專利名稱：在高細胞密度發酵中控制磷酸金屬鹽沉淀的方法
背景技術：
本發明是關于生產重組蛋白的細菌發酵方法，其中監測和調節進料中某些培養基營養成分，來控制磷酸金屬鹽在培養基中的沉淀。具體地，本發明是關于高細胞密度發酵中的一種方法，其中在培養基中使用多聚磷酸鹽和/或偏磷酸鹽，以消除養份的沉淀并提高細胞密度。
隨著分子生物學的進步和重組DNA的開發，使得我們在一些宿主細胞系統中生產大量的外源蛋白質成為可能。通過將編碼有意義的蛋白質的DNA轉入到宿主細胞中，然后讓這些細胞在一定條件下生長，使重組蛋白在這些宿主細胞中產生這樣使新的重組蛋白得以表達。一些細菌宿主細胞系統能用于產生大量的重組蛋白，而這些蛋白在自然資源中只能極有限地獲得。
原核生物大腸桿菌是一種研究極廣泛的細菌，它通常被選作高表達宿主細胞，部分原因是大腸桿菌細胞能產生極大量的重組蛋白。其核宿主細胞和酵母無法象大腸桿菌一樣產生大量重組蛋白，而且高密度細胞發酵能使大腸桿菌產生更大量的重組蛋白質。(Yee and Blanch，生物技術和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)41221-230，1993)。
象大腸桿菌等，生產重組蛋白的宿主細胞體系的發酵通常是在有限的物理容器中進行(如發酵罐，反應器等)。攪拌釜式發酵罐仍是最常見幾何形狀的發酵罐，盡管大量其它物理形狀的發酵容器也在發展。發酵操作模式大體分為如下三種形式(1)，不連續發酵(批量式發酵)，(2)，連續式發酵，(3)，各種半連續發酵，如堿間歇式補料。
根據操作模式和選用的宿主系統，必須設計一種精確均衡的批量式和/或補料式培養基，以使細胞生長并表達重組蛋白。指定的培養基里若僅含有細胞生長所必需的養份被稱為“最低限度”培養基。如大腸桿菌系統，最低限度培養基必須包含碳源，氮源，磷源，鎂源和一些微量的鐵和鈣。(Gunsalus and Stanter細菌(The Bacteria)VollChapter1.Academic Press Inc.N.Y.1960)。大部分最低限度培養基都以葡萄糖作碳源，氨作氮源，正磷酸鹽(如PO4)作磷源。理想的培養基包含有供細胞生長消耗的各種準確養分，既無養分的過分積累而抑制細胞生長，也不會因缺少任何一種養分而使細胞饑餓。(Thompson et al，生物技術和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)，27818-824，1985)大腸桿菌均衡的最低限度培養基已在理論上被計算出來，用于低細胞密度搖瓶發酵(細胞密度最大為1.5克細胞干重/升)。Neidhordt et al細菌學雜志(Journal of Bacteriology)，119736-747，1974)。
除培養基的化學組成外，一些其它環境參數如pH值，時間，培養溫度，溶解氧分壓等都必須給予考慮。例如，大腸桿菌生長的最適pH是7.0，但在發酵中，由于氨的消耗或一些微生物合成的代謝產物如乙酸、乳酸等，都可能改變發酵pH值。pH值的改變不適細胞的最佳生長，因而保持培養基的pH值是很關鍵的，可通過加酸或加堿來達到目的。發酵中pH值及其它參數可通過手工或自動化儀器監測。
高細胞密度發酵(細胞密度＞20克細胞干重/升)就必須使用高濃度培養基。而在高細胞密度發酵過程中發現，往往由于含磷酸鹽溶液與含養分溶液的混合而在培養基中出現沉淀。這些沉淀物涉及正磷酸鹽沉淀，它包括NH4MgPO4，Mg3(PO4)和金屬離子磷酸鹽類(Me)n(PO4)m(Me包括Fe，Ca，Zn，Cu，Co)。這些化合物在水中溶解度很低。(Dean，John A朗氏化學手冊(Lange′s Handbook of Chemistry)，12th edition，McGraw-Hill，New York，Pages 7-12 1979)。沉淀多少隨pH值，葡萄糖濃度及培養基濃度的不同而變化。
