防御素基因的植物表達載體質粒的制作方法

專利名稱：防御素基因的植物表達載體質粒的制作方法
技術領域：
本發明涉及到植物基因工程領域，即將源自動物的防御素(defensin)基因重組到植物表達載體上。防御素(defensin，DEF)是一類微生物抗性和細胞毒性肽，主要存在于哺乳動物的白血細胞、吞噬細胞、小腸的潘氏細胞、昆蟲的脂肪體中。防御素通常含有29—35個氨基酸，包括6個高度保守的半胱氨酸。通過核磁共振光譜與X射線晶體學分析表明，哺乳動物防御素是通過分子內二硫鍵連接了其氨基端與羧基端的半胱氨酸殘基，從而形成穩定的β片狀剛性結構，這可能對于發揮其功能是必要的。昆蟲的防御素的立體結構與哺乳動物有些不同，盡管它們也是含有6個高度保守的半胱氨酸殘基的多肽，但它們的立體結構不僅含有反向平行的β片狀結構，而且含有α螺旋結構。
體外實驗表明[參考Lehrer，K.I.等，Inun Kev.Immunol 11105—128(1993)]，防御素的微生物素抗性譜包括革蘭氏陰性與陽性細菌、分枝桿菌、支原體、衣原體、許多種真菌和一些被膜病毒。此外，防御素表現出對廣泛的正常與惡性細胞具有非特異性的毒殺性，這些靶細胞包括抗TNF-α和NK-細胞溶解因子的細胞。防御素抗微生物的機理與對哺乳動物靶細胞的毒殺機理是相同的即帶正電荷的防御素分子先與帶負電荷的靶細胞表面分子(可能是極性膜脂層的頭部基團)靠靜電相互作用，隨后插入到細胞膜中，形成電壓依賴離子通道，擾亂了細胞膜的通透性及細胞能量狀態，導致細胞膜去極化、呼吸作用受到抑制以及細胞ATP含量嚴重下降，從而使微生物細胞或哺乳動物靶細胞致死。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結合而導致病毒失去生物活性。
基于防御素具有廣譜的微生物抗性，特別是兔子防御素嗜中性白細胞肽(neutrophil petide，NP)NP-1和NP-2，既抗多種革蘭氏陽性與陰性細菌，又抗多類真菌與病毒，使防御素在基因工程上頗具誘惑力。這種應用主要表現在二個方面一是在醫學上，研究出高效的細菌、酵母或植物等表達系統，以大量生產防御素；另一方面是從兔子等哺乳動物或昆蟲中分離防御素基因，然后導入到植物中去，以培育出抗病植物新品種。
誠然，從宿主有機體中分離防御素，其成本是相當昂貴的。為此，科學家試圖研究出高效的細菌、酵母等表達系統。Reichhart等[參見Invert.Repreduct.Develop.2115—24(1992)]首次報道昆蟲防御素A在酵母中得到表達，并從酵母中分離純化出昆蟲防御素A。Piers等[參見Gene 1347-13(1993)]報道利用蛋白A作載體，與人類防御素HNP—1構建融合蛋白，在細菌S.aureus中得到表達，但表達的HNP-1不具有活性。植物抗病基因工程仍然是植物基因工程的重大課題。盡管抗病基因工程已取得相當大的進展，一些抗病基因工程產品不久將上市場。但是，目前可利用的抗病基因不多，而且大多數抗病基因的微生物抗性譜不廣。
本發明的目的之一是將防御素基因構建成植物表達載體質粒，再將該載體質粒導入植物中，旨在植物體中生產防御素，然后從轉基因植物中提取防御素，以降低防御素的生產成本。
本發明的目的之二是利用防御素基因構建成植物表達載體質粒，再將該載體質粒通過土壤根癌或發根農桿菌、基因槍、Polyethylene Glycol(PEG)等多種轉化技術導入植物中，使植物具有抗細菌、病毒及(或)真菌的特點，從而培育出作物、林木、果蔬以及花卉等植物抗病新品種，為農林果木業生產及減少農藥污染作出貢獻。由于原核細胞與真核細胞的結構，尤其是膜結構的差異，防御素在植物中的表達只會毒殺微生物而不會毒殺植物本身。
本發明主要包括以下四個方面的技術
一、從兔子肝臟中提取總DNA。
