被調節的細胞程序死亡的制作方法

專利名稱：被調節的細胞程序死亡的制作方法
技術領域：
本發明涉及與嵌合蛋白質同二聚或多聚的，較好是非肽的有機分子的低聚合有關的材料、方法及應用。借助對宿主細胞的重組修飾及其在基因治療中的應用或可誘導基因表達的其他應用，舉例說明了本發明的若干方面。
引言生物學特異性通常是由蛋白質間高度特異性的相互作用而導致的。信號轉導即是這一原理的實際例證，借助這一過程細胞外分子影響到細胞內行為。許多途徑都是隨著細胞外配體與細胞表面受體結合而發生的。在許多情況下，受體二聚合導致蛋白質的轉磷酸化及補充，所述蛋白質繼續進行信號級聯反應。認識到膜受體可經過同二聚作用而被激活是從受體可由交聯了兩個受體的抗體所激活這一觀察結果而得出的。其后，發現許多受體都有這些性質。據信許多受體的細胞外和跨膜區域都通過配體依賴性二聚合或低聚合，將受體的胞漿區帶向密切接近處而發揮功能的，而受體的胞漿區則將特定信號傳遞給細胞的內部對應部分。
其他一些人已研究了配體-受體在不同的系統中的相互作用。例如Clark等人(Science(1992)258，123)描述了B細胞抗原受體復合物的胞漿效應物。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)、Verweij等人(J.Biol.Chem.(1990)265，15788)和Shaw等人(Science(1988)241，202)報導NF-AT指導的轉錄是嚴格處于抗原受體控制下的。Emmel等人(Science(1989)246，1617)和Flanagan等人(Nature(1991)352，803)報導了環孢菌素A(cyclosporin A)和FK506對NF-AT-指導的轉錄的抑制作用。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)和Mattila等人(EMBO J.(1990)9，4425)描述了NF-AT結合位點。描述ζ鏈的參考文獻包括0rloff，等人Nature(1990)347，189-191；Kinet，等人，Cell(1989)57.351-354；Weissman，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，9709-971 3和Lanier，Nature(1989)342，803-805。Byrn等人(Nature(1990)344，667-670)描述了CD4免疫粘附蛋白(immunoadhesin)。Irving等人(Cell(1992)64，891)，以及Letourner和Klausner(Science(1992)255，79)描述了CD8-ζ融合的蛋白質。
描述與啟動子區域關聯的轉錄因子和不同的活化作用和DNA結合的轉錄因子的文章包括Keegan等人，Nature(1986)231，699；Fields和Song，ibid(1989)340，245Jones，Cell(1990)61，9；Lewin，Cell(1990)61，1161；Ptashne and Gann，Nature(1990)346，329；Adams and Workman，Cell(1993)72，306。
描述孢囊擊靶和融合的文章包括Sollner等人，(1993)Nature 362，318-324；和Bennett and Scheller(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2559-2563。
描述調節的蛋白質降解的文章包括Hochstrasser等人(1990)Cell 61，697；Scheffher，M.等人(1993)Cell 75，495；Rogers等人(1986)Science 234，364-368。
提供合成技術和FK506及相關化合物的修飾方面的其他信息的公開包括GB 2 244 991 A；EP 0 455 427 A1；WO91/17754；EP0 465 426 A1；US 5,023,263和WO 92/00278。
涉及Fas抗原、p55 TNF受體(下文的“TNF受體”)和/或細胞程序死亡的描述性公開包括Itoh等人(1991)Cell 66，233-243；Nagata等人，歐洲專利申請公開號510691(1992)；Suda等人，Cell(1993)，75(6)1169-78；Oehm等人，J.Biological Chem.(1992)267(15)，10709-10715；和Wong and Goeddel，JImmunol(1994)，152(4)，1751-5。
有關基因治療的方法和材料的討論見于Watson，Gilman，Witkowski和Zoller，RECOMBINANT DNA，2d edition(WHFreeman&Co，1992)的第28章以及該文文獻目錄中引用的參考文獻，尤其是pp564-565中。
然而，如從本說明書中可以清楚地看出的，前述作者都沒有描述或提示本發明。下文中詳細公開的我們的發明包括利用蛋白質在活細胞內同二聚合、異二聚合和低聚合的普遍適用的方法及材料。(本文所用術語低聚體、低聚合化和低聚合作用包含二聚體、三聚體和更高級的低聚體及其形成)。嵌合應答蛋白質是作為有特異性受體區的融合蛋白質在細胞內表達的。用與受體區域結合的細胞可穿透性多價配體試劑處理細胞，導致嵌合體的二聚合或低聚合。與其他嵌合受體(如參見Weiss，Cell(1993)73，209)相似，設計嵌合蛋白質以使低聚合作用激發細胞死亡，在某些具體實施方案中，可激發任選的其他繼后的變化過程，如細胞內信號通過繼后的蛋白質-蛋白質相互作用傳播，從而激活特異性亞群的轉錄因子。可使用受體基因檢測法檢測轉錄的開始。由合成配體在細胞內交聯嵌合蛋白質對于各種細胞過程的基礎研究、工程細胞中可調節地發動細胞死亡和在調節有治療或農業重要性之蛋白質的合成中具有潛在作用。此外，配體介導的低聚合目前已使調節的基因治療得以可能實現。在這種情況下，它提供了-種新方法以提高用基因治療得到的安全性、表達水平及總體效果。
發明的概述本發明提供了宿主細胞基因工程的材料和方法，以使所述細胞及其后代以可調節的方式對有程序的細胞死亡(細胞程序死亡)敏感。本發明可用作消除在培養基中或體內生長的工程細胞的群體的手段，因此它可為基因治療中所用的基因工程細胞提供特別的具有自動防止故障特性的機理。
本發明涉及新的嵌合的(或“融合的”)蛋白質、編碼它們的DNA構建體，以及能夠使嵌合蛋白質低聚合的配體分子。該嵌合蛋白質至少含有一個與下文詳述的能在細胞中啟動程序死亡的作用區域融合的配體結合(或“受體”)區域。如下文也將述及的，嵌合蛋白質也可含有附加區域。就其各個區域是得自不同的來源，因而并非同時存在于自然界(即是異種的)這個意義上說，嵌合蛋白質是重組的。
本發明提供了編碼新的嵌合蛋白質的DNA分子(“構建體”)，它可用于宿主細胞的基因工程。這些構建體就其組成部分，如編碼特定區域或表達控制序列的各部分并非在自然界中被發現彼此直接相連這個意義上說，它們是重組體。本發明還提供了產生和使用所述經修飾細胞的方法和組合物。
為了產生經修飾細胞，有人將編碼所需嵌合體的DNA引入選定的宿主細胞，這可以通過使用常規的載體(可以商購多種載體)和技術來完成。如有必要，還可通過常規方法從其他細胞中篩選、分離出經修飾細胞并培養之。
用于實施本發明的低聚合化配體能與兩個(或多個)受體區域，即含有這種受體區域的兩個或多個嵌合蛋白質結合。低聚合化配體可以任一順序或同時與嵌合體結合，優選Kd值低于大約10-6，更優選的低于約10-7，甚至最好的是低于大約10-8，并且在某些實施方案中Kd值低于約10-9M。優選的配體不是蛋白質，并且具有小于大約5kDa的分子量。如此低聚合的嵌合蛋白質的受體區域可以是相同或不同的。嵌合蛋白質能夠在暴露于配體之后，即嵌合體低聚合后啟動其宿主細胞的程序死亡。因此，本發明基因工程細胞的程序死亡發生在細胞暴露于能使嵌合體低聚合化的配體之后。換句話說，本發基因工程細胞含有上述嵌合體蛋白質，并且對能使那些嵌合體低聚合化的配體的存在有反應。這種反應性可通過對細胞死亡的啟動來證實。
被編碼的嵌合蛋白質可進一步包含能夠將嵌合蛋白質導向預期的細胞對應部分的細胞內靶向區域。靶向區域可能是分泌性前導序列、跨膜序列區、膜結合區或指導蛋白質例如與泡囊或與核聯系的序列。
嵌合蛋白質的作用區域可選自通過交聯激發細胞程序死亡的任何蛋白質或蛋白質區域(優選為人類來源或序列)，包括例如Fas抗原的胞質區域。
正如下文將更詳細討論的，舉例來說，本發明多個實施方案中，嵌合蛋白質能夠結合FK506型配體、環孢菌素A型配體、四環素或類固醇配體。這種結合導致嵌合蛋白質與其他可以相同或不同的嵌合蛋白質分子的低聚合。
除了編碼上述嵌合體(“初級”嵌合體)的構建體以外，細胞還可任選地進一步含有另外的異源DNA構建體用以一個或多個所需基因的可調節性或組成性表達。例如，細胞另外還可含有一個或多個編碼任選嵌合體的其他構建體，否則如上所述只含有作用區域，它通過配體誘導的低聚合作用可激發生物過程而不是細胞程序死亡。這種其他的作用區域可選自能夠在該嵌合蛋白質低聚合后影響所需生物學結果的多種不同蛋白質的區域。例如，作用區可包含如CD 3 zeta(ζ)亞單位這樣的蛋白質區域，該區域在接觸配體并繼而低聚后，能夠發起可檢測的細胞內信號；作用區還包含如Gal4這樣的DNA結合蛋白質，或如VP16這樣的轉錄激活區。本文提供了許多其他的例子。可檢測之細胞內信號的一個例子是在可對低聚合作用反應的轉錄控制元件(如增強子和/或啟動子元件等)的轉錄控制下，激活基因轉錄的信號。優選地，可使初級嵌合體低聚合化并導致細胞程序死亡的配體不會導致任選嵌合體蛋白質的低聚合。通常甚至更優選的是可使任選嵌合體低聚合化并影響任選的生物學過程，如經調節的基因轉錄的配體不會導致初級嵌合體的低聚合或激發細胞程序死亡。不同套的配體在某種意義上來說是正交的。
正如下文將更詳細討論的，在本發明各種實施方案中，嵌合蛋白質能夠結合FK506型配體、環孢菌素A型配體、四環素或類固醇配體。這種結合可導致嵌合蛋白質分子與其他可以相同或不同的嵌合蛋白質分子的低聚合。
可任意選擇的是，細胞還可以含有另一個重組構建體或這類構建體系列，該構建體包含處于轉錄控制元件(如啟動子/增強子)的轉錄控制下的靶基因，所說的轉錄控制元件對由配體介導的任選嵌合蛋白質的低聚合，即細胞暴露于相關配體所激發的信號有反應。就靶基因并非天然處于反應性轉錄控制元件的轉錄控制之下而言，這些構建體是重組的。
這種任選的靶基因構建體可含有(a)對上述任選嵌合蛋白質的低聚合起反應的轉錄控制元件，和(b)來自靶基因的側翼DNA序列，該序列允許轉錄控制元件同源重組到與靶基因相關聯的宿主細胞中。在另外的實施方案中，構建體含有所需基因和允許靶基因同源重組到所需座位中之靶座位的側翼DNA序列(參見例如Mansour等人，1988，Nature 336，348-352以及M.Capecchi等人后來的論文)。構建體還可含有反應性轉錄控制元件，或可由座位提供的反應性元件。靶基因可編碼如表面膜蛋白質、分泌性蛋白質、胞質蛋白質或核酶(ribozyme)或反義序列。
本發明的構建體還可含有允許構建體轉染到宿主細胞中并選擇含有該構建體之轉染體的可選擇標志。本發明進一步包括DNA載體，它含有各種本文所述的構建體，可用于將此構建體引入進行組織培養的宿主細胞中，也可在活體內將此構建體施用給整個生物體以引進細胞中。在任一種情況下，此構建體可通過附加體引入或用于染色體整合。該載體可以是病毒載體，例如包括腺病毒載體、腺相關病毒載體或反轉錄病毒載體。
本發明還包括由我們的任何一個DNA構建體編碼的嵌合蛋白質，以及含有和/或表達它們的細胞，包括原核和真核細胞，特別是各種類型和譜系的酵母、蠕蟲、昆蟲、小鼠或其他嚙齒動物、以及包括人細胞在內的其他哺乳動物細胞，其可以是冷凍的或呈活體生長的，或培養中的或含有它們的整體生物。
概括地說，本發明提供了含有編碼初級嵌合蛋白質的第一個DNA構建體的細胞，優選但并非一定是哺乳動物細胞，其中所說的嵌合蛋白質包含(i)至少一個能夠與本發明選擇的低聚合化配體結合的受體區域以及(ii)另一個蛋白質區域，它與有關的受體區域異源，但與一個或多個其他類似區域低聚合后能夠激發細胞的程序死亡。將細胞暴露于選定的配體之后，即可發生程序化的細胞死亡。
在一些實施方案中，剛剛描述過的細胞也可含有編碼一個或多個嵌合蛋白質的一個或多個任選的DNA構建體，其中所說的嵌合蛋白質包含(i)至少一個能夠與本發明選擇的低聚合化配體結合的受體區域以及(jj)另一個蛋白質區域，它與有關的受體區域異源，但與這些任選的嵌合體低聚合后能夠激發(直接或間接)靶基因在對所說的低聚合起反應之轉錄控制元件的轉錄控制下的轉錄過程活化。這些細胞通常也可含有處在對所說的低聚合配體起反應的轉錄控制元件之表達控制下的靶基因。在暴露于選擇的配體之后，靶基因得以表達。另外，能夠使初級嵌合體低聚合化的配體和能夠使任選的嵌合體低聚合化的配體應能正交。
在其他實施方案中，本發明的細胞也可含有編碼第一任選嵌合蛋白質的DNA構建體，其中所說的嵌合蛋白質包含DNA結合區和至少一個能與第一個選擇的配體部分結合的受體區域。所述細胞進一步包括含有轉錄激活區域及至少一個能與第二個選擇的配體部分(其可以與第一個選擇的配體部分相同或不同)結合的受體區域的第二任選嵌合蛋白質。所述細胞另外還含有編碼處于異源轉錄控制序列的轉錄控制下的靶基因的DNA構建體，靶基因具有相關的結合位點以結合到DNA結合區域并對轉錄激活區發生反應，從而在細胞暴露于含有選擇之配體部分的低聚合化配體之后即可表達靶基因。
用于實施本發明各方面的DNA組合物包括那些編碼任選嵌合體的DNA組合物，那些組合物含有編碼嵌合蛋白質之第一DNA構建體和編碼靶基因之第二DNA構建體，其中所說的嵌合蛋白質包含至少一個能與選擇的配體結合的受體區，該受體區則融合于能夠在暴露于低聚配體后，即嵌合蛋白質低聚合后發起生物學過程的異源附加蛋白質區；且其中所說的靶基因處于對低聚配體起反應的轉錄控制元件的轉錄控制下。
用于實施本發明各方面的另一類型的DNA組合物包含編碼第一和第二個嵌合蛋白質的第一系列DNA構建體，以及編碼靶基因的第二DNA構建體，所說的靶基因處在對嵌合蛋白質分子低聚合起反應的轉錄控制元件的轉錄控制下。編碼第一個嵌合蛋白質的DNA構建體包含(a)至少一個能與選擇的第一配體部分結合的第一受體區域，以及與受體區域融合的(b)能夠在接觸低聚合配體，即第一嵌合蛋白質低聚成第二嵌合蛋白質分子后起動生物學過程的異源附加蛋白質區域。編碼第二個嵌合蛋白質的DNA構建體包含(i)至少一個能夠與選擇的第二配體部分結合的受體區域，以及與該區域融合的(ii)能夠在接觸低聚配體后，即與第一個嵌合蛋白質低聚合后起動生物學過程的異源附加蛋白質區域。在這些情況下，第一和第二受體部分可以是相同或不同的，并且第一和第二選擇配體部分也同樣可以是相同或不同的。
我們的配體是能夠與本發明的兩個或多個嵌合蛋白質分子結合，以形成其低聚體的分子，并有下列通式接頭-[rbm1，rbm2，…rbm n]其中n是2至大約5的整數，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或不同的并能與嵌合蛋白質結合的受體結合部分。rbm部分共價連接到接頭部分上，所說的接頭部分是能夠與兩個或多個rbm部分共價結合(“-”)的雙或多功能分子。優選的配體分子量小于大約5kDa，并且不是蛋白質。這樣的配體的例子包括其中rbm部分相同或不同者，而且包含FK506-型部分，環孢菌素型部分、類固醇或四環素。環孢菌素型部分包括環孢菌素及能夠與親環素(cyclophilin)結合的，天然或經修飾的，較好有低于大約10-6M之Kd值的其衍生物。在某些實施方案中，配體較好以大于約10-6M，更好以大于約10-5M的Kd值結合到天然存在的受體上。本發明的說明性配體是其中至少-個rbm包含FK506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或兩位置上經修飾之衍生物的分子者，這些配體以比其天然存在之受體蛋白質結合的Kd值小至少1個，較好2、更好3個，甚至最好4或5個或更大數量級的Kd值，與經過修飾的受體或含有經過修飾之受體區域的嵌合分子結合。接頭部分也在下面詳細描述，但作為說明其可包括如C2-C20亞烷基、C4-C18氮雜亞烷基、C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基，C6-C18亞芳基，C8-C24芳基二亞烷基或C8-C36雙羧酰氨基亞烷基部分。
本發明的單體rbm，以及含有單一rbm拷貝的化合物是低聚合拮抗劑，其能夠與我們的嵌合蛋白質結合但不影響其二聚合或更高級的聚合或低聚合(從個別rbm的單體性質來看)。
在本發明的一個重要的方面，本發明的基因工程細胞可以與其他細胞一起培養，通過加入有效量的相應于(即可結合于)初級嵌合蛋白質的低聚合配體可從細胞混合物中有選擇地清除出此基因工程細胞。因此，將此細胞與低聚合配體接觸可激發工程細胞的細胞死亡。例如，可允許這種細胞在需要的期間內產生內源或異源產物，然后通過加入配體使之缺失。在這種情況下，細胞被工程化以產生根據本發明的初級嵌合體。可按常規方法在培養物中培養將進一步被工程化以在配體誘導的調節下表達所需基因的細胞。在那種情況下，向培養基中加入任選嵌合體的配體可導致所需基因的表達和所需蛋白質的產生。如下文詳細描述的，然后向培養基中加入低聚合拮抗劑即可關閉基因的表達和蛋白質的產生。在其他情況下，蛋白質的產生是組成型的。無論怎樣，在這些工程細胞已完成其所要完成的使用目的(如產生所需蛋白質或其他產物)之后，可通過向培養基中加入有效量的適當低聚合化配體以導致初級嵌合體的低聚合并誘導工程細胞的程序死亡，從而從細胞培養物中清除這些工程細胞。本發明的工程化改造的細胞也可以在體內用于修飾整體生物，例如包括人在內的動物，以使含有這些細胞的動物體內由這些細胞產生所需蛋白質或其他效果。這類應用包括進行基因治療。另外，可以在細胞外使用嵌合蛋白質和低聚分子，以將協同發揮啟動生理學作用的蛋白質帶到一起。
因此本發明提供了在對加入低聚合配體反應中，有選擇地清除細胞的材料和方法。該方法包括提供按照本發明進行工程改造的細胞，并使細胞與配體接觸。
因此，本發明提供了使用如本文所述的工程化細胞通過可調節地激活細胞中靶基因的轉錄從而產生異源蛋白質，并在需要時清除工程細胞的方法。該方法包括可提供本發明的細胞，它可表達初級嵌合蛋白質，此蛋白質在低聚合后可啟動細胞程序死亡，該細胞進一步包含并能表達(a)至少一個可編碼嵌合蛋白質的DNA構建體，此蛋白質在低聚合后可激活(b)靶基因的轉錄。嵌合蛋白質包含至少一個能夠與選擇的低聚合配體結合的受體區域。該受體區域融合到一個在暴露于低聚配體之后，即與一個或多個含有另一作用區域之拷貝的其他嵌合蛋白質低聚合后，能夠啟動細胞內信號的作用區域上。此信號能夠激活基因的轉錄，例如在這種情況下可激活處于對此信號起反應之轉錄控制元件的轉錄控制下之靶基因的轉錄。因此該方法包括使細胞暴露子能夠與導致靶基因表達的有效量嵌合蛋白質結合的低聚合配體。在細胞生長于培養基中的情況下，向培養基中加入配體即可使細胞暴露于配體。在細胞存在于宿主生物體內的情況下，則將配體投藥于宿主生物體，即可實現細胞與配體的接觸。例如，在宿主生物體是動物，特別是哺乳動物(包括人)的情況下，可將配體在其適當的載體中，經口服、口內(bucal)、舌下、經皮、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內或吸入等途徑對宿主動物給藥。為了清除工程細胞，可根據具體情況在培養基中加入或給宿主生物體、施用能夠使初級嵌合體低聚合化的第二低聚合化配體。
本發明進一步包括藥用組合物，用于從包括動物組織或含有這種工程細胞的個體在內的不同細胞混合物中清除本發明的基因工程細胞。這種藥用組合物含有與可藥用的載體及任選的一種或多種可藥用的賦形劑相混合的本發明低聚合配體。如在本文其它部分所詳述的，低聚合配體可以是同低聚合試劑或異低聚合試劑，只要它能與本發明的初級嵌合蛋白質結合或能激發本發明工程細胞的程序死亡。同樣，本發明還包括一種藥用組合物，它含有與可藥用的載體并可選擇地與一種或多種可藥用的賦形劑相混合的本發明低聚合拮抗劑，用于完全或部分地防止或降低細胞培養物或個體內本發明工程細胞中嵌合蛋白質的低聚合水平，因此可防止或消除相關細胞中的細胞死亡。因此使用低聚合試劑和低聚合拮抗劑制備的藥用組合物包括在本發明的范圍內。
本發明還貢獻一種提供對本發明的低聚合配體有反應的宿主生物體，優選是動物，在許多情況下是哺乳動物的方法。該方法包括引入已按本發明進行離體(ex vivo)工程化改造的，即含有編碼前述之嵌合蛋白質之DNA構建體的生物體細胞。另外，亦可在允許體內轉染一個或多個宿主哺乳動物細胞的條件下將本發明的DNA構建體導入宿主生物體，如哺乳動物體內。