沉淀的形成可能對補充培養基和發酵罐帶來一些問題。如在培養基里導致供料的不均勻(這里因為沉淀物在容器或管線中沉積下來)而細胞因得不到關鍵可溶性養分而饑餓。沉淀物也會磨損進料泵和管道，以及堵塞管道等。
在發酵罐中，如果培養基相對細胞生長不均衡，就可能產生沉淀。在罐中的沉淀可能會堵塞住空氣噴嘴，導致培養基的不均勻混合(沉淀物在發酵罐中輕微的沉積)，降低細胞對溶解性養分的利用率。細胞可利用的養分濃度將取決于因沉淀形成而損失的養分的損失率與細胞對養分吸收率之比。這些影響都可以通過自動加酸加堿控制pH值來解決，但這些條件都降低了發酵過程的再現性。甚至沉淀的存在還能影響到蛋白質的純化操作，要將沉淀物從產品中分離出去就不得不增加額外的純化步驟。
在商業化生產中，要使發酵更加實用，就必須解決沉淀問題。一種推薦方法可以防止最低限度培養基中的養分沉淀，這就是加入EDTA或檸檬酸鹽以螯合培養基中的金屬離子(Pirt，S.J.微生物和細胞培養原理(Principles of Microbe and cell Cultivation)，Page 134，1975)。但是加入螯合劑的方法并不是很理想的因為這些試劑并不能被代謝掉，因而造成大量積累從而增加了細胞環境的滲透壓。高滲透壓對細胞的代謝有重要影響(Gouesbet等細菌學雜志(Joumal of Bacteriology)，175214-221，1993)。高濃度的螯合劑也可能破壞細胞膜(Ryan等，生物技術和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)37430-444(1991))。
在一份申請號為290,212 A5的德國專利(申請日期為1988，7，28)中，Riesenberg等人描述了一種制備最低限度葡萄糖培養基的方法，這種培養基用于培養大量大腸桿菌以得到重組DNA產品。據Riesenberg講，設計這種培養基可克服工作中常遇到的嚴重沉淀問題。但這種以正磷酸鹽為磷源的該專利申請描述的培養基并不能完全消除養分的沉淀，它僅能減輕培養基沉淀的形成，使培養基呈現較低的湍動性。
除上述討論外，文獻中尚無報道關于制備能有效消除養分沉淀的高細胞密度發酵的培養基。因此現在仍需要一個方法來減少那些在各成分混合(對于大腸桿菌在pH中性下混合)時并無沉淀出現的批量式和/或補料式的培養基，并且保證在隨后發酵過程中也無沉淀問題。本發明就提供了這樣一個方法，使用磷酸鈉玻璃作為高濃度營養培養基中的磷源。不同于上述引用的參考文獻的方法，本發明方法有三大優點(1)該方法能制備高濃度，完全均衡，無沉淀的批量式和/或補料式培養基，(2)能被大腸桿菌完全代謝利用，和(3)能增大細胞密度和生長速度。該發明方法適用于各種細菌發酵，尤其是高細胞密度的發酵。
發明概述本發明是關于生產重組蛋白的細菌發酵方法，其中，監測和調節某些培養基中的營養成分，從而控制磷酸金屬鹽在發酵過程的沉淀。具體地，本發明是關于高細胞密度發酵中的一種方法，該方法采用磷酸鈉玻璃作為高濃度營養液的磷源。令人驚異地該方法不僅能消除培養基中的沉淀形成，而且能在標準條件下促進細胞密度的增加。
附圖簡述
圖1示出C組(-)和D組(o-o)的細胞密度變化曲線圖形。該圖表明在培養基中用磷酸鹽玻璃作為磷源，其細胞密度的增加大大高于以正磷酸鹽為磷源的情況。細胞密度是用一臺Perkin-Elmer M35分光光度計來測定的，將不同時間的OD600光密度值對時間作圖。
