產生同樣量的V1J質粒。這些V1Jneo載體與V1J載體的異種基因產物的表達相當。我們任意選擇了含有的kanr基因與作為表達構建體的V1J中的ampr基因有相同方向的V1Jneo#3，并在以后稱之為V1Jneo。
D)V1Jns表達載體給V1Jneo增加一個SfiI位點以方便整合研究。在載體的BGH序列的KpnI位點加入商業(yè)供應13堿基對的SfiI接頭(linker)(New England.BioLabs)。用KpnI將V1Jneo線性化，凝膠純化，用T4DNA聚合酶將之末端平齊并且與末端平齊的SfiI接頭連接。通過限制性圖譜選擇克隆的分離物并用通過接頭的測序加UL確證。新的載體稱為V1Jns。在V1Jns(帶有SfiI)中異種基因的表達與V1Jneo(帶有KpnI)中相同基因的表達相當。
實施例2表明美洲產白尾棕色兔乳頭狀瘤病毒蛋白質的DNA構建體的制備所有克隆基因的CRPV DNA的來源是CRPV-pLAII。這是完整的在SalI位點克隆進pBR322中的CRPV基因組(Nasseri，M.，Meyers，C.和Wettstein，F(xiàn).O.(1989)CRPV發(fā)病機理的遺傳分析L1開放讀碼框對細胞轉化是非必需的但對乳頭狀瘤形成是需要的，病毒學170，321-325)。
1.V1Jns-L1用CRPV-pLAII DNA為模板用PCR產生L1編碼序列。PCR引物被設計成含BamHI位點以便在凝膠純化PCR片段后可以切割。
用于產生L1編碼區(qū)的引物是有義引物5′GGTACAGGATCCACCATGGCAGTGTGGCTGTCTACGCAG3′(SEQ ID NO7)BamHI反義引物5′CCACATGGATCCTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATG3′(SEQ ID NO8)BamHI用凝膠純化PCR片段，用BamHI切割并與用BglII切割的V1Jns連接。
2.V1Jns-L2通過PCR產生L2編碼區(qū)。載體CRPV-pLAII的L2基因被用于將CRPV插入pBR322的SalI位點破壞了。因此，用SalI切割CRPV-pLAII并在SalI位點將CRPV DNA連接為環(huán)型可產生PCR用的模板。該連接的CRPV DNA被用做PCR的模板。PCR引物被設計成含有BamHI位點以便在PCR片段凝膠純化之后進行切割。
用于產生L2編碼區(qū)的引物是有義引物5’GGTACAGGATCCACCATGGTTGCACGGTCACGAAAACGC3′(SEQ ID NO9)BamHI反義引物5’CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT3′(SEQ ID NO10)BamHI3.V1Jns-E2用CRPV-pLAII DNA為模板通過PCR產生E2編碼區(qū)。PCR引物被設計成包含BglII位點以便在PCR片段凝膠純化后進行切割。
用于產生E2編碼區(qū)的引物是有義引物5’GGTACAAGATCTACCATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA3’(SEQ ID NO11)BglII反義引物5’CCACATAGATCTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAACBGLIIAC3’(SEQ ID NO12)4.V1Jns-E4用CRPV-pLAII DNA為模板通過PCR產生E4編碼區(qū)。PCR引物被設計成含有BglII位點以便在PCR片段凝膠純化后切割之。
用于產生E4編碼區(qū)的引物是有義引物5’GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC3’(SEQ ID NO13)BglII反義引物5′CCACATAGATCTTTATAAGCTCGCGAAGCCGTCTATTCC3′(SEQ ID NO14)BglII5.V1Jns-E7在一種情況下以CRPV-pLAII為模板而另一種情況下以純化的來自Kreider′s CRPV株的DNA為模板，用PCR產生E7編碼區(qū)。兩個模板所用的引物是相同的。PCR引物被設計成含有BglII位點以便在PCR片段凝膠純化之后切割之。
用于產生E7編碼區(qū)的引物是有義引物5′GGTACAAGATCTACCATGATAGGCAGAACTCCTAAGCTTAG3′BglII反義引物5′CCACATAGATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC3′6.PGEX-2T-E2如所介紹的V1Jns-E2一樣用PCR產生E2編碼區(qū)。將該片段在BamHI位點克隆入pGEX-2T中，以與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)產生在框內的(in-frame)的融合。該構建體被用于在大腸桿菌中產生蛋白質。