我們進一步提供了產生對配體調節的細胞程序死亡敏感之細胞的試劑盒。一種試劑盒包含至少一個編碼我們的初級嵌合蛋白質之一的DNA構建體，所說的嵌合蛋白質則含有至少一個受體區域和作用區域(例如Fas或TNF受體的胞質區，如前所述)。在一個實施方案中，DNA構建體含有常規的多接頭以給實踐者提供摻入細胞型特異性表達控制元件(啟動子和/或增強子元件)的位點，從而提供一個或多個嵌合體的細胞型或組織特異性表達。該試劑盒可含有一定量能夠使由試劑盒中的DNA構建體編碼的嵌合蛋白質分子低聚合的本發明的配體，另外并可含有一定量的低聚合拮抗劑，如單體配體試劑。在由構建體編碼單一嵌合蛋白質時，低聚配體是同低聚合配體。如編碼一個以上這樣的嵌合蛋白質，則可包括異低聚合配體。該試劑盒可進一步包含另外的DNA構建體，該構建體編碼任選的嵌合體和/或靶基因構建體和/或對嵌合蛋白質分子的低聚合起反應的轉錄控制元件。DNA構建體較好是與一個或多個便于選擇轉染體的選擇標志，以及用于在原核細胞中復制、在真核細胞中表達等的其他常規載體元件相聯系的。對于每個不同的DNA構建體來說選擇標志可以是相同或不同的，從而便于選擇含有這種DNA構建體的多種聯合的細胞。
例如，本發明的一種試劑盒含有編碼如本文其它部分所述的初級嵌合蛋白質的DNA構建體，編碼嵌合蛋白質的第一任選的DNA構建體，其中嵌合蛋白質包含至少一個融合到轉錄激活物區域上的受體區域(能夠與選擇的配體結合)；編碼嵌合蛋白質的第二任選的DNA構建體，其中嵌合蛋白質至少含有一個融合到DNA結合區域上的受體區域(能夠與選擇的配體結合)；以及編碼靶基因的靶基因DNA構建體，其中靶基因處于含有一DNA序列的轉錄控制元件的控制下，所說的DNA序列上結合了DNA結合區并且它是在第一和第二個任選的嵌合蛋白質存在下經暴露于配體而被轉錄激活的。
另外，用于導入處于反應性轉錄控制元件控制下之靶基因的DNA構建體可含有一代替靶基因的克隆位點，以為工程化細胞提供可誘導地表達由實際工作者將提供的基因提供適用試劑盒。
本發明的其他試劑盒可包含一個或兩個(或多個)表達嵌合蛋白質的DNA構建體，其中一個或多個構建體含有克隆位點代替作用區域(轉錄起始信號發生元件、轉錄激活因子、DNA結合蛋白質等)，以允許使用者插入她/他所希望的某一個作用區域。這樣的試劑盒亦可任選包含上述的其他元件，如表達處于反應性表達控制下之靶基因的DNA構建體、低聚合配體、拮抗劑等。
任何試劑盒還都可含有用本發明的構建體穩定地轉化的陽性對照細胞，以使它們在對細胞與配體接觸發生反應中表達報導基因(編碼CAT、β-半乳糖苷酶或任何可方便地檢測的基因產物)。還可提供檢測和/或定量報導基因表達產物的試劑。
附圖的簡要描述

圖1是質粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)的示意圖。NF-AT-SX中，來自含IL2增強子/啟動子之IL2-SX的HindIII-ClaI DNA片段，被賦予基本轉錄的最小IL-2啟動子和含有3個串聯NFAT結合位點的可誘導元件所取代(詳見下述)。
圖2是制備細胞內信號傳輸嵌合體質粒p#MXFn和p#MFnZ的流程圖，其中n是指示結合區域的數目。
圖3A和3B是制備細胞外信號傳輸嵌合體質粒p#1FK3/pBJ5的流程圖。
圖4A、4B和4C是構建主題發明所用質粒中使用的引物的序列。
圖5是具有不同增強子群的報導構建體對受體TAC/CD3ζ與配體反應的反應曲線。
圖6是各種配體與實施例1中所述TAg Jurkat細胞的活性的曲線圖。
圖7是配體FK1012A(8，圖9B)與細胞外受體1FK3(FKBPx3/CD3ζ)之活性的曲線圖。
圖8是通過肉豆蔻酰化的CD3ζ/FKBP12嵌合體經信號傳遞激活NFAT報導基因的曲線圖。
圖9A和9B分別是烯丙基連接的FK506變異體和環己基連接的FK506變異體的化學結構。
圖10是合成FK520的衍生物的流程圖。
圖11A和B是合成FK520衍生物的流程圖，和FK520的化學結構，其設計底部結構以接到突變體FKBP12上。
圖12是圖解說明在假定的溝中的有經修飾之FK520的突變體FKBP。
圖13是合成FK520和環孢菌素之異二聚體的流程圖。
圖14是圖解顯示嵌合蛋白質的低聚合，舉例的嵌合蛋白質含有親免素部分作為受體區。
圖15說明配體介導的嵌合蛋白質的低聚合，圖解顯示對轉錄起始信號的激發。
圖16描繪基于FK-506型部分的MED和HOD試劑的合成流程。
圖17描繪以CsA開始的(CsA)2的合成。
圖18是融合cDNA構建體和蛋白質MZF 3E的概觀。
圖19顯示FK1012誘導的，用肉豆蔻酰化Fas-FKBP 12融合蛋白質(MF3E)轉染之Jurkat T細胞系的細胞死亡，根據降低的細胞的轉錄活性指示結果。
圖20A是在瞬間轉染試驗中對親環素-Fas(和Fas-親環素)融合構建體的分析。在該系列中顯示MC3FE是最有效的。
圖20B描繪親免素-Fas抗原嵌合體，和在用大的T抗原穩定轉化的Jurkat T細胞中瞬間表達實驗的結果。Myr取自編碼殘基1-14之pp60c-grc的肉豆蔻酰化序列(Wilson等人，Mol.εCellBiol.94(1989)1536-44)FKBP人FKBP12；CypC編碼殘基6-212的鼠親環素C序列；(Freidman等人，Cell 664(1991)799-806)；Fas編碼殘基179-319之人Fas抗原的細胞內區域(Oehm等人，J.Biol.Chem.267.15(1992)10709-15)。細胞用編碼分泌的堿性磷酸酶報導基因(該報導基因處于3個串聯AP1啟動子控制下)的質粒連同6倍摩爾過量的親免素融合構建體經電穿孔而轉染。24小時后用PMA(50ng/ml)(借以刺激報導基因的合成)和(CsA)2刺激細胞。在第48小時，檢測細胞的報導基因活性。在24小時用抗HA表位抗體進行Western印跡試驗。
圖21描繪經修飾的FK506型化合物的合成。
本發明的描述I.一般性討論本發明提供了嵌合蛋白質，用于低聚合嵌合蛋白質的有機分子及使用它們的系統。融合的蛋白質(嵌合體)有一個用于與(較好是小的)有機低聚合分子結合的結合區域和一個作用區域，作為嵌合蛋白質低聚合的結果其可導致某生理學作用或細胞過程。
圖14中圖解說明了可誘導的蛋白質聯系的基本概念。可發揮異二聚合(或異低聚合，“HED”)劑和同二聚合(或同低聚合，“HOD”)劑作用的配體是啞鈴形結構給出的。
(同二聚和同低聚是指相似部分結合，例如它們借助本發明的配體相連接而形成二聚體或低聚體。異二聚和異低聚是指不相似的組分結合形成二聚體或低聚體。因此同低聚體包含特定成分的多個拷貝的結合，而異低聚體包含不同成分之拷貝的結合。本文所使用的術語“低聚合作用”、“低聚合化”和“低聚體”，如無明顯的相矛盾的指示，不管有無字首，都意欲包括“二聚合作用”、“二聚合化”和“二聚體”。
圖14中描繪的是含有有用靶蛋白質區域(“作用區域”)和一個或多個可與配體結合之受體區域的融合蛋白質分子。對于細胞內嵌合蛋白質，即定位于產生它們的細胞之內的蛋白質，較好還存在一細胞擊靶序列(包括細胞器擊靶氨基酸序列)。配體與受體區域的結合導致融合蛋白質的異或同二聚合。低聚作用使得作用區域彼此密切靠近，從而激發正常情況下與各個作用區域相關聯的細胞過程-例如細胞程序死亡或TCR介導的信號轉導。
可由低聚作用激發的細胞過程包括狀態的改變，例如構象改變、結合對象改變、細胞死亡、起始轉錄、通道開放、離子(如Ca+2等)釋放等物理狀態的改變，或者例如酶解催化的化學反應，如酰化、甲基化、水解、磷酸化或去磷酸化、氧化還原狀態改變、重排等化學狀態的改變。因此，任何這類可由配體介導的低聚合作用激發的過程均包括在本發明范圍內，盡管本文最初的焦點是細胞程序死亡。
在本發明的主要特征中，細胞經修飾以便能與配體分子反應，該配體分子能與本文公開的初級嵌合體結合。因此能使嵌合體低聚合化。例見以下實施例4(B)和4(C)。這種工程細胞通過進行細胞程序死亡而對配體的存在發生反應，因此在必需或需要清除經遺傳修飾的細胞的基因治療和其他場合的應用中可以清除這種工程細胞。例如，經修飾的細胞可以變成癌性或者要不然變成有害的或多余的細胞。
經修飾的細胞的特征在于其基因組含有基因構建體(或其系列)，此構建體編碼可允許配體調節的細胞程序死亡的本發明初級嵌合蛋白質，此初級嵌合體含有例如Fas抗原或Apo-1抗原的胞質區域，當其交叉連接時可誘導大多數細胞類型的細胞程序死亡(Trauth等人，(1989)Science 245，301-305Watanaba-Fukunaga等人，(1992)Nature 356，314)。通過這種方式可為工程細胞的群體提供配體誘導的細胞死亡。
可將細胞進一步工程化改造以產生能與選定的配體分子結合并反應的任選的其他嵌合蛋白質。這種進一步任選的工程改造給予細胞額外的配體調節的功能，此功能可用于包括體外細胞培養的應用及基因治療的應用。優選地，能與任選的其他嵌合體結合并能調節任選的其他細胞過程(如基因轉錄)的配體分子不能與初級嵌合體分子交叉反應，因此它不能激發工程細胞的程序死亡。
這種進一步經修飾的細胞可用于需要調節如靶基因的轉錄或翻譯(兩者統稱為表達)的細胞過程調節的應用中。這種細胞的特征在于其基因組至少含有第一或第一系列(該系列可能只包括一個構建體)基因構建體，此基因構建體編碼任選的其他嵌合體，并可望包括第二或第二系列(該系列可以只包括一個構建體)靶基因構建體。
所述基因構建體的性質和數目將取決于嵌合蛋白質的性質及其在細胞中所起的作用。例如，在一些實施方案中任選的其他嵌合蛋白質是將與靶基因(其可含有指導嵌合蛋白質將與細胞表面膜或與核或泡囊等細胞器相聯系的細胞內擊靶序列或區域)的表達相聯系的，這樣正常情況下將至少有兩個系列的這種其他構建體編碼嵌合蛋白質的第一系列，該蛋白質在配體介導低聚合后起動信號指導靶基因表達，以及更理想的是還有第二個包括靶基因和/或其表達控制元件(該元件對信號有應答)的系列。
在包括同低聚體通常是同二聚體時，第一系列中將只需要單一的構建體，而當包括異低聚體時，則可能涉及兩個或多個且通常不多于三個構建體。由第一系列構建體編碼的嵌合蛋白質將與基因轉錄的啟動相關并且通常將被指引向表面膜或核，在那里低聚合的嵌合蛋白質能夠直接或間接地啟動一個或多個靶基因的轉錄。在導入外源基因，或者為表達內源基因而導入外源或重組表達控制序列時(例如通過同源重組)，將需要第二系列的附加構建體，每種情況下其轉錄均將因嵌合蛋白質的低聚合而激活。
在嵌合蛋白質是在細胞內的并且能直接起作用而沒有引發另一個基因的轉錄的情況下，則利用不同的第一系列其他構建體。例如，能夠可誘導地或構成上地表達與胞吐作用相關的蛋白質，此時蛋白質除非在低聚分子存在下，一般將不發生復合。通過利用具有任何或所有下列這些性質的蛋白質，即在宿主細胞中不復合；經與其他蛋白質復合而受到抑制，且其抑制作用可因與配體低聚而得到克服；需要通過一個宿主細胞中不可得到的過程來激活；或者通過修飾指導泡囊與胞漿膜融合的蛋白質以形成嵌合蛋白質，此時復合物形成和膜融合的程度因有低聚分子的存在而提高，胞吐作用具有將被低聚分子誘導的能力。
可以同樣地修飾和使用其他細胞內蛋白質，如激酶、磷酸酶及細胞周期控制蛋白質。
對本發明實際可用的各類任選的其他基因構建體描述如下(1)編碼包括結合區和作用區之嵌合蛋白質的構建體，其中結合區是細胞外或細胞內的，作用區是細胞內的，這樣配體介導的嵌合蛋白質的低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚體)或與包含不同作用區之不同融合蛋白質的低聚合(形成異低聚體)，即可誘導產生導致一系列過程的信號，進而激活一個或多個基因的轉錄；(2)編碼包括有結合區和作用區之嵌合蛋白質的構建體，其中結合區和作用區在同一核內，這樣配體介導的蛋白質的低聚合，包括其自身的低聚合(形成同低聚物)或與包括不同作用區之不同的融合蛋白質的低聚合(形成異低聚物)，即可誘導直接通過低聚物與DNA轉錄起始區的復合而發動轉錄過程(3)編碼包括結合區和作用區之嵌合蛋白質的構建體，其中結合區和作用區是胞質內的，這樣配體介導的蛋白質低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚體)或與包含有不同作用區之不同的融合蛋白質的低聚合(形成異低聚體)，即可導致胞吐作用；和(4)編碼包括結合區和作用區之嵌合蛋白質的構建體，其中結合區和作用區是細胞外的，而且作用區與發動生物學活性相關聯(作為非限制性舉例說明，作用區可以自身與一種物質，即受體或其他膜蛋白質結合，在經過配體介導的嵌合體低聚合之后，橋接一種或多種相似或不相似的分子或細胞)；以及(5)編碼去穩定化的、失活的或短壽命的具有結合區和作用區之嵌合蛋白質的構建體，這樣一來配體介導的蛋白質與含有不同作用區之靶蛋白質的低聚合便導致所說低聚合的靶蛋白質的去穩定和/或降解或失活。
II.轉錄調節上述(1)和(2)類構建體被看作是第一系列。(1)類構建體在其作用上不同于(2)類構建體。(1)類構建體是稍有多效性的，即能夠激活許多野生型基因，以及靶基因。另外，(1)類基因的表達產物對配體的反應相對較慢。(2)類構建體可被導向特異性靶基因并能夠限制將被轉錄之基因的數目。(2)類構建體的表達產物對配體的反應十分迅速。
(1)和(2)類的主題系統將包括第一系列含有編碼嵌合蛋白質的DNA序列的構建體，通常包括一至三個，一般是一至兩個不同的構建體。該系統通常還包括第二系列將便于一個或多個基因，常常是外源基因表達的構建體。“外源基因”是指不同于正常情況下的由細胞表達的基因，原因例如可以是由于細胞的性質、細胞的遺傳缺陷、基因來源于不同的種或者是突變的或合成的基因等情況。這樣的基因可能編碼蛋白質、反義分子、核酶等，或者可以是包含一表達控制序列的DNA序列，所說的表達控制序列被連接或將要連接到一個正常情況下表達控制序列并不與之聯系的外源基因上。因此，如上所述，該構建體可含適于配體誘導的外源基因表達的外源或重組表達控制序列。
常常優選的是，由(1)、(2)和(3)類構建體編碼的嵌合蛋白質可以有一個細胞內擊靶區，其包含將嵌合蛋白質指向所需之區如表面膜、核、泡囊膜或其他部位的序列，在這些部位由配體介導的嵌合蛋白質的低聚合作用，至少是二聚合發動所需的生理學活性。
嵌合蛋白質含有能夠與至少一個配體分子結合的第二(“結合”或“受體”)區域。由于配體可含有一個以上的結合位點或表位，所以其可與本發明的嵌合蛋白質形成二聚體或更高級的同或異低聚體。嵌合蛋白質的結合區可具有一個或多個結合位點，從而可與二價配體形成同低聚體。因為有兩個或多個能結合第二區域的表位，故配體可以以這種方式低聚嵌合蛋白質，從而為嵌合蛋白質的更高級低聚合作好準備。
嵌合蛋白質還含有能夠在通過結合區實現配體介導的嵌合蛋白質分子的低聚合后發動生物學活性的第三(“作用”)區域。因此，作用區可以作為配體介質的低聚合的結果，與信號的轉導相關聯。所述信號，例如可依據于參與信號轉導的特定中間成分，導致一個或多個基因轉錄的開始。圖15描繪了一個有代表性的嵌合蛋白質，其中細胞內擊靶區包含肉豆蔻酸酯部；受體區包含三個FKBP12部分；且作用區包含一個ζ亞單位。在其它嵌合蛋白質中，作用區可含有轉錄因子，其在低聚合后導致一個或多個靶基因(內源和/或外源的)的轉錄開始。作用區可包含與泡囊膜同表面或其他膜的融合相關的蛋白質或其部分，如SNAP和SNARE組群的蛋白質(參見Sollner等人，Nature(1993)362，318 and 353Cell(1993)72，43)。
A.表面膜受體本發明的一類其他任選的嵌合蛋白質是與表面膜相關的并且是能夠轉導引起一個或多個基因轉錄的信號。該過程涉及許多在最終實現轉錄因子與靶基因相關啟動子區域結合的一系列相互作用中的輔助蛋白質。在轉錄因子結合到與其他基因相關的啟動子區域上的情況下，此處也發起轉錄。編碼本實施方案之嵌合蛋白質的構建體，可以編碼能受到加工并因而可能不存在于成熟嵌合蛋白質中的信號。嵌合蛋白質在任何過程中都將包括(a)能夠結合預定配體的結合區域，(b)任選的(但在許多實例中又是優選的)膜結合區，其包括為使融合的蛋白質向細胞表面/膜上轉移，和維持結合到細胞表面膜上的蛋白質所需的跨膜區或結合脂質，以及(c)作為作用區的胞質信號起始區。胞質信號起始區能夠發動導致基因轉錄的信號，所述基因在轉錄起始區中有識別起始之信號的序列。
本文中所說的其表達受來自嵌合蛋白質之信號調節的基因是指“靶”基因，包括處于內源或外源(或雜種)表達控制序列的表達控制下的外源基因或內源基因。促使與膜結合之嵌合蛋白質的分子部分也稱為“保留區域”。適當的保留區包括直接與膜的脂質層結合的部分，如通過脂質參與膜中或通過膜延伸等。如圖15中所示，在這些情況下蛋白質逐漸向膜特別是細胞膜轉移并與之結合。
B.核轉錄因子另一個任選的第一構建體編碼含有細胞擊靶序列的嵌合蛋白質，所說的序列適于使蛋白質向核轉位的需要。該(“信號共有序列”)序列具有多個堿性氨基酸，稱為由兩部分組成的堿性重復序列(參見Garcia-Bustos et al.，Biochimica et Biophysica Acta(1991)1071，83-101)。該序列可以出現在分子內部或接近于N或C末端的僑何部分，并可致使嵌合蛋白質成為核內的。本發明一個實施方案的實踐將涉及至少兩種(“第一系列”)嵌合蛋白質(1)一種具有與靶基因相關轉錄起始區的DNA結合的作用區域，以及(2)含有作為作用區的轉錄激活區域的另一種不同的嵌合蛋白質，其能夠與第一個嵌合蛋白質的DNA結合區聯合，發動靶基因的轉錄。兩個作用區域或轉錄因子可衍生于相同或不同的蛋白質分子。
對于細胞宿主來說，轉錄因子可以是內源的或外源。如果轉錄因子是外源的，但在宿主內發揮功能并且可以與內源性RNA聚合酶(而不是需要可導入基因的外源性RNA聚合酶)協同作用，一起提供隨融合的轉錄因子發揮功能的外源性啟動子元件則配有用于調節靶基因轉錄的第二個構建體。借助這一手段，可使轉錄的起始限制到與外源啟動子區域相聯系的基因，即靶基因。
已知大多數轉錄因子為發揮活性需要有兩個亞單位。另外，在單一轉錄因子可以分成兩個獨立的功能區域(如轉錄激活區和DNA結合區)的情況下，構個區域可各自失活，但是當使它們在一起密切接近時，則又恢復了轉錄活性。可以使用的轉錄因子包括由Fields和Song(文獻同上)描述的可分成兩個區域的酵母GAL4。作者使用了GAL4(1-147)-SNF1和SNF4-GAL4(768-881)的融合體，其中SNF1和-4可以被主題結合蛋白質(作為結合區)所取代。可利用GAL4和VP16或HNF-1的結合體。其他轉錄因子是Jun、Fos和ATF/CREB家族的成員，Oct1、Sp1、HNF-3、類固醇受體總家庭等的成員。
作為不同于的聯合使用DNA結合區和天然存在之激活區或其修飾形式的可代用方式，可以用與轉錄激活區和RNA聚合酶(包括但不只限于RNA聚合酶II)間的橋接有關的結合蛋白質之一取代激活區。這些蛋白質包括稱為TAF′s的蛋白質、TFII蛋白質，特別是B和D等。因此，可使用任何一種蛋白質或組合，例如融合蛋白質或其結合部分，用于橋接DNA結合蛋白質和RNA聚合酶并用于發動轉錄。在與DNA結合區接合以發動轉錄中，較好使用最接近RNA聚合酶的蛋白質。如果需要，主題構建體可為將三個或更多個，通常不超過約4個，蛋白質帶到一起作好準備，以提供轉錄起始復合物。
可使用失活化區，如ssn-6/TUP-1或Krüppel家族阻遏區，而不是有作為作用區的轉錄激活區。以這種方式，調節導致構成型表達基因轉錄的關閉。例如，在基因治療情況下，可以提供構成型表達的一種激素(如生長激素)、血液蛋白質、免疫球蛋白等。利用編碼一種含有與配體結合區連接之DNA結合區的嵌合蛋白質，和另一種含有與配體結合區連接之失活化區的嵌合蛋白質的構建體，即可通過配體介導的低聚合作用抑制基因的表達。
設計編碼特別含有與轉錄激活區或亞單位、轉錄失活化區或DNA結合區融合之配體結合區的嵌合蛋白質的構建體，并按照組裝其他構建體的同樣方式組裝之。轉錄因子的N-末端將常常結合到配體結合區的C-末端上，盡管在某些情況下是反過來的，例如單一轉錄因子的兩個不同的區域分在兩個不同的嵌合體間。
III.胞吐作用配體介導的低聚合機制的另一個應用是胞吐作用，其中蛋白質的輸出面不是轉錄作用受到配體的控制。此可與一種或多種有用蛋白質的表達相配合，作為一種可替代方式促成通過分泌信號序列分泌有用蛋白質。該實施方案涉及兩種不同的第一構建體。一種構建體編碼將蛋白質引向泡囊以整合到泡囊膜中的嵌合蛋白質(Sollner et al.，文獻出處同上)。可用作泡囊結合蛋白質的蛋白質包括單獨或合用的VANP(synaptobrevin)、SNC2、rab3、SEC4、synaptotagmin等。細胞膜蛋白質可包括單獨或組合的syntaxin、SSO1、SSO2、neurexin等。其他構建體則為向表面膜運輸作準備，并利用上述的肉豆蔻酰信號序列、其他胞漿膜擊靶序列(為用于異戊烯化)或跨膜保留區。上述參考文獻中描述了所編碼的蛋白質，作為作用區的全部或其功能性部分。可在與外源蛋白質表達的配合中使用這些構建體，其適當地進行編碼以運輸泡囊或內吞內源性蛋白質，以提高內源性蛋白質的輸出。
