專利名稱：防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，更確切地說，涉及用于防治植物根部病害，特別是用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑。
大豆是我國的重要栽培作物之一，其經濟價值較高。近年來由于種植面積不斷擴大，重迎茬耕作問題突出，因而導致大豆病蟲害發病面積增加，危害日益嚴重。在諸多病蟲害中，以大豆胞囊線蟲(Hetero derag1ycines)病的危害最大，其發病面積約占大豆種植面積的70％以上，一般損失達10-40％，嚴重的甚至可造成大豆絕產。對于大豆根部的病害，目前多數是采用呋喃丹、多福合劑與乙基硫磷等化學農藥以及各種化學種衣劑。這類藥物雖然在大豆生長前期有一定防效，但是由于這類化學農藥的大量使用，導致環境的嚴重污染。另外，由于藥物在土壤中長期積累，降低了土壤肥力，而且易使病菌及害蟲產生抗藥性，降低了藥物對病蟲害的防治效果。鑒于化學農藥的諸多弊病，使得利用生物方法來防治植物寄生線蟲病日益受到關注。在生物防治的過程中，最關鍵的問題是要找到并分離出對特定的病蟲害有足夠殺滅能力的微生物菌株及用該菌株配制出適于使用的制劑。迄今為止，用淡紫擬青霉(Paccilomyceslilacinus)來防治根結線蟲(Meloidogyne spp.)國外已做過不少試驗，例如，菲律賓已有商品制劑(商品名BIOCON)投放市場，此制劑通過浸泡馬鈴薯塊莖來防治其根結線蟲病的效果很好。然而這種制劑對于防治大豆胞囊線蟲病的效果卻很不理想，所以迄今為止尚未發現有利用深紫擬青霉制劑來防治大豆胞囊線蟲病的報導。這是因為，對于大多數植物而言，其生活環境十分復雜，菌劑與植物本身、病害蟲、土壤等各方面的條件互相影響。以往的生防菌劑多是作用方式和作用位點單一，因而防治效果有限，尤其是對用于植物根部病害的生防菌劑，由于土壤抑菌作用[即土壤抑制真菌孢子(也包括細菌、放線菌的繁殖體)萌發]的普遍存在，嚴重影響了菌劑實際應用于大田中的病害蟲防治。特別是對大面積種植的大豆來說，至今仍未發現一種能有效地防治大豆胞囊線蟲病的生物防治方法。
本發明的目的是要提供一種適用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株及其制劑。
本發明人經過多年對各種有關菌株的篩選分離工作，90年在黑龍江省華楠縣孟家崗的大豆連作四年的田塊土壤中，測得每100g土中平均含有胞囊數67.5個。共檢測了128個胞囊，完全寄生的占9.5％。其中發現了一個胞囊很特別，胞囊內的物質全部被消解掉，而真菌孢子充滿了整個體腔，將孢子轉移到PDA平板上培養繁殖，經鑒定為淡紫擬青霉的特異菌株。另外對50余種土樣一萬多個胞囊測定的結果，發現雖有一些寄生菌屬于淡紫擬青霉，但均未發現象上述菌株能在大豆胞囊線蟲雌蟲體內產生大量孢子的現象，只是在胞囊內產生菌絲，寄生或纏繞在卵上。因而本發明人確定，上述分離出的特異菌株是一種新菌株。將得到的菌株轉入含多菌靈(從0.1ppm至50ppm，逐漸增大濃度)的PDA培養基中，結果篩選出一種可耐50ppm多菌靈的生防菌株。多次轉代后，該菌株的產孢能力會有所下降，但可通過紫外誘導的方法使其復壯，即在20w紫外燈下15-20cm處，隔日輻照一次，每次約15min，一般輻照3-4次后即可挑選菌落中的回復部分，進行單孢分離，即可實現菌株復壯。該菌株在PDA培養基上培養時，菌落正面呈暗紫紅色，背面為黑褐色。培養兩周后，其菌落直徑即達到79±4mm，產生大量分生孢子，其大小為(2.4±1.1)×(2.2±0.3)μm。該種菌可耐50ppm的多菌靈，可寄生于大豆胞囊線蟲的卵中及雌蟲體內并能消解利用其中的物質，最終使其分生孢子充滿整個雌蟲體腔并導致雌蟲死亡，從而使大豆胞囊線蟲由于無法繁殖而很快被消滅。而所測定的淡紫擬青霉中的其他菌株均未發現上述效果。于是，本發明人將這一特異的新菌株送往北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏日期為1995年10月23日，保藏號為CGMCC0241，其名稱為淡紫擬青霉CGMCC0241。另外，如果將本發明的淡紫擬青霉CGMCC0241采用液體發酵的三級發酵工藝，并加入復合添加劑制成該菌株的制劑，則更方便于在大面積的大豆種植田上用于大豆胞囊線蟲病的防治。
從而，本發明提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其特征在于，它是淡紫擬青霉CGMCC0241。
