鑒定隱球菌病高危發(fā)性的免疫減弱病人的方法

專利名稱：鑒定隱球菌病高危發(fā)性的免疫減弱病人的方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及免疫學、傳染病及AIDS研究。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的鑒定具有隱球菌病高危發(fā)性的AIDS或其它免疫抑制的病人的方法。
相關技術的說明獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的突出特征之一是，實際上大多數(shù)死亡并不是由人免疫缺陷病毒(HIV)本身造成的。實際上，大多數(shù)死亡是由機會原生動物、真菌、細菌和病毒引起的，而這些病原體對正常的、健康人幾乎是不致病的。最常見的機會感染由卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、鼠弓形體(Toxoplasmagondii)、spp分枝桿菌(Mycobacterium spp)、人巨細胞病毒和酵母新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)引起。
新型隱球菌是一種廣泛存在于我們周圍的酵母。很多人都可能被這種酵母感染，但他們的免疫系統(tǒng)能夠防止出現(xiàn)明顯的疾病。免疫功能的喪失很可能導致這種酵母由原先的潛伏部位(可能是肺)擴散到血液，最后到腦膜。
在AIDS病人的護理方面已有一些進步。病人壽命幾乎延長了一倍，而且生存質(zhì)量也有所改善。在治療AIDS病人方面最大的進步是預防性使用抗生素來防止肺囊蟲性肺炎。對所有的AIDS病人進行抗肺囊蟲病預防是一種有效的方法，因為大多數(shù)(70％)AIDS病人可能出現(xiàn)肺囊蟲性肺炎。
在AIDS病人中進行預防性隱球菌病治療有很大的潛力，但是此方法必須不同于用于治療卡氏肺囊蟲的方法。5至15％的AIDS病人可能發(fā)生隱球菌病。如果只有5至15％的AIDS病人出現(xiàn)了隱球菌病，而對所有AIDS病人進行隱球菌病的預防性治療是不現(xiàn)實的。取而代之的是，對AIDS病人的預防性治療將依賴于開發(fā)一種鑒定出最具隱球菌病發(fā)病危險性的AIDS病人的方法。
現(xiàn)有技術缺乏鑒定最可能發(fā)生隱球菌病的AIDS或其它嚴重免疫減弱病人的有效手段。本發(fā)明滿足了本領域這一長期以來的需求。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個實施例中，提供了一種鑒定具有出現(xiàn)隱球菌病危險性的個體的方法，其步驟包括測定所述個體血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖(glucuronoxylomannan)抗體的水平。
在本發(fā)明的另一實施例中，提供了將多糖葡糖醛酸木糖聚甘露糖與固相偶聯(lián)的方法，此方法可用于分析與抗原結(jié)合的抗體，其步驟包括在pH約8.5時用苯醌激活多糖；在pH約7.5時將活化的多糖與疏水性配基偶聯(lián)；在pH約7.0時使修飾的GXM與所述的固相結(jié)合。
在本發(fā)明的另一實施例中，提供了一種檢測血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的方法，其步驟包括將涂有抗原的微滴板格與以PBS-Tween稀釋的血清一起在25℃孵育90分鐘；從格中去除病人血清，并用PBS-Tween洗滌所述格以去除未結(jié)合的抗體；洗滌后的格與稀釋的對人IgG具有特異性的酶結(jié)合抗體一起在25℃孵育30分鐘；從格中去除酶結(jié)合抗體，并通過用PBS-Tween洗格去除未結(jié)合的酶結(jié)合抗體；加入酶結(jié)合抗體的合適底物，然后在25℃孵育30分鐘；加人終止溶液，并測定酶產(chǎn)物的光密度。
在本發(fā)明的另一實施例中，提供了一套試劑盒(kit)，它用于分析隱球菌病危發(fā)病人血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的存在，它包括一種固體相；一種能使葡糖醛酸木糖聚甘露糖與固相疏水性結(jié)合的疏水性配基；一種酶指示劑系統(tǒng)；和針對酶聯(lián)抗體的合適底物。
在本發(fā)明的另一實施例中，提供了一種治療隱球菌病危發(fā)個體的方法，其步驟包括測定所述個體血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體水平；給以抗新型隱球菌劑。
為了公開，以下給出本發(fā)明優(yōu)選實施例的說明，由此可明了本發(fā)明的其它方面及進一步的內(nèi)容、特征和優(yōu)點。
附圖簡述為了達到或詳細理解上述本發(fā)明的特征、優(yōu)點、目的及將會看到的其它內(nèi)容，對被簡要概括如上的本發(fā)明的更為具體的說明將參考某些特定的實施例，所附的附圖中對這些實施例進行了描述。這些附圖構成說明書的一部分。但是必須指出，附圖描述的是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所以不應理解為限制了實施的范圍。