有多種機制可用于胞吐作用。依據細胞類型以及何種蛋白質對該細胞內的胞吐作用是限制性的，可由一種或多種具有被配體激活之反應性元件的構建體編碼一種或多種泡囊結合的蛋白質或細胞蛋白質。特別有用的是組合VAMP和syntaxin。另外，亦可提供控制胞吐作用的非限制性蛋白質的構成型表達，以及提供配體調節胞吐作用限制性蛋白質的表達。最后，可以提供與胞吐作用相關的嵌合蛋白質的構成型表達，從而由嵌合蛋白質與配體的低聚合控制胞吐作用。使用適當的結合區域，可以使不同的嵌合蛋白質將在泡囊表面上低聚合以形成活性復合物，和/或通過配體使泡囊蛋白質與細胞膜表面蛋白質連接。在沒有配體的情況下，由于對配體的修飾如缺失、突變等，實質上降低了蛋白質控制的胞吐作用間的結合親合性，嵌合蛋白質沒有可能提供胞吐作用。可以使用各個蛋白質的交迭片段并確定那一個片段保留有活性便可很容易地確定這些修飾的存在。可以進一步使用丙氨酸取代修飾各片段，以確定實質上影響結合的各個氨基酸(Beohncke等人，J.Immunol.(1993)150，331-341，Evavold等人，出處同上(1992)148，347-253)。
如上所述，可以在構成上或可誘導地表達組裝在泡囊腔中的蛋白質，以及與胞吐作用相關的融合蛋白質。是涉及內源性或是外源性蛋白質，將被輸出的蛋白質是構成型表達還是可誘導地表達，是否可使用同樣配體發動與胞吐作用相關聯之融合蛋白質以及將被輸出之蛋白質的轉錄，或者是否不同的蛋白質要受制于不同的可誘導信號，均可依據胞吐作用的目的確定控制表達的方式。一個方面，胞吐作用機制應只是由配體控制的過程。在另一方面，至少一種蛋白質的表達以及胞吐作用均可受到配體控制。
通過引入使蛋白質向泡囊轉位的細胞擊靶序列，而不丟失所述蛋白質的生理學活性來修飾各種蛋白質。可使用胞吐作用作為釋放機制，依據宿主的性質，在短時間內釋放相對高的劑量蛋白質，在維管系統中產生高度定位水平的或高濃度的蛋白質。令人感興趣的有意義蛋白質包括胰島素、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、細胞激活素、促紅細胞生成素、集落刺激因子、生長因子、炎性肽、細胞遷移因子。
可從與胞吐作用相關的泡囊結合蛋白質得到將蛋白質導向泡囊的編碼序列(如參見Sollner，等人，文獻出處同上)。
低聚合機制的另一個應用是控制蛋白質降解或失活。例如，可以借助與本發明不同的嵌合蛋白質(其具有相對短的半壽期或去穩化或以趨向于降解的低聚物)的配體介導的低聚合作用，使本發明的相對穩定的或有長壽期的嵌合蛋白去穩定化或趨向于降解。在這一實施方案中，配體介導的低聚合通過賦予蛋白質以縮短的半壽期而調節蛋白質的生物學功能。后來的嵌合蛋白質可含有使蛋白質對準溶酶體的區域或使蛋白質易在細胞溶質或核或非溶酶體細胞器中對蛋白水解裂解敏感的區域。
可根據許多因素確定細胞內蛋白質的半壽期，這些因素包括在所說的蛋白質內存在富含氨基酸殘基脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的短氨基酸序列(因此是“害蟲(PEST)”)、有相似功能的其他序列、蛋白酶敏感性裂解位點及遍在蛋白化狀態。遍在蛋白化是由針對蛋白質降解的一個或多個短肽鏈單位、遍在蛋白完成的對蛋白質的修篩。一般認為蛋白質遍在蛋白化的速率主要是由被加工蛋白質N-末端氨基酸的同一性以及靠近氨基末端的一個或多個特有賴氨酸殘基決定的。
IV.其他調節系統可由與個別蛋白質有關的特定活性的低聚作用控制的其他生物學功能是蛋白質激酶或磷酸酶活性、還原酶活性、環氧合酶活性、蛋白酶活性或依賴于亞單位聯系的酶促反應。另外，還可以提供與細胞周期有關的G蛋白質與受體蛋白質的聯系，如細胞周期調節蛋白(cyclins)和cdc激酶、多單位解毒酶。
V.構建體的成分與(1)和(2)類任選的其他嵌合蛋白質相關聯的第二或其他任選的構建體(靶基因構建體)包括有指明的靶識別序列或反應性元件的轉錄起始區，以便對來自活化受體或活化轉錄因子的起始信號作出應答，導致至少一個有意義基因轉錄成有意義序列，通常是mRNA，其轉錄及適當情況下的翻譯可導致蛋白質的表達，和/或對其他基因的調節，如反義鏈、轉錄因子的表達、膜融合蛋白質的表達等。
為不同的目的，可以使用不同的位點，不同的結合區域和不同的胞質區域。對于與表面膜相關聯的嵌合蛋白質受體，如果配體結合區是細胞外的，可以設計嵌合蛋白質使之含有一個選自各種表面膜蛋白質的細胞外區域。同樣，可以根據由胞質部分調節的那個內源性基因，而使用能夠轉導信號的表面膜蛋白質的不同的胞漿或細胞內區域。如嵌合蛋白質是內在的，在表面膜蛋白內或與例如核、泡囊等細胞器相聯系的，則配體結合區部分將受制于能夠與可穿過表面膜或其他膜(如果適宜的話)的分子結合的區域。因此，這些結合區域一般將同小的天然存在的或并不包括蛋白質或核酸的合成的配體分子結合。
A.胞質區域(1)類似嵌合蛋白質受體可以含有胞質區域，后者來自各種細胞表面膜受體之一，包括其突變蛋白，其中參與與胞質區域相關聯之起始轉錄的識別序列是已知的，或者對這些序列有反應的基因是已知的。有意義的突變受體將使靶基因的轉錄激活同可能與有害付作用(如失調的細胞生長或細胞激活素的不適當釋放)相關之基因的活化脫離聯系。特別令人感興趣的受體相關的胞質區域將具有下列特征對相對很少的(可望少于100)并且一般在細胞宿主中無害的基因，受體活化導致轉錄的起始；由受體活化發動的轉錄所必需的其他因子存在于細胞宿主中；靶基因以外的基因被激活將不影響期望使用這些細胞要達到的目的；胞質區域的低聚合作用或其他可利用的機制導致信號發動；胞質區域連接到所需的配體結合區上將不干擾信號發送。許多不同的胞質區是已知的。這些區域中許多是酪氨酸激酶或是與酪氨酸激酶復合的，如CD3ζ、IL-2R、IL-3R等(參見Cantley，etal.，Cell(1991)64，281中的綜述)。經交聯如二聚合(基于首先由Yarden和Ulrich[Annu.Rev.Biochem.(1988)57，443]提出的命名)而活化的酪氨酸激酶受體包括I亞類EGF-R、ATR2/neu、HER2/neu、HER3/c-erbB-3、Xmrk；II亞類胰島素-R、JGF-1-R[胰島素樣生長因子受體]、IRR；III亞類PDGF-R-A、PDGF-R-B、CSF-1-R(M-CSF/c-Fms)、c-kit、STK-1/Flk-2；以及IV亞類FGF-R、flg[酸性FGF]、bek[堿性FGF]神經營養性酪氨酸激酶Trk家族，包括NGF-R、Ror1，2。與交聯后酪氨酸激酶相聯系的受體包括CD3ζ家族CD3ζ和CD3η(主要見于T細胞，與Fyn相聯系)；FcεRI的β和γ鏈(主要見于肥大細胞和嗜堿性細胞中)；FcrRIII/CD16的γ鏈(主要見于巨噬細胞、嗜中性細胞和天然殺傷細胞中)；CD3γ、-δ和-ε(主要見于T細胞中)；Ig-α/MB-1和Ig-β/B29(主要見于B細胞中)。許多細胞激活因子和生長因子受體與共同的β亞單位相關聯，β亞單位與酪氨酸激酶和/或其他信號發送分子相互作用，并且可在本發明的嵌合蛋白質中用作胞質區域。這些β亞單位包括(1)由GM-CSF、IL-3和IL-5受體分享的通用β亞單位；(2)與IL-6、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經營養性因子(CNTF)、制瘤素M和IL-11受體相關的β鏈gp130；(3)也與IL-4、IL-7和IL-13(及可能的IL-9)的受體相關的IL-2受體γ亞單位；以及(4)與G-CSF受體之胞質區域同源的IL-2受體的β鏈。
可以使用包括干擾素α/β和γ(其可以激活酪氨酸激酶之JAK、TyK家族的一個或多個成員)在內的干擾素家庭的受體、以及生長激素、促紅細胞生成素和催乳素(可能也激活JAK2)受體作為胞質區域的來源。
胞質區域的其他來源包括細胞表面受體的TGF-β家族(Kingslkey，D.，Genes and Devel opment(1994)8，133)。該受體家族在其胞質區域包含絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，據信是經交聯而被激活的。
與轉錄因子的活化和去活化相關的酪氨酸激酶在提供可受控制的、并可用以發動或抑制外源基因表達的特殊途徑中是特別有用的。
下表中列出了一些受體和與受體相關的性質，以及其激活基因的核反應性元件。該表不是無遺漏的，所列出的只是可適用于主題本發明的舉證性的系統。
在許多狀態下可以得到突變的胞質區，其中被轉導的信號可能不同于野生型，從而產生與野生型相比受限制的或不同的途徑。例如，對于EGF和FGF等生長激素，已報導了其突變情況，其中信號與細胞生長相脫離，但仍由c-fos保留(Peters et al.，Nature(1992)358，678)。
在全身的各種細胞上，都可以發現酪氨酸激酶受體。相反，CD3ζ家族、Ig家族和淋巴激活素β鏈受體家族則主要見于造血細胞、特別是T細胞、B細胞、肥大細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞及天然殺傷細胞上。NF-AT轉錄所需要的信號主要來自抗原受體的zeta(ζ)鏈，較少來自CD3γ、δ、ε。
由于天然存在的或被截短的、修飾的或突變的，胞質區域至少約10個，一般至少約30個，更通常至少約50個氨基酸，并且通常不超過約400個氨基酸，更好是不超過約200個氨基酸(參見Romeo，et al.，Cell(1992)68，889-892)。雖然任何種均可使用，但較好使用內源于宿主細胞的種。然而，在許多情況下，可以有效地使用來自不同種的胞質區。上文指出的任何胞質區，以及目前已知的或繼后可能被發現的其他胞質均可使用。
表1

對于大部分與轉錄因子相關的其他嵌合蛋白質來說，主要不同在于具有將嵌合蛋白質導向核膜內側的細胞擊靶序列，并具有作為作用區域的轉錄因子或其部分。通常，轉錄因子作用區域可分為“DNA結合區”和“激活區”。可以提供有一個或多個配體結合區的DNA結合區，以及有一個或多個配體結合區的激活區。以這種方式，DNA結合區可以與多個結合區和/或激活區偶聯。另外，對涉及信號轉導的與表面膜有關之嵌合蛋白質的討論也適用于指導與基因組DNA結合的嵌合蛋白質。同樣，與胞吐作用相關的嵌合蛋白質，代替轉導性胞質蛋白質，基本上不同于與泡囊膜同表面膜的融合相關的蛋白質。
B.細胞擊靶區域信號肽或序列使嵌合蛋白質運輸到細胞表面膜，此時相同或其他的序列可以編碼與細胞表面膜結合的嵌合蛋白質。雖然有一個通用的信號序列部分，在兩個或三個N末端極性氨基酸之后是大約15-20個基本上疏水的氨基酸，但個別氨基酸可能有很大的變化。因此，實質上任何在宿主中有功能活性的，并且可能或可能不與嵌合蛋白質的其他區域之一相聯系的信號肽均可利用。正常情況下，信號肽要經過加工并且將不保留在成熟的嵌合蛋白質中。編碼信號肽的序列是在編碼序列的5′端，并且將包括起始蛋氨酸密碼子。
選擇膜保留區域對于本發明來說不是很重要的，因為發現這些膜保留區域實質上是可替代的，并且結合或為激活而結合到其他膜區域上都不要求有嚴格的氨基酸。因此，不管是否是宿主內源的，從任何方便的表面膜或胞漿蛋白質中都可以分離膜保留區域。
至少有兩個不同的膜保留區跨膜保留區，其為橫跨膜延伸的氨基酸序列；以及脂質膜保留區，其脂質與細胞表面膜的脂質相聯。
為了易于構建，大部分都可使用胞質區域或受體區域的跨膜區，這樣可趨向于簡化融合蛋白質的構建。然而，對于脂質膜保留區，通常在與膜結合的N末端編碼序列的5′端，和接近C末端結合區編碼序列的3′端加上加工信號。脂質膜保留區具有約12到24個碳原子，特別是14個碳原子，更具體是有肉豆蔻酰基，與甘氨酸連接的脂質。脂質結合區的信號序列是一N末端序列并且可有很寬范圍的變化，通常在2位殘基上是甘氨酸且在7位殘基上是賴氨酸或精氨酸(Kaplan，et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)8，2435)。Carr等人(PNAS，USA(1988)79，6128)、Aitken等人(FEBS Lett.(1982)150，314)、Henderson等人(PNAS，USA(1983)80，319)、Schulz等人(Virology(1984)123，2131)、Dellman等人(Nature(1985)314，374)都已描述過，并在Ann.Rev.of Biochem.(1988)57，69中也已綜述過參與翻譯后加工以提供脂質膜結合的肽序列。有意義的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。多種DNA序列均可用于編碼融合之受體蛋白質中的所述序列。
一般說來，跨膜區域有大約18-30個氨基酸，更常見是約20-30個氨基酸，其中心部分主要是中性、非極性氨基酸，并且該區域的末端是極性氨基酸，常常是帶電荷的氨基酸，一般約帶1-2個電荷，跨膜區域的末端主要是堿性氨基酸，其后是螺旋斷裂殘基，如pro-或gly-。
C.配體結合區域本發明任何嵌合蛋白質的配體結合(“二聚合”或“受體”)區可以是任何允許使用或結合天然或非天然配體，較好是非天然合成配體進行誘導的適宜區域。根據構建體的性質和選擇的配體不同，結合區域可以是細胞膜內部的或外部的。多種包括受體在內的結合蛋白質，包括與上文指出的胞質區相關的結合蛋白質都是已知的。其中特別有用的是已知其配體的(較好是小的有機配體)或可以容易產生的結合蛋白質。這些受體或配體結合區域包括FKBP和親環素受體、類固醇受體、四環素受體、上文指出的其他受體等，以及可從抗體，特別是重或輕鏈亞單位、其突變序列得到的“非天然”受體、以隨機程序、組合合成等方法得到的隨機氨基酸序列。在大多數情況下，受體區作為天然區域或其截短的活性部分，至少有大約50個氨基酸、且少于約350個氨基酸，通常少于200個氨基酸。結合區較好是小的(＜25kDa，以允許在病毒載體中有效轉染)、單體的(這就排除了抗生物素蛋白-生物素系統)、非免疫原性的，并且應是易于合成上的、可透過細胞的、可二聚成形的無毒性配體。
依據編碼嵌合蛋白質之構建體的設計和適當配體的可利用性，受體區可以是細胞內或細胞外的。對于疏水配體，結合區可以在膜的任一側，但對于親水配體，特別是蛋白質配體，除非有一個使配體以其得到結合的形式實現內在化的運輸系統，否則結合區通常都是細胞膜外的。對于細胞內受體，構建體可以編碼信號肽和受體區序列的跨膜區5′或3′端，或可能有受體區序列的脂質連接信號序列5′或3′端。當受體區處于信號肽和跨膜區域之間時，受體區將是細胞外的。
構建體的編碼受體的部分可因種種原因受到誘變。經誘變的蛋白質可提供更高的結合親和性，允許由配體分辨天然出現的受體和經誘變受體，為設計受體-配體對等提供機會。受體改變可包括已知是在結合位點上的氨基酸的改變、使用組合技術進行隨機誘變，其中可經改變特定氨基酸的密碼子(有已知改變或隨機改變)，在適當的原核宿主中表達所得到的蛋白質，然后篩選所得到的用于結合的蛋白質，而對與結合位點相關之氨基酸或與構型改變相關之其他氨基酸的密碼子進行誘變。可舉例的這種狀態是將FKBP12的36位Phe改變成Ala，和/或將其37位Asp改變成Gly或Ala，以便在FK506或FK520的9或10位上容納氨基酸取代。具體地說，作為在C9和/或C10上包含修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區，代替一個或多個Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99而含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸的突變FKBP12部分是特別有意義。
作為結合區可以使用抗體亞單位，如重鏈或輕鏈，特別是其片段，更具體的是全部或部分可變區，或重鏈與輕鏈的融合體以產生高親和性結合。可以制備抗生理上可接受之半抗原分子的抗體，并根據結合親和性篩選個別抗體亞單位。可以分離編碼亞單位的cDNA并經缺失恒定區、部分可變區、誘變可變區等對其進行修飾，以得到對配體有適當親和性的結合蛋白質區域。以這種方式，幾乎任何生理上可接受的半抗原化合物均可以用作配體，或提供配體的表位。如結合區是已知的并且有一個有用的結合配體時，可以利用天然受體來代替抗體單位。
基于體外利用誘變或對編碼蛋白質之序列的組合修飾，得以能夠生產可根據不同配體的結合親和性進行篩選的蛋白質文庫。例如，可在編碼結合蛋白質的DNA序列中的一個或多個位點上，總體上隨機設定一個有1至5個、10個或更多個密碼子的序列，制成表達構建體并將此表達構建體導入單細胞微生物中，以建立文庫。然后可以根據對一個或理想地多個配體的結合親和性篩選該文庫。然后即可使用與它們將導入其中的細胞相匹配的最好的親和性序列作為結合區。應根據所使用的宿主細胞來篩選配體，以確定配體與內源性蛋白質結合的水平。可以權衡對經過誘變的結合區的結合親和性與對內源性蛋白質的結合親和性之結合區的比例，以確定結合特性。然后可使用有最好結合特性的那些配體作為配體。作為非限制性的例子，可在完成前述工作中使用噬菌體顯示技術。
D.多聚合正常情況下，轉導的信號是由于配體介導的嵌合蛋白質分子的低聚合造成的，即由于配體結合后的低聚合的結果，盡管亦可利用其他結合過程，例如變構激活來產生信號。就各區域的次序和個別區域的重復數目來說，嵌合蛋白質的構建體間是有所不同的。對于在5′-3′方向上轉錄的細胞外受體區域來說，構建體將編碼包含信號肽、受體區、跨膜區和信號起始區的蛋白質，其最后一個區域將是細胞內的(胞質的)。然而，如受體區是細胞內的，則可利用不同的次序，此時信號肽之后可跟著受體區或信號起始區，然后是其余區域，或者有多個受體區，信號起始區可夾在受體區之間。通常，信號起始區的活性位點是在序列內的，并且不需要有游離的羧基末端。每個區域都可以被多聚合，特別是受體區，通常具有不超過大約5次重復，及常見是不超過大約3次重復。
為了使受體多聚合，嵌合表面膜蛋白質的受體區配體通常是在其至少應有兩個結合位點的意義上多聚的，同時每個結合位點均能夠與受體區結合。可望主題配體是二聚體或更高級的低聚體，通常是不大于四聚的小的合成有機分子，單個分子一般至少約150D并且小于約5KD，通常是小于約3KD。可利用多種合成配體和受體對。例如，在涉及天然受體的實施方案中，可使用二聚FK506與FKBP受體，可使用二聚合的環孢菌素A與環孢菌素受體、二聚合的雌激素與雌激素受體、二聚合的糖皮質激素與糖皮質激素受體、二聚合的四環素與四環素受體、二聚合的維生素D與維生素D受體等。另外亦可使用更高級聚合如三聚合的配體。對于涉及非天然受體的實施方案，例如抗體亞單位、經修飾的抗體亞單位或經修飾的受體等，可以使用任何各種不同的化合物。這些配體單位的重要特征是它們以高親和性(較好Kd≤10-8M)與受體結合，并且能夠化學二聚合。
配體可以有帶不同表位的不同的受體結合分子(也稱為“ HED”試劑)，因為它們可以介導有相同或不同結合區域之嵌合蛋白質的異二聚合或異低聚合。配體可包括FK506或FK506型部分，以及CsA或環孢菌素型部分。兩部分部共價連接到共同的接頭部分上。這樣的配體將適用于介導第一和第二嵌合蛋白質的低聚合，其中第一嵌合蛋白質含有能夠與FK506型部分結合的受體區如FKBP12第二嵌合蛋白質則含有能夠與環孢菌素A型部分結合的受體區如親環素。
VI.細胞細胞可以是原核的，但最好是真核的，包括植物、酵母、蠕蟲、昆蟲以及哺乳動物。目前特別優選的細胞是哺乳動物細胞，特別是靈長類動物，更具體是人，但可以涉及其他任何有興趣的動物特別是家養動物，如馬、牛、鼠、羊、狗、貓等。這些種動物中，可包括各種類型的細胞，例如造血、神經、間質、皮、粘膜、基質、肌肉、脾、網狀內皮、表皮、內皮、肝、腎、胃腸、肺等組織的細胞。其中特別有用的是造血細胞，其包括任何可能與淋巴樣細胞或骨髓單核細胞譜系相關的有核細胞。其中特別有價值的是T和B細胞譜系的成員、巨噬細胞和單核細胞、成肌細胞和成纖維細胞。另外特別適用的是干細胞和祖細胞，如造血、神經、基質、肌肉、肝、肺、胃腸等細胞。
細胞可以是自體細胞、同源細胞、同種異型細胞、甚至有些情況下是異源細胞。可以改變主要組織相容性復合(“MHC”)特征以修飾細胞，包括失活β2巨球蛋白以阻止生成功能性I類MHC分子、失活II類分子、為一種或多種MHC分子的表達準備條件、經提高或抑制與細胞毒活性相關之基因的表達提高或失活胞毒能力等。
在某些情況下，特定克隆或寡克隆細胞可能是有意義的，這些細胞有特定的特異性，例如T細胞和B細胞即具有特定抗原特異性或保有靶位點特異性。
VII.配體包括天然發生的和合成的物質在內的多種多樣的配體均可用于本發明，以影響嵌合蛋白質分子的低聚合。選擇配體的適用的和容易觀察或度量的標準是(A)配體是生理上可接受的(即對于它所用于的細胞或動物沒有過多的毒性)，(B)有合理的治療劑量范圍，(C)可望(用于整體動物，包括基因治療應用時)能夠口服攝入(其在胃腸系統中是穩定的，并且可被吸收到血管系統中)，(D)必要時可以穿越細胞和其他膜，并且(E)以適合所期望之應用的親和性結合到受體區域上。第一個合乎需要的標準是除了其激活受體的能力之外，所用化合物在生理上是相對惰性的。配體與天然受體結合越少并目與天然受體結合之總配體的比例越低，則反應越是正常。特具體地說，受體對天然蛋白質不應該有強的生物學效應。對大多數情況來說，受體將是非肽的和非核酸的。