7.pGEX-2T-E4如V1Jns-E4中所介紹的用PCR產生E4編碼區(qū)。將該片段在BamHI位點克隆入pGEX-2T中以便與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)產生框內的融合。該構建體被用于在大腸桿菌中產生蛋白質。
8.pGEX-2T-E7如V1Jns-E7中所述的用PCR產生E7編碼區(qū)。將該片段在BamHI位點克隆入pGEX-2T中，以便與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)產生框內的融合。該構建體被用于在大腸桿菌中產生的蛋白質。
實施例3來自大腸桿菌的質粒的純化將V1J構建體培養(yǎng)過夜至飽和。收集細胞并且用改良的堿性SDS法裂解細胞(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，分子克隆實驗操作指南。冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，第二版(1989)。改良包括將細胞裂解和DNA提取的體積增大3倍。通過CsCl-EtBr梯度兩次分帶純化DNA。用正丁醇抽提去除溴化乙錠。將得到的DNA用苯酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。將DNA重懸于TE中(10mM Tris，1mMEDTA)，pH8用于轉染，而溶于0.9％NaCl中用于注射小鼠。用OD260/280的讀數(shù)來確定每一個DNA制品的濃度和純度。260/280的比值≥1.8。
實施例4體內CRPV特異性抗體的生產五只一組的兔子被放血并注射1.2ml鹽水，該鹽水含1mg V1Jns-L1，V1Jns-L2，V1Jns-L1與V1Jns-L2混合(共2mg)，或僅含V1Jns(不含編碼蛋白質的對照載體)。接種物平均分布在6個肌肉位點上即兩個后腿，兩個前腿和后背上(lower-back)。在最初的DNA注射之后3周，將兔子放血并以相同的方式第二次注射相同的DNA。在第二次注射之后四周，再次給兔子放血。
將10倍連續(xù)稀釋的免疫血清與1∶3稀釋的CRPV貯存病毒(Kreider株)混合以測試血清的病毒中和抗體。用補加有1％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco’s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)制備稀釋液。CRPV貯存病毒(購自Dr.J.Kreider，Hershey，PA)由獲自野生的美洲產白尾棕色兔的皮膚塊制備而來，其中該皮膚塊被CRPV感染并且被植入無胸腺小鼠的腎囊下(renal Capsule)。將得到的濕疣組織勻漿并且離心澄清以制備貯存病毒制品。將免疫血清和病毒貯存的混合物在冰上至少保溫60分鐘，并接著將50μl每一種混合物用到3只新西蘭白兔的剃過毛的，并被劃破的背上的1cm2的皮膚面積上。七周后觀察動物中疣的存在并對背腹的和兩側的橢圓形疣的大小(mm)進行測量。根據(jù)不同稀釋度疣的頻率用Reed-Muench內插法確定終點效價。注射L1 DNA或L1和L2 DNA二者的兔的中和抗體效價被繪在圖1的y軸上。
還可用ELISA測定來自注射L1DNA的兔的血清的抗體。用1μg/孔半純化的重組的酵母來源的CRPVL1蛋白在4℃將聚苯乙烯ELISA板包被過夜。在啤酒醇酵母中制備重組L1并如Kirnbaucer等所介紹的方法(美國國家科學院院報8912180-4，1992)略加修改進行純化。加入稀釋的血清并在室溫保溫1小時(在定軌(orbital)模床上振蕩)。洗板并加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(Fc特異的)。振蕩下將板溫育1小時后洗板并加入底物。用動力學ELISA讀數(shù)儀(Molecular RevicesCorp.)在450nm讀培養(yǎng)板并將獲得的數(shù)值校正本底，即用同樣稀釋度的免疫接種后的血清的反應速率減去免疫前的血清的反應速率。通過將得到的修正后的反應速率對稀釋度的曲線內插為10mOD/分鐘的速率數(shù)值而確定效價。注射L1DNA或L1加L2DNA的兔的ELISA效價被繪在圖1的x-軸上。圖1示12/13的血清的中和活性是陰性的(log效價≥1，即相對未稀釋的血清是陽性的)，ELISA抗體(ELISA效價≥100)也是陽性的。其中4個中和抗體是陰性的血清，其ELISA效價都≤350。所有的來自只接管L2DNA或V1J對照載體的兔的血清的ELISA效價小于100?？偟目磥恚@些數(shù)據(jù)表明在注射L1DNA之后獲得了對CRPV特異的并能中和它的抗體。在免疫接種之后至少32周兔中的ELISA效價保持不減少。