圖1顯示涂覆緩沖液制劑對125I-標記的酪胺化葡糖醛酸木糖聚甘露糖(T-GXM)與Immulon I板結(jié)合的影響。數(shù)據(jù)表示為加入不同量的T-GXM后的結(jié)合T-GXM量(圖左)或加入的與測試格結(jié)合的T-GXM百分比(圖右)。T-GXM被稀釋在0.05M的碳酸鹽緩沖液(上圖)、磷酸鹽緩沖液(中圖)或檸檬酸鹽緩沖液(下圖)中。緩沖液的使用為，原緩沖液(三角)，補充0.1M的NaCl(方塊)或補充0.95M的NaCl(圓形)。所示結(jié)果是4個重復格的平均值。
圖2顯示孵育時間和溫度對T-GXM與Immulon I板結(jié)合的影響。將結(jié)合動力學繪制成各時間間隔的結(jié)合量(左圖)或準一級圖，圖中的Ao為期望的最大T-GXM結(jié)合量，A為各時間段的實得結(jié)合能力。測試格在4℃(圓形)、20℃(方塊)或37℃(三角)，與100μl的10μg/ml放射性標記的酪胺化GXM的磷酸鹽涂覆緩沖液溶液(含0.95M NaCl)一起孵育不同的時間。所示結(jié)果是3個重復格的平均值。
圖3顯示保存時間和條件對T-GXM在Immulon I微滴板上滯留的影響。測試格被涂以T-GXM，然后(i)用PBS-Tween洗滌并干燥保存(圓形)，(ii)用PBS-Tween洗滌后再水洗，然后干燥保存(方塊)或(iii)用PBS-Tween洗滌后PBS-Tween覆蓋保存(三角)。在所示的保存時間后，測試格全部用PBS-Tween洗滌，然后測定結(jié)合T-GXM的量。所示結(jié)果是4個重復格的平均值。
圖4顯示40個正常成年供者血清中的抗GXM抗體。每一點代表一份進行帶IgG、IgM或IgA重鏈或κ或λ輕鏈抗體分析的血清樣品。
圖5顯示的是正常人血清中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類的抗GXM抗體分析。被選用于分析的血清其抗GXM IgG抗體效價≥1/50。
圖6顯示由HIV感染發(fā)展至AIDS不同階段獲得的血清中抗GXM抗體的產(chǎn)生與特征。血清取自10個CD4計數(shù)＞500/μl的HIV陽性患者(圖左)，20個CD4計數(shù)為200至499/μl的患者(圖中)和10個CD4計數(shù)＜200/μl的患者(右圖)。
本發(fā)明的詳細說明根據(jù)本發(fā)明，“免疫減弱”指病人體內(nèi)T淋巴細胞功能的喪失提高了病人對傳染性隱球菌病的易感性。
新型隱球菌是一種被多糖被膜所包圍的機會性酵母。被膜的主要結(jié)構成份是一種多糖，被稱為葡糖醛酸木糖聚甘露糖(GXM)，由甘露糖、木糖、葡糖醛酸和O-乙?；鶚嫵??？贡荒ず?或抗GXM抗體具有多種生物活性，其中包括補體結(jié)合，對小鼠腹膜巨噬細胞和人中性白細胞吞噬作用的調(diào)理素作用，加強人天然殺傷細胞的抗隱球菌病活性、和利用被動免疫體內(nèi)清除隱球菌。
帶負電的被膜多糖，例如隱球菌的GXM，與常用于固相免疫分析的聚苯乙烯微滴板的粘附性很差。有報道的促進多糖與聚苯乙烯結(jié)合從而可進行抗被膜抗體測定的現(xiàn)有技術方法包括(i)將微滴板預涂以聚-L-賴氨酸，它可與帶負電的多糖形成多個靜電鍵；(ii)將多糖與聚-L-賴氨酸共價偶聯(lián)，然后與聚苯乙烯微滴板結(jié)合；(iii)將多糖與能夠極大地加強粘附的酪胺共價偶聯(lián)；(iV)將帶負電的多糖與帶正電的甲基化蛋白質(zhì)復合；(V)將多糖與固相衍生的蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)或先與蛋白質(zhì)偶聯(lián)再將其加入聚苯乙烯微滴板；(Vi)生物素標記多糖，然后與涂有親和素的微滴板結(jié)合；(vii)多糖在促進固定化的涂覆條件下被動結(jié)合。
多糖與促進固定的反應試劑的共價偶聯(lián)通常涉及為與含氨基的化合物連接而活化多糖。活化步驟包括(i)用溴化氰處理多糖，在多糖的羥基位置引入活性基團，多數(shù)可能為亞氨碳酸酯和氰酸酯；(ii)多糖的限制性高碘酸氧化作用以產(chǎn)生能與合適的親核物質(zhì)縮合的醛基；(iii)氰脲酰氯處理多糖。
苯醌活化作用比其它方法(例如溴化氰活化作用)具有突出的優(yōu)點，因為活化作用可以在pH≤8.5時完成。隱球菌多糖被O-乙?；揎棧@些基團易于被溴化氰活化所需的更高的堿性pH或高碘酸氧化的多糖與氨基偶聯(lián)時常用的硼氫化鈉所產(chǎn)生的堿性pH水解。
本發(fā)明引入了酪胺與苯醌活化的多糖的偶聯(lián)，并明確了有利于酪胺化GXM(T-GXM)與聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板結(jié)合的條件。