對大多數主題化合物要有兩個或多個單位，這些單位可以是通過中心連接基團連接在一起的相同或不同的單位。“單位”是能夠結合受體區的各個部分(如FK506、FK520、環孢菌素A、類固醇等)。至少在二聚體或較高級同聚物中，各單位通常通過相同的反應性部分連接到連接基團上。
如上文指出的，對于小的非蛋白質有機分子有多種不同的天然存在的受體，這些小的有機分子都符合上述標準，并且可在不同的位點上二聚合以提供本發明的配體。只要保留有所需特異性的結合能力，即允許對這些化合物進行實質性修飾。許多化合物是大環的，例如大環內酯。適宜的結合親和性將反映在Kd值低于10-4，較好低于10-6，更好低于約10-7，但結合親和性也可能低于10-9或10-10，并且在某些情況下是最合乎要求的。
普遍優選的配體包括低聚物，通常是能夠與FKBP蛋白質和/或親環素蛋白質結合之化合物的二聚體。這樣的配體包括保留其與天然或誘變之結合區的結合能力的，環孢菌素A、FK506、FK520及雷帕霉素和其衍生物的同和異多聚體(通常是2-4個，更常見為2-3個單位)。這些化合物的許多衍生物部是已經知道的，包括可用于本發明實踐中的合成的高親和性FKBP配體(例如參見Holt et al，J.Am.Chem.Soc.1993，115，9925-9935)。連接FK506和其類似物的有意義位點包括卷入從17至24位的環狀碳原子的位置，以及與這些環原子結合的取代基位置，如21(烯丙基)、22、37、38、39和40位或32位(環己基)，而除21位外同一位置對于FK520是有意義的。對于環孢菌素，有意義的位點包括MeBmt，位置3和位置8。
對配體修飾中特別有意義的是改變其結合特性，特別是就配體的天然存在的受體來說。同時，應改變結合蛋白質以適應配體的改變。例如，可以用具有更大空間需要的基團取代羥基，或者用有更大空間要求的基團取代羰基或使羰基功能化，例如形成N取代的西夫堿或亞胺來修飾10位上的羰基，以加大該位置的空間體積，而對FK506的9和10位上基團進行修飾(參見Van Duyne et al(1991)Science252，839)，以便增強它們的空間要求。可以在這些位點上方便地引入的各種功能性基團是形成醚的烷基基團、酰氨基團、N-烷化胺、2-羥乙基亞胺也可形成1，3-噁唑啉等。一般說來，取代基大約有1-6個，通常1-4個，更多是1-3個碳原子，且有1-3個，通常1-2個雜原子，這些雜原子一般是氧、硫、氮等。可使用具有基本結構的不同衍生物，產生對結合有不同構型要求的不同配體。經誘變受體，可以得到實質上有相同序列的不同受體，所述受體對結構上沒有明顯不同的經修飾的配體有不同親和性。
可以使用的其他配體是類固醇。類固醇可以是低聚的，以致在沒有丟失其與含有一個或多個類固醇受體區之嵌合蛋白質的結合能力的情況下，顯著地降低了它們的天然生物學活性。作為非限制性實施例，可以使用糖皮質激素和雌激素。也可以使用多種藥物，已知這些藥物能夠以高親和力結合特定受體。在受體的結合區是已知的時尤其是這樣，因此允許在本發明的嵌合蛋白質中只使用結合區，而不是整個天然受體蛋白質。為此目的，可使用酶和酶抑制劑。
A.接頭連接中可包括多種不同的官能團，例如酰胺基團，包括碳酸衍生物、醚、酯、有機和無機酯、氨基等。為了提供連接，可經氧化、羥化、取代、還原等修飾特定單體，以提供偶聯位點。可以根據不同單體、選擇不同的位點作為偶聯位點。
可用任何常規方法合成多聚配體，其中連接基團是在并不干擾配體與受體在結合位點上的結合的位點。在生理學活性的活性位點和配體與受體區的結合位點不同的情況下，一般可望在活性位點連接以失活配體。可以利用多種連接基團，通常在兩分子之間的鏈中有1-30個、更好有大約1-20個原子(除氫以外)，其中連接基團主要由碳、氫、氮、氧、硫和磷組成。連接基因可以包括各種官能團，如酰胺和酯(有機和無機的)、胺、醚、硫醚、二硫化物、季銨鹽、肼等。鏈可包括脂族、無環、芳族或雜環基團。可根據合成容易的和多聚配體的穩定性來選擇鏈。因此，如果希望保留長期活性，可使用相對惰性的鏈，以使多聚配體鍵合不被裂解。另外，亦可只希望在血流中有短的半壽期，那么即可利用易于被裂解的各種基團，例如酯和酰胺，特別是肽，其中循環的和/或細胞內的蛋白酶能夠裂解連接基團。
可利用各種基團作為配體間的連接基團，例如通常有2至20個碳原子的亞烷基，通常有4至18個碳原子的氮雜亞烷基(其中氮通常是在兩個碳原子之間)、通常有6至2 4個碳原子的N-亞烷基氮雜亞烷基(見上文)、通常有6至18個碳原子的亞芳基、通常有8至24個碳原子的芳二亞烷基(ardialkylene)、通常有8至36個碳原子的雙-羧酰氨基亞烷基等。說明性的這類基團包括亞癸基、亞十八烷基、3-氮雜亞戊基、5-氮雜亞癸基、N-亞丁基、5-氮雜亞壬基、亞苯基、亞二甲苯基、對二亞丙基苯、雙-苯甲酰基1，8-二氨基辛烷等。可使用下文實施例中描述的材料和方法，用攜帶相應受體區的本發明嵌合蛋白質估計上述含接頭部分的多價或其他(詳見下述)配體分子。
B.配體特征對于細胞內結合區，應選擇能夠以生物活性形式跨膜轉移的配體，即該配體是可透過膜的。多種配體都是疏水的或者是可以經用親脂基團進行適當修飾而制成的。具體地說，可經提供約有12至24個碳原子脂族側鏈來利用連接橋提高配體的親脂性。另外，亦可提供一個或多個將提高跨膜運輸能力的，而又希望沒有核內體形成的基團。
在某些例子中，不必使用多聚配體。例如，在兩個不同的結合位點供受體二聚時，可以使用分子。在其他例子中，配體的結合可導致受體區的構型改變，例如使受體低聚合而導致活化。誘導信號的其他一些機制也是可以發揮效力的，例如結合具有構象改變而導致胞質區域激活的單一受體。
如本文別處所討論的，能夠發動如靶基因轉錄的任何任選的其他細胞過程的配體應優選被選擇為不能與工程細胞中的初級嵌合蛋白質交叉反應以啟動細胞程序死亡。
C.配體拮抗物可以使用單體配體逆轉多聚配體的作用，即防止、抑制或破壞低聚體的形成或維持。因此，如果希望迅速終止細胞激活的效應，可以使用單體配體。可以使用同樣方法，在如多聚體的相同位點方便地修飾母配體部分，不同的是用單功能化合物取代多功能化合物。可使用有2到20個(它們可以更長)，通常有2至12碳原子的單胺，如乙胺、己胺、芐胺等代替多胺。另外，在母體化合物沒有過多不期望的生理學活性(如免疫抑制、有絲分裂、毒性等)的情況(或劑量水平)下，可以使用單價母體化合物。
D.舉例說明性的同可與含補償性突變之突變受體結合的“隆起塊”異低聚(HED)和同低聚(HOD)的試劑如上文討論的，由于在經修飾的HED/HOD試劑上存在與受體之結合“袋”中的側鏈殘基進行空間碰撞的取代基(“隆起塊”)，所以可以制備這種不能與其野生型受體(如FKBP12)發生可估計的結合的經修篩的HED/HOD試劑。也可以制得在干擾殘基上包含突變(“補償性突變”)的相應受體，并因此而獲得與帶“隆起塊”之配體結合的能力。使用“形成隆起塊的”配體部分和攜帶補償性突變的受體區域，會提高我們的試劑的特異性并進而提高其效力。形成隆起塊的試劑不會與內源性、野生型受體結合，其另外可以對基于天然配體部分的二聚體起到“緩沖劑”作用。另外，新的受體-配體對的產生同時將會產生將在需要異二聚化時使用的HED試劑。例如，可以使HED試劑誘導syntaxin(一種漿膜融合蛋白質)與synaptobrevin(一種泡囊膜融合蛋白質)的異二聚，而實現受調節的泡囊融合。這不僅提供了一種研究工具，而且也可作為使用經適當修飾的分泌細胞對糖尿病進行基因治療的基礎。
作為“形成隆起塊的FK1012s”的一個實例，我們制備了FK506的C10乙酰胺和甲酰胺衍生物。有關FK1012s A-C和FK506M的合成的其他詳細內容可參見圖16A和我們的報導，Spencer et al，“Controlling Signal Transduction with Synthetic Ligands”，Science262，(1993)1019-1024。我們選擇制備兩類形成隆起塊的FK1012s一類在C10上有隆起，一類在C9上有隆起。已按照圖16B中所示的反應順序合成了FK506之C10乙酰胺和甲酰胺的R和S異構體。這些帶隆起的衍生物在它們對FKBP12的結合親和性失去了至少3個數量級(圖16B)。檢測衍生物抑制FKBP12旋轉異構酶(rotamase)的活性來確定親和性。
第二類C9帶隆起塊之衍生物的一個實例是已按已知方法(參見例如Fisher et al.J.Org.Chem.56，8(1991)2900-7和Edmunds et al.Tet.Lett.32，48(1 991)819-820)制得的螺-環氧化物(如圖16C中所示)。令人特別感興趣的C9衍生物系列的特征在于它們的sp3雜化和在C9上的還原的氧化狀態。已按照圖16C中所示的反應合成了幾種這樣的化合物。
應理解到的是，異二聚體(或其他異低聚體)須按不同于同二聚體的方法構成，否則至少在應用中同二聚體污染時可能會對其成功地應用造成不利影響。圖16D中圖解顯示了為克服這一問題而發展的一個說明性的合成戰略。在含過量三乙胺的二氯甲烷中，使單alloc-保護的1，6-己二胺(Stahl et al，J.Org.Chem.43，11(1978)2285-6)與衍法形式的FK506偶聯，以44％產率得到alloc-胺-取代的FK506。現在即可將該中間產物用于與任何活化的FK506(或帶隆起塊的FK506)分子偶聯。在室溫THF中雙甲酮存在下，用催化性四聯-三苯基膦鈀去保護，除去胺保護基團。立即用活化的FK506衍生物處理，然后脫甲硅基而產生二聚產物。已使用該技術合成了說明性的HOD和HED試劑。
E.說明性的環孢菌素試劑環孢菌素A(CsA)是以高親和力(6nM)與其細胞內受體親環素——一種13kDa單體蛋白質-結合的環十一肽。所得到的復合物如FKBP12-FK506復合物，與蛋白質磷酸酶calcineurin結合并使之失活，進而導致藥物的免疫抑制性質。作為本發明的另一個說明性實例，我們以6個步驟通過其MeBmtl測鏈二聚合了CsA，并以35％的總產率得到(CsA)2(圖17，按Eberle et al，J.Org.Chem.57，9(1992)2689-91中報導的方法進行步驟1-4)。同FK1012s一樣，選擇二聚位點以使所得的二聚體與兩個親環素分子結合而又不能在結合親環素后與calcineurin結合。我們已證明(CsA)2以1∶2的化學計算量用親環素A結合。因此，(CsA)2同FK1012s一樣，并不抑制信號傳輸途徑并因而沒有免疫抑制作用和毒性。
VIII.靶基因A.轉錄起始區域靶基因構建體在5′區域具有反應性元件，如上文所討論的，其可能是通過產生和轉導轉錄起始信號，對配體介導的嵌合受體蛋白質的低聚合作用發生反應。因此，必須選擇至少一個由胞質區域直接或間接激活的或者可通過兩個區域的聯系而激活的轉錄起始系統，例如轉錄因子。還必須選擇至少一個對所得到的轉錄起始系統起反應的啟動子區域。需要選擇啟動子區域或在其轉錄控制下的基因。換句話說，可以基于作用區域通過給定的啟動子或反應性元件在起始轉錄中所起的作用，來選擇嵌合蛋白質的作用區(由“第一”系列構建體編碼)(如參見上文V(A)部分“胞質區域”)。
在知道反應性元件的情況下，即可使其包括在靶基因構建體中，以便為整合到基因組中(以游離基因形式或經染色體摻入)提供表達盒。只要知道在天然配體結合到含有胞質區的蛋白質上之后由胞質區轉錄激活的基因，便不必去分離反應性元件的特定序列。然后可以使用同源重組將有意基因插入啟動子區的下游以使之處于內源性啟動子區的轉錄調節之下。如特異的反應性元件序列是已知的，可以將其與不同的、可以在轉錄速度上有高或低的活性以及結合特定的轉錄因子等其他表現的轉錄起始區相連接。
因此，表達構建體將在其轉錄方向的5′端有允許誘導有用靶基因，通常是治療性基因轉錄起始的反應性元件和啟動子序列。轉錄終止區不是那么重要，其可通過插入用于降低mRNA穩定性的AU序列，用以提高短半壽期mRNA的半壽期或制得短半壽期的mRNA，并因此而限制蛋白質作用的時間。可以利用任何提供必要的轉錄終止，以及在需要時提供翻譯終止的任何區域。
反應性元件可以是單一序列或者可以是低聚合的，通常具有不超過約5次重復，更多是有大約3次重復。
也可以使用同源重組除去或失活內源性轉錄控制序列(包括對低聚合過程有反應的啟動子和/或反應性元件)，和/或在所需內源性基因上游插入這樣的反應性轉錄控制序列。
B.產物可以利用多種基因作為靶基因，包括編碼有意義蛋白質的基因或有意義的反義序列或有意義的核酶(ribozyme)。靶基因可以是提供所需表型的任何有用序列。靶基因可以表達表面膜蛋白質、分泌的蛋白質、胞質蛋白質，或者是可表達不同類型產物的多個靶基因。靶基因可以是反義序列，該序列可通過抑制轉錄調節蛋白質而調節特定途徑，或者通過抑制某途徑中抑制物的翻譯而開通該特定途徑。靶基因可編碼核酶，該核酶可以通過在RNA水平上干擾相關轉錄調節物的表達，或干擾特定途徑之抑制物的表達來調節特定途徑。被單一地或聯合地表達的蛋白質可以牽涉到尋靶(homing)、細胞毒性、增殖、免疫反應、炎性反應、凝血或血凝塊溶解、體液調節等過程。所表達的蛋白質可以是天然存在的蛋白質，天然蛋白質的突變體、獨特序列或其組合形式。
基因可以是由細胞分泌的任何基因，從而可隨意制得期望得到的或宿主必需的被編碼的產物。多種被分泌的產物包括激素，如胰島素、人生長激素、胰高血糖素、垂體釋放因子、ACTH、促黑激素、松弛素等；生長因子，如EGF、IGF-l、TGF-α、-β、PDGF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、FGF、促紅細胞生成素、巨核細胞刺激和生長因子等；白細胞介素，如JL-1至-13；TNF-α和-β等；以及酶，如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、補體級聯反應成員、perforins、超氧化物歧化酶、凝血因子、抗凝血酶-III、因子VIIIc、因子VIIIvW、α-抗胰蛋白酶、蛋白質C、蛋白質S、內啡呔、dynorphin、骨形態形成蛋白質、CFTR等。
基因可以是任何天然的或經導入適當信號肽及跨膜序列而制得之表面膜蛋白質的基因。各種各樣的蛋白質可以包括尋靶受體，如L-選擇素(Mel-14)、血液相關蛋白質，特別是有kringle結構的蛋白質，如因子VIIIc、因子VIIIvW，造血細胞標志物，如CD3、CD4、CD8、B細胞受體、TCR亞單位α、β、γ、6、CD10、CD19、CD28、CD33、CD38、CD41等；受體，如白細胞介素受體IL-2R、IL-4R等；離子如H+、Ca+2、K+、Na+、Cl-等流入或流出的通道蛋白質；CFTR、酪氨酸激活基序、ζ激活蛋白質等。
為了向泡囊運輸蛋白質以便發生胞吐，可以對蛋白質進行修飾。加進來自某蛋白質的被引向泡囊的序列，在這里修飾該序列使之接近一個或另一個末端，或位于與蛋白質來源相似的位置，以將被修飾的蛋白被導向泡囊中高爾基氏器進行包裝。這一過程與存在胞吐作用的嵌合蛋白質相結合，即可將蛋白質迅速地輸向細胞外介質，并達到相對高的定位濃度。
另外，具體根據宿主細胞的性質，一些細胞內蛋白質可能是有意義的，例如代謝途徑中的蛋白質、調節蛋白質、類固醇受體、轉錄因子等。上文指出的某些蛋白質也可以作為細胞內蛋白質存在。
下面是不同基因的少數實例。在T細胞中，可能希望導入編碼一條或兩條T細胞受體鏈的基因。對于B細胞，可以提供用于分泌作用的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。對于皮膚細胞，例如角質形成細胞，特別是干細胞角質形成細胞，可以通過分泌α-、β或γ-干擾素、抗趨藥性因子、對細菌細胞壁蛋白質特異的蛋白酶等而提供防止感染保護作用。
除了提供有治療價值之基因的表達外，有許多情況下可希望將細胞導向特定部位。這些部位可包括解剖部位，如淋巴結、粘膜組織、皮膚、滑囊、肺或其他內部器官等，或者是例如凝血、損傷部位、外科處理部位、炎癥、感染等功能性部位。經提供在宿主靶部位對天然存在之表位的結合，以提供可將宿主細胞引向特定部位之表面膜蛋白質的表達，從而可使分泌的產物達到局部化的濃度。有用蛋白質包括尋靶受體，如L-選擇素(Selectin)，GMP140、CLAM-1等；或地址素，如ELAM-1、PNAd、LNAd等；血塊結合蛋白質，或對趨藥因子的局部化梯度反應的細胞表面蛋白質。在許多情況下可希望將細胞導向特定部位，并在該部位釋放出治療產物，這將是有很大價值的。
在許多情況下可能希望能夠殺死經修飾的細胞，例如希望終止對細胞的處理，細胞已變得不合乎需要，例如變為致瘤性細胞，或者細胞應完成的使命已經完成，它們的繼續存在已無必要。本發明的經修飾細胞能夠表達初級嵌合蛋白質，此蛋白質含有如Fas抗原或TNF受體的胞質區的區域(Watanable-Fukunaga et al.，Nature(1992)356，314-317)。將細胞暴露于能使初級嵌合體低聚合化的配體之后，通過細胞程序死亡可容易地消除本發明經修飾的細胞。使用常規材料和方法將編碼初級嵌合體的構建體設計成可組成型表達，從而使經修飾的細胞在其表面上有或在其胞質中存在這樣的蛋白質。此外，也可以提供受控制的表達，此時相同或不同的低聚合配體均可發動表達初級嵌合體和開始自然死亡過程。通過在胞質中提供Fas抗原或TNF受體的胞質部分-其中所說的胞質部分連接到與有意靶基因表達相關之結合區域不同的結合區域上，即可在受控制的條件下殺死被修飾的細胞。
C.闡述性舉例作為舉例說明，可按下述方法處理心臟病人或易患中風的病人。將按本文所述方法修飾的細胞施予病人并保留相當長的時間。舉例的細胞包括漿細胞、B細胞、T細胞或其他造血細胞。應修飾細胞使之表達與血凝塊結合的蛋白質，例如有kringle區域結構的蛋白質，或粘附性相互作用的蛋白質如CD41，并表達凝塊溶解蛋白質，如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、鏈激酶等。以這種方式，在配體介導的低聚合后，細胞在血塊部位積聚并提供高定位濃度的血栓溶解蛋白質。
另一個例子是再灌注損傷。可以利用有限半壽期的細胞，例如巨噬細胞或多形核白細胞(“嗜中性細胞”)。細胞具有嗜中性細胞尋靶受體以將細胞引向再灌注損傷的部位。細胞也可表達超氧化物歧化酶，以破壞單氧并抑制自由基對組織的侵害。
第三個例子是自體免疫性疾病。可利用長半壽期的細胞，例如T細胞。構建體將提供尋找自身免疫損傷部位的尋靶受體、并對引起損傷的細胞進行胞毒性攻擊。然后治療即針對引起損傷的細胞發揮作用。另外，可以提供分泌可溶性受體或其他肽或蛋白質的條件，其中分泌產物將抑制對引起損傷之細胞的活化或誘導無反應性。另一種可替代的手段是分泌可用于減小退化作用的抗炎產物。
第四個例子包括通過包裹用內啡肽治療慢性疼痛。用其中以嵌合轉錄調節蛋白質控制人內啡肽轉錄的構建體轉染人成纖維細胞的原株。DNA構建體由TATAAA位點和轉錄起始位點上游的HNF-1*轉錄因子GTTAAGTTAAC的3個結合位點拷貝組成。內啡肽cDNA將被插入到起始位點的下游，多腺苷酸和終止序列的上游。任選地，內啡肽cDNA裝備有“PEST”序列以使蛋白質不穩定，或者在mRNA的3′非翻譯區中有AUUA序列以使其被快速降低。
也用有兩個轉錄單位的構建體轉染成纖維細胞，其中之一將編碼截短的HNF-1*cDNA，以正好編碼從氨基酸1到250的DNA結合序列，后者偶聯到處于在成纖維細胞中有功能的調節起始和終止區之轉錄和翻譯控制下的三聚FKBP結合區域上。構建體應包括一個附加的轉錄單位，后者是由偶聯到三聚FKBP′結合區上的指導衍生于HNF-4之轉錄激活區產生的同一調節區域驅動的(該最好部分意欲改變FKBP以nM濃度結合到經修飾的FK506上。此修飾抑制了與內源性FKBP的結合)。
可包裹這些總體上修飾的細胞以抑制免疫識別，并放在病人的皮下或其他方便的體內部位。當病人需要疼痛藥物治療時，給病人使用二聚配體FK506-FK506′，給予大約1μg至1mg應是足夠的。以這種方式可以在無須注射或沒有成癮危險的情況下提供止痛效果。
第五個例子是治療骨質疏松。可以克隆擴增淋巴細胞或培養生長來自待治療病人的皮膚成纖維細胞。按上述方法轉染細胞，其中用骨形態形成因子cDNA基因取代內啡肽基因。對于淋巴細胞，可以使用抗原特異性克隆，以允許用抗sIg之獨特型抗體破壞之。另外，給予sIg的抗原將會擴充細胞群體，以增加可被釋放之蛋白質的量。可注入淋巴細胞克隆并給予產生骨形態形成因子所需的配體。監測對配體的反應，并可根據監測的結果調整所產生的骨形態形成因子的量，以便將劑量調到所需要的水平。