二、兔子防御素NP-1基因的聚合酶鏈反應(Polymerase ChainReaction，PCR)擴增兔子NP-1基因由兩個內含子(Intron)和3個外顯子(Exon)組成，其中第一個外顯子對應于5′端不翻譯區，第二外顯子主要是編碼防御素信號肽和前導肽(Preproprotein)序列。第三個外顯子則是編碼成熟肽段及3′端不翻譯區[參見Gang，T.等J.of Immunology 1431358—1365(1989)]。由于植物中翻譯加工機制和動物中翻譯加工機制存在著不同，為了使NP—1基因在植物中高效表達出有功能活性的成熟防御素以達到植物抗病的目的，在5′端引物第一個密碼子前加了啟始密碼子ATG，而且5′、3′端引物分別有外加的酶切位點BamH I和Sac I，便于PCR產物的克隆。這樣用于NP—1基因的PCR擴增的雙端引物分別設計為5′端引物(5′GTGTAGGATCCATGGTGGTCTGTGCGTGCAGACG3′)和3′端引物(5′GGGAGAGCTCAGTAGTCAAAACATGT3′)。反應體系為50ul，其中Taq酶0.5ul(5U/ul)，4種dNTP中每種終濃度為200umol/L，Mg2+的終濃度為1.5mmol/L，10×反應緩沖液5ul，雙端引物各2ul，模板DNA20ng，其余加雙蒸水補齊。反應條件為94℃預變性3分鐘，然后94℃變性45秒，58℃復性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環，最后72℃延伸5分鐘以補齊末端。
三、NP-1基因的克隆和序列分析將PCR擴增的NP-1基因產物用內切酶BamHI和SacI在37℃消化2小時，然后75℃10分鐘失活內切酶，與經同樣酶切處理的PUC19載體16℃連接5小時，然后轉化感受態大腸肝菌DH5α。這樣NP-1基因定向插入到PUC19的BamHI和SacI位點。在含有100ug/ul氨芐青霉素及X—gal和IPTG各800ug的LB平板上經藍白斑系統篩選出陽性克隆。用BamHI和SacI雙酶切鑒定出有正確插入的重組子，再用AppliedBiosystem 381A型DNA序列分析儀測定序列。
四、NP-1基因植物中高效表達載體的構建我們將NP-l基因替換pBI121質粒中GUS基因，這樣NP-1基因5′端有在植物中高效表達的花椰菜花葉病毒(Califlower Mosaic Virus CaMV)35S啟動子，3′端有增強表達的nos終止子。而且這個載體還含有能在植物中和細菌中表達的卡那霉素抗性基因。
圖例說明在圖例1中，(1)表示植物表達載體質粒pBI121，其中RB為右邊界序列，NPT-II為卡那霉素抗性基因，35SCaMV為花椰菜花葉病毒35S啟動子，GUS為β-葡糖苷酸酶基因，Noster為nos終止子，HindIII、XbaI、BamHI、SacI和EcoRI為限制性內切酶位點，LB為左邊界序列。
在圖例1中，(2)表示插入了成熟NP-1基因的pUC19質粒載體，其中Apr為氨芐青霉素抗性基因，Polycloning Site為多酶切位點，EcoRI、SacI、XbaI、SalI、PstI、SphI和HindIII。
在圖例1中，(3)表示已構建好的兔防御素NP-1基因的植物表達載體質粒pBIC-35SNPl，其中NPT-II為卡那霉素抗性基因，CaMV35S啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子，RB為右邊界序列，LB為左邊界序列，HindIII、XbaI、SacI和EcoRI為限制性內切酶位點，ATG為NP-1基因的起始密碼子。
實施例1兔子肝臟總DNA的提取[參照Kavis，L.G.等Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，lnc(1986)]1.將抽提DNA的組織(兔子肝臟，100mg以上)放在一個10ml的聚丙烯管內；2.加入2ml勻漿緩沖液
；3.用組織勻漿器(Polytron)碾磨，直到看不見塊狀組織；4.加入125ul10％SDS，振蕩混合；5.65℃水浴中至少保溫30分鐘；6.加入350ul 8M醋酸鉀振蕩混合，樣品置冰上60分鐘；7.4℃，5000×g離心10分鐘；8.將上清液轉移入新的10ml管中，棄去沉淀；9.加2ml氯仿和2ml飽和酚抽提，短暫振蕩混合或倒轉管子混合之后，靜止或短暫離心使液層分開；10.將上層移入一個新管，棄去下層；11.再加2ml氯仿，混合方法如上，靜止使液層分開后，棄去下面的氯仿層；12.在水相層上加5ml乙醇，沉淀DNA，倒轉管子溫和混合，1500×g離心10分鐘，沉淀的DNA將形成團；13.棄去上清層，加5ml 80％乙醇，溫和混合；14.1500×g離心5分鐘；15.移去乙醇，倒干液體，管子在室溫下放置至少30分鐘，使沉淀基本干燥，不要干透；16.將沉淀溶解在300ul無菌雙蒸水中，室溫下溫和振蕩90分鐘，4℃貯存，DNA樣品可以穩定保存6個月；17.制備的樣品可供限制性內切酶酶切并可作瓊脂糖凝膠電泳。一般30ul無菌雙蒸水中含有10ug DNA。
