專利名稱：：高分辨圖譜的做圖方法及圖譜探針的制作方法致謝本發(fā)明部分是在政府部門的支持下完成的，能源部(DepartmentofEnergy)的許可號為DE-FG603-92ER-61402，而國有健康人類基因組創(chuàng)始研究所(NationalInstitutesofHealthHumanGenomeInitiative)的許可號為R29HG00037-04。政府對本發(fā)明享有一定的權利。
背景技術：
：本發(fā)明涉及用以鑒定與人疾病有關的基因的方法及試劑。本發(fā)明還涉及整個人基因組的高分辨遺傳圖的構(gòu)建。本申請中的各種文獻均注明在括號里。這些文獻公開的內(nèi)容以其全文引入本申請作為參考，以便對與本發(fā)明相關的
技術領域：
的狀況作更全面的描述。
背景技術：
：由人類基因組工程(HumanGenomeProject)提供的資源正形成用來鑒定造成人類疾病的50-100,000個基因的策略。當前用高度多態(tài)的標記來快速和廉價地定位造成遺傳疾病的基因的種種努力(Weissenbach，J.等，Nature359794-801，1992)已超過將可得到的標記與目前已知的10,000或更多的人cDNA聯(lián)系起來的能力。目前已克隆了預計全部約50,000-100,000人基因中的近20,000個片段，并部分已被測序。雖然有了這些成功，僅約3000個這樣的克隆被定位到它們各自的染色體位點上，大部分定位于包括多條帶的10-20Mb大的區(qū)域。因此，不能將染色體上均勻間隔的提供大量信息的標記鑒定出來導致了當前做圖技術的明顯的弱點。物理圖譜技術對遺傳連鎖提供了補充。例如，標準的瓊脂糖凝膠電泳的分辨率的范圍為1到10Kb。脈沖場技術使該范圍延伸至兆堿基的水平。然而，凝膠電泳技術對于以前沒有被定過位的DNA序列的初始定位是無用的。而且，這些方法不具備使相差多于幾十萬對堿基的DNA序列排序的能力，也不具備使DNA序列分配到特定染色體區(qū)域的能力。染色體顯帶技術使特定的人染色體的識別變得容易半且提供了診斷染色體異常的主要依據(jù)。最初的染色體分配和基因定位，已使用了幾種技術來獲得高度精確的定位。然而這些技術具有一些不利的方面。例如，部分依賴于在UV輻射后DNA丟失的顯帶技術會因此導致某些信號的丟失(Cherif等，Proc.Natl.Acad.SciUSA876639-6643(1990)；和Takahashi等，Hum.Genet8614-16(1990))。與其它技術相比，標準的DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，或PI(碘化錠)染色產(chǎn)生不一致的圖譜，并且通常分辨率較低(Pinkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832934-2938(1986)；Lemieux等，CytogenetCellGenet.59311-312(1992)；Yamada等，Genomics15449-452(1993)；及Heng等，Chromosoma102325-332(1993))。其它技術產(chǎn)生強的好區(qū)分的圖譜，適于強信號大探針的探測，但會模糊由小探針產(chǎn)生的微弱信號(Rowley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA879358-9362(1990))。最后，雜交后的吉姆薩染色，是其它染色技術的典型，必須經(jīng)兩輪的微觀評價，一輪測雜交探針而另一輪定位信號到顯帶的染色體上(Klever等，Hum.Genet.86484-486(1991))。使用分散的重復序列的同時雜交方法也可用于標記帶(Baldini等，Genomics9770-774(1991))，但經(jīng)常證明難以獲得既顯示清晰的帶圖譜又顯示由小探針產(chǎn)生的雜交信號的中期帶圖。鑒定人DNA片段在染色體上座位的最直接的方法是原位雜交。雖然小于1Kb長的單一序列可用同位素標記的探針來定位，但放射自顯影的顯影時間長(經(jīng)常數(shù)周或數(shù)月)，需要大量的統(tǒng)計分析，并且圖譜的精確性被為捕獲放射的同位素信號而必須用感光乳膠劑覆蓋所限制。相反，非同位素標記的探針，雖在速度和空間分辨方面得到了改進，但敏感性差。因此，雖然已描述了許多的染色體帶分配技術，但這些現(xiàn)有技術均有弊端。例如，大多數(shù)的現(xiàn)有技術的分辨率比標準的吉姆薩顯帶要低，使用的熒光染料的光譜與標準FISH標記重疊，導致DNA的丟失，或僅被使用于插入到粘?；蚴删w載體中的大基因組探針。盡管圖譜技術有了前面所述的進展，為建立空間規(guī)則排列的覆蓋人類基因組的克隆基因組序列而進行的快速、高效、和精確定位大量克隆的努力被在幾種水平上遇到的各種限制所妨礙。結(jié)果，目前建立不起來由單一標記所定義的特定染色體區(qū)帶的精細圖譜，特別是缺失、易位、或重復定義的在醫(yī)學上重要的基因位置的精細圖譜。因此，需要簡便地將基因精確分配到單個染色體帶位點的方法和試劑。這些進展將推動基因序列信息與其生物學重要性的相關分析，并因此使適當?shù)尼t(yī)學治療的鑒定變得容易。