另一種情況是修飾抗原特異性T細胞，此時可以為激活細胞而激活蛋白質的表達。其中T細胞受體可能是直接針對腫瘤細胞、病原體、細胞介導的自身免疫等的。通過提供細胞的激活，例如象IL-2這樣的白介素即可在對配體反應中用于擴充被修飾的T細胞。被修飾之T細胞的其他應用可包括表達將T細胞導向特定部位的尋靶受體，由此可望實現細胞毒性、靶細胞例如上皮細胞表面膜蛋白質的向上調節，或其他所需的生物學過程。
另外可能要求向靶部位釋放高劑量的胞毒性因子。例如，在通過尋靶受體識別腫瘤抗原后，可以激發腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)釋放出毒性濃度的TNF或其他相似產物。
另一種可替代的應用是輸出被胞吐的激素或因子。在提高了胞吐作用的情況下，將會輸出更大量的激素或因子；此外，如果有一個基于胞質中激素或因子的量的反饋機制，則將增加激素或因子的產生。或者，可以提供誘導的激素或因子的表達，以致能夠相伴隨地誘導表達和輸出。
也可以供給在保留的體液如血管系統、淋巴系統、腦脊液等中的蛋白質。經修飾可以具有延長了在宿主中之半壽期的細胞，例如造血細胞、角質形成細胞、肌細胞等，特別是干細胞，蛋白質即可更長時間地保留在體液中。可以用提供分泌或胞吐作用的構建體來修飾細胞。適于實現分泌的構建體應具有作為轉位區的信號肽，并且在使用其他嵌合蛋白質的情況下則具有結合區和作用區。作用區可得自于相同或不同的蛋白質。例如，就組織血纖維蛋白溶酶原激活物來說，其可以有凝塊結合區為一個作用區，并有血纖維蛋白溶酶原活性位點為另一個不同的作用區。另外，也可以利用結合蛋白質，例如LFA-1作為一個作用區并用選擇素作為第二個作用區，從而提高了對自動尋標的阻斷。通過修飾蛋白質例如整聯蛋白、T細胞受體、sIg等的亞單位，可以提供能夠聚集并與某分子結合的可溶形式的表面膜蛋白質。其他機會是補體蛋白質、參與凝血的血小板膜蛋白質、細胞表面上的自體抗原，以及感染劑表面上的病原體分子。
IX.構建體導入細胞內本文所述的構建體可以作為一個或多個DNA分子或其構建體導入細胞中，這些構建體中通常至少有一個標志物并可能有兩個或多個標志物，借以選擇含有構建體的宿主細胞。可以用常規方法制備構建體，包括分離基因和調節區，適當情況下經連接后克隆到適當的克隆宿主中，并經限制性酶切或序列測定分析或其他常規手段分析之。具體地說，可以利用PCR，分離包含全部或部分功能性單位的個別片段，其中可以使用“引物修補”、并在必要時利用連接、體外誘變等手段引入一個或多個突變。在完成構建并證明所得構建體具有適當的序列后，即可用任何常規方法將其導入宿主細胞中。可以將構建體整合并包裝到非復制的、有缺陷的病毒如腺病毒、腺相關病毒(AAV)或單純性皰疹病毒(HSV)或其他病毒，包括反轉錄病毒的基因組中，以感染或轉導到細胞內。如果需要的話，構建體可以包括轉染的病毒序列。或者，也可以借助融合、電穿孔、biolistics、轉染、脂染等技術導入構建體。在導入構建體之前，通常要培養宿主細胞并在培養物中擴充之，然后經適當處理以導入構建體并整合該構建體。擴展細胞并借助存在于構建體中的標志物篩選之。可被成功地使用的各種標志包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。
在某些情況下，可以有同源重組的靶位點，其中可望在特定位點整合構建體。例如，可以使用本領域已知的同源重組的材料和方法，“擊倒”(knock-out)內源基因并用構建體編碼基因取代之(在同一位點或其他位點)。另外，可以修飾對信號起始區起反應之內源基因的轉錄起始區，而不是提供基因。在這樣的實施方案中，可經給予配體來控制如EPO、tPA、SOD等內源基因的轉錄。對于同源重組，可以使用Ω或O-載體(例如參見Thomas and Capecchi，Cell(1987)51，503-512；Mansour，et al.，Nature(1988)336，348-352；Joyner，et al.，Nature(1989)338，153-156)。
構建體可以作為編碼所有基因的單一DNA分子，或有一個或多個基因的不同DNA分子被導入。可以同時或相繼地導入各有相同或不同標志物的構建體。在一實例中，一個構建體含有處于特異性反應元件控制下的治療基因(如NFAT)，另一個則編碼含有融合到配體受體區(如在MZF3E中的)上之信號發生區的受體融合蛋白質。也可以導入編碼尋靶受體或增加治療產物之釋放效率的其他產物的第三個DNA分子。
可用于制備構建體DNA貯備物并完成轉染的含有細菌或酵母復制原點、可選擇和/或可擴增標志、在原核或真核細胞中表達所需之啟動子/增強子元件等有用元件的載體是本領域中已知的，并且可以市場上購得。
X.細胞和配體的施用使已用DNA構建體修飾的細胞在選擇條件下在培養基中生長，然后可擴充根據其含有構建體而選擇的細胞，并使用例如聚合酶鏈反應檢測宿主細胞中構建體的存在而進一步分析之。一旦鑒定了被修飾的宿主細胞之后，即可按計劃使用之，如培養這些細胞或導入宿主生物體中。
然后可根據細胞的性質，以多種不同的方法將細胞導入宿主生物體，如哺乳動物體中。通常以至少約104個細胞，一般不超過約1010個，較好不超過約108個細胞的細胞數將造血細胞注射到血管系統內。所使用的細胞數目將取決于多種環境條件、導入的目的、細胞的半壽期、待使用的程序例如給予的次數、細胞增殖的能力、治療劑的穩定性、對治療劑的生理需要等因素。另外，皮膚細胞可以作為移植物使用，其細胞數目取決于待施用于燒傷或其他損傷上的細胞層的大小。一般說來，成肌細胞或成纖維細胞的細胞數目至少約104個且不超過大約108個，并且可作為分散體施用，一般是注射到感興趣的部位或其附近。細胞一般都是存在于生理上可接受的培養基中。
在許多情況下可希望在體內修飾細胞而不是在體外修飾細胞。為此目的，已開發了多種不同的體內修飾靶組織和細胞的技術。已開發了許多病毒載體，如可以將病毒轉染和隨機整合到宿主中的腺病毒和反轉錄病毒(例如參見Dubensky et al.(1 984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7529-7533；Kaneda et al.，(1989)Science 243，375-378；Hiebertet al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，3594-3598；Hatzoglu et al.(1990)J.Biol.Chem.265，17285-17293和Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8377-8381)。載體可經血管內或肌肉內注射、吸入或其他胃腸道外方式使用。
按照體內遺傳修飾，修飾的方法取決于組織的性質、所需的細胞修飾的效力、修飾特定細胞的機會、組織對被導入這DNA組合物的可接近性等。應用攜帶靶轉錄起始區的被減毒或修飾的反轉錄病毒后，必要時可使用本發明轉錄因子構建體之一來活化病毒，從而可以產生病毒并轉染相鄰的細胞。
DNA導入不一定在每種情況下部導致整合。在某些情況下短暫保留被導入的DNA即可滿足需要。以這種方式可使被導入的DNA具有短期效應，這種情況下可將細胞導入宿主體內并經過預定時間后，例如當細胞已能夠定位到特定部位后開通其活性機制。
然后可根據需要使用激活胞質區的配體。可根據配體的結合親和性、所需的反應、施用方式、細胞半壽期、所存在的細胞數目的不同，使用多種不同的方法。配體可以以胃腸道外或口服途徑使用。可根據上述因素確定給藥次數。配體可以作為藥丸、粉末、或分散體給口服攝入，或口頰內、舌下含服；血管內、腹膜內、皮下注射；吸入等途徑使用。可使用本領域熟知的常規方法和材料來配制適于各種途徑給藥的配體(及單體化合物)。給藥的精確劑量和特定方法將取決于上述因素，并可由臨床醫生或人或動物保健提供者來確定。在大多數情況下，給藥方式將根據經驗確定。
在欲逆轉由配體激活的過程時，可以給予單體化合物或其它能與配體競爭的信號結合位點化合物。因此，在有不利反應或期望終止治療效果的情況下，可以以任何方便的方式，特別是經血管內(如果希望快速逆轉的話)途徑使用單體結合化合物。此外，也可以在存在失活區(或轉錄沉默子)的情況下提供DNA結合區。在另一種方法中，通過本文別處所述的Fas或TNF受體發出信號使細胞程序死亡即可消除細胞。
可以按照治療劑量監測程序來確定用于各種應用之配體的特定劑量，其中可望在延長的時間里，例如大約兩周以上維持特定的表達水平；或者在重復治療的情況下，以長的間隔期例如兩周或更長時間的間隔期，在短時間里給予單個或重復劑量的配體。可以在預定范圍內給出配體的劑量并監測反應，以便得出時間-表達水平關系曲線，同時觀察治療反應。可根據在此期間觀察到的表達水平和治療反應，按照反應大小在下次提供更大或更小的劑量。可以反復重復這一過程直到得到一個治療范圍內的有效劑量。當緩慢投用配體時，一旦確定了配體的維持劑量，即可以以延長的間隔期進行檢測，從而確保該細胞系統是可以提供適當的反應和表達產物水平的。
值得注意的是，該系統受制于許多可變因素，如細胞對配體的反應、表達效率以及必要時的分泌水平、表達產物的活性，病人的隨時間和環境而改變的特殊需要，以及因細胞丟失而丟失細胞活性的速度或個別細胞的表達活性等。因此，既使有可以對大的群體使用的一般性細胞，也期望對每個個別病人監測其適當的個體劑量。
本方法學和組合物可用于治療多種病理狀況或病征。例如可用B和T細胞治療腫瘤、感染性疾病、代謝缺陷、心血管病、遺傳性凝血缺陷、自身免疫性疾病、關節退化性疾病，例如關節炎、肺部疾病、腎病、內分泌異常等。可使用牽連結構的各種細胞例如成纖維細胞和成肌細胞治療遺傳缺陷，如結締組織缺陷、關節炎、肝病等。在必須制得大量蛋白質以補充缺陷或向肝炎或門脈循環中釋放治療產物的情況下，則可以使用肝細胞。
給出下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
實施例細胞的轉化和評估實施例1經交聯T細胞受體的CD3鏈誘導已分離的IL-2增強子結合轉錄因子將(1)用SspI和HindIII切割的pPL/SEAP(Berger，et al.，Gene(1988)66，1)；(2)用Nde I切割，用Klenow修成平頭，然后用PvuI切割的pSV2/Neo(Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.(1982)1，232)和(3)用PvuI與HindIII切割的各種含啟動子質粒(即NFAT-CD8、B-CD8、cx121acZ-Oct-1、AP1-LUCIF3H，或cx15IL2)(如下所述)的三片段連接，制成含有處在人IL-2啟動子(-325至+47；MCB(86)6，3042)控制下之胎盤分泌的堿性磷酸酶基因的質粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)(圖1)，及相關質粒變異體(即NFAT-SX，NF B-SX、OAP/Oct1-SX和AP-1-SX)-其中報導基因處于與含有各種啟動子元件(即分別是NFAT、NKB、OAP/Oct-1和AP1)的合成寡聚體結合的最小IL-2啟動子(-325至-294和-72至+47)的轉錄控制之下。NFAT-CD8含有NFAT結合位點(-286至-257；Gene and Dev.(1990)4，1823)的3個拷貝，且cx121acZ-Oct含有來自人IL-2增強子的OAP/Oct-1/(ARRE-1)結合位點(MCB，(1988)3，1715)的4個拷貝；B-CD8含有來自小鼠輕鏈之NF B結合位點(EMBO，(1990)9，4425)的3個拷貝，且AP1-LUCIF 3H含有來自金屬硫蛋白啟動子之AP-1位點(5′-TGACTCAGCGC-3′)的5個拷貝。
在各次轉染中，將5μg編碼嵌合受體TAC/TAC/Z(TTZ)(PNAS88，8905-8909)的表達載體pCDL-SR(MCB8，466-72)(Tac-IL2受體鏈)連同各種以分泌堿性磷酸酶為基礎的報導質粒(見圖1中pSXNzo/IL2的基因圖)共轉染到TAg Jurkat細胞(用SV40大T抗原穩定轉染的人T細胞白血病Jurkat細胞系的衍生物[Northrup，et al.，J.Bi ol.Chem.，1993])中。各報導質粒均含有用于最小IL-2啟動子內不同IL-2增強子結合轉錄因子之結合位點的多聚合寡核苷酸，或者是報導基因的完整IL-2增強子/啟動子上游。24小時后，將細胞的等分樣品(約105個)放在含有對數稀釋度之結合的抗TAC(CD25)mAb(33B3.1；AMAC，Westbrook，ME)的微量滴定板小井中。作為陽性對照并控制轉染效率，向各次轉染的等分樣品中加入肌霉素(ionomycin)(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續保溫14小時后，檢測上清液中的堿性磷酸酶活性，以及相對于陽性對照組樣品所表達的這些活性。加入1ng/ml FK506，所有活性均由于NFAT而降到本底水平，證明失活作用是以用FK506阻斷的同樣途徑發生的。所得到的各數據點都是兩份樣品的平均值，并且幾次實驗均得到相似的結果(見圖5)。數據表明，用已知的細胞外受體，得到報導基因和不同增強子的適當反應。當使用抗TcR復合物(即OKT3)MAb時得到了相似的結果。
實施例2免疫抑制劑藥物FK506和環孢菌素A(CsA)或二聚衍生化合物FK1012A(8)、FK1012B(5)、CsA二聚體(PB-1-218)的抑制活性向105個TAg-Jurkat細胞中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。另外，加入各種滴定度的不同藥物。5小時后在溫和去污劑(即Triton X-100)中溶解細胞并使提取物與β-半乳糖苷酶底物，MUG(甲基半乳糖苷基繖形酮)一起保溫1小時。加入甘氨酸/EDTA停止緩沖液并檢測提取物的熒光值。所得到的每個數據點都是兩份樣品的平均值，并且幾次實驗都得到相似的結果。令人驚奇的是，FK1012B在最高濃度(即5μg/ml)似乎可稍微放大促細胞分裂素活性；但對照實驗則顯示單獨FK1012B沒有刺激作用(見圖6)。
實施例3二聚FK506衍生物FK1012A對嵌合FKBP12/CD3(1FK3)受體的活性5μg含有嵌合受體(1FK3)的真核表達載體pBJ5(基于在16S拼接位點和poly A位點間插入了多接頭的pCDL-SR)與4μgNFAT可誘導地分泌堿性磷酸酶的報導質粒NFAT-SX進行共轉染。在平行的轉染中，使用5μg pBJ5代替1FK3/pBJ5作為對照。24小時后，將含有約105個細胞的各轉染實驗的等分樣品與如上指出的對數稀釋度的藥物FK1012A一起保溫。作為陽性對照并為了控制轉染效率，向各轉染的等分樣品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續保溫14小時后，檢測上清液的堿性磷酸酶活性和相對于陽性對照樣品的被表達的這些活性。加入2ng/ml FK506使所有刺激作用降至本底水平，證明活化是以與用FK506阻斷一樣的途徑進行的。因此，FK506或環孢菌素將作為使用這些化合物的有效解毒劑。所得到的各數據點均為兩份樣品的平均值，并且幾次實驗都得到了相似的結果(見圖7)。
實施例4A二聚FK506衍生物FK1012B對肉豆蔻酰化嵌合CD3/FKBP12(MZF3E)受體的活性我們成功地證明了許多進行配體設計與合成的辦法，包括用稱為“FK1012”的基于FK506的HOD試劑得到的陽性結果。我們已發現FK1012達到2∶1結合化學計算值的高親和性(Kd(1)＝0.1nM；Kd(2)＝0.8nM)，并且不抑制神經鈣蛋白(calcineurin)介導的TCR信號發生。此配體既非“免疫抑制性”的也無毒性(在細胞培養物中高達0.1mM)。同樣，我們已制備了基于環孢菌素A的同二聚試劑“(CsA)2”，其可以1∶2的化學計算量與CsA受體親環素結合，但不與神經鈣蛋白結合。因此，象FK1012一樣，(CsA)2并不抑制信號傳輸途徑，并且既不是免疫抑制性的同樣也無毒性。
我們的配體介導的蛋白質聯系的這樣及其他實例均導致了對信號轉導途徑的控制。在一個實例中，這一目的是通過產生由足以進行翻譯后肉豆蔻酰化的Src的小片段(M)、ζ的胞質尾部(Z；也使用B細胞受體的成分)、三個連續的FKBP12(F3)和flu表位tag(E)組成的細胞內受體而實現的。在人(Jurkat)T細胞中表達構建體MZF3E(圖18)后，我們進一步證實所編碼的嵌合蛋白質經受了FK1012介導的低聚合。根據在對FK1012反應中(EC30＝50nM)堿性磷酸酶分泌作用(SEAP)所證實的，伴隨的ζ鏈的聚集導致通過內源性TCR信號傳輸途徑發生信號(圖15)。構建SEAP報導基因的啟動子以由被激活之T細胞的核因子(NFAT)轉錄激活，使其在TCR信號發生后組裝在核中。可通過稱為FK506-M的配體的無毒性單位譯本誘導的去聚集過程來終止FK1012誘導的信號傳輸。
具體地說，5μg真核表達載體，即含有肉豆蔻酰化嵌合受體的pBJ5與4μg NFAT-SX共轉染。MZE、MZF1E、MZF2E和MZF3E分別含有處在肉豆蔻酰化CD3胞質區下游的0、1、2、或3個FKBP12的拷貝。(見圖2)。作為對照，在平行的轉染實驗中使用5μgpBJ5。24小時后，將約含105個細胞的各轉染樣品的等分部分與如所指出的藥物，FK1012B的對數稀釋液一起保溫。作為陽性對照并為了控制轉染效率，向各轉染的等分樣品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續保溫12小時后，檢測上清液的堿性磷酸酶活性和相對于陽性對照樣品被表達的這些活性。加入1ng/mlFK506使所有刺激作用降到接近本底水平，證明激活是以如用FK506阻斷同樣的途徑進行的。這一結果進一步證實本發明細胞激活作用的可逆性。所得到的各數據點均為兩份樣品的平均值并且所進行的幾次實驗都得到了相似的結果(見圖8)。肉豆蔻酰化的衍生物以大約放大一個數量級對較低濃度的配體起反應，并且激活NFAT依賴性轉錄達到可比較的水平，但應注意到的是配體是不同的(比較圖7和8)。
體內FK1012誘導的蛋白質二聚合。我們接下來要進一步證實MZF3E受體的細胞內聚集確定是由FK1012誘導的。因此使MZF3E構建體的流感血細胞凝集素表位-tag(flu)與不同的表位-tag(flag-M2)交換。在Jurkat T細胞中共表達密切相關的嵌合體MZF3Eflu和MZF3Eflag。用FK1012A處理細胞后使用偶聯在瓊脂糖小球上的抗F lag抗體進行免疫沉淀實驗。在FK1012A(1μM)存在下，蛋白質嵌合體MZF3Eflag與MZF3Eflu相互作用，并與MZF3Eflag共免疫沉淀。不存在FK1012A時則觀察不到MZF3Eflu的共免疫沉淀。用FKBP單體構建體MZF 1 Eflu和MZF 1 Eflag進行的相關實驗并沒有出現信號，表明它們也在FK1012A作用下發生了二聚合。這一結果反映了用內源性T細胞受體和我們的人工受體MZF3E觀察到的聚集要求。
FK1012誘導的蛋白質-酪氨酸磷酸化作用在抗原刺激后TCR、CD3和ζ鏈的細胞內區域與胞質蛋白質酪氨酸激酶相互作用。Src家庭的特殊成員(lck和/或fyn)使這些細胞內區域內活化基序(酪氨酸活化基序，TAM)的一個或多個酪氨酸殘基磷酸化。酪氨酸激酶ZAP-70被補充(通過其兩個SH2區域)到酪氨酸磷酸化的T細胞受體上，被活化，并很可能參與磷酸化酶C的進一步的下游激活作用。如在E分別免疫沉淀內源性T細胞受體ζ鏈和MZF3E構建體后經體外激酶檢測法所測得的，向用MZF3E穩定轉染的Jurkat細胞中加入抗CD 3 MAb或FK1012A，導致了對ζ鏈之激酶活性的恢復。用抗CD3MAb或FK1012處理細胞后，使用單克隆α-磷酸酪氨酸抗體檢測酪氨酸磷酸化作用。在刺激后的不同時間分析整個細胞溶胞產物。用抗CD3MAb或FK1012刺激后觀察酪氨酸磷酸化之蛋白質的類似圖形。該圖形由可能是ZAP-70的70 kDa之主帶和120kDa、62kDa、55kDa及42kDa的小帶組成。
實施例4(B)用親免素-Fas抗原嵌合體調節程序化的細胞死亡Fas抗原是細胞表面受體中神經生長因子(NGF)/腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員。Fas抗原與抗其細胞外區的抗體交聯可激活一個知之很少的信號發生途徑，由此導致程序化的細胞死亡或細胞自然死亡。Fas抗原和其相關自然死亡信號發生途徑存在于包括可能所有腫瘤細胞在內的大多數細胞中。該途徑導致迅速而獨特的細胞死亡(2小時)，特征在于胞質濃縮、沒有炎性反應及核小體DNA斷裂，而這些特征部是壞死性細胞死亡中見不到的。
我們還發展了一個次等的、導致細胞自然死亡的可誘導的信號發生系統。同MZF3E途徑一樣，該途徑是通過激活一個人工受體而產生的，所說的人工受體則是構成上表達之“應答者”基因的產物。但此新的途徑不同于第一個途徑之處在于我們的HOD試劑誘導內源途徑的產物而不是被轉染的、可誘導的(如報導)基因的產物的合成。