實施例5對強毒性CRPV的攻擊的兔的保護作用如上所述，每組5只的兔子被肌內注射1mgV1Jns-L1，V1Jns-L2，V1Jns-L1與V1Jns-L2的混合物(共2mg)，或只注射V1Jns(對照載體，不含編碼蛋白質)。在初次注射DNA后3周，給兔第二次注射相同的DNA。在第二次注射之后四周，用CRPV攻擊兔子。CRPV攻擊實行是將50μl兩個稀釋度的病毒貯存(用DMEM加1％BSA12或1∶12稀釋)用于每只兔的剃過毛的，被劃破的背上的三個平行的1cm2的位點。如上所述在攻擊時從注射L1DNA或L1+L2DNA的動物中取的血清中用ELISA測定出其含有抗L1抗體及病毒中和抗體。在攻擊3、6和10周后觀察動物中疣的形成。在未接受L1DNA的兔中，用CRPV攻擊的54個位點的51個形成了疣，而在接受L1DNA的兔中，用CRPV攻擊的60個位點中只有2個形成了疣。在用L1DNA免疫接種的免中觀察到的兩個疣之中的一個在其出現(xiàn)之后3周之內縮小了(regressed)。表1表示在CRPV攻擊后疣在兔上的分布。用L1DNA預防性地免疫接種可以使兔在受強毒力CRPV感染后不形成疣。
實施例6L1DNA誘導的抗體的構象的特異性為了證明保護性中和抗體識別VLP的構象表位而進行了吸收實驗。L1VLP(15)對免疫血清的吸收去除了所有的中和抗體和ELISA活性(圖3A，B)。當給劃破的皮膚施用混有免疫前兔血清的CRPV時在所有的攻擊位點上都出現(xiàn)了濕疣，但當用混有免疫血清的CRPV以同樣方式施用時，由于中和抗體活性的存在而未見到濕疣。當將CRPV與已用L1VLP吸收的免疫血清混合時，所有位點(3/3)都是濕疣陽性的，而其中免疫血清的中和抗體應該已經被去除了。相反，當免疫血清被變性的非顆粒狀L1蛋白(在8M尿素中通過還原和烷基化而變性)吸收時，該血清仍能夠中和CRPV(圖3A)，并保留其在ELISA中的活性(圖3B)。因此由L1DNA免疫接種誘導的病毒中和抗體只能被天然構象形式的L1VLP而不是變性的L1去除。ELISA測試可檢測與完整的L1VLP反應的一級構象特異性的抗體，因為吸收對ELISA活性的去除相應于中和抗體的去除(圖3B)。
實施例7E4和E7DNA誘導的抗體反應給4只一組的NZW兔每次免疫接種肌內注射1mg的V1J-E2或V1J-E7DNA。在0、4、8和20周進行四次免疫接種并在22周時采血。抗體被用做所編碼蛋白質的表達替代標記。用包被有1μg/孔GST-E2或GST-E7融合蛋白的ELISA板(NUNC Maxisorp)進行血清抗體測定，其中融合蛋白純化自用編碼CRPVE2或E7的pGEX表達載體轉化并用IPTG誘導的大腸桿菌。如實施例3所述進行ELISA測定。mOD/min形式的凈反應速率(4次劑量后減去免疫前)如圖4所示。大于10mOD/min的凈反應速率被認為是陽性的，具有高的抗體效價的樣品可能由于檢測系統(tǒng)的過飽和而在最低的稀釋度的具有低的凈反應速率。因此所編碼的E2和E7蛋白由受體免疫系統(tǒng)表達和識別。
權利要求
1.一種包括編碼至少一種乳頭狀瘤病毒基因的全部或部分的核酸的多核苷酸，該多核苷酸在其被導入動物組織體內時可誘導乳頭狀瘤病毒特異性的免疫反應。
2.權利要求1的多核苷酸，其中編碼乳頭狀瘤病毒蛋白質的基因選自由HPVL1，HPVL2，HPVE1，HPVE2，HPVE3，HPVE4，HPVE5，HPVE6，HPVE7，CRPVL1，CRPVL2，CRPVE1，CRPVE2，CRPVE3，CRPVE4，CRPVE5，CRPVE6，CRPVE7，及其結合使用。
3.一種在脊椎動物中誘導抗乳頭狀瘤病毒表位的免疫反應的方法，它包括將至少Ing權利要求1的多核苷酸導入動物中。
4.一種包括權利要求1的多核苷酸的抗乳頭狀瘤病毒的疫苗。
5.一種包括權利要求1的多核苷酸和一種藥用可接受載體的藥物組合物。
6.一種用人乳頭狀瘤病毒基因在體內誘導免疫反應的方法，它包括a)分離該基因，b)將該基因與調控序列連接從而使該基因可操作地與控制序列相連，該控制序列當被導入活的組織中時可指導該基因的轉錄啟始及隨后對該基因的翻譯；和c)將該基因導入活的組織中。
全文摘要
能在被直接導入動物組織時表達的編碼乳頭狀瘤病毒的DNA構建體，它是能提供針對乳頭狀瘤病素感染的免疫保護作用的預防性藥物。
文檔編號C12N15/37GK1156966SQ95194672
公開日1997年8月13日 申請日期1995年6月1日 優(yōu)先權日1994年6月30日
發(fā)明者J·J·唐奈利, M·A·劉, D·馬丁尼茲, D·L·蒙哥馬利 申請人:麥克公司