本發(fā)明滿足了這些需要，也提供了相關的長處。本發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，高分辨的、快速和可重復的染色體帶顯帶方法已被建立起來。本發(fā)明的方法能精確地將基因定位于單個染色體帶上而不發(fā)生標記位移。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了易于定位序列的試劑。所述的試劑用于識別由特定DNA序列產(chǎn)生的染色體帶。附圖簡述圖1描述本發(fā)明的單個染色體帶的定位策略。每條染色體帶右側(cè)的圓點代表獨特的識別和標記染色體帶上特異座位的分子細胞遺傳學試劑。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了高分辨的、可重復的反帶(R帶)顯帶方法，該方法能快速確定和精確分配基因序列的單個染色體體帶圖位置。發(fā)明方法加快了具有生物學重要性的基因序列與特定染色體帶位置的相關分析。本發(fā)明方法所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能構(gòu)建人基因組的所有染色體的完整物理圖譜，并因此能鑒定出治療遺傳紊亂的適當?shù)尼t(yī)療方法。另外，本發(fā)明方法提供的高分辨率可精準建立和評估與人遺傳疾病相關的小鼠同源基因。本發(fā)明的教導能在多基因內(nèi)或在含有約93％核苷酸水平同源性的假基因家族內(nèi)精準探測轉(zhuǎn)錄位點。原位熒光雜交(FISH)是將單一基因分配到特定的人染色體帶的最精確和快速的方法之一，并是人基因定位和臨床細胞遺傳學的基本要素。(Pinkel，D.等，ProcNatl.Acad.Sci.USA，832934(1986))。本發(fā)明提供了將敏感的原位熒光雜交與高分辨的染色體顯帶及隨機cDNA測序結(jié)合起來的改進，以將具有平均大?。?Kb的插入片段的cDNA定位到單個人染色體帶上。還提供了產(chǎn)生與原位雜交相容的高分辨的R帶的方法。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了將大小范圍在1-1,000Kb的DNA探針直接定位到顯有R-帶的人染色體上的方法和試劑。還提供了可與R-帶顯帶方法相結(jié)合應用的染色體制備、雜交、及產(chǎn)生信號的方法。本發(fā)明的方法能構(gòu)建人染色體的完整物理圖譜。本發(fā)明的獨特的反帶(R)顯帶是通過原位雜交后的色霉素A3和遠端霉素A的染色而得到的。本發(fā)明的雜交方法所得的清晰的帶譜可同時看見熒光R帶及使用標準顯微照相術或自動成像系統(tǒng)的原位雜交信號。該技術的敏感性僅用標準的顯微照相術就可使大小范圍在1.2-3Kb的cDNA定位到單個染色體帶上。本發(fā)明方法可在350-700之間快速而可重復地顯帶。本發(fā)明在實踐中的重要問題是需要確定由微弱信號所產(chǎn)生的定位結(jié)果的置信標準。至于任何存在于明顯小于100％染色體上的信號，已建立了保守的定位標準來使真正人信號從非特異的染色體背景中區(qū)分出來。只有那些在一條染色體的兩條染色體單體上在同樣的帶位置均被看見的信號才被視為陽性結(jié)果。而且，因許多中期染色體可能重疊或在分析中丟失，不用第二染色體上的信號來增加定位的確定性。因此，在200個被檢的中期細胞中，在多于或等于10％的細胞中存在至少一條染色體對單一位點的信號是陽性時，才考慮探針定位；當在5-10％的被檢中期細胞中存在時，考慮探針初步定位；而當在2-5％的被檢中期細胞中存在時盡可能地探針定位。當少于1％的細胞為陽性時，認為信號是背景。用僅在2-5％細胞中存在的信號已經(jīng)且能精確地定位許多基因，例如，谷氨酰胺酶(＜5％-參見下面)顯示，用本發(fā)明的方法被定位于2q32(以前被分配到2q32-34)。對FISH前和后得到的本發(fā)明的R-帶圖譜的比較揭示本發(fā)明方法，在雜交后需染色，但不改變?nèi)旧w的形態(tài)?！扒啊焙汀昂蟆钡娜旧w顯帶圖譜在分辨率和清晰度方面表現(xiàn)為基本相似。在給定制備的情況下在大于90％的中期細胞中觀察到該圖譜，并且與在有或無溴脫氧尿苷(BrdU)摻入的染色體的圖譜一致。Magenis等對現(xiàn)有技術的顯帶技術進行了改進(Hum.Genet69300-303(1985))，用以防止使用現(xiàn)有技術而典型地遇到的快速褪色。例如，提高了McIlavane緩沖液的pH(Schweizer，D.等，Exp.CellRes.，111327(1979))；根據(jù)探針的大小改變色霉素A3的染色時間；及使用了色霉素A3/遠端霉素的二輪染色。另外，為進行探針和顯帶圖譜的同時照像或顯影，按照信號的強度來調(diào)整曝光時間和染色強度。對產(chǎn)生弱信號的較小探針，當使用標準的顯微照相術時所需的曝光時間在15-200秒之間變化。相比之下，記錄強度更強的信號需要更短的時間。所有的標準顯微照相均使用柯達100ASA膠卷以使分辨率最大?？墒褂每祜@膠卷以減少曝光時間，然而這卻使帶的分辨率變低。