發明詳述通過此方法監測和調節培養基中某些養分，從而控制在發酵過程中磷酸金屬鹽的沉淀。該方法將在下面討論中將詳細描述并通過實例加以例證說明。實例表明改變磷源在高密度發酵中可用于消除養分的沉淀。令人驚異的結果是用磷酸鈉玻璃在批量式和/或補料式高濃度培養基中作為磷源，可消除培養基中的磷酸金屬鹽沉淀，同時它又能提高發酵中的細胞密度。
用于生產重組蛋白的發酵過程都會使用下列操作方式中的一種(1)不連續(批量式)操作，(2)連續操作，(3)半連續(補料式)操作。批量式方法具有下列特征，在方法開始時，將微生物接入無菌的培養基(批量培養基)中，培養一特定的反應時間。在培養期間，培養基中的細胞濃度，底物濃度(碳源，營養鹽類，維生素等)以及產物濃度都一直在變化中。要防止在反應混合液中局部成分不勻或溫度不勻，就須將培養基混合充分。其反應應是非靜態的，細胞一直生長到其生長必需的底物被消耗完為止(通常是碳源耗盡)。
連續操作具有如下特征；新鮮的培養基(給料培養基)不斷地加入到發酵罐中，而消耗過的培養基和細胞以同樣的速率不斷地從罐中流出。在連續操作中，細胞的生長速率取決于培養基加入的速率，細胞得率取決于生長限制性底物(即碳源)的濃度。所有反應變量和控制參數在時間上是恒定的，因此，可根據恒定的生產量和輸出來確立在發酵罐中的穩定狀態。
半連續操作可看作是將批量式和連續式結合在一起的一種操作模式。在該模式中，發酵開始時同批量式操作一樣，當生長限制性底物被消耗完后，就以一個特別方式(補料)連續地補加入含有葡萄糖和礦物質的補料培養基。換句話說，該操作即使用了批量培養基又使用了補料培養基，從而使細胞充分生長并產生足夠多的蛋白質產物，在培養過程中既不加入細胞也不帶出細胞，因而就微生物而論，發酵罐仍是分批操作的。本發明適用于上面提到的所有發酵操作方式，而最優選則是補料式方法。
在上述每個方法中，細胞的生長和產物的積累都可間接地通過擇優地選擇代謝產物的形成和其量的相關關系來檢測，如培養基的pH值，光密度值，顏色，酸值滴定等變化。例如光密度值可顯示不溶性的細胞顆粒的聚集，和可用與顯示器或記錄儀相連的微型光密度計來連續測定，或通過非連續性測定樣品在600nm波長的光密度值(OD600)來確定細胞的干重。
高細胞密度發酵是通常指那些細胞回收大于20克細胞干重/升(OD600＞30)的發酵，所有的高細胞密度發酵都使用高濃度營養型培養基，它們通過“補料方式”逐步加入發酵罐中。高濃度營養培養基符合高細胞密度方法的要求，可減少發酵中在反應罐中養分的稀釋。補料過程是必須的，因為它可使操作者能有效控制碳源的供給，這是很重要的，因為如果細胞在高濃度碳源中就能產生高密度細胞，而細胞也會產生許多抑制性副產物，如乙酸等，這樣細胞的生長就停止(Majewski andDomach，生物技術和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)，35732-738，1990)。
通過發酵產生重組蛋白的標準條件是pH值在5.0～8.0之間，大腸桿菌的培養溫度在20℃～50℃。在本發明里，以大腸桿菌為宿主系統是最優選的；最佳pH值為7.0，最佳培養溫度為37℃。
在通常的發酵過程中，標準的營養成分包括有能源，碳源，氮源，磷源，鎂鹽和微量的Fe，Ca，另外培養基里可能還含有一些生長因子(如維生素和氨基酸)，無機鹽和其它產物形成所必需的前體。微生物的基本組成可用作計算適于細胞生長所需各養分比例的參考。各成分的濃度取決于是低密度發酵還是高細胞密度發酵。例如在低細胞密度的批量式發酵中，葡萄糖的濃度在1～5克/升之間，而在高細胞密度發酵中，葡萄糖的濃度在45～75克/升之間。