本發(fā)明說明了(i)在對-組正常成年志愿者中抗GXM抗體的產(chǎn)生幾率和免疫球蛋白種類的描述；(ii)在正常志愿者血清中發(fā)現(xiàn)的IgG抗體亞類的測定；(iii)有關HIV感染向AIDS的發(fā)展伴隨著對抗GXM抗體的量與質(zhì)的影響的測定。本發(fā)明顯示，有些正常受試者具有高濃度的抗GXM IgG，而基本上所有受試者中都易測得抗GXM IgM?？贡荒gG主要為IgG2亞類，但在有些個體的血清中出現(xiàn)有IgG1抗體。最后，HIV感染向AIDS的發(fā)展伴隨著IgM類抗GXM抗體的選擇性喪失；但是，幾乎沒有或完全沒有IgG類抗GXM抗體的喪失。
在本發(fā)明中，提供了一種鑒定出現(xiàn)隱球菌病的高危發(fā)性個體的方法，其步驟包括測得所述個體血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體水平。還提供了一種治療隱球菌病高危發(fā)性個體的方法，其步驟包括測得所述個體血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體水平；然后給以抗新型隱球菌劑。
很明顯，本發(fā)明的方法雖然能夠施用于全部個體，但最理想的是用于由于免疫減弱而易于出現(xiàn)隱球菌病的個體。通常，可對所有具有T淋巴細胞功能缺陷或抑制的個人實施本發(fā)明的方法。一種免疫減弱個體是被人免疫缺陷病毒感染的個體。另一種是處于某種病理生理學狀態(tài)的免疫減弱個體，這種病理生理學狀態(tài)選自獲得性免疫缺陷綜合征、使用超生理劑量的腎上腺皮質(zhì)激素、結(jié)節(jié)病和淋巴癌。
通常，本發(fā)明方法測得選定個體的血清中的抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體水平。較好的是，被測的抗體是IgG。
本發(fā)明還提供了一套用于測定免疫減弱個體的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體存在的試劑盒，它包括某種固體相；能使GXM與固相疏水性結(jié)合的疏水性配基；酶指示劑系統(tǒng)；酶聯(lián)抗體的合適底物。
在本發(fā)明提供的試劑盒的使用中，隱球菌葡糖醛酸木糖聚甘露糖被固定在固相上，從而無需修飾、封閉或降解能被抗隱球菌抗體識別的表位就能使GXM與固相牢固結(jié)合。通常，固相可以是能夠與GXM結(jié)合的任何一種。較好地固相是聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板；其它固相為硝酸纖維素或其它形式的紙、磁性珠或塑料插棒。
較好的固定化方式是GXM與能夠使GXM與固相疏水性結(jié)合的疏水性配基偶聯(lián)。此疏水性配基必須不被人血清中的抗體所識別。酪胺是較為理想的配基。GXM與疏水性配基的結(jié)合必須是共價的，而且其進行方式不能使對堿敏感的0-乙?；鶄?cè)鏈水解。利用本發(fā)明的概括內(nèi)容，本領域的熟練技術人員將很容易發(fā)現(xiàn)涂覆微滴板的最佳抗原濃度，以及涂覆微滴板的最佳pH和最佳溫度。
本發(fā)明的試劑盒還包括一套酶指示劑系統(tǒng)，例如對人IgG重鏈具有特異性的抗體。較好的是，抗體是辣根過氧化物酶標記的山羊(或綿羊)抗體。其它酶指示劑系統(tǒng)是本領域所熟知的。通常，還包括一種酶聯(lián)抗體的合適底物。這種底物的圖1顯示，將GXM加入碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液中時，有大量的GXM被結(jié)合。在碳酸鹽和磷酸鹽緩沖液中的最大結(jié)合約100-150ng/格。使用檸檬酸鹽緩沖液使得結(jié)合量顯著下降，觀察到的最大結(jié)合約50ng/格。加入NaCl至0.1M與在相同緩沖液中不加NaCl相比，顯著加強了使用磷酸鹽緩沖液發(fā)生的結(jié)合。與之類似的，在磷酸鹽緩沖液中，用0.95M NaCl產(chǎn)生的結(jié)合量大大多于在相同緩沖液中使用0.1M NaCl時的。在碳酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液中，提高離子強度并不產(chǎn)生類似的加強作用。
實施例5時間與溫度要求對涂覆時間和溫度進行了檢測。加入100mμl 10μg/ml放射性標記的T-GXM磷酸鹽涂覆緩沖液(含0.95M NaCl)溶液，孵育Immulon I微滴板。微滴板在4℃、20℃或37℃孵育1、2、4、8、24或48小時。洗滌微滴板并測定T-GXM結(jié)合量。
圖2顯示，在不同的測試時間，在20℃或37℃之間沒有明顯的結(jié)合水平差異。在20℃或37℃孵育48小時的結(jié)合并不明顯高于在24小時觀察到的。當孵育時間≥2小時，在4℃孵育的微滴板產(chǎn)生的結(jié)合明顯少于在20℃或37℃涂覆的微滴板。因此，此后均使用在20℃用T-GXM涂覆微滴板24小時。
ln(A/A0)對時間的繪圖，其中A是給定時刻的非充分結(jié)合能力，A0是總結(jié)合能力(在此定義為在20℃或37℃孵育48小時時的T-GXM結(jié)合量)，對在0℃、20℃或37℃涂覆的微滴板來說是線性的。這表明，結(jié)合的發(fā)生在各涂覆溫度具有單一一級速度常數(shù)特征。4℃時的結(jié)合(準一級速度常數(shù)≈3.2×10-4)比20℃(準一級速度常數(shù)≈2.7×10-3)或37℃(準一級速度常數(shù)≈2.6×10-3)時的低得多。