實施例2兔子防御素NP-1基因的PCR擴增取上述提取的兔子總DNA 20ng作PCR擴增模板，于50ul反應體系中，加入Taq酶0.5ul(5U/ul)，4種dNTP(每種dNTP終濃度為200umol/L)，Mg2+(終濃度為1.5mmol/L)，10×反應緩沖液(GeneAmp試劑盒，購自Perkin-Elmer-Cetus公司)5ul，雙端引物(5′端為5′GTGTAGGATCCATGTGGTCTGTGCGTGCAGACG3′，3′端為5′GGGAGAGCTCAGTAGTCAAAACATGT3′)各2ul，其余加雙蒸水補齊。反應條件為94℃預變性3分鐘，然后94℃變性45秒，58℃復性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環，最后72℃延伸5分鐘以補齊末端。取少量擴增產物于2％的瓊脂糖(購自Promega公司)凝膠中電泳鑒定，結果擴增出一條大小約200bp的條帶。
實施例3NP-1基因的克隆和序列分析1.將PCR擴增的大小約200bp的NP-1基因產物用內切酶BamHI和SacI在37℃消化2小時，然后75℃反應10分鐘以失活內切酶；2.連接到經同樣酶處理過的PUC19載體(購自Promega公司)，16℃連接5小時，然后轉化感受態大腸桿菌DH5α，這樣NP-1基因定向插入到PUC19的BamHI和SacI位點；3.在含有100ug/ul氨芐青霉素及X-gal和IPTG各800ug的LB(1升LB含10g蛋白胨，10g氯化鈉，5g酵母提取粉，15g瓊脂粉，PH7.0)平板上經藍白斑系統篩選出陽性克隆，即從轉化皿中共挑選出12個白斑進行鑒定，其9個白斑質粒變大。對這9個質粒HindIII和EcoRI雙酶切，有8個切出了小片段，其中6個小片段約250bp，另兩個小片段大小約500～600bp，可能是兩個片段串連而成。取前面6個中的兩個用PstI單酶切，若能用PstI單酶切切下80bp左右的小片段，則認為是NP-1的克隆，結果兩個克隆都切出了80bp左右的小片段；4.用BamHI和SacI雙酶切鑒定出有正確插入的克隆(即重組子)，用Applied Biosystem 381A型DNA序列分析儀測定其序列，結果與已發表的序列完全一致(參見Gang，T.等J.of Immunology 1431358-1365(1989)和Ligmer，R.等FEBS 321267—273(1993)]。
實施例4NP-1基因的植物表達載體質粒的構建1.用限制性內切酶XbaI和SacI雙酶切消化已插入大小約200bp NP-1基因的PUC19載體；2.連接到用同樣酶處理過的植物表達載體pBI121上，16℃連接5小時，然后轉化感受態大腸桿菌DH5a，這樣NP-1基因定向插入到pBI121質粒XbaI和SacI位點處。其5′端有植物中高效表達的CaMV35S啟動子，3′端有增強表達的nos終止子，以保證NP-1基因在植物中高效表達。pBI121上的卡那霉素抗性基因作為轉化植株的篩選標記；3.然后用XbaI和SacI雙酶切鑒定NP-1基因的插入，并用沒有插入NP-1的pBI121載體作對照。構建的載體切出了200bp的NP-1基因，說明NP-1已經正確插入到pBI121的質粒XbaI和SacI位點處。這樣NP-1基因的植物表達載體已構建成功，并命名為pBIC-35SNP1，可以用農桿菌、基因槍、激光等轉化技術導入植物中。
本發明不受所述實施例4的限制，任何相類似的啟動子(如Patatin、ubiqitin、Actin和pEmu啟動子)在本發明之內，任何相類似的篩選標記基因(如Hygr基因和Bar基因等)在本發明之內，任何相類似的動物(如哺孔動物、兩棲類動物、爬行類動物、昆蟲等)的防御素基因在本發明之內。