本發明可使用廣泛圍的各種磷酸鹽玻璃作為培養基磷源。磷酸鹽玻璃是具有特別用途的線性多聚磷酸鹽。關于線性多聚磷酸鹽，包括磷酸鹽玻璃的一般性討論可參考Corbridge，D.E.C.的文章“磷它的化學、生化與技術概觀(PhosporusAn Outline of its Chemistry，Biochemistryand Technology)”第四版，第三章，210-301頁，1990。磷酸鹽玻璃可由廣泛成分來制備，它主要由陽離子和分開的多聚磷酸鹽鏈的混合物組成。這種由Na+陽離子構成的玻璃經過全面分析，它是由一系列在常溫下穩定的，從P2O5到5Na2O100 P2O5的化學成分構成。磷酸鹽玻璃是由正磷酸根陰離子，即NaH2PO4加熱到650℃然后急冷，凝結而成的。這種典型玻璃是從650℃及55乇水蒸汽中急冷后的熔體而得，是平均鏈長n＝60的PO4四方體。 各種玻璃態的多聚磷酸鈉可市售購得。它們可制成各種不同平均鏈長(從n＝5到n＝200)的產品。
本發明方法中，通常采用的多聚磷酸鹽是磷酸鈉玻璃。具體地，磷酸鈉玻璃的鏈長范圍是從n＝2到大約n＝100，更優選是鏈長在n＝4到n＝20。這些磷酸鹽玻璃之所以用于本發明是因為(1)它們的溶解度性質可使高濃度培養基制備混合時不產生沉淀，(2)象大腸桿菌的宿主細胞系統都有一定代謝途徑來代謝磷酸鹽玻璃，和(3)由于沒有沉淀，所有的養分都可全部被利用，這就能使細胞密度及生長速率得到提高。在優選的實施中，平均鏈長n＝11的玻璃化多聚磷酸鹽用作磷源。
本發明適用于各種重組蛋白的生產方法。較為典型的有下列蛋白質細胞分裂素，包括各種造血因子如G-CSF因子，SCF，EPO，GM-CSF，CSF-1等因子，中介白細胞素如IL-1到IL-12，IGFs，M-CSF，TNF，或LIF。以及其它一些有療效的蛋白質如干擾素(α、β、γ或雜型干擾素)，和一些有用的生長因子或激素，如人或動物生長激素(如豬，雞生長激素)，FGF，KGF，EGF及PDGF。蛋白酶抑制劑，具有代表性的有金屬蛋白酶抑制劑，如TIMP-1，TIMP-2等。神經生長因子如BDNF，NT-3等。還包括一些具有原蛋白部分或全部一級結構的肽鏈，這些肽鏈保留著至少一種以上的原蛋白質的生物性質。
通常本發明使用的KGF因子擁有人KGF因子的序列式相似序列。已發表的申請號為WO 90108771的PCT專利申請描述了下列KGF純化方法從人胚胎成纖維細胞培養液中純化KGF分離部分肽段的氨基酸序列，基因克隆，和在大腸桿菌中表達，得到具有生物活性的KGF重組蛋白。
在方法優選實施中以大腸桿菌作為宿主細胞較好，因為大腸桿菌的遺傳性質已得到充分研究，它可以形成高細胞密度并在常規條件下很好生長(如pH值，溫度等)。
本發明的優選實施還包括一些輔助條件復合氮源，如酵母膏和大豆粉、酪蛋白水解物，肉汁，血液或棉籽的化學消化液。本技術領域的人員都會理解，本發明涵蓋了可以包括各種附加因素的組合的控制磷酸金屬鹽沉淀的方法。
實例1均衡的最低限度營養型補料培養基使用各自不同的磷源制備，這些典型的培養基可被用于高細胞密度發酵生產重組蛋白。一種“標準”的批量式最低限度培養基(將它命名為培養基A)，它用正磷酸鹽為磷源，與另一種用HexophosTM玻璃態多聚磷酸鈉為磷源的培養基(命名為培養基B)作比較實驗。其中HexophosTM多聚磷酸鈉鏈長n＝11，由FMC公司提供。
培養基A的成分為45克/升葡萄糖，3克/升酵母膏，1克/升(NH4)2SO4，4克/升K2HPO4，4.56克/升KH2PO4，0.71克/升MgSO4·7H2O，0.74克/升KCl，4.0毫升/升微量金屬離子溶液A(27克/升FeCl3·6H2O，2.0克/升ZnCl2·4H2O，2.0克/升CoCl2·6H2O，2.0克/升MnMoO4·2H2O，1.0克/升CaCl2·2H2O，1.9克/升CuSO4·5H2O，0.5克/升H3BO3，1.6克/升MnCl2.4H2O，73.5克/升檸檬酸鈉·H2O)和4毫升/升維生素溶液A(0.06克/升生物素，0.04克/升葉酸，1.4克/升維生素B6鹽酸鹽，0.42克/升核黃素，5.4克/升泛酸，和6.1克/升煙酸)。培養基B與培養基A僅一種成份不同，這就是用3.33克/升HexaphosTM作為磷源代替K2HPO4和KH2PO4。