實施例6T-GXM在聚苯乙烯微滴板上固定化的穩(wěn)定性為了評價T-GXM與Immulon I微滴板結(jié)合的穩(wěn)定性，檢測了多種洗脫劑和解離劑。測試格加入100mμl 10μg/ml放射性標記的T-GXM磷酸鹽涂覆緩沖液(含0.95M NaCl)溶液，室溫下孵育24小時。測試格用PBS-Tween洗滌6次，在每格中加入100μl洗脫劑，在20℃孵育1小時。測試格用PBS-Tween洗滌6次，然后測定結(jié)合的酪胺化GXM量。結(jié)果被表示成與用PBS處理的測試格相比的被去除的酪胺化GXM百分比。
表1顯示，結(jié)合后的酪胺化GXM對用強解離劑洗脫具有突出的耐受性。明顯的洗脫出現(xiàn)在用堿性緩沖液或離液序列高的鹽處理時。但是，從微滴板上洗脫的T-GXM與以PBS處理的微滴板相比從不高出35％以上。
圖1顯示，將GXM加入碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液中時，有大量的GXM被結(jié)合。在碳酸鹽和磷酸鹽緩沖液中的最大結(jié)合約100-150ng/格。使用檸檬酸鹽緩沖液使得結(jié)合量顯著下降，觀察到的最大結(jié)合約50ng/格。加入NaCl至0.1M與在相同緩沖液中不加NaCl相比，顯著加強了使用磷酸鹽緩沖液發(fā)生的結(jié)合。與之類似的，在磷酸鹽緩沖液中，用0.95M NaCl產(chǎn)生的結(jié)合量大大多于在相同緩沖液中使用0.1M NaCl時的。在碳酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液中，提高離子強度并不產(chǎn)生類似的加強作用。
實施例5時間與溫度要求對涂覆時間和溫度進行了檢測。加入100mμl 10μg/ml放射性標記的T-GXM磷酸鹽涂覆緩沖液(含0.95M NaCl)溶液，孵育Immulon I微滴板。微滴板在4℃、20℃或37℃孵育1、2、4、8、24或48小時。洗滌微滴板并測定T-GXM結(jié)合量。
圖2顯示，在不同的測試時間，在20℃或37℃之間沒有明顯的結(jié)合水平差異。在20℃或37℃孵育48小時的結(jié)合并不明顯高于在24小時觀察到的。當孵育時間≥2小時，在4℃孵育的微滴板產(chǎn)生的結(jié)合明顯少于在20℃或37℃涂覆的微滴板。因此，此后均使用在20℃用T-GXM涂覆微滴板24小時。
ln(A/A0)對時間的繪圖，其中A是給定時刻的非充分結(jié)合能力，A0是總結(jié)合能力(在此定義為在20℃或37℃孵育48小時時的T-GXM結(jié)合量)，對在0℃、20℃或37℃涂覆的微滴板來說是線性的。這表明，結(jié)合的發(fā)生在各涂覆溫度具有單一一級速度常數(shù)特征。4℃時的結(jié)合(準一級速度常數(shù)≈3.2×10-4)比20℃(準一級速度常數(shù)≈2.7×10-3)或37℃(準一級速度常數(shù)≈2.6×10-3)時的低得多。
實施例6T-GXM在聚苯乙烯微滴板上固定化的穩(wěn)定性為了評價T-GXM與Immulon I微滴板結(jié)合的穩(wěn)定性，檢測了多種洗脫劑和解離劑。測試格加入100mμl 10μg/ml放射性標記的T-GXM磷酸鹽涂覆緩沖液(含0.95M NaCl)溶液，室溫下孵育24小時。測試格用PBS-Tween洗滌6次，在每格中加入100μl洗脫劑，在20℃孵育1小時。測試格用PBS-Tween洗滌6次，然后測定結(jié)合的酪胺化GXM量。結(jié)果被表示成與用PBS處理的測試格相比的被去除的酪胺化GXM百分比。
表1顯示，結(jié)合后的酪胺化GXM對用強解離劑洗脫具有突出的耐受性。明顯的洗脫出現(xiàn)在用堿性緩沖液或離液序列高的鹽處理時。但是，從微滴板上洗脫的T-GXM與以PBS處理的微滴板相比從不高出35％以上。
在不同保存條件下保存后測定了固定化T-GXM的穩(wěn)定性。聚苯乙烯微滴板的測試格在室溫下用100mμl 10μg/ml放射性標記的T-GXM磷酸鹽涂覆緩沖液(含0.95M NaCl)溶液涂覆24小時。測試格用PBS-Tween洗滌，然后(i)去除PBS-Tween，干燥保存；(ii)測試格再用蒸餾水洗滌兩次，干燥保存；或者(iii)100μlPBS-Tween覆蓋保存。間隔不同的時間取出4個測試格，用PBS-Tween洗滌，然后測定被結(jié)合的酪胺化多糖。不論在PBS-Tween洗滌后干燥保存(半壽期≈ 46天)或PBS-Tween覆蓋保存(半壽期≈47天)的微滴板都發(fā)生了T-GXM的逐漸丟失。通過蒸餾水洗滌來去除PBS-Tween使微滴板在干燥保存64天后丟失的T-GXM較少(估計半壽期＞100天)。