本文提供的方法可獲得高分辨率的圖譜，所述的圖譜可重復產(chǎn)生并可被本領域的技術人員做為常規(guī)技術成功地用來對大小范圍在＞1Kb到1Mb的DNA序列進行染色體帶的定位。本發(fā)明可使用寬范圍的探針，即，如酵母人工染色體(YACs)、細菌人工染色體(BACs)的大探針，和如基因組質(zhì)粒和cDNA的小探針。目前，YACs，或稱為酵母人工染色體，被用于大多數(shù)的人基因組的定位。YACs允許≥約500Kb片段的克隆。然而，YAC文庫的操縱已遇到了一些難題。例如，在各種YAC文庫中，一部分的克隆得自于共克隆事件，即它們在單一克隆內(nèi)包括不連續(xù)的DNA片段。大部分的YAC克隆，特別是具有高分子量插入片段的克隆是嵌合體。嵌合克隆定位染色體上的多位點，并因此上，阻礙了做圖及分析的進展。YAC克隆的另一個特有的問題是由DNA片段引起的，所述的片段是不能克隆或不穩(wěn)定的并傾向于重排和缺失。細菌人工染色體(BACs)，提供了YAC系統(tǒng)的替代物。BACs使YACs最棘手的問題，例如高比率的嵌合現(xiàn)象和克隆的不穩(wěn)定性得到了緩解。BACs基于大腸桿菌的單拷貝質(zhì)粒F因子，并能可靠地擴增大于約300Kb大小的DNA片段。BACs具有許多物理性質(zhì)，這些性質(zhì)，包括容易操縱及嵌合缺乏，使它們適于物理做圖。嵌合的缺乏及能擴增大的外源DNA插入片段的能力使BACs成為染色體散步及產(chǎn)生連續(xù)的物理圖譜手段的佼佼者。不象YACs是線性的，具有插入片段的BACs在大腸桿菌中以超螺旋環(huán)狀質(zhì)粒存在。這種構(gòu)象通過較小的切割使大DNA易于分離和操縱，而酵母染色體卻難以分離其完整的形式，因為線性DNA更容易剪切。在此所用的BAC克隆系統(tǒng)提供了物理做圖中介系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在YACs和粘粒之間分散。雖然YAC系統(tǒng)仍然還是大規(guī)模做圖的強有力的工具(因為已克隆了大于一兆堿基的分子)，但BACs比YACs更容易使用而且更適于進行精細物理圖譜的做圖和染色體散步。實際上，已發(fā)現(xiàn)那些在YAC載體中不能克隆或不穩(wěn)定的DNA片段，即，YAC上具有缺失或缺口的區(qū)域，可很好地被克隆于BACs中。而且，BACs同粘粒一樣易于操作，但含有的插入片段大小可大10倍。BACs具有高的克隆效率使克隆的DNA容易操作，并可穩(wěn)定維持插入的DNA。本發(fā)明極大地增加和改進了FISH的潛力。因此，現(xiàn)有技術的約2-3Mb范圍的探測限度被顯著地改善到約1-10Kb范圍的探測限度。本發(fā)明技術，因此上能使本領域的技術人員快速地產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄序列的高分辨圖譜。本發(fā)明還提供了人基因組獨特單帶染色體位點(參見圖1)的序列已定位的試劑。本發(fā)明試劑是獨特的分子細胞遺傳學標記，識別和標記染色體帶的特定位置。本文所用的本發(fā)明試劑是指短的DNA或cDNA序列，易于被探測，獨特地識別物理基因組位置。這些試劑可用作適于標記的探針，并可用于疾病決定基因的精確染色體位置的鑒定。另外，本發(fā)明試劑提供用于基因組大規(guī)模測序的底物。在此還提供了本發(fā)明試劑的集合或試劑盒。還提供了重疊試劑的集合，所述重疊試劑涵蓋基因組的非間斷的區(qū)段，即連續(xù)的cDNA。本發(fā)明試劑盒含有多種試劑，每種試劑對應于或識別染色體帶的特異座位。本發(fā)明試劑盒的試劑內(nèi)容可依據(jù)被定位的DNA序列而改變。例如，任何給定的染色體的單一的帶可具有大約40到80個的獨特的圖譜位點，每個位點由與其相對應的特異試劑代表。因此，本發(fā)明試劑盒可包含對應于單條染色體帶的多種試劑，對應于中心粒的多種試劑，對應于端粒的多種試劑，或針對單條染色體的多種試劑。本發(fā)明較其它方法的優(yōu)點可通過例如，將包括130個cDNA、30個質(zhì)粒、50個粘粒、500條細菌人工染色體(BACs)和150條YACs的900多個DNA序列定位到人單個染色體的帶上而得到說明。另外，已定位了39個新克隆的在人腦中表達的基因，其中的26個定義了與已知基因具有明顯同源性的新座位；這些中的20個代表高等生物的多基因家族的新成員，而6個代表與低等生物的那些多基因家族相關的基因新成員。它們包括與磷酸二酯酶、磷酸酶、蛋白激酶、鈉通道、極低密度脂蛋白(VLDL)受體、軸突糖蛋白、膜運輸?shù)鞍住PP(淀粉樣蛋白前體)家族成員(一個定位到以前建議的阿爾茨海默氏連鎖區(qū)域，第二個為進一步的研究提供了候選座位)等等有關的基因。當與其圖譜位置結(jié)合時，如表1所示，這些基因為人或小鼠的同源區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)生物學疾病提供了直接的候選目標。