增加對Fas途徑的控制為生物學研究和醫學進步提供了重要的機會。用處于細胞特異性啟動子控制下的“死亡”應答基因設計轉基因動物。然后可以給動物施用HOD試劑，以化學消除成年動物體內的靶細胞。以這種方法，可以評價特定腦細胞在記憶或認識中的作用，或免疫細胞在誘發或維持自體免疫性疾病中的作用。也可以使用由M.Blaese及其同事建立的人基因治療技術(Culver，et al.，Science256，5063(1992)1550-2)將死亡應答基因導入腫瘤中，然后經用HOD試劑處理病人而相繼激活這些基因(類似于最近報導的治療腦腫瘤的“gancyclovir”基因治療臨床試驗)。最后，我們設想在基因治療的實踐中合用死亡應答基因和治療基因。這將為基因治療提供一種“失效保護”組分。如果什么東西要跑掉(一個共同討論的問題是導致腫瘤的整合誘導的腫瘤抑制基因的丟失)，基因治療病人就可服用將殺死所有被轉染細胞的“失效保護”藥片。因此我們為此目的設計了低聚合化試劑的正交系統。因此，我們提供了一套配體和嵌合應答蛋白以用于調節宿主細胞的程序化死亡，另一套用于調節治療基因的轉錄。用于調節治療或所需基因轉錄的配體被設計為(或選擇為)不能交叉反應和啟動細胞程序死亡。
已構建了由三個與Fas抗原的胞質信號傳輸區相融合之FKBP12區組成的嵌合cDNA范例(圖19)。當在人Jurkat和小鼠D10T細胞中表達時，可由FK1012試劑誘導該構建體二聚合，并發起將導致FK1012依賴性自然死亡過程的信號級聯。如根據報導基因活性丟失所確定的，FK1012A介導的被MFF3E短暫轉染之細胞死亡的LD50值為15nM(見圖19；有關檢測法的討論參見圖20)。這些數據與在穩定轉染的細胞系中進行的細胞死亡檢測結果相符。因為穩定的轉染體代表了一個細胞的同源群體，所以它們已被用于確定死亡是由于自然死亡而不是壞死(膜起泡、核小體DNA斷裂)。然而，短暫轉染程序更加方便，并因此被用作如下描述的初始試驗系統。
實施例4(C)用親環素-Fas抗原嵌合體調節程序化的細胞死亡我們還制備了一系列親環素C-Fas抗原構建體并在短暫表達試驗中檢驗了它們的誘導(CsA)2依賴性自然死亡的能力(圖20A)。
此外，已經用被該系列中最活躍的構建體MC3FE(M＝Src的肉豆蔻酰化區域，C＝親環素區域，F＝Fas的胞質尾部，E＝flu表位tag)穩定轉染的人Jurkat T細胞證明了(CsA)2依賴性自然死亡。在1、2、3或4個連續的親環素區域之前或之后融合了Fas的胞質尾部。也制備了兩個缺少Fas區的對照構建體。在這種情況下，我們觀察到只有當放在二聚區之后時信號發生區才有功能活性(當放在二聚區之前或之后時ζ鏈構成信號)。如由Western印跡分析所證實的，3個信號發生構建體的表達水平和其活性有著量上的不同(圖20B)。已如此明確證明的最佳系統是MC3FE。MC3FE進行的(CsA)2介導之細胞死亡的LD50約為200nM。這些數據證明了親環素-環孢菌素相互作用對于調節細胞內蛋白質聯系的實用性，并舉例說明了不與FKBP12-FK1012系統發生交叉反應的正交試劑系統。此外，在此情況下，數據還顯示由Fas胞質尾部發起信號傳送只需要二聚合而不需要聚集。
肉豆蔻酰化作用信號的N末端甘氨酸突變為丙氨酸將阻止肉豆蔻酰化，并因此而阻止膜定位。我們也已觀察到突變的構建體(△MFF3E)具有如FK1012依賴性自然死亡的誘導物的等同能力，此表明膜定位對于Fas介導的細胞死亡并不是必須的。
實施例5鼠信號傳送嵌合蛋白質的構建使用圖4中所述的引物制得各個不同的片段。有關引物編號應參見圖4。
使用含鼠II類MHC受體(Cell，32，745)之I-E鏈的約1.2kbcDNA片段作為信號肽的來源，用供應商(Promega)描述的PCR方法由P#6048和P#6049制得70bp SacII-XhoI片段。使用含有連接到CD3之跨膜和胞質區(PNAS，88，8905)上的Tac(IL2受體鏈)的質粒制得第二個片段。使用P#6050和P#6051，以PCR方法制得CD3之跨膜區和胞質區的32Dbp XhoI-EcoRI片段。連接這兩個片段并插入SacII-EcoRI消化的pBluescript(Stratagene)中以得到質粒SPZ/KS。
為了得到FK506的結合區，使用質粒rhFKBP(由S.Schreiber提供，Neture(1990)346，674)與P#6052和P#6053制得含有人FKBP12的340bp XhoT-SalI片段。將該片段插入用XhoI和SalI消化的pBluescript中以提供質粒FK1 2/KS，并以其作為FKBP12結合區的來源。用XhoI消化SPZ/KS，磷酸化(細胞小腸堿性磷酸酶CIP)以防止自身退火，并與10倍摩爾過量的來自FK12/KS的含XhoI-SalI FKBP 12片段結合。分離在正確方向上含有單體、二聚和三聚FKBP12的克隆。克隆1FK1/KS、1FK2/KS和1FK3/KS在轉錄方向上由來自鼠MHCII類基因I-E的信號肽、分別是人FKBP12的單體、二聚體或三聚體的部分，以及CD3的跨膜和胞質部分組成。最后，使用限制性酶從pBluescript切下SacII-EcoRI片段并連接到已用SacII和EcoRI消化的p3J5的多接頭中，以分別得到質粒1FK1/pBJ5、1FK2/pBJ5和1FK3/pBJ5(見圖3和4)。
實施例6A.細胞內信號傳送嵌合體的構建從Pellman等人(Nature 314，374)處得到來自c-src的肉豆蔻酰化序列并連接到CD3的互補序列上，以提供互補于跨膜區之序列3′的引物，即P#8908 。該引物具有與肉豆蔻酰化序列的5′末端相鄰的SacII位點，以及與其3′末端相鄰的XhoI序列。另一引物P#8462具有與CD3之3′末端序列互補的序列SalI識別位點3′，終止密碼子及EcoRI識別位點。使用PCR制得由肉豆蔻酰化序列和在5′-3′方向融合的CD3序列組成的450bp SaclI-EcoRI片段。將該片段連接到SacII/EcoRI消化的pBJ5(XhoI)(SalI)中并克隆之，得到質粒MZ/pBJ5。最后，用SalI消化MZ/pBJ5，磷酸化，并與10倍摩爾過量的來自FK1 2/KS的含XhoI-SalI FKBP12片段合并并連接之。克隆后，分離含有在5′-3′方向上由肉豆蔻酰化序列、CD3和FKBP12多聚體組成之所需構建體的質粒，并驗證其具有正確結構(參見圖2和4)。
B.細胞內信號傳送嵌合體表達盒的構建用限制性酶XhoI和SalI消化構建體MZ/pBJ5(MZE/pBJ5)，除去TCRζ片段并將所得載體與10倍過量的FKBP12的單體、二聚體、三聚體或更高級聚合體連接，以制得MF1E、MF2E、MF3E或MFnE/pBJ5。然后可將經過消化以含有相容性側翼限制性位點(即XhoI和SalI)的活性區克隆到MFnE/pBJ5的唯一XhoI或SalI限制位點中。
實施例7核嵌合體的構建A.GAL4 DNA結合區-FKBP區域一表位tag。使用含有Kozak序列之SacII位點上游和翻譯起始位點的5′引物(#37)，和含有SalI位點的3′引物(#38)，以PCR方法擴增GAL 4 DNA結合區(氨基酸1-147)。分離P(CR產物，用SacII和SalI消化，在SacII和SalI位點處連接到pBluescrjpt II KS (+)中，得到構建體pBS-GAL4 。經序列分析證實該構建體。分離pBS-GAL 4中的SacII/SalI片段并在SacII和XhoI位點處連接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構建體(合有肉豆蔻酰化序列，見實施例6)中，得到構建體GF1E、GF2E和GF3E。
PCR擴增產物的5′端SacII |----Gal4(1-147)--->>
—— M K L L S S I5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG——KozakPCR擴增產物的3′端<<----Gal4(1-147----)|R Q L T V S5′ GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG3′ CTGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC——SalIB.HNF1二聚合/DNA結合區-FKBP區域-tag。
使用含有Kozak序列之SacII位點上游和翻譯起始位點的5′引物(#39)，和含有SalI位點的3′引物(#40)，以PCR方法擴增HNFla二聚/DNA結合區(氨基酸1-282)。分離PCR產物，用SaclI和SalI消化并在SacII和SalI位點處連接到pBluescriptIIKS(+)中，產生構建體pBS-HNF。經序列分析證實該構建體。分離pBS-HNF中的SacII/SalI片段并在SacIl和XhoI位點處連接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構建體中，產生構建體HF1E、HF2E和HF3E。
PCR擴增產物的5′端SacII |--FNF1(1-281)-->>
—— M V S K L S5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC——KozakPCR擴增產物的3′端<<——HNF1(1-282)——|A F R H K L5′CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG3′GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC——SalIC.FKBP區-VP16轉錄激活區-表位tag。以下述三個步驟制得這些構建體(i)由IFK3/pBJ5產生其中的肉豆蔻酰化序列被直接接在XhoI位點上游之起始位點所取代的構建體，得到構建體SF3E；(ii)將核定位序列插入XhoI位點，產生構建體NF3E；(iii)將VP16激活區克隆到NF3E的SalI位點中，產生構建體NF3EV1E。
(i)將編碼Kozak序列和側接有SacII和XhoI位點之起始位點的互補寡核苷酸(#45和#46)一起退火，經磷酸化處理后連接到MF3E的SacII和XhoI位點中，產生構建體SF3E。種屬起始位點的插入Kozak_____M L E5′GGCCACCAIGC3′ CGCCGGTGGTACGAGCT—— ——SacIIXhoI突出部分突出部分(ii)將編碼側接有5′SalI位點和3′XhoI位點之SV40T抗原核定位序列的互補寡核苷酸(#47和#48)一起退火，經磷酸化處理后連接到SF1E的XhoI位點中，產生構建體NF1E。經DNA序列分析證實該構建體。分離一個含有突變或缺陷形式之核定位序列的，其中128位蘇氨酸取代賴氨酸的構建體。該構建體被定名為NF1E-M。從pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將該片段連接到用XhoI切成線形的NF1E中，得到FKBP12區的多聚體。如此產生了構建體NF2F和NF3E。
將NLS插入種屬起始位點T(ACN)126 132L D P K K K R K V L E5′ TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC3′ GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT—— ——SalI XhoI因128位上的蘇氨酸而產生有缺陷的NLS。
(iii)使用含有SalI位點的5′引物(#43)和含有XhoI位點的3′引物(#44)以PCR法擴增VP16轉錄激活區(氨基酸413-490)。分離PCR產物，用SalI和XhoI消化并在XhoI和SalI位點上連接到MF3E中，得到構建體MV1E。經DNA序列測定證實該構建體。作為XhoI/SalI片段從MV1E中分離單一VP16序列，并將該片段連接到用XhoI切成線形的MV1E中而產生多聚的VP16區。以同樣方法產生構建體MV2E、MV3E和MV4E。從MV1E或MV2E中分離作為XhoI/SalI片段的編碼一種或多個多VP16區域的DNA片段并連接到用SalI切成線形的NF1E中，產生構建體NF1V1E和NF1V3E。從pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將此片段連接到用XhoI切成線性的NF1V1E中，得到FKBP12區的多聚體。從而導致構建體NF2V1E和NF3V1E的產物。
PCR擴增產物的5′端SalI|--VP16(413-490)--->>
_______ A P P T D V5′ CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTCPCR擴增產物的3′端<<--VP16(413-490)----|D E Y G G5′GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG3′CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC——Xhol
寡核苷酸#3738mer/0.2um/OFF 5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG#3828mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC#3934mer/0.2um/OFF5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC#40 28mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG#43 29mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC#44 26mer/0.2um/OFF 5′CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC#45 26mer/0.2um/OFF 5′GGCCACCATGC#46 18mer/0.2um/OFF5TCGAGCATGGTGGCCGC#47 27mer/0.2um/OFF 5TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC#48 27mer/0.2um/OFF 5TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG實施例8轉錄誘導的證明使用所指出的構建體(各5μg構建體)以電穿孔法(960μF，250v)轉染Jurkat TAg細胞。24小時后，將細胞重新懸浮在新鮮培養基中并分成若干等份。取每份轉染物的一半與二聚FK506衍生物(實施例14)，以1μM的終濃度保溫。12小時后，洗細胞并經反復凍融制備細胞提取物。用標準方法(Molecular CloningALaboratory Manual.Sambrook at al.eds.(1989)CSH Laboratory，pp.16-59 ff.)檢測氯霉素乙酰轉移酶(CAT)活性。所得數據證明37℃保溫18小時后在70μl提取物(總提取物體積為120μl)中如所希望的(樣品2中有或沒有配體；樣品5和6中存在配體)存在CAT活性。該項檢測中所使用的樣品是
1.G5E4TCAT(GAL4-CAT報導質粒)2.G5E4TCAT，GAL4-VP163.GSE4TCAT，NFSV1E4.G5E4TCAT，GF2E5.G5E4TCAT，GFF2E，NF3V1E6.G5E4TCAT，GF3E，NF3V1E化學合成實施例如本文中所指出的，目前作為低聚劑的特別適用的化合物具有下列結構接頭-[rbm1，rbm2，…rbmn]。
其中“接頭”是如本文所述的與“n”(從2到約5的整數，通常是2或3)可以相同或不同的受體結合部分(“rbm”)共價連接的接頭部分。如本文其他段落中所指出的，受體結合部分是已知受體的配體(或其類似物)，如在V(C)部中所列舉的配體，并包括能夠與FKBP結合的FK506、FK520、雷帕霉素和其類似物；以及能夠與各自的受體結合的環孢菌素、四環素、其他抗生素和大環內酯及類固醇。
接頭是能夠共價結合(“-”)到兩個或多個受體結合部分上的雙或多功能分子。典型地，接頭可含有最高達約40個原子，除了碳和氫外還包括氮、氧和硫。VI(A)部分和各實施例中公開了一些舉例說明的接頭部分，并且其中包括C1-C30烷基、亞烷基或芳烷基基團，它們可以被取代或不被取代，可以是直鏈、支鏈或環狀，例如烷基取代基是飽和直鏈、環狀或支鏈烴部分，優選為1至約12個碳原子，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、環丁基、環丙基亞甲基、戊基、己基、庚基、辛基等等，并任選地可被一個或多個取代基所取代，所述取代基為例如低級烷氧基、羧薹、氨基(取代或親取代的)、苯基、芳基、巰基、鹵素(氟、氯、溴或碘)、疊氮基或氰基。
可以使用市場上可購得的材料和/或本領域已知的方法制備這些化合物。可按下文所述方法制得這些化合物的工程化受體。特別有用的化合物是以小于10-6，較好小于約10-7并且甚至更好小于10-8M的Kd值與受體結合的化合物。
令人感興趣的低聚合劑中的一個亞類是其中一個或多個受體結合部分為FK506、FK-506型化合物或其衍生物的低聚合劑，其中受體結合部分通過C21(使用FK506編號)上的烯丙基基團(如圖9A中所示的化合物5或13)，或通過環己基環(C29-C34)，如通過C32羥基(如圖9B中所示的化合物8、16、17)共價連接到接頭部分上。可按本文中(包括下述實施例中)所述的方法制備該類化合物。
另一亞類有用的低聚合試劑是其中至少一個受體結合部分是FK520或其衍生物的低聚合試劑，其中FK520或其衍生物的分子共價連接到如圖10所示FK1040A或FK1040B中的接頭部分上。可按圖10所示的方案1、圖11A和11B所示的方案2或圖12與圖13所示的方案3制備這類化合物。
再一個有用低聚合試劑的亞類是其中至少一個受體結合部分為環孢菌素A或其衍生物的低聚合試劑。
應理解到的是，本發明的這些或其他低聚合試劑可以是同低聚合試劑(其中的rbm都是相同的)或導低聚合試劑(其中的rbm是不同的)。可按本文給出的相以方法，包括圖13所示的方案3及本文中所討論過的方法制備異低聚合試劑。
下列合成實施例只是舉例說明性的。
A.通用方法。所有反應均在正氮或氬氣壓力下在烘箱干燥的玻、璃器皿中進行。對空氣和濕氣敏感的化合物通過注射器或經過橡膠隔片套管導入。
B.物理數據。在Bruker AM-500(500MHz)和AM-400(400MHz)分光儀上記錄質子磁共振譜(1H NMR)。使用溶劑共振作為內部標準(氯仿，7.27ppm)報告來自四甲基硅烷的化學位移(ppm)。數據報告如下化學位移，多重性(s＝單峰，d＝雙重峰；t＝三重峰，q＝四重峰，br＝加寬峰，m＝多重峰)，偶聯常數(Hz)，積分，得到低和高分辨率質譜。
C.層析。使用E.Merck硅膠60F玻璃板(0.25mm)經薄層層析(TLC)監測反應。用長波紫外光光照，暴露于碘蒸氣，和/或浸沒于鉬酸鈰銨水溶液中然后加熱以顯現各組分。層析的溶劑為HPLC級。在E.Merck硅膠160(230-400目)上使用所指出的溶劑系統的加壓流(快速層析)進行液相層析。
D.溶劑和試劑。所有試劑和溶劑都是分析級的，并除了下述特殊要求者外均直接使用。從二苯甲酮羰游基鈉中蒸餾四氫呋喃(THF)、苯、甲苯和二乙醚。從氫化鈣中蒸餾三乙胺和乙腈。從五氧化二磷中蒸餾二氯甲烷。在減壓下從氫化鈣中蒸餾二甲基甲酰胺(DMF)并過4_分子篩儲存。FK506衍生物的制備實施例9FK506-TBS2(1至2)的硼氫化作用/氧化作用按照Evans(Evans，et al.，JACS(1992)114，6679；引文同上(1992)6679-6685)所述方法進行硼氫化反應(編號參見Harding，et al.，Nature(1989)341，758)。10ml燒瓶內裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(33.8mg，0.033mmol)和[Rh(nbd)(diphos-4)]BF4(3.1mg，0.004mmol，13mol％)。將此有機混合物溶解在甲苯(2.0ml)中，減壓下經4小時除去溶劑。用氮氣小心清洗燒瓶，將桔黃色油溶于THF(3.0ml，10mM終濃度)并用冰水浴冷卻到0℃。通過注射器加入兒茶酚硼烷(98μl，0.098mmol，在THF中的1.0M溶液，3.0當量)并將所得溶液于0℃攪拌45分鐘。反應物于0℃與0.2ml THF/EtOH(1∶1)，然后是0.2ml pH7.0緩沖液(Fisher；0.05M磷酸鹽)，再后用0.2ml 30％ H2O2驟冷。將溶液于室溫下攪拌至少12小時。減壓下除去溶劑，將剩余的油溶于甲苯(10ml)中并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗，分離各相并用苯(2×10ml)反萃取水相。