表1T-GXM從聚苯乙烯微滴板上的洗脫洗脫劑 pH 被洗脫的GXM百分比a對PBS的P甘油(35％) 8.0 1±11 0.83甘氨酸，0.5M HCl，0.5M HCl 2.0 -5.2±8.0 0.26硫氰酸胍，6.0M，0.05M Hepes/NaOH 7.2 19±3 ＜0.001鹽酸胍，6.0M，0.05M Hepes/NaOH 7.2 22±5.6 ＜0.001H2Ondb1.9±12 0.75MgCl2·H2O(4.0M)，0.1 M Hepes/NaOH6.3 9.2±3.40.02MgCl2·H2O，3.0M，0.075M Hepes/NaOH， 7.2 8.3±7.80.08325％乙二醇Na2CO3(1.0M)，0.5M NaCl 11.6 31±8.4 ＜0.001NaCl(3.0M) nd 11±14 0.13NaI(4.0M) 7.6 33±11 ＜0.001NH4OH(1.0M)11.5 18±5.7 ＜0.001PBS-0.01％Tween 7.0 10±11 0.10PBS-1％SDS 7.0 2.2±6.20.47硫氰酸鈉，6.0M，0.05M Hepes/NaOH 7.2 19±8.1 0.003脲，8.0M，0.05M Tris/HCl 8.0 9.2±17 0.66a洗脫量計算為與只用PBS的相比，被各種洗脫劑去除的T-GXM量。以上報道的數(shù)據(jù)是5個重復測試格的平均值±SD。b表示未測定。
使用CNBr、氰脲酰氯和高碘酸氧化反應活化被膜多糖以便與酪胺偶聯(lián)。本發(fā)明顯示，為了酪胺化多糖以便用于免疫測試，使用苯醌活化也是一種有效手段。苯醌活化有幾個與其活化步驟有關的特征。首先，進行苯醌活化的pH(≤8.5)低于其它方法所要求的。這對隱球菌多糖來說尤其重要，因為O-乙酰化是GXM的重要抗原特征之一。當pH＞8.5時，O-乙酰基很容易從多糖上脫落。其次，苯醌活化在多糖中引入了生色團，從而有助于對活化步驟的監(jiān)測。
將T-GXM與聚苯乙烯微滴板結(jié)合的量與用蛋白質(zhì)觀察的結(jié)合量進行了比較。用含0.95M NaCl的磷酸鹽緩沖液中的T-GXM涂覆，在50至100ng/cm2時開始出現(xiàn)結(jié)合飽和的位置。GXM的高水合性特性很容易說明用蛋白質(zhì)與用T-GXM獲得的結(jié)果間的差異。多糖是高水合性的，這一事實可預見，以重量分析為基礎時，充滿全部可及位置所需的多糖量較少。
溫度可能成為影響T-GXM與聚苯乙烯結(jié)合效率的一個重要因素。在4℃時的準一級速度常數(shù)約比20℃或37℃時的結(jié)合速度常數(shù)低8倍。
本發(fā)明表明，T-GXM與聚苯乙烯結(jié)合具有突出的牢度。洗脫劑幾乎都不能從微滴板上明顯洗脫T-GXM。此結(jié)合強度使得微滴板能夠長期保存而幾乎不丟失已結(jié)合的T-GXM。酪胺基團的引入無疑使得分子更具有疏水性，同時更易被聚苯乙烯所吸引。但是，由于每mol GXM結(jié)合約30mol的酪胺，單個GXM分子結(jié)合的多價特性可能是結(jié)合強度中的一個重要因素。與疏水性部分多數(shù)位于分子內(nèi)部的蛋白質(zhì)不同，很可能，GXM的伸展特性使得大多數(shù)(如果不是全部)酪胺基團能夠與聚苯乙烯表面結(jié)合。
實施例7隱球菌細胞與GXM如實施例1和2所述分離GXM。如實施例2所述使GXM與酪胺共價結(jié)合。
將活化的多糖(約4mg/ml)與等體積的鹽酸酪胺(1mg/ml的0.1M磷酸鈉緩沖液溶液，pH7.5)混合，室溫下孵育過夜，如此進行苯醌活化的GXM與酪胺的偶聯(lián)。如前所述加入乙酸鈉晶體和冰醋酸，加入2倍體積95％乙醇來沉淀酪胺偶聯(lián)的GXM。離心收集沉淀，以4mg/ml的濃度溶解在含0.5M NaCl的0.1M磷酸鈉(pH7.5)中，然后依次對含0.5M NaCl的0.1M磷酸鈉(pH7.5)和0.1M磷酸鈉(pH7.5)透析。利用Dubois等在Anal.Chem.28350-356(1956)所述的苯酚-硫酸試驗來測定GXM的濃度，然后將酪胺偶聯(lián)的GXM稀釋成2mg/ml，過濾滅菌，保存于4℃。
實施例8對抗隱球菌抗體的ELISA測定Immulon I微滴板(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，Va)的測試格用100ng酪胺化GXM(T-GXM)在100μl涂覆緩沖液(0.05M磷酸鈉，pH7.4，含10mMEDTA)中形成的溶液在4℃涂覆過夜。測試格用封閉緩沖液(0.05M磷酸鈉，pH7.4)洗滌3次，用300μl含0.05％ Tween20的封閉緩沖液封閉90分鐘。涂有酪胺化GXM的微滴板用PBS-Tween(含0.05％Tween20的PBS)洗滌3次，然后用連續(xù)兩倍稀釋的人血清的PBS-Tween溶液孵育90分鐘，起始稀釋比為1∶5。作為陰性對照，將全部血清在含4μg GXM/ml的PBS-Tween中并在加入涂有酪胺化GXM(GXM中和的血清)的測試格前孵育30分鐘。在用血清或GXM-中和的血清孵育后，測試格用PBS-Tween洗滌3次，用辣根過氧化物酶(HRPO)標記的第二抗體在室溫下孵育90分鐘。