表1基因名稱插入片段大小圖譜位置推測的APP-c10011Kb(*C)Xq24盤狀大腫瘤抑制子17p12-13.1邊緣人Folyl多聚谷氨酸酶2.1Kb(c)9q34.1Fibulin2.2Kb(c)22q13.3鈉通道31.6Kb(c)2q24VLDL受體1.2Kb(c)2q24Fibromodulin3個不同的序列1q32Aggrecan(c)15q26Tg737(c)13q12精氨琥珀酸合成酶1.5Kb(c)9q34.1胞液絲氨酸2.0Kb(c)11p11.2羥甲基轉(zhuǎn)移酶線粒體絲氨酸羥甲2.0Kb(c)12q13.2基轉(zhuǎn)移酶鉀通道11p14-15邊緣G蛋白質(zhì)CONE&Gai3(c)1p13.1OD&Gai2(c)3p21.3*c＝cDNA此處所示的結(jié)果證明本發(fā)明可用于大規(guī)模的cDNA定位。這些結(jié)果使本發(fā)明與其它方法在精確度(包括高分辨染色體帶分配、多種信號的獲得及分析)、敏感性及cDNA序列的定位速度方面區(qū)別開來。為說明多位點的信號的重要性，人們可假設靶大小或同源性的減小將導致出現(xiàn)陽性信號的細胞或染色體比例的減少。對那些試驗變量大體保持不變的同樣的細胞或細胞群內(nèi)的第二位點雜交尤其如此。因為代表潛在的假基因和多基因家族信號的靶序列的大小恒定或可能更小些，因此，具有較大比例陽性細胞的位點更可能代表轉(zhuǎn)錄座位。例如，預期在具有93.5％或更高同源性的多基因家族內(nèi)，測定產(chǎn)生陽性信號的細胞的比例可定義轉(zhuǎn)錄座位。陽性細胞的百分數(shù)與轉(zhuǎn)錄的對假基因座位之間的關系測試如下。(參見實施例11-12)。對大多數(shù)的未加工的假基因來說，由于假基因靶大小減小(因為截短和重排)，其信號較??；由于因靶序列對轉(zhuǎn)錄探針的序列位移而導致的同源性減小，出現(xiàn)信號的可能性也較小。對加工的假基因來說，結(jié)果卻不同，同源性雖仍然很高但基因組的排列卻不同了。關注點是，例如，盡管序列的同源性減低，新產(chǎn)生的加工的假基因，具有成簇排列的外顯子，可比轉(zhuǎn)錄基因的基因組座位能更好地用作雜交靶子，因在轉(zhuǎn)錄基因內(nèi)的內(nèi)含子將外顯子雜交靶打斷了。由于已知的在Southern印跡中的觀察結(jié)果，高度同源的假基因座位產(chǎn)生的帶比與轉(zhuǎn)錄座位有關的那些帶明顯地要強，使該關注點得到了極大地加強。當然，在Southern印跡中，帶的強度反映了靶大小及序列同源性，因此，用cDNA探測相關的轉(zhuǎn)錄座位所得的假基因帶，可代表比從轉(zhuǎn)錄座位而得到的類似大小的帶更多的外顯子(較低同源性的)，并可被分成幾個強度較弱的帶。在原位熒光雜交的中期染色體的分辨率水平，所有的外顯子均被檢測為一個點。因此，序列同源性及外顯子靶大小(外顯子的數(shù)目)是信號大小的重要的決定因素。其它的決定因素，例如，包括易接近性、鹽濃度、堿基組成、片段的二級結(jié)構(gòu)、及其它。僅由于同源性降低，預計大多數(shù)的加工的假基因產(chǎn)生的信號將比那些預計從轉(zhuǎn)錄座位獲得的信號小。認識到本發(fā)明的方法，在一定程度上，與傳統(tǒng)的Cot曲線的相關比溶液雜交的固定化膜的相關更甚是很重要的。這是因為每條染色體代表一個分子，并且具有特異雜交信號的染色體比例敏感地反映雜交的概率，即在一定Cot時雜交分子的比例。雖然密度有一些近似，在非線性信號密度和多條帶的標準的Southern印跡中，信息大多被丟失了。FISH對信號的放大對非線性有貢獻，可使大小增加，而強度顯然對探測有貢獻。因為轉(zhuǎn)錄基因及可能的假基因座位均在同樣的制備中被檢測，應保持其兩者及具有大體上反映同源程度和靶大小信號的細胞比例的探針濃度及雜交條件，Viz，Cot的恒定。因此，可預期，給定假基因的序列位移和重排，在轉(zhuǎn)錄座位具有陽性信號的細胞比例將比假基因的大。靶與探針大小之間的關系對雜交信號的特異性也是重要的。例如，假定探針和靶均比約50-100bp(在所用條件下單擊穩(wěn)定雜交所需的大小)大，對相同大小的靶(假基因和轉(zhuǎn)錄座位)來講，具有高度同源性和穩(wěn)定性的座位將產(chǎn)生大的信號。根據(jù)靶大小而增大探針的大小，如同小外顯子(＜50-100bp)，大部分的探針吻合性差。例如，對含有不止一個外顯子的雜交的cDNA片段來講，第二個外顯子保持不配對，將可能降低完全匹配的穩(wěn)定性。因此，大探針(＞200bp)有利于具有連續(xù)外顯子的靶的信號產(chǎn)生，所述的外顯子是小外顯子。這對于外顯子比探針大的信號不是主要的影響因素。因此，小探針(50-200bp)的使用，在按本發(fā)明所述使用時，可使轉(zhuǎn)錄的對加工的假基因的相應檢測變得簡便。本發(fā)明的方法使極為相關的序列和在cDNA大小范圍內(nèi)的可重復的圖譜較小片段間的信號強度差異最大化。因此，本發(fā)明方法在幾個方面區(qū)別于現(xiàn)有技術方法，如，高嚴謹條件(包括提高洗滌溫度)的使用，多種放大、及平均范圍在100-200bp內(nèi)的較小片段探針的使用。較小片段的使用及高嚴謹條件的洗滌趨于增加雜交形成的特異性，可敏感定義如精氨琥珀酸合成酶系統(tǒng)所示的同源性差異小至6％的轉(zhuǎn)錄座位。