合并有機相并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗一次。用MgSO4干燥苯相，濃縮，并經快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)后得到澄清的無色油狀初級醇(12.8mg，0.012mmol，37％)。
制備混合的碳酸酯(2至3)。用Ghosh的方法制備混合的碳酸酯(Ghosh，et al.，Tetrahedron Lett.(1992)33，2781-2784)。在10ml燒瓶內裝入初級醇(29.2mg，0.0278mmol)和苯(4ml)。在減壓下經60分鐘除去溶劑。將油溶解在乙腈(2.0ml，14mM終濃度)中并于20℃攪拌下加入三乙胺(77μl，0.56mmol)。以一份加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(36mg，0.14mmol)并于20℃將溶液攪拌46小時。用二氯甲烷稀釋反應混合物并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水層。合并有機相并干燥(MgSO4)之，濃縮并進行快速層析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分離得到澄清無色的油狀所需的混合碳酸酯(16.8mg，0.014mmol，51％)。
FK506的二聚合(3至4)。在一干的1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)內裝入混合的碳酸酯(7.3mg，0.0061mmol)和乙腈(250μl，25mM終濃度)。加入三乙胺(10μl，0.075mmol)，再加入對位亞二甲苯二胺(8.3μl，0.0027mmol，加在DMF中的0.32M溶液)。反應物于20℃攪拌22小時并加入二氯甲烷(10ml)稀釋使之聚冷。用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗該溶液。分離各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水層。合并有機相并干燥(MgSO4)之、濃縮并進行快速層析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到所需的被保護的二聚體，其為澄清的無包油狀物(4.3mg，1.9μmol，70％)。
FK506二聚體的去保護(4至5)。將被保護二聚體(3.3mg，1.4μmol)放在配有旋轉葉輪的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，3mM終濃度)并在攪拌下在20℃向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher)。將此溶液室溫攪拌18小時。然后在15ml試管中在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配去保護的FK506衍生物。旋轉試管去充分混合各相，分離后用吸管除去有機相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO4)合并的有機相，濃縮并進行快速層析(1∶1∶1己烷∶THF∶乙醚至1∶1THF∶乙醚)得到所需的澄清的無色油狀二聚體產物(1.7mg，0.93μmol，65％)。
依照上述步驟，可以使用其他單胺和二胺，如芐胺(14)、辛二胺、癸二胺等。
實施例10用L-Selectride還原FK506(FK506至6)Danishefsky及其同事已證明用L-Selectride處理FK506可得到有硼酸酯接合C24和C22羥基基團的22-二氫-FK506(Colemanand Danishefsky，Heterocycles(1989)28，157-161；Fisher，et al.，J.Org.Chem.(1991)56，2900-2907)。
混合碳酸酯的制備(6至7)。10ml燒瓶裝入22-二氫-FK506-硼酸仲丁酯(125.3mg，0.144mmol)和乙腈(3.0ml，50mM終濃度)，并在室溫攪拌下加入三乙胺(200μl，1.44mmol，10當量)至澄清溶液。一次加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(184.0mg，0.719mmol)，并將此澄清溶液在室溫攪拌44小時。用乙酸乙酯(20ml)稀釋溶液，再用飽和碳酸氫鈉溶液(10ml)洗滌并分離各相。然后用乙酸乙酯(2×0ml)反萃取水相，合并有機相，干燥(MgSO4)，并對所得到油進行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需混合碳酸酯(89.0mg，0.088mmol，61％)。
FK506混合碳酸酯的二聚合(7至8)。在一干燥的1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)中裝入混合的碳酸酯(15.0mg，0.0148mmol)和二氯甲烷(500μl，30mM終濃度)。室溫攪拌溶液同時加入三乙胺(9μl，0.067mmol，10當量)再加入對亞二甲苯二胺(0.8mg，0.0059mmol)。反應在20℃下攪拌進行16小時并經用二氯甲烷(5ml)稀釋進行驟冷。用飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗該溶液。分離各相并用二氯甲烷(2×5ml)反萃取水相。合并有機相并干燥(MgSO4)，濃縮并進行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清無色油的所需二聚體(7.4mg，3.8μmol，65％)。
按照上述步驟，可以用其他單胺、二胺或三胺代替亞二甲苯二胺，例如可使用芐胺(15)、辛二胺、癸二胺(16)、雙-對位二芐胺、N-甲基二亞乙基胺、三-氨基乙胺(17)、三-氨基丙胺、1，3，5-三氨基甲基環己烷等。
實施例11FK506的氧化裂解和還原(1至9)按照Kelly(VanRheenen，et al.，Tetrahedron Lett.(1976)17，1973-1976)的方法進行鋨酸化。按照Danishefsky(Zell，etal.，J.Org.Chem.(1986)51，5032-5036)的方法裂解。按照Krishnamurthy(J.Org.Chem.，(1981)46，4628-4691)的方法進行醛還原。10ml燒瓶內裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(84.4mg，0.082mmol)、4-甲基嗎啉N-氧化物(48mg，0.41mmol，5當量)和THF(2.0ml，41mM終濃度)。通過注射器加入四氧化鋨(45μl，0.008mmol，0.1當量)。將澄清的無色溶液室溫攪拌5小時。用50％甲醇水溶液(1.0ml)稀釋反應混合物并一次加過碘酸鈉(175mg，0.82mmol，10當量)。將所得混濁混合物室混攪拌40分鐘，用乙醚(10ml)稀釋，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗滌。分離各相并用乙醚(2×5ml)反萃取水層。干燥(MgSO4)合并的有機層并用固體亞硫酸鈉(50mg)處理。然后過濾有機層，濃縮并對油狀物進行快速層析(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)處理，得到澄清的無色油，即為不穩定的醛中間體(53.6mg)。將此醛直接溶解在THF(4.0ml)中并在氮環境下冷卻到-78℃，并用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氫化鋁鋰(0.60ml，0.082mmol，0.14M的THF溶液，1.0當量)處理之。將澄清的溶液于-78℃攪拌10分鐘，再用乙醚(4ml)稀釋并加入飽和氯化銨水溶液(0.3ml)使之驟冷。將混合物溫熱至室溫并加入固體硫酸鈉以于燥之。然后過濾混合物并濃縮。對所得到的油進行快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需要的醇(39.5mg，0.038mmol，47％)。
混合碳酸酯的制備(9至10)。按Ghosh等人(TetrahedronLett.(1992)33，2781-2784)所述方法制備混合的碳酸酯。10ml燒瓶內裝入伯醇(38.2mg，0.0369mmol)和乙腈(2.0ml，10mM終濃度)，并在室溫攪拌下加入2，6-二甲基吡啶(43μl.0.37mmol，10當量)。以一份量加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(48mg，0.18mmol)并將所得溶液室溫攪拌24小時。用乙醚(10ml)稀釋反應混合物并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用乙醚(2×10ml)反應萃取水層。合并有機相并干燥(MgSO4)、濃縮之，對其進行快速層析(2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分離得到作為澄清的無色油的混合碳酸酯(32.6mg，0.028mmol，75％)。
氨基甲酸芐酯的制備(10至11)。在一干燥的、1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)內裝入混合的碳酸酯10(8.7mg，0.0074mmol)和乙腈(500μl，15mM終濃度)。于室溫下攪拌的同時加入三乙胺(10μl，0.074mmol，10當量)，然后再加入芐胺(1.6μl，0.015mmol，2當量)。室溫下將反應混合物攪拌4小時。用干燥氮氣流除去溶劑并直接對所得到的油進行快速層析，(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到澄清的無色油狀的所需被保護的單體(6.2mg，5.3μmol，72％)。
將被保護的單體(6.2mg，5.3μmol)放在配有旋轉葉輪的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，11mM終濃度)并在室溫攪拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher；終濃度3.0N)。室溫下將溶液攪拌18小時。然后使去保護的FK506衍生物在15ml試管中分配于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。旋轉試管徹底混合各相，分離后用吸管吸去有機相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相并干燥(MgSO4)合并的有機相，然后濃縮并進行快速層析(己烷∶乙酸乙酯1∶1至0∶1)，得到所需的澄清的無色油狀去保護的氨基甲酸芐酯(3.9mg，4.1μmol，78％)。
用二胺如亞二甲苯基二胺(12)、六亞甲基二胺、亞辛基二胺癸二胺(13)或其他二胺代替芐胺，制備本發明的二聚化合物。
實施例12混合的FK506(12)碳酸酯的制備。在10ml燒瓶中裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(339.5mg，0.329mmol)、4-甲基嗎啉N-氧化物(193mg，1.64mmol，5當量)、水(0.20ml)和THF(8.0ml，終濃度41mN)。通過注射器加入四氧化鋨(0.183ml，0.032mmol，0.1當量，在水中制成的0.18M溶液)。室溫下將澄清的無色溶液攪拌4.5小時。用50％含水甲醇(4.0ml)稀釋該反應物并一次加入高碘酸鈉(700mg，3.29mmol，10當量)。室溫下將混濁的混合物攪拌25分鐘，用乙醚(20ml)稀釋，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用乙醚(2×10ml)反萃取水層。用MgSO4和固體亞硫酸鈉(50mg)干燥合并的有機相。然后過濾和濃縮有機相，將所得到的醛直接溶解在THF(8.0ml)中并在氮氣環境下冷卻到-78℃，再用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氫化鋁鋰(2.35ml，0.329mmol，在THF中的0.14M溶液，1.0當量)處理。-78℃下將澄清的溶液攪拌60分鐘(以TLC法密切監測)后經用乙醚(5ml)在-78℃稀釋進行驟冷并加入飽和氯化銨水溶液(0.3ml)。使混合物溫熱至室溫并加入硫酸鈉以干燥該溶液。將混合物攪拌20分鐘，過濾、濃縮，并將所得到的油直接溶解于乙腈(10ml)中。向所得到的在CH3CN中的伯醇溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.380ml，3.3mmol，10當量)和N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(420mg，1.65mmol，5當量)。室溫下將異質混合物攪拌19小時，同時用乙醚(30ml)稀釋并用飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)洗。用乙醚(2×10ml)反萃取水相。合并有機相并干燥(MgSO4)、濃縮，并進行快速層析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)。分離得到呈澄清、無色油狀的所需的混合的碳酸酯12(217mg，0.184mmol，4步驟總產率56％)。
實施例1324，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-A的制備。(對位亞二甲苯基二胺橋接)于燥的、1ml錐形玻璃瓶內裝入混合的碳酸酯(23.9mg，0.0203mmol)和乙腈(500μl，41mM終濃度)。加入三乙胺(28μl，0.20mmol，10當量)后再加入對位亞二甲苯基二胺(46μl，0.0101mmol，在DMF中的0.22M溶液)。反應混合物在室溫下攪拌18小時，用干燥氮氣除去溶劑，并對所得的油直接進行快速層析(己烷/乙酸乙酯，3∶1至2∶1至1∶1)，分離后得到呈澄清的、無色油狀的所需被保護的二聚體(11.9mg，5.3μmol，52％)。
實施例14FK1012-A(對位亞二甲苯基二胺橋接)(13)的制備將被保護的二聚體(11.0mg，4.9μmol)放在1.5ml配有旋轉葉輪的聚丙烯管中。加入乙腈(0.50ml，10mM終濃度)，于20℃攪拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher終濃度3.0N)。于室溫下將溶液攪拌16小時。然后在15ml試管內使去保護的FK506衍生物分配在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。旋轉試管使各相充分混合，并在分離后用吸管吸除有機相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO4)合并的有機相，濃縮并對其進行快速層析(己烷/THF/乙醚1∶1∶1至THF/乙醚1∶1)制得作為澄清的無色油的FK1012-A(5.5mg，3.0μmol，63％)。
實施例1524，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-B(癸二胺橋接)的制備在一干燥的1ml錐形玻璃瓶中裝入混合的碳酸酯(53.3mg，0.0453mmol)和乙腈(2.0ml，11mM終濃度)。加入三乙胺(16μl，0.11mmol，5當量)，再加入癸二胺(61μl，0.0226mmol，在DMF中的0.37M溶液)。在室溫下將反應混合物攪拌12小時，用氮氣流除去溶劑，并對所得到的油直接進行快速層析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)，分離后得到所需的作為澄清的無色油的被保護的二聚體(18.0mg，7.8μmol，35％)。
實施例16FK1012-B(癸二胺-1，10橋接)(14)的制備。
將被保護的二聚體(18.0mg，7.8μmol)放在配有攪拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，16mM終濃度)，并在室溫下攪拌同時向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，終濃度3.6N)。將溶液于23℃攪拌17小時。然后使產物FK1012-B分配于15ml試管中的二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。充分旋轉試管以混合各相。分離后用吸管吸掉有機相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO4)合并的有機相，濃縮并進行快速層析(100％乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇20∶1)，得到作為澄清的無色油的FK1012-B(5.3mg，2.9μmol，37％)。
實施例1724，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-C(雙-對位氨基甲基苯甲酰基癸二胺橋接)的制備。
在一干燥的25ml滴形燒瓶內裝入二胺連接物(15.1mg，0.0344mmol)和1.0ml DMF。在一分立的燒瓶中，將混合的碳酸酯和三乙胺(0.100ml，0.700mmol，20當量)溶解于2.0ml二氯甲烷，然后緩慢(4×0.50ml)加到攪拌的雙-對位氨基甲基苯甲酰基癸二胺-1，10的溶液中。用二氯甲烷(2×0.50ml)洗含有混合的碳酸酯12的燒瓶內，以確保混合之碳酸酯12的完全轉移。于23℃將反應混合物攪拌16小時，用于燥氮氣流除去溶劑，并對余留的油直接進行快速層析(己烷/乙酸乙酯1∶1至1∶2)，以得到作為澄清的無色油的，所需被保護的二聚體(29.6mg，11.5μmol，34％)。
實施例18FK1012-C(15)的制備將被保護的二聚體(29.6mg，11.5μmol)(17)放在配有攪拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，23mM終濃度)，并于室溫下攪拌溶液同時加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，3.6N終濃度)。于室溫下攪拌溶液17小時。然后在15ml試管中使所需的對稱二聚體分配于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。大幅度旋轉試管以混合各相，分離后用吸管吸去有機相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO4)合并的水相，濃縮并進行快速層析(100％乙酸乙酯至15∶1乙酸乙酯/甲醇)，得到為澄清的無色油的FK1012-C(11.5mg，5.5μmol，47％)。CsA衍生物的制備實施例19MeBmt(OAc)--OH1CsA(2)。
將MeBmt(OAc)--OAc1-CsA(1)(161mg，124mmol)(參見Eberle and Nuninger，J.Org.Chem.(1992)57，2689)溶解在甲醇(10ml)中。將KOH(196mg)溶于水(8ml)。將297μlKOH溶液(.130mmol，1.05當量)加到(1)在甲醇的溶液內。在惰性氣體環境和室溫下將此新的溶液攪拌4小時，同時用乙酸(2ml)使反應驟冷。使用5cm×25cm，12μ，100A，C18柱以反相HPLC法純化反應混合物，其中于70℃用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70％乙腈/水洗脫得到112mg(72％)所需的單乙酸酯(2)。