另外，本發明還提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是采用真菌菌株接種，通過液體三級發酵工藝而制成，其特征在于，用于接種的菌株為淡紫擬青霉CGMCC0241；液體發酵的溫度一般控制在24-30℃，優選為26-28℃；PH值一般控制在5-8，優選PH6-7；所說三級發酵最終結束時間的掌握條件是鏡檢觀察到的菌株液生孢子濃度達到5×108個/ml以上，優選是達到7×108個/ml以上，并且菌絲干重達到2％(W/V)以上。
上述三級發酵工藝是指從試管原種開始，經過三角搖瓶、種子罐、發酵罐的三級發酵，接種量一般為5-10％，這些是現有技術，但對本發明的淡紫擬青霉來說，在發酵過程中的溫度、PH值和發酵時間皆應限定在上述范圍內。發酵時間一般與培養基的組成、發酵溫度、發酵罐的體積、通氣條件等有關。通常搖瓶和種子罐的發酵時間各為1.5-2.5天，發酵罐的發酵時間為2-4天，總發酵時間約為一周。
上述的液體發酵所用的培養基設有嚴格限制，它可以采用現有技術中一般的真菌培養基，但本發明人通過研究后發現，根據大豆營養需求及我國大豆主產區土壤礦質元素的分布規律，應適當添加一定比例(從數個ppm至數百個ppm)的微量元素(如硼、鉬等)。在培養基中加入一定氯化鈉和鈣鹽(0.1-2％)，可明顯地增加產孢率和抑制雜菌生長。
因此，本發明采用的培養基成分如下培養基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(補足100％)在上述成分中，一些元素(氯和鈣)具有抑制有害細菌生長的效果。同時，適量鈣鹽可在一定程度上提高植株耐病性。另外，由于我國大豆種植地區的土壤中缺少鉬和硼，因此適當補充這兩種微量元素十分重要。其他各種成分都是有利于淡紫擬青霉的繁殖或有利于大豆生長的成分。
在菌株液體發酵的基礎上，控制發酵液PH值，并復合多種添加劑研制成具有多種作用方式，多位點的新型生防菌劑-大豆保根菌劑。首先，為利于真菌的生長繁殖，將發酵液PH值調至微酸性條件(PH6.0-6.5)。幾丁質成分一方面在分解后可釋放出殺線物質，同時又可以刺激加強生防菌對線蟲的侵染，而且還能夠給微生物、植株提供豐富的營養，克服土壤對真菌菌劑的抑制作用，增強植株耐病性。在發酵生產結束后，選擇加入0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質、膠原蛋白的物質(主要為蝦、蟹等動物的甲殼)。另外，一些植物具有良好的殺線蟲效果，選擇在發酵液中加入2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。另外，在菌液中加入0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素，以增加菌液粘稠度和均勻度，同時使菌劑更牢固地包衣在大豆種子上。
上述的三類添加劑，既可單獨使用其中的任一類，也可以使用其中的任兩類或者三類結合使用。
另外，本發明菌株液體制劑的另一種優選方案的特征在于，其中所說的菌株發酵液經減壓濃縮，然后再加入上述各種添加劑中的一種或多種進行復配而制成。其中所述的添加劑包括富含幾丁質、膠原蛋白的物質；蒜汁和/或大麻汁；甲基纖維素。該方案的優點是便于貯存和運輸。
另外，本發明菌株液體制劑的另一種優選方案的特征在于，其中所說的菌株發酵液經過過濾，將固、液組分分別處理、包裝，制成待播種時混合施用的制劑。該方案的優點也是便于貯存和運輸。
另外，本發明還提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病的固體菌珠制劑，其特征在于，它是由上述液體菌珠制劑與固體填充物按(0.5-1.3)∶1(w/w)混合、陰干和粉碎而制成。
上述的固體填充物最好是由硅藻土70重量％和草炭30重量％混合而成。
本發明的液體菌株制劑的使用方法如下按播種每畝所用的大豆種子量(約5-6kg大豆)加100ml的液體菌劑混合，包衣種子，待晾干后即可進行正常播種。此外根據不同的耕作條件及生產規模，還可以采用其他后處理工藝，例如將液體菌劑濃縮后復配，或將發酵液過濾，將固、液組分分別處理包裝，待播種時再混合施用。
本發明的固體菌株制劑的使用方法是將該制劑的粉碎細粒或其成形顆粒劑與大豆種子混合均勻后再進行正常的播種。
與現有技術的化學農約或類似生物農約相比，本發明的用于防治大豆胞囊線蟲病的液體或固體菌株制劑具有如下優點1、可以寄生于線蟲的胞囊、雌蟲體內及卵中，抑制其發育和繁殖，從而顯著地減少土壤中線蟲種群數量；2、淡紫擬青霉在液體發酵過程中產生的代謝物可抑殺胞囊線蟲的2齡幼蟲；3、能有效地克服土壤的抑菌作用，可以長期地保持淡紫擬青霉的殺線蟲的能力；4、可定殖于大豆植株的根際，拮抗線蟲及根腐菌的浸染；5、可調節根際微環境(包括酶活性及微生物群落)，有利于大豆生長；6、增加大豆須根量，并增加根瘤數量和體積；7、促進大豆生長，增加大豆耐病性；8、制劑中的有機添加物分解后能釋放出抑殺線蟲及病菌的物質，即通過多個位點、多種方式作用于線蟲生活史的各個階段，從而能長期地保持殺線蟲和抑制病菌的能力。