(參見實施例11)。如本發(fā)明所提供的相對完整的一套順序轉(zhuǎn)錄的序列的易于獲得性，將極大地促進得到完整的人基因組圖譜的努力。使用含有本發(fā)明的序列已定位的試劑的連續(xù)的cDNA，可使靶的平均大小增加，使該方面的研究成為產(chǎn)生人基因組精細結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄圖譜的快速而經(jīng)濟的基因定位方法。產(chǎn)生的cDNA框架將定位和證實精細YAC圖譜及遺傳圖，并將即時提供大量的定位的人基因，所述的人基因可被用于研究其在人類遺傳疾病中所起的作用。下面的實施例用以說明，而不是限制本發(fā)明。實施例1中期相的制備用經(jīng)過一些改進的BrdU阻斷來制備染色體(Zabel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，806932-6936(1983))。簡言之，使人外周血淋巴細胞在補加了L-谷氨酰胺(2mM)，15％的胎牛血清、青霉素(100IU/ml)，鏈霉素(0.05mg/ml)及0.02％的植物凝血素的RPMI1640(GIBCOBRL，Gaithersbury，MD)中于37℃生長72小時。通過加入5-溴-脫氧尿苷(0.8mg/ml)達16小時將細胞阻斷在S期。然后用HBSS(Hanks平衡鹽溶液)(GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)將它們洗滌一次，以除去同步化試劑，并通過將它們在補加有2.5μg/ml胸苷的培養(yǎng)基中溫育而將其釋放。通過加入0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙堿10分鐘，接下來以0.075MKCl低滲溶液于37℃處理15分鐘，然后用3∶1的甲醇和乙酸的混合物固定1-5分鐘。實施例2高質(zhì)量染色體的制備為制備高質(zhì)量的染色體，可通過將一滴懸液滴到乙醇-清潔的、平展的、完全沒有細胞質(zhì)的載玻片上而制備中期伸展相。然后，根據(jù)環(huán)境濕度將載玻片放到加有熱水的容器上20-60秒。通過在相差顯微鏡下先檢查幾張載玻片來確定最佳條件。為得到最佳結(jié)果，在原位雜交前，應將載玻片在室溫下老化至少2-3周。最好將載玻片在老化后貯存于-70℃。在變性前的那天，將載玻片從-70℃取出并于4℃過夜保存。然后將載玻片于室溫放置1-2小時，接下來將其在55-60℃焙燒2小時，然后在70％的甲酰胺(于66-70℃)中變性。為得到最佳結(jié)果，將新鮮的載玻片于66℃變性。實施例3用于定位小DNA探針的探針片段大小以缺口翻譯標記的探針的片段大小應在100-200bp之內(nèi)，且在雜交混合物中的探針DNA的濃度應在20-40ng/μl(即，200-400ng/載玻片)的范圍內(nèi)。這能增加非-特異性結(jié)合，但通常將產(chǎn)生好的信/噪比。為減少重復序列的非-特異性背景雜交，應將少量的CotIDNA與cDNA探針(即，1-3μg的CotI與200-400ng的探針DNA)一起使用。實施例4探針的生物素標記用生物素-14-dATP通過缺口翻譯(GIBCOBRL)標記DNA探針。用層析(交聯(lián)萄聚糖G-50)將未摻入的核苷酸分離。通過非變性的瓊脂糖凝膠使所有的DNA探針的片段平均大小為約200bp，在100-600bp的范圍內(nèi)。實施例5原位雜交為得到單拷貝序列與小DNA探針的特異雜交，將Lichter等描述于Science24764-69(1990)的FISH方法加以改進。對在使用前一年多以前制備的載玻片，不必進行RNase處理。必要時，RNase處理為100μg/ml的RNase在載玻片上于37℃停留20分鐘，然后以70％、90％和100％的系列冷乙醇脫水。載玻片在70％的甲酰胺/2×SSC(0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉)中于67-70℃變性1-2分鐘(新鮮制備的染色體需要較短的時間)。每張載玻片上置含有生物素標記的探針及3μgCot1DNA和7μg超聲斷裂的鮭精DNA(探針Cot1DNA的比率為1∶15-30；總DNA濃度為1μg/μl)的雜交緩沖液。然后蓋上蓋玻片并用橡膠粘劑密封之，接下來于37℃在濕化室內(nèi)將其溫育過夜。實施例6探針信號的免疫熒光探測雜交過夜后，將載玻片在50％的甲酰胺(V/V)/2×SSC中于44℃洗滌(4×5分鐘)，然后在2×SSC中于50-60℃洗滌(3×5分鐘)。對于小探針(插入片段大?。?.5Kb)，漂洗時間應短些(3×2分鐘)。為提高由小探針產(chǎn)生的熒光信號的強度，有必要降低雜交后洗滌的嚴謹程度(2×SSC，45-50℃)。然后將載玻片在含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Tween20的4×SSC的100μl中于37℃放置10-20分鐘進行封閉。然后將緩沖液用FITC-親合素(0.5μg/ml，溶于4×SSC/1％BSA/0.1％Tween20)來替換，37℃30分鐘。