在每種培養基滅菌時，葡萄糖和MgSO4是在一起滅菌的，微量金屬離子溶液A及培養基其它成分(如正磷酸鹽)是分開滅菌的。這樣做是為了防止產生不必要的副反應。在培養基B中，HexaphosTM也是分開滅菌的。當所有滅過菌的培養基成分混和在一起時，培養基A溶液里有霧狀出現，這種混濁是因為有沉淀反應產生。但培養基B在混和后仍保持透明。
沉淀的重量是通過用0.2μm孔徑的尼龍膜(Nalgene，215-4020)過濾器(Nalgene，300-4100)過濾10毫升培養基樣品來確定的。第二過濾器用來計算因進入膜上的可溶性固體而導致重量的總增加。此過濾器在空氣中干燥幾個小時，然后在Labware 9000中微波干燥至恒重。Labware 9000可被用來確定過濾器在過濾前后的干重變化，這些結果都如下表1所示。
表1培養基沉淀重量A 0.2克/升B 未檢測到實例2此例將通過在大腸桿菌中生產重組蛋白的高細胞密度補料式發酵，以比較在批量式培養基和高濃度營養型補料式培養基中使用磷酸鹽玻璃或正磷酸鹽作為不同磷源而產生的不同結果。它將確定這些磷源對培養基中磷酸金屬鹽沉淀的影響以及細胞密度的變化。一種以正磷酸鹽為磷源的“標準”補料式最低限度培養基(編名為C組)同以HexaphosTM為磷源的D組相對照。
在C組里，批量式發酵培養基成分見如下；5克/升葡萄糖，1.68克/升(NH4)2SO4，0.05克/升K2SO4，0.36克/升NaH2PO4·H2O，0.136克/升MgSO4·7H2O，0.008克/升KCl，0.78毫升/升微量元素溶液A(27克/升FeCl3·6H2O，2.0克/升ZnCl2·4H2O，2.0克/升CoCl2·6H2O，2.0克/升MnMoO4·2H2O，1.0克/升CaCl2·2H2O，1.9克/升CuSO4·5H2O，0.5克/升H3BO3，1.6克/升MnCl2·4H2O，73.5克/升檸檬酸鈉·H2O)。在D組里，除了用0.28克/升HexaphosTM取代NaH2PO4·H2O外，其它成分與C組一樣。
在C組里補料式培養基成分為；651.5克/升葡萄糖，6.52克/升K2SO4，46.91克/升NaH2PO4·H2O，17.69克/升MgSO4·7H2O，1.08克/升KCl，以及102毫升/升的微量元素溶液A。在D組里的補料式培養基除用37.2克/升HexaphosTM取代NaH2PO4·H2O外，其它成分與C組中的一樣。每組中的補料式培養基都通過加入36毫升/升的40％(v/v)NaOH溶液來將其pH值調至pH7.0。
就象實例1中一樣，用正磷酸鹽為磷源的均衡的最低限度補料培養基在各滅菌成分混和時，有沉淀產生，而用HexaphosTM作磷源的培養基則沒有沉淀產生。沉淀的多少可通過上述例1的方法進行測定，其結果如下表2所示。
表2組沉淀重量C 0.33克/升D 未檢測到同時，在C組和D組中的細胞密度變化也可監測得到。在每組中，細胞在批量式培養基中開始分批發酵生長。當葡萄糖被耗盡時，開始連續地加入補料式培養基，在補料發酵過程中，補料速度可根據細胞密度大小間隔2小時而增加。在C組中，細胞的生長速率開始為0.08h-1，當48小時后，細胞密度達到OD＝65，開始補料時，其生長率下降到0.04h-1，其OD值也同時下降。在D組里，經43小時發酵，細胞密度達到OD＝92，其生長率維持在0.09h-1水平上，然后OD值下降(如圖1所示)。最終，D組的細胞密度可達61克細胞干重/升，而C組中，細胞密度僅有43克細胞干重/升。結果還表明，D組中可生產180毫克/升的KGF，而C組中僅能生產120毫克/升的KGF。