下面通過具體實施例來進一步解釋本發明。
實施例1
采用試管培養的淡紫擬青霉CGMCC 0241原種，再按三角搖瓶→種子罐→發酵罐的三級發酵工藝培養，接種量為7％，采用的培養基組合物成分如下培養基成分 含量蔗糖 3％(W/V，下同)NaCl 1％KNO30.3％K2HPO40.1％CaCO30.3％FeSO4·7H2O100ppmZnSO4100ppmMgSO4·7H2O500ppmCuSO45ppmNaMoO4·2H2O 5ppmH3BO410ppm水 余量(補足100％)控制發酵溫度在26-28℃；PH6.5±0.5一、二級發酵時間各定為2天，三級發酵結束時間定為發酵液中液生孢子濃度達到6×108個/ml，整個發酵時間為7天。發酵結束后測得的菌絲干重為2％(W/V)。調節菌液PH值為6.0，往該發酵液中加入0.25％(W/V)的蟹殼粉、3％(W/V)的蒜汁和0.2％(W/V)的甲基纖維素，混合均勻后按每100ml制劑與3kg大豆種子(一畝的用量)混合拌種，共試驗100畝地。另外，為了對比起見，在同一地區劃出10畝地未使用本發明的制劑。結果表明，在使用本發明制劑的100畝大豆中，胞囊線蟲病明顯減輕，較對照減少65％，對根腐病防效40％以上，大豆的平均畝產要比未使用本發明制劑的平均畝產高出約20％。
權利要求
1.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其特征在于，它是淡紫擬青霉CGMCC0241。
2.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是采用真菌菌株接種，通過液體三級發酵工藝而制成，其特征在于，用于接種的菌株為淡紫擬青霉CGMCC0241；液體發酵的溫度一般控制為24-30℃；PH值為5-8；所說三級發酵最終結束時間的掌握條件是鏡檢觀察到的菌株液生孢子濃度達到5×108個/ml以上，并且菌絲干重達到2％(W/V)以上。
3.如權利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在制備該制劑時的發酵過程中使用的培養基組合物的成分如下培養基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl 0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(補足100％)
4.如權利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質、膠原蛋白的物質。
5.如權利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。
6.如權利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素。
7.如權利要求2所述的菌株液體制劑，其特征在于，在該制劑中還含有0.2-0.5％(W/V)富含幾丁質、膠原蛋白的物質；2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁及0.1-0.3％(w/v)的甲基纖維素。
8.如權利要求2所述菌株液體制劑，其特征在于，其中所說的菌株發酵液經減壓濃縮，然后再加入權利要求7中所述添加劑的一種或多種進行復配而制成。
9.如權利要求2所述菌株液體制劑，其特征在于，其中所說的菌株發酵液經過過濾，將固、液組分分別處理、包裝，制成待播種時混合施用的制劑。
10.一種用于防治大豆胞囊線蟲病的固體菌株制劑，其特征在于，它是由液體菌劑與固體填充物按(0.5-1.3)∶1(W/W)混合，陰干和粉碎而制成。
全文摘要
一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株，其名稱為淡紫擬青霉CGMCC0241。一種用于防治大豆胞囊線蟲病的菌株液體制劑，它是用上述菌株接種，經過三級發酵并加入復合添加劑而制成。發酵過程溫度為24-30℃；pH值為5-8；最終發酵結束時間的條件為鏡檢觀察到的液生孢子數在5×10
文檔編號C12N1/14GK1138096SQ9512111
公開日1996年12月18日 申請日期1995年12月29日 優先權日1995年12月29日
發明者劉杏忠, 張新德, 謝云清, 孫漫紅 申請人:中國農業科學院生物防治研究所, 黑龍江省農墾科學院農作物開發研究所