經(jīng)過3次各5分鐘的在2×SSC/0.1％Tween20中于45℃的洗滌后，通過加入生物素標記的羊抗-親合素抗體層(5μg/ml)在37℃30分鐘將雜交信號放大。為減少免疫學的非特異結(jié)合，在放大步驟前將載玻片在5％羊血清/2×SSC/3％BSA/0.1％Tween20中預溫育10-20分鐘。洗滌后，如前所述加入第二層的FITC-親合素到載玻片上。為提高雜交信號的強度，如必要可進行第二輪的放大。然后將載玻片在2×SSC/0.1％Tween20中于45℃洗滌3次，并直接進行干燥。實施例7染色體R-帶顯帶為同時看見染色體帶和熒光信號，用染料色霉素A3和遠端霉素A作為復染劑(Schweizer，Chromosoma58307-324(1976)；Schweizer，Hum.Genet571-14(1981)；及Magenis等，Hum.Genet69300-303(1985))。在最后的探測后在染色前立即將載玻片以Schweizer等所述的McIlavane緩沖液(pH8.5-9.0)(以蒸餾水1∶1進行稀釋)進行漂洗。結(jié)果，將100μl的色霉素A3(0.5mg/ml，溶于1/2的McIlavane緩沖液pH8.5-9.0中)于暗中置于載玻片上室溫下10分鐘-1小時。所需的染色時間依賴于載玻片的新鮮程度；較新鮮的載玻片需要較長的染色時間，而老化的載玻片僅需要10分鐘。經(jīng)過第一輪的染色后，將載玻片在1/2的McIlavane緩沖液中漂洗1分鐘，并將過量的液體甩掉。接下來通過將50μl的0.1mg/ml的遠端霉素A置于載玻片上，并將其于室溫溫育1-2分鐘，然后進行如上所述的漂洗而進行第二輪的染色。如果所用的DNA探針具有小的插入片段(即，預計產(chǎn)生微弱的信號)，在此，可用一薄層在磷酸鹽緩沖液中含有對-苯二胺的抗褪色溶液將載玻片固定(Johnson等，J.Immunol.Methods43349-350(1981))。通過兩輪的色霉素A3和遠端霉素A染色所得到的圖帶分辨率最佳且褪色最小。另外，通過在探測步驟后立即染色，而不是遲后2-3天，可得最好的顯帶結(jié)果。染色后最好立即進行顯微鏡觀察，對于小探針(1.0Kb-2.5Kb)不遲于3天而對于大探針(＞2.5-3Kb)不遲于1-2周。在用相差顯微鏡檢查載玻片之前只需輕輕地復染。事實上，該顯帶技術的優(yōu)點在于，如必要可在雜交之后的任何時候重復復染步驟以使染色體更明亮些。而且，在圖像捕獲后，用計算機化的系統(tǒng)，為使FITC雜交信號更清晰地被看見可選擇性地將顯帶圖譜漂白。實施例8顯微術和照相術用ZeissAxiophot100或Axiovert135熒光顯微鏡(Zeiss，Inc，Thomwood，NY)觀察載玻片。用400-490nm帶通過的激發(fā)器、460nm二色，及470nm阻片(Zeiss濾器型號#05)來激發(fā)FITC和色霉素A3。雜交的片段顯現(xiàn)為亮藍綠色或亮黃綠色的圓點，而其余的染色體帶顯現(xiàn)為暗綠色?？逻_技術的pan(ASA100)膠片用于黑白照相。用BDS(生物探測系統(tǒng)，Pittsburgh，PA)成像軟件通過冷卻的CCD照相機(PhotometricsCH250，PhotometricsLtd.，Tuscon，AZ)捕獲彩色圖像。實施例9cDNAs通過標準的小型制備培養(yǎng)物來獲得cDNAs(Sambrook，J.等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarbor1989))。它們是從克隆在bluescript(Stratagene，LaJolla，CA)上的胎腦文庫中隨機分離并測序的。用FISH定位，定義了含有大于1Kb大小范圍的插入片段的cDNA，所述cDNA包括表II和表III所示的那些與數(shù)據(jù)庫匹配的序列。表2.新基因的FISH定位表3.通過FISH對座位圖譜位置的證實/細化來源細胞(+)百分數(shù)基因符號/基因產(chǎn)物插入片段大小(Kb)以前或預測的圖譜位置FISH的定位ATCC(*HGM)85C3/補體組分34.319p13.3-9p13.219p13.370F8VWF/vonWillebrand因子2.912pter-12p12+ps12p13.145HMGCR/3-羥基-3-甲基二?；鵆oA還原酶4.35q13.3-5q14+ps5q13.315ASS/精氨琥珀酸合成酶1.59q34-9qter+ps9q34.1Venter等(#1)50MAP-1B/Neuraxin/微管相關蛋白1B1.85q135q1330醛縮酶A216q22-16q2416q22(主要)16q11(次要)25α-烯醇化酶1.51pter-1p36.31p36.320膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白質(zhì)2.117q2117q21ATCC(*HGM)85C3/補體組份34.319p13.3-9p13.219p13.370F8VWF/vonWillebrand因子2.912pter-12p12+ps12p13.18谷氨酰胺酶2HSA2q32-q342q32Venter等(#2)45淀粉樣蛋白前體樣蛋白質(zhì)1/APLP21.619q11-q1319q1230淀粉樣蛋白前體樣蛋白質(zhì)2/APLP21.511q2611q25</table></tables></tables>實施例10定位單個基因通過對已知圖譜分配的單個基因和已知為多基因或假基因家族成員的基因的定位能力來測試本發(fā)明的精確性。