實例3除HexaphosTM外，其它幾種多聚磷酸鹽(其鏈長范圍在n＝2到n＝19之間)也被用作高細胞密度發酵培養基中的磷源。在大腸桿菌發酵中，通過將高濃度的葡萄糖/MgSO4貯液(888克/升葡萄糖)與不同的磷源化合物及水混和，精確配制成幾種培養基，它們的葡萄糖/磷，葡萄糖/Mg的比例都符合高細胞密度發酵所必需條件。每種培養基的pH值都用40％NaOH或30％HCl調到pH7.0。
每天通過對各種培養基的透光率的自測分析來確定沉淀的形成，一直持續五天，其結果如下表3所示。結果顯示，當用HexaphosTM作為磷源，可允許使用濃度高達800克/升的葡萄糖溶液而無沉淀產生，當使用玻璃HTM，一種玻璃態多聚磷酸鈉，其鏈長為n＝19和SodaphosTM，一種鏈長n＝4的玻璃態多聚磷酸鈉時，培養基中葡萄糖濃度可達600克/升，而另一方面，當用正磷酸鹽作磷源時，其葡萄糖濃度只能達到462克/升。
表3磷源鏈長沉淀形成時間(無)800克/升 600克/升 400克/升 200克/升 100克/升葡萄糖 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖Glass HTM19 2 無無無無HexophosTM11 無 無無無無SodaphosTM42 無無無無Tripoly- 11 1 1無無Phosphate正磷酸鹽N/A N/A 0*無無無*得到最大葡萄糖濃度是462克/升。
結果表明，各種玻璃狀多聚磷酸鈉都能有效消除高濃度培養基中的養分沉淀，這些培養基都可用于高細胞密度發酵生產重組蛋白。
上述結果也證實了本發明是控制在高細胞密度細菌發酵過程中培養基中金屬磷酸鹽沉淀反應的實用方法，并能促進細胞的生長及蛋白的產生。
權利要求
1.在生產重組蛋白質的細菌發酵中，減少沉淀的方法，該方法包括在生產蛋白的培養基中使用磷酸鹽玻璃作為磷源。
2.權利要求1的方法，其中所述磷酸鹽玻璃是選自鏈長范圍約為n＝2到n＝100的一組磷酸鈉玻璃。
3.權利要求2的方法，其中所述磷酸鈉玻璃的鏈長約為n＝4到n＝20之間。
4.權利要求3的方法，其中，磷酸鈉玻璃的鏈長為n＝11。
5.權利要求1的方法，其中，發酵為高細胞密度發酵。
6.權利要求5的方法，其中，高細胞密度發酵是批量式，連續式或補料式發酵中的任意一種。
7.在生產重組蛋白的細菌發酵中提高細胞密度的方法，該方法包括在生產蛋白質時使用磷酸鹽玻璃作為磷源。
8.權利要求7的方法，其中，所述磷酸鹽玻璃選自鏈長范圍約為n＝2到n＝100之間的一組磷酸鈉玻璃。
9.權利要求8的方法，其中，所述磷酸鈉玻璃的鏈長約為n＝4到n＝20之間。
10.權利要求9的方法，其中，磷酸鈉玻璃的鏈長為n＝11。
11.權利要求7的方法，其中，所述的發酵為高細胞密度發酵。
12.權利要求11的方法，其中，高細胞密度發酵包括批量式發酵，連續式發酵和間歇補料式發酵中的任意一種。
13.在用大腸桿菌生產重組蛋白的高細胞密度的發酵中減少沉淀的方法，該方法包括使用鏈長約為n＝4到n＝20的磷酸鹽玻璃作為生產蛋白質的培養基中的磷源。
14.權利要求13的方法，其中磷酸鹽玻璃的鏈長約為n＝11。
全文摘要
本發明是利用一類磷酸鹽玻璃作為高細胞密度發酵培養基的磷源，從而減少磷酸金屬鹽的沉淀反應。此發明展示了一個實用的方法，可用來有效控制在營養型培養基中或產生高細胞密度的發酵罐中磷酸金屬鹽沉淀的程度。它適用于各種高細胞密度細菌發酵。
文檔編號C12N1/38GK1151182SQ95193686
公開日1997年6月4日 申請日期1995年4月27日 優先權日1994年4月28日
發明者C·E·柯列斯, J·B·巴克拉斯基 申請人:安姆根有限公司