第二抗體為HRPO標記的、親和純化的山羊抗人IgG重鏈(1/16,000；SouthernBiotechnology，Cat.no.2040-05)，HRPO標記的、親和純化的山羊抗人IgM重鏈(1/15,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2020-05)，HRPO標記的、親和純化的山羊抗人IgA重鏈(1/12,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2050-05)，HRPO標記的、親和純化的山羊抗人κ抗體(1/10,000；Southern Biotechnology，Cat.no.2060-05)或HRPO標記的、親和純化的山羊抗人λ抗體(1/5000；SouthernBiotechnology，Cat.no.2070-05)。第二抗體使用時稀釋8倍，使用純IgG(抗IgG、抗κ或抗λ)、IgM(抗IgM)或IgA(抗IgA)涂覆的微滴板格產(chǎn)生的OD450值為2.5。微滴板用PBS-Tween洗滌3次，然后用100μl TMB Microwell過氧化物酶底物溶液(Kirkegaard & Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MD)孵育30分鐘。加入100μl 1M的H3PO4終止反應。用一臺Ceres 900酶聯(lián)免疫吸附測定儀(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)在450nm處讀取30分鐘內(nèi)的吸光度。全部ELISA測定均重復進行，包括GXM中和對照。計算重復測試格的平均值，用不與GXM預孵育的血清獲得的OD450減去用GXM中和的血清獲得的OD450，計算出比OD450。用Kineticalc EIA Application Software 2.2版(Bio-Tek Instruments，Inc.)以滴定度眾數(shù)分析數(shù)據(jù)。用4參數(shù)計算法測定數(shù)據(jù)的最佳擬合，并將滴定度閾值設定為0.5。在此條件下，將產(chǎn)生的OD450為0.5(對背景(GXM中和的)進行了校正)的血清稀釋比作為終點。將血清稀釋比為1/5時OD450低于0.5的血清作為陰性。以鼠單克隆IgG1抗體為標準物，約500pg抗體產(chǎn)生的OD450為0.5。
對上述ELISA測定進行修改，將其用于測定抗GXM IgG抗體的IgG亞類。在此修改后的測定中，用GXM涂覆微滴板，如前所述，用血清稀釋液或稀釋在含GXM的PBS-Tween中的血清孵育。測試格在洗滌后與以最佳稀釋比稀釋的針對人IgG1(1/2,000；Calbiochem，La Jolla；Cat no.411451)、IgG2(1/8000；Calbiochem，La Jolla；Cat no.411461)、IgG3(1/40,000；Calbiochem，La Jolla；Catno.411481)或IgG4(1/1500；Calbiochem；Cat no.411492)的鼠單克隆抗體在室溫下孵育90分鐘。然后如前所述，用PBS-Tween洗滌微滴板，用100μl辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1/4500；Southern Biotechnology Assoc.，Inc.；Cat.no.1030-05)孵育，洗滌后，用底物孵育。報道的結(jié)果為對背景(GXM中和的)進行了校正的，產(chǎn)生的OD450為0.5的血清稀釋比。
實施例9正常供者的血清中抗GXM抗體的產(chǎn)生與免疫球蛋白種類對血清進行檢查，測定IgG、IgM和IgA抗體的水平。血清獲得自40個正常的成年志愿者。還檢查估定了具有κ或λ輕鏈的抗體的產(chǎn)生與水平。圖4顯示，28％的血清具有效價≥1/10的IgG抗體，98％的血清具有效價≥1/10的IgM抗體，只有一份血清樣品具有效價≥1/10的IgA抗體。99％的血清具有效價≥1/10的帶κ鏈抗體，45％的血清具有效價≥1/10的帶λ鏈抗體。
對IgG抗體效價＞1/50的的5份血清進行了進一步的檢測，以測定抗GXM IgG抗體的IgG亞類。結(jié)果(圖5)顯示，每份血清中都含有可測量的IgG2亞類的抗GXM抗體。其中兩份血清還含有可測量的IgG1抗體。全部血清都不含可測量的IgG3或IgG4亞類的抗GXM抗體。
實施例10HIV陽性供者的血清中抗GXM抗體的特征對病人血清中具有各種重鏈及輕鏈同種型的抗GXM抗體的產(chǎn)生幾率和水平進行檢測，這些病人為(i)HIV陽性，CD4數(shù)量≥500細胞/ml；(ii)HIV陽性，CD4數(shù)量為200至499細胞/mi；(iii)HIV陽性，CD4數(shù)量＜200細胞/ml。陽性效價定義為抗體效價≥1/10。