首先，以前已知或預測過圖譜位置的15個基因的圖譜位置得到了證實，并且所有的測試均在cDNA克隆的FISH分析的基礎上得到相當?shù)募毣ｊP于單個基因的進一步的結(jié)果及其探測的敏感性在下面描述。對于多基因家族，定位轉(zhuǎn)錄基因位點的精確度由靶大小、同源程度、及可能的基因組重排決定。用該技術對由15個G-蛋白質(zhì)α亞基組成的多基因家族(Wilkie等，NatureGenetics185-90(1992))進行定位，所有的人cDNA被獨立地定位到由已知的小鼠同源性預測的區(qū)域。而且，盡管在Gai2和Gai3之間的核苷酸序列的同源性高達75％，任何cDNA均未觀測到第二位點。用2.0Kb片段進行醛縮酶A的定位，不僅提高了分辨率而且在已知的與醛縮酶C有關的基因位點均未檢測到次級信號，而在整個編碼區(qū)其同源性將近74％(Costanzo等，1988)。這些數(shù)據(jù)提示對于在多基因家族內(nèi)相似基因組重排的序列，既使是在有約75％的核苷酸同源性(高于已知多基因家族的大多數(shù)成員的同源性)，總體上相當于大約90％的蛋白質(zhì)同源性存在的情況下，用本發(fā)明方法可定義單一的圖譜位置。實施例11假基因信號的探測嚴謹試驗作為對來自轉(zhuǎn)錄的對加工的假基因座位信號的可能的優(yōu)選探測，用與14個加工的假基因家族相關的，精氨琥珀酸合成酶(AS)轉(zhuǎn)錄基因和cDNA描述本發(fā)明在信號間區(qū)分信號的能力。三個假基因在2139bp內(nèi)具有(與表達序列)93.5％(AS1pl)、92.9％(ASp3)和89.4％(ASp7)的序列同源性。盡管如此同源，用1.5KbcDNA同AS雜交揭示在9q34.1，即轉(zhuǎn)錄座位出現(xiàn)信號的染色體(15％)，占200個細胞的比例最高，并且次級位點陽性的占細胞的3％(染色體6p21)和1％(7q32)，定義了假定的假基因座位。實施例12轉(zhuǎn)錄座位的探測在相關的假基因存在下探測轉(zhuǎn)錄座位時，在cDNA對pp52的定位中注意到了有趣的實例，人淋巴細胞特異的基因與在一個外顯子內(nèi)具有高于90％同源性的四個不同的基因組座位相關，而其中的三個可能為假基因(May等，1993)。雖然與座位相關的粘粒識別一個以上的座位，而且一些頻率近于相等，但cDNA探針主要在染色體11p15.5，即轉(zhuǎn)錄座位產(chǎn)生信號。實施例13淀粉樣蛋白質(zhì)4-樣基因的定位定位于19q13.1的淀粉樣蛋白質(zhì)前體蛋白質(zhì)樣基因(APLP1)，與遲發(fā)型家族性阿耳茨海默式病(AD2)間的潛在關系令人感興趣。在21號染色體上的淀粉樣蛋白質(zhì)前體基因(APP)的突變與一種形式的家族性阿耳茨海默式病AD1相對應。Pericak-Vance等，Cytogenet.CellGenet.，58751(1991)已得到了AD2和在19q近端的幾個標志連瑣的證據(jù)。在這些家族中，受影響者僅在分析時使用，在近ATP1A3(19q13.2)和D19S13(19中心粒-13.1)得到了4.4的最大多點LOD值。雖然載脂蛋白E的基因，定位于19q13.2(端粒至APLP1)的等位基因APOE4的劑量增加，與AD2風險的增加有關，但認為，如Wasco等，Genomics，15237(1993)所建議的，該風險相關可能部分起因于與另一基因的連瑣不平衡不是沒有道理的，所述的另一基因可能是我們定位到該區(qū)域的APLP1基因。第二個APLP基因(命名為CDE-1-BP，因為它與酵母中心粒的一致性序列相結(jié)合)，定位于11q26，也令人感興趣，但關于阿耳茨海默氏病其令人感興趣的程度稍小，因為，盡管與APP同源性高，但目前沒有任何遺傳連瑣的提示。盡管如此，這兩個圖譜位置對估測與家族性阿耳茨海默氏疾病有關的基因為那些與21號染色體和19號染色體無關的家族提供了候選座位(瑞典家族Lannfelt等，NatureGenetics，4218-219(1993)；和Volga德國家族Schellenberg等)。實施例14蛋白質(zhì)磷酸酶2A，β-亞基的定位有相當多的證據(jù)證明蛋白質(zhì)磷酸酶2A在細胞加工過程中起作用。這包括主要代謝途徑的調(diào)控、翻譯、轉(zhuǎn)錄、G2-M細胞周期轉(zhuǎn)換、及腫瘤發(fā)生(參見Jones等，CytogenetCellGenet.6335-41(1993))。因此，將其圖譜位置分配到染色體4P16.3為研究其在Wolf-Hirschhom綜合癥(WHS)(其特征為生長過度而智力遲鈍)中的可能角色提供了直接的基因候選座位。在4P16.3關鍵區(qū)域缺失的2.5Mb的范圍內(nèi)用cDNA定位定位了蛋白質(zhì)磷酸酶(Gandelman等，1992)。