由以上可以總結出本發明的效果有以下二點1.用DNA重組技術將防御素NP-1基因定向插入到植物表達載體pBI121質粒的XbaI和SacI位點處，其5′端是CaMV35S啟動子，3′端是nos終止子。保證了NP-1基因在植物中的高效表達，卡那霉素基因NPT-II基因作為轉基因植物的篩選標記；2.用XbaI和SacI雙酶切該載體質粒，證明了NP-1基因已經正確地插入到植物表達載體pBI121質粒的XbaI和SacI的位點處，可以用農桿菌感染法、基因槍法、花粉管導入法等多種轉化方法導入植物中。
權利要求
1.一種載體質粒，含有啟動子、防御素(defensin)基因、終止子和篩選標記基因，其特征在于將源自動物的防御素(defensin)基因重組到植物表達載體上，該基因表達產生的防御素含有六個高度保守的半胱氨酸，形成三對分子內的二硫鍵，對細菌、真菌、支原體、衣原體及有被膜病毒具有非特異性的殺傷作用。
2.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于含有高度同源的防御素基因，哺乳動物、兩棲動物、爬行類動物和昆蟲的防御素基因表達產生的防御素都有相似的氨基酸組成，都含有六個高度保守的半胱氨酸，形成三對分子內的二硫鍵，從而形成類似的高級結構，執行類同的防御功能。
3.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的5′端組裝基因調控元件CaMV35S啟動子，它能使防御素基因在植物體中表達。
4.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的5′端組裝基因調控元件ubiquitin啟動子，它能使防御素基因在植物體中強表達。
5.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的5′端組裝基因調控元件Actin啟動子，它能使防御素基因在單子葉植物體中強表達。
6.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的5′端組裝基因調控元件pEmu啟動子，它能使防御素基因在單子葉植物體中強表達。
7.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的5′端組裝基因調控元件Adh1啟動子，它能使防御素基因在單子葉植物體中強表達。
8.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于在防御素基因的3′端組裝了增強表達能力的nos終止子。
9.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于該質粒組裝NPT-II基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用卡那霉素篩選。
10.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于該質粒組裝Hygr基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用潮霉素篩選。
11.根據權利要求1所述的載體質粒，其特征在于該質粒組裝Bar基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用除草劑Bastar篩選。
全文摘要
將兔子的防御素基因NP-1基因構建成植物表達載體質粒，將該質粒導入植物后，可以在植物體內表達，在植物體內產生防御素(defensin)，從而賦予植物抗細菌、抗真菌、抗病毒的能力，用于農業、林業、果樹等抗病新品種培育，同時也可以從轉基因植物中提取防御素，用于醫藥。
文檔編號C12N15/63GK1126760SQ9510887
公開日1996年7月17日 申請日期1995年9月1日 優先權日1995年9月1日
發明者孫勇如, 付榮昭, 曹光誠, 李文彬, 舒群芳, 馬江生, 張利明, 李忠陽 申請人:中國科學院遺傳研究所