圖6顯示了HIV陽性供者血清分析的結(jié)果。表II給出正常供者(圖4)與HIV陽性供者(圖6)之間陽性效價幾率的比較?？笹XM IgG在CD4少于200的病人中出現(xiàn)幾率較低。但是，這一差別并不顯著。正常受試者中的IgG類抗GXM抗體的產(chǎn)生幾率顯著高于HIV陽性供者，這與CD4水平無關。與之類似的，HIV陽性供血者中的具有κ輕鏈的抗GXM抗體產(chǎn)生幾率顯著低于正常受試者中的。如果用實際抗體水平而不是用效價≥1/10的受試者的出現(xiàn)幾率進行比較，可能會發(fā)現(xiàn)其它差異。最后，利用Mann-Whitney級數(shù)總數(shù)測試對各受試組中的個體效價進行了比較。除了一個例外，用后一測試測得的明顯差異與根據(jù)陽性效價的幾率來評價數(shù)據(jù)時所發(fā)現(xiàn)的相同。這一個例外是，在CD水平低于200的HIV陽性病人血清中發(fā)現(xiàn)了顯著(P≤0.01)的抗體(帶λ輕鏈)效價抑制(與正常受試者相比)。
表II正常供者的血清和具有不同CD4水平的HIV陽性個體的血清中各種免疫球蛋白種類的抗GXM抗體抗體種類正常血清 HIV陽性，CD4＞500陽性1/總數(shù) 陽性/總數(shù)對正常的P2IgG 11/40 5/10 ＝0.27IgM 39/40 5/10 ＜0.001IgA 1/40 0/10 ＞0.99κ39/40 3/10 ＜0.001λ19/40 6/10 ＝0.51抗體 HIV陽性，C1)4200-499HIV陽性，CD4＜200陽性/總數(shù)對正常的P2陽性/總數(shù) 對正常的P2IgG 6/20 ＞0.99 1/10 ＝0.42IgM 7/20 ＜0.001 4/10 ＜0.001IgA 1/20 ＞0.99 0/10 ＞0.99κ 2/20 ＜0.001 1/10 ＜0.001λ 8/20 ＝0.78 5/10 ＞0.991將比抗體效價≥1/10的血清歸為陽性。
2利用Fisher Exact測定進行的統(tǒng)計學分析。
實施例11對AIDS病人血清的回顧性分析本發(fā)明提供了一種高敏感性的測定方法，用于檢測能夠與新型隱球菌的主要被膜多糖反應的抗體。本發(fā)明的方法能夠測定潛伏感染的存在，因為此種酵母留下了一個IgG抗體形式的“印跡”，此抗體能夠與多糖反應。這樣，抗體的存在指示出潛伏的隱球菌感染的存在，而且由此指示出AIDS病人中的隱球菌病高發(fā)危險性。
抗體的測定測定血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的存在，此為新型隱球菌的主要血清型特異多糖。這種多糖是包圍酵母的被膜多糖的主要成份。在酶聯(lián)免疫吸附測定中測定抗GXM的抗體，此測定中，將GXM固定在標準微滴板上。固定化作用要求對GXM進行某種方式的化學修飾，這種修飾作用在保留多糖的抗原結(jié)構的同時提高與微滴板牢固結(jié)合所需的疏水性。此測定使用了可使酪胺與GXM結(jié)合的苯醌偶聯(lián)法。如此修飾后的多糖與聚苯乙烯或聚氯乙烯微滴板的結(jié)合特別牢固。
病人血清測定采集血清，然后分為兩類當HIV感染發(fā)展為ADIS時(1)出現(xiàn)隱球菌病的和(2)不出現(xiàn)隱球菌病的HIV感染病人。出現(xiàn)隱球菌病組病人中測得的IgG抗體產(chǎn)生幾率顯著高于沒有出現(xiàn)隱球菌病組的病人中測得的。
本發(fā)明提供了新的有關正常成年供者血清中抗GXM抗體的信息。正常供血者產(chǎn)生抗隱球菌抗體IgM的幾率為98％，正常供者中產(chǎn)生IgG抗體的幾率為28％。本發(fā)明顯示了各種HIV陽性病人中IgM類抗體產(chǎn)生的顯著降低。對于具有κ輕鏈的抗體也可觀察到類似的產(chǎn)生幾率的降低。相反，產(chǎn)生具有λ輕鏈的抗體的HIV陽性病人的百分比并沒有降低。在HIV感染的各階段都沒有發(fā)現(xiàn)IgG抗體產(chǎn)生的明顯減少。這表明，作為隱球菌病危發(fā)性標志的IgG抗體在AIDS發(fā)展過程中并不隨免疫系統(tǒng)的衰退而丟失。
過去已發(fā)現(xiàn)，在HIV感染的較早期階段出現(xiàn)對2型T細胞依賴性抗原的應答減弱。對肺囊蟲疫苗的免疫應答的已有研究發(fā)現(xiàn)，在患有全身性淋巴結(jié)病的HIV陽性病人中，IgG、IgM和IgA應答減弱。所以，抗GXM IgG抗體的減少可能是因為IgG2的選擇性丟失。這與被檢的5份正常血清中有2份產(chǎn)生IgG1相一致。
正常人血清中對抗GXM抗體的抗原刺激尚不清楚?？贵w可能是受在環(huán)境中遇到的交叉反應性抗原的刺激。能夠與幾種細菌的被膜反應的“天然”抗體被認為與不致病的腸道或鼻咽微生物抗原接觸有關。葡糖醛酸和O-乙酰基是許多多糖的常見組份。所以，有可能，廣泛存在的抗GXM IgG抗體能夠與這些成份中的一種反應。另一方面，木糖雖然常見于植物中，但并不特征性地常見于細菌的被膜中。IgG抗GXM抗體可能表明與實質(zhì)性的或亞臨床表現(xiàn)的感染狀態(tài)的隱球菌接觸。這樣，抗GXM IgG抗體將成為潛伏的隱球菌感染以及HIV感染病人或其它免疫減弱病人中隱球菌病發(fā)病危險性提高的標志。
本說明書中提到的專利和公開文獻都表明了本發(fā)明所涉及領域中熟練技術人員的研究水平。所有的專利和公開文獻在此均作了相同程度的引用與參考，每一篇文獻都被具體、單獨地說明，以在此引用參考。