實施例15軸突糖蛋白(TAG-1/軸突蛋白1)的定位最近幾年，已鑒定出細胞表面蛋白質(zhì)如TAG-1在神經(jīng)組織中表達，并認為在神經(jīng)網(wǎng)絡的發(fā)育過程中起至關重要的作用。人TAG-1/軸突蛋白已被獨立地克隆，并發(fā)現(xiàn)其表達限制在正在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)分化區(qū)域(Hasler等，Biochem211329-339(1993))。因此，將人TAG-1/軸突蛋白定位于染色體帶1q32為VanderWotede綜合癥(裂唇/腭，下唇為粘液細胞)提供了令人感興趣的基因候選座位，所述的綜合癥由該區(qū)域的缺失而引起。實施例16硫氰酸生成酶的定位作為為線粒體蛋白質(zhì)編碼的核基因，該基因在染色體22q13.1的圖譜位置為研究其與以常染色體顯性方式遺傳的線粒體疾病之間的關系提供了基礎。小鼠在此區(qū)域的突變是神經(jīng)性的，并包括灰色震顫、搖擺及致盲，對于該基因而言所有的這些突變均會令人感興趣。實施例17肌醇1、4、5三磷酸激酶的定位與肌肉的中央核疾病(CCO)連瑣的19號染色體區(qū)域的圖譜令人感興趣(Mulley等，Am.J.ofHum.Genet52398-405(1993))。可用當前的連瑣圖及物理數(shù)據(jù)對此關系進行直接評估。實施例18鈣調(diào)蛋白-依賴的βII型蛋白質(zhì)激酶的座位雖然在染色體的7p13區(qū)域沒有發(fā)生候選疾病，除鈣調(diào)蛋白樣序列外，該基因是在該區(qū)域被鑒定的第二或第三個蛋白質(zhì)激酶(PRKAR1B)。實施例19Nod1膜運輸超家族的定位該基因與參與結(jié)節(jié)形成的根瘤菌屬基因具有高度的同源性，并與ATP-依賴的細菌運輸?shù)鞍子泻軓姷耐葱?。提供了?q21區(qū)域內(nèi)少有的幾個已知基因及其它兩個神經(jīng)受體中的一個。很明顯具有如此高度保守序列的基因很可能參與重要的功能。實施例20多粘菌素B抗性蛋白質(zhì)的定位該基因是與酵母具有很高同源性的可能的蛋白質(zhì)激酶，定位于12q21，提供了最初已知的基因之一。實施例21AMP脫氨酶的定位該基因在能量代謝過程中起著至關重要的作用，定位于5q32，該區(qū)域是受體和與小鼠的區(qū)域具有同源性的人區(qū)域，所述的小鼠區(qū)域內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)學突變，包括Vt(退化尾，全垂體機能減退)、dt(侏儒突變)。實施例22cAMP-特異的磷酸二酯酶的定位與以前定義的人基因同源，此新基因定位于1P31-32，基因富含區(qū)，該基因是其族中被首先定位的基因。實施例23XPR2的定位堿性細胞外蛋白酶，定位于15q22，是定位于整條圖帶的第一個基因的代表。該成核區(qū)，提供了第一個定位的細胞外蛋白酶，并可能成為與15q22相關的染色體重排有關的關注點，而15q22相關的染色體重排與前髓細胞白血病有關。雖然結(jié)合公開的實施方案對本發(fā)明進行了描述，應理解為在不背離本發(fā)明精神的前提下可進行各種修改。權利要求1.將核酸序列定位到人染色體的單條帶的做高分辨圖的方法，所述的方法包括(a)用所述的核酸序列與人伸展的染色體雜交，其中所述的核酸序列是生物素標記的，(b)使雜交的伸展染色體與至少一種熒光標記及至少一種復染劑相接觸，及(c)檢測所述的核酸序列的存在，并確定其染色體帶的位置。2.權利要求1的方法，其中所述的核酸序列為大約1Kb至大約1Mb。3.將cDNA和基因組探針定位到人染色體單條帶座位的做高分辨圖的方法，所述的方法包括原位熒光雜交和反帶(R)顯帶。4.含有多種試劑的組合物，其中每種試劑均包含從人基因組中衍生的核酸序列，并且其中的每種試劑與染色體帶的特異座位相對應。5.根據(jù)權利要求4的組合物，其中組合物內(nèi)的所有試劑來自單條的染色體帶。6.根據(jù)權利要求4的組合物，其中組合物內(nèi)的所有試劑來自單條染色體。7.根據(jù)權利要求4的組合物，其中所述的試劑含有自中心粒衍生的核酸序列。8.根據(jù)權利要求4的組合物，其中所述的試劑含有自端粒衍生的核酸序列。9.根據(jù)權利要求4的組合物，其中組合物內(nèi)的所有試劑均含有連續(xù)的cDNA。10.根據(jù)權利要求4的組合物，其中組合物內(nèi)的所有試劑均為非嵌合體。11.根據(jù)權利要求10的組合物，其中所述的試劑為BACs。全文摘要按照本發(fā)明，高分辨的、快速而可重復的染色體顯帶方法已被建立起來。本發(fā)明方法能將基因精確定位到單條染色體圖帶上而不發(fā)生標記位移。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，還提供了獨特地識別物理基因組位置的DNA或cDNA探針。所述的試劑用于鑒定從特定的DNA序列衍生的染色體帶。文檔編號C12Q1/68GK1153535SQ95193054公開日1997年7月2日申請日期1995年5月9日優(yōu)先權日1995年5月9日發(fā)明者朱利·R·科瑞恩伯格,陳曉寧申請人:塞達斯-西奈醫(yī)療中心