本領域中熟練技術人員將很容易理解，本發(fā)明適合于實現(xiàn)本發(fā)明的目的，并獲得文中提到或其它隱含的效果和優(yōu)點。本文中描述的實施例以及方法、步驟、治療方法、分子和具體化合物在本文中代表優(yōu)選實施方式，它們是舉例性質(zhì)的，而不是對本發(fā)明范圍的限定。本領域的技術人員將能夠發(fā)現(xiàn)其中的改變和其它用途，這些都包含在本發(fā)明權利要求所限定的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種鑒定隱球菌病高危發(fā)性個體的方法，其特征在于，其步驟包括測定所述個體的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的水平。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的個體是免疫減弱的。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述的免疫減弱個體處于某種病理生理學狀態(tài)，這種狀態(tài)選自獲得性免疫缺陷綜合征，超生理劑量的腎上腺皮質(zhì)激素，結(jié)節(jié)病和淋巴癌。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的個體感染了人免疫缺陷病毒。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的抗體為IgG。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述的IgG抗體是IgG1或IgG2亞類的抗體。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，通過酶聯(lián)免疫吸附測定來測定其中所述的抗體。
8.用于測定隱球菌病高危發(fā)性個體的血清中存在抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的試劑盒，其特征在于，它包含某種固體相；能夠使GXM與固相疏水性結(jié)合的疏水性配基；酶指示劑系統(tǒng)；和酶聯(lián)抗體的合適底物。
9.一種檢測血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的方法，其特征在于，其步驟包括用稀釋在PBS-Tween中的血清在25℃與涂有抗原的微滴板測試格一起孵育90分鐘；從測試格中去除病人的血清，用PBS-Tween洗滌所述的測試格以去除未結(jié)合的抗體；洗滌后的測試格用對人IgG具有特異性的稀釋的酶聯(lián)抗體在25℃孵育30分鐘；通過PBS-Tween洗滌從測試格中去除酶聯(lián)抗體；加入酶聯(lián)抗體的合適底物，然后在25℃孵育30分鐘；加入終止溶液，然后測定酶產(chǎn)物的光密度。
10.一種治療隱球菌病高危發(fā)性個體的方法，其特征在于，其步驟包括測定所述個體的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的水平；給以抗新型隱球菌劑。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的個體是免疫減弱的。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于，其中所述的免疫減弱個體處于某種病理生理學狀態(tài)，這種狀態(tài)選自獲得性免疫缺陷綜合征，超生理劑量的腎上腺皮質(zhì)激素，結(jié)節(jié)病和淋巴癌。
13.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的個體感染了人免疫缺陷病毒。
14.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，其中所述的抗體為IgG。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于，其中所述的IgG抗體是IgG1或IgG2亞類的抗體。
16.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，通過酶聯(lián)免疫吸附測定來測定其中所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒定隱球菌病高危發(fā)性個體的方法，其步驟包括測定所述個體的血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖IgG抗體的水平。本發(fā)明還提供了多種檢測血清中抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的方法，和一套用于測定免疫減弱個體的血清中存在抗葡糖醛酸木糖聚甘露糖抗體的試劑盒。
文檔編號C12P19/00GK1147270SQ95192919
公開日1997年4月9日 申請日期1995年4月27日 優(yōu)先權日1994年5月2日
發(fā)明者T·R·科澤爾 申請人:研究發(fā)展基金會