MeBmt(OAc)--OCOIm1CsA(3)。MeBmt(OAc)--OH1-CsA(2)(57mg，45.5μmol)和羰基二咪唑(15mg，2當量，91μmol)移入50ml園底燒瓶中，并溶解在無水THF(6ml)中。加入二異丙基乙胺(32μl，4當量，182μmol)后于室溫下在旋轉蒸發器上除去溶劑。使用乙酸乙酯作為洗脫劑，在硅膠上經快速層析純化殘留物，得到45mg(73％)所需的氨基甲酸酯(3)。
三-(2-氨基乙基)胺CsA三聚體三乙酸酯(6)。將MeBmt(OAc)--OCOIm1-CsA(3)(7.5mg，5.54μmol，3.1當量)溶解于THF(100μl)。加入二異丙基乙胺(62μl，5當量，8.93μmol含有100μl胺在4ml THF中的溶液)，然后再加入三(2-氨基乙基)胺(26μl，1.79μmol，1當量含有101mg三胺在10mlTHF中的溶液)。在N2環境下將該溶液攪拌5天。蒸發反應混合物，然后使用在氯仿中的0-5％甲醇，在硅膠上經快速層析純化之，得到4.1mg所需的產物(6)。
實施例20癸二胺CsA二聚體(8)。使固體鈉金屬(200mg，過量)與無水甲醇(10ml)于0℃下反應。將癸二胺CsA二聚體二乙酸酯(5)(4.0mg)溶解在MeOH(5ml)中。向(5)的溶液中加入2.5ml NaOMe溶液。于惰性環境下室溫攪拌2.5小時后，用乙酸(2ml)快速冷卻溶液，并使用5mm×25mm，12μ，100A，C18柱在70℃用反相HPLC法純化產物，層析中用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70-95％乙腈/H2O經20分鐘洗脫得到2.5mg(60％)所需的二醇。
用0.45當量的1，10-二癸胺代替三(2-氨基乙基)胺制備癸二胺CsA二聚體二乙酸酯(5)。
實施例21對位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。
用0.45當量的對位亞二甲苯基二胺代替三(2-氨基乙基)胺制備對位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。
按照文獻中描述的下列方法，經在1(MeBmt1)位點以外的位點上連接而制備親環素的其他衍生物。
使生產菌攝入D-氨基類似物制得在特定位點上摻入的8位D-異構體類似物[參見Patchett，et al.，J.Antibiotics(1992)45，43(β-MeSO)D-Ala8-CsA)；Traber，et al.，文獻同上(1989)42，591]。經在Sac3的特定碳上使CsA多聚-鋰氧化/烷基化，以制備3位類似物，參見Wenger，Transplant Proceeding(1986)18，213，supp.5(涉及親環素橋接和活性特征，特別是D-MePhe3-CsA)；Seebach，美國專利No.4,703,033，1987年10月27日公布(涉及衍生物的制備)。
按照上述方法，可使CsA的其他天然存在的變異體多聚化，以代替環孢菌素A用于本發明。實施例21A. CsA二聚體的選擇合成MeBmt(OH)-η-OCOIm1-CsA將MeBmt(OH)-η-OH1-CsA(38mg，31μmol，1218.6g/mol)和羰基二咪唑(20mg，4當量，124μmol，162.15g/mol)移入10ml圓底燒瓶中，并溶解在無水THF(2ml)中。加入二異丙基乙胺(22μl，4當量，125μmol，129.25g/mol)后于室溫下在旋轉蒸發器上除去溶劑。使用于乙酸乙酯中的0-20％丙酮作為洗脫劑，在硅膠上經快速層析純化殘留物，得到32mg(產量為78％)白色固體。
(CsA)2亞二甲苯基二胺CsA二聚體將MeBmt(OH)-η-OCOIm1-CsA(12.5mg，9.52μmol，1312.7g/mol)溶于DCM(200μl)中，在此溶液中加入22μl(0.5當量，4.75μmol)于DMSO(0.5ml)中的亞二甲苯基二胺(14.7mg，136.2g/mol)溶液，在緩慢濃縮的氮氣環境下室溫攪拌反應混合物72小時。反應物經乙腈(2ml)稀釋，玻璃纖維過濾，反相HPLC(Beckman C18，10μ，100A，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H2O(+0.1％TFA)，30分鐘，70℃)純化可得到6.1mg(產率為49％)白色固體。 實施例21B. FK506-CsA二聚體的合成MeBmt(OAc)-η-CH2COOEt-CsA
將MeBmt(OAc)-η-Br1-CsA(26mg，～80％純度，15.7μmol，1323.57g/mol)溶于THF(500μl)中，用注射器將此溶液在15小時內加入乙基氫丙二酸(過量的)的鎂enolate之THF溶液，后者是通過將jPrMgCl(2.15ml，2.34M，乙醚中)加入于THF(4.7ml)中的乙基氫丙二酸(Lancaster，2.5mmol，332mg，132.12g/mol)的0℃溶液后再加溫至室溫而制備的。用1N HCl(50ml)使反應混合物驟冷并用乙酸乙酯(2×50ml)抽提之，用Na2SO4于燥有機層，過濾并蒸發之。
將粗產物溶于DMF(1ml)中，加入Et4NOAc·4H2O(150mg，過量)，在90℃下加熱此混合物2小時。將反應混合物冷至室溫，用H2O(50ml)稀釋并用醚(2×50ml)抽提。用Na2SO4干燥合并的有機相，過濾并蒸發之。經用75-100％乙酸乙酯/己烷洗脫，在硅膠上通過快速層析純化殘留物，可得到11.4mg(55％)白色固體。 MeBmt(OH)-η-CH2COOH1-CsA將MeBmt(OAc)-η-CH2COOEt1-CsA(11.0mg，8.27μmol，1330.76g/mol)溶于MeOH(2ml)中，并加入NaOMe(于MeOH中，1.30M，10ml)溶液中。在氮氣環境下室溫攪拌反應混合物5小時，攪拌過程中加入H2O(2ml)，再將混合物攪拌2小時。反應物經用冰醋酸(1ml)驟冷，玻璃纖維過濾，反相HPLC(Rainin C18 dynamax，5u，300A，21.4mm×250mm，20ml/min，50至90％ACN/H2O(+0.1％TFA)，30分鐘，70℃)純化，可得到5.5mg(產率為53％)白色固體。 雙-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯將雙-TBS-FK506琥珀酰亞氨基碳酸酯(也是(tbs)4-FK1012的前體)(5.8mg，1177.62g/mol，4.93μmol)溶于DCM中，在此溶液中加入N-Boc-1，6-二氨基己烷(7.25mg，過量)。在室溫下攪拌10分鐘后蒸發反應混合物，經用10至40％乙酸乙酯/己烷洗脫，通過快速層析純化可得到5.9mg(產率為94％)產物。
N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯將雙-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯(5.9mg，1278.88g/mol，4.61μmol)轉移到盛有ACN(700μl)的聚丙烯管中，再加入HF水溶液(49％，100μl)。室溫下6小時后反應完全，緩慢加入飽和的NaHCO3溶液使反應物驟冷，用飽和NaHCO3(4ml)，H2O(4ml)稀釋混合物，并用DCM(3×10ml)抽提之。用MgSO4干燥合并的有機相，過濾并蒸發之可得到3.6mg(產率為82％)粗產物。 將MeBmt(OH)-η-CH2COOH1-CsA(2.86mg，2.27μmol，1260.66g/mol)和N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯(粗品，2.16mg，2.28μmol，949.21g/mol)溶于DCM(900μl)中，在此溶液中加入127μl(3.0當量，6.8μmol)于DCM(500μl)中的BOP(11.9mg，442.5g/mol)溶液，再加入45μl(2.25當量，5.1μmol)于DCM(1.0ml)中的二異丙基乙胺溶液(20μl，d＝0.742129.25g/mol)，最后加入DMF(40μl)，在氮氣流下，室溫緩慢蒸發反應混合物達12小時，用乙腈(1ml)稀釋反應混合物，并經玻璃纖維過濾，反相HPLC(Beckman C18，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H2O，25分鐘，50℃)純化，可得到2.4mg(產率為48％)白色固體。 實施例22(A)基于結構所作的設計和FK1012“隆起塊”化合物及其有補償性突變的FKBP12的合成可以是或者已通過合成得到的FK506的C9和C10位上的取代基，與不同組的FKBP12側鏈殘基相抵觸。因此，這些配體的一類突變受體應包含不同的修飾，其中一個造成C10取代基的補償性空穴，一個則造成C9取代基的補償性空穴。對碳10進行選擇性修飾使之具有從碳上突出的N-乙酰基或N-甲酰基基團(與FK506中的羥基基團相對)。這些衍生物的橋接性質清楚地表明，C10隆起塊有效消除與固有FKBP12的結合。圖21圖解顯示了含有附加之C9隆起塊之FK506型部分的合成。使這樣的配體與本發明的接頭部分相組合即可構成制備嵌合蛋白質的HED和HOD(及拮抗劑)試劑，其中所說的嵌合蛋白質含有攜帶補償突變的相應結合區。圖21中圖解說明了包含C9和C10′位上的修飾基團的HED試劑。
因此本發明包括一類含有FK-506型部分的FK-506型化合物，所說的部分在C9和C10之一或兩者上含有選自-OR、-R、-(CO)OR、-NH(CO)H或-NH(CO)R，其中R是被取代或未被取代的，可以是直鏈、支鏈或環狀的烷基或芳基烷基的功能性基團，包括被取代或未被取代的過氧化物，以及碳酸酯。“FK506型部分”包括FK506、FK520和至少保留FK506環結構的(被取代或未被取代的)C2至C15部分，并能夠較好以低于約10-6M的Kd值與天然或被修飾的FKBP結合的其合成的或天然產生的變異體、類似物及衍生物(包括雷帕霉素)。
本發明進一步包括含有一個或多個共價結合到本發明之接頭部分上的這類FK-506型化合物的同或異二聚體及更高級低聚合體。這些FK-506型化合物的單體也是有用的，而不管是否共價結合到接頭部分上，也不管是否經過修飾進而沒有消除它們對相應FKBP的結合親和力。可以使用這些單體化合物作為低聚合拮抗劑，即作為基于象FK-506型化合物之低聚合試劑的拮抗劑。根據本發明包含它們的化合物和低聚體較好以至少0.1％，更好至少以大約1％，最好以至少大約10％的親和力，如大到FK506對FKBP12的親和力(參見Holt et al.，下文)，與天然的或優選突變的FKBP結合。
可用基于結構的，位點特異性的或隨機的誘變方法制得本發明的這些和其他配體的受體區域。我們研究了一個FKBP12部分的家族，其含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸代替Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99中的一個或多個氨基酸，以作為包括C9和/或C10位修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區域。我們尤其期望使用與FK506型和FK520型配體結合的FKBP，FKBP中具有小的置換，如Gly或Ala置換Asp37，而配體在C10位有取代基(如-NHCOR，其中R是烷基，優選為低級烷基如甲基或-NHCHO)，還期望使用在C9位含有置換(如Oxazalines或亞胺類)的FK506型和FK520型配體結合的FKBP，FKBP中含有小的置換，如Gly或Ala置換Phe36，Phe99和Tyr26 。
可使用大引物誘變法(參見Sakar and Sommer，Bio Techniques84(1990)404-407)進行位點特異性誘變。用序列酶(Sequenase)試劑盒進行cDNA序列測定。可在包含在大腸桿菌菌株XKA90中的質粒pHN1+中進行突變體FKBP12的表達，因為許多FKBP12突變體均已在該系統中獲得了有效地表達。可按已描述過的方法(例如參見Aldape et al.，J.Biol.Chem.267，23(1992)16029-32和Park et al.，J.Biol.Chem.267，5(1992)3316-3324)，通過DE52陰離子交換樹對脂進行分級分離，然后在Sepharose柱上進行分子篩分離以方便地純化突變體蛋白質。可按兩種方法之一很容易地確定結合常數。如果突變的FKP保留有足夠的異構酶(rotamase)活性，可利用標準異構酶檢測法(如參見Galat et al.，Biochemistry 31(1992)2427-2434)。否則可使用我們以前用于檢測FKBP和親環素的LH20樹脂和放射標記的3H2-二氫FK506及3H2-二氫CsA，對突變的FKBP12進行結合試驗(Bierer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，4(1993)555-60)。
(B)使用酵母二雜種系統選擇隆起塊-FK506的FKBP12中的補償突變得到包括FKBP12的受體蛋白質或區域之變異體的一種方法是酵母“二雜種”或“相互作用陷阱”系統。已使用二雜種系統確定彼此相互作用的蛋白質。由融合到轉錄激活區上靶蛋白質組成的“鉺”融合蛋白質與融合到DNA結合區上的潛在的“鉤”的cDNA庫共表達。根據受體基因產物(其合成需要連接DNA結合和激活區)的出現來確定蛋白質-蛋白質(鉺-鉤)相互作用。本文提到的酵母二雜種系統最初是由Elledge和其同事共同建立的(Durfee et al.，Genes&Development 74(1993)555-69和Harper et al.，Cell 75，4(1993)805-816)。
因為二雜種系統不能提供對涉及小分子有機配體的受體-配體相互作用的深入了解，所以我們已發展了一種新的、FK1012可誘導的轉錄激活系統(見下文所述)。使用該系統可以擴展二雜種系統，從而能夠深入研究小分子(例如本發明的FK506或FK1012或FK506型分子)。首先產生具有區域定位于FK506的C9和C10周圍位點處之突變的FKBP(“鉤”)的cDNA庫。對于“鉺”來說可采取兩種不同的策略。第一個是利用FK506與FKBP12結合的能力并造成一個與calcineurin結合的復合表面。因此序列特異性轉錄激活物由下列部分組成DNA結合區-突變FKBP12-隆起塊FK506-calcineurinA-激活區(其中“-”是指非共價結合相互作用)。第二個策略利用FK1012同時與二種FKBP結合的能力。可使用FK1012的HED變體篩選下列集合體DNA結合區-突變FKBP12-隆起塊FK506-正常FK506-野生型FKBP12-激活區。
1.作為“鉺”的calcineurin-Gal4激活區融合體已構建了含有Gal4激活區和calcineurin A亞單位融合構建體的pSE1107的衍生物。已使用二雜種系統制出calcineurin的FKBP-FK506結合位點圖譜，研究證實了其以所提出的方式作為“鉺”的能力。
2.作為“鉺”的hFKBP12-Gal4激活區融合體作為包括完整開放讀碼的EcoRI-HindIII片段，切下hFKBP12cDNA，修成平頭并與已修成平頭的pSE1107的XhoI位點連接，以產生全長度hFKBP-Ga14激活區蛋白質融合體。
3.突變體hFKBP12cDNA庫可用EcoRI和HindIII消化hFKBP12，修成平頭并克隆到已用NcoI切割并修成平頭的pAS1(Durfeeet al，文獻同上)中。進一步用NdeI消化該質粒以除去pAS1之多聚接頭序列中NdeI位點和hFKBP12之5′末端間的NdeI片段，并再連接之，從而產生hFKBP12-Gal4DNA結合區蛋白質融合體。用引物#11206和#11210再次擴增hFKBP。引物表11206 NdeI5NdFK 5′-GGAATTC CAT ATG GGC GTG CAG G-3′H M G V QD11207 SmoI35mFK375′-CTGTC CCG GGA NNN NNN NNN TTT CTT TCC ATC TTC AAG C-R S X X X K K G D E L11208 SmaI35mFK275′-CTGTC CCG GGA GGA ATC AAA TTT CTT TCC ATC TTC AAG CAR S S D F K K G D E L MNNN NNN NNN GTG CAC CAC GCA GG-3′X X X H V V C11209 BomHI3BmFK985′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG CTC CAC ATC NNNEND E L K L L E V D XNNN NNN AGT GGC ATG TGG-3′X X T A H P11210 BamHI3BmFK 5′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG C-3′5ND E L K L L引物表用于構建區域定位的hFKBP 12cDNA文庫的引物，用以篩選補償性突變。
然后使用下面列出的在限定的位置上含有hFKBP之隨機化突變序列的引物，以聚合酶鏈反應法制備突變體hFKBP 12cDNA片段，并將其插入Ga l4DNA結合區-hFKBP(NdeI/BamHI)構建體中。
4.酵母菌株釀酒酵母Y153攜帶兩個被整合到基因組中并由Gal4啟動子(Durfea，文獻同上)驅動的可選擇標志基因(his3/β-半乳糖苷酶)。
使用Calcineurin-Gal4激活區域作為“鉺”。FKBP12-FK506復合物以高親和力與calcineurin-一種2B型磷酸酶蛋白質相結合。因為我們使用C9或C10有隆起的配體作為二雜種系統中的橋，所以只有含補償突變的cDNA庫中的FKBP才產生轉錄激活劑。為方便起見，可以制備各含有8,000個突變FKBP12的至少三個不同的文庫(使用引物表中的引物11207-11209)。經檢查FKBP12-FK506結構來選擇隨機化的位點，此提示突變的殘基群可允許令人討厭的C9或C10取代基結合于有隆起基團的FK506上。然后使用C9和C10帶隆起基團的FK506分別篩選各文庫。可根據宿主酵母在his滴落(drop-out)培養基上生長的能力及β-半乳糖苷酶基因的表達確定帶隆起基因之FK506與補償性hFKBP12突變體的相互作用。因為這一選擇取決于帶隆起基因之FK506的存在，可使用添加或未添加帶隆起之基團FK506配體的復制板，經扣除篩選(substractive screening)排除假陽性。
使用hFKBP12-Gal4激活區作為“鉺”。使用calcineurin A-Gal4激活區篩選hFKBP12突變cDNA庫是-種鑒定FKBP12上補償突變的簡單方法。但是，使帶隆起基團的FK506與hFKBP12結合的突變可破壞突變FKBP12-帶隆起FK506復合物與calcineurin間的相互關系。如果用calcineurin作為鉺的初始篩選有錯誤，則可以使用野生型hFKBP12-Gal4激活區代替之。可以合成包括固有FK506-帶隆起部分的FK506(圖16)組成的FK1012HED試劑并用作“鉤”。FK1012的FK506部分可以結合FKBP12-Gal4激活區。FKBP12的帶隆起FK506部分與FKBP12補償的補償突變體間的相互作用，可使宿主酵母生長在his滴落培養基上生長并表達β-半乳糖苷酶。以這種方式，單獨基于hFKBP12突變體與帶隆起基團的FK506反應的能力進行選擇。可使用同樣的扣除篩選策略排除假陽性。
除了較早討論的體外結合試驗外，還可以使用體內試驗確定帶隆起之FK506與補償性hFKBP12突變體的結合親和力。在酵母二雜種系統中，可根據“鉺”和“捕獲物”間相互作用的程度來確定β-gal活性。因此，可根據在不同的HED(天然FK506-帶隆起的FK506)濃度下由宿主酵母產生的相應β-半乳糖苷酶活性來估計帶隆起之FK506和補償性FKBP12突變體間的親和力。
使用同樣的策略，可以以低親和力補償性FKBP12突變體作為模板產生涉及其他隆起塊接觸殘基的附加隨機化突變體FKBP12cDNA文庫，并進行相似的篩選。
對高親和力補償性FKBP突變的噬菌體展開篩選法(displayscreening)。有些隆起塊FK506的高親和力hFKBP12突變體可在蛋白質的不連續區域含有幾個結合的點突變。含有適當結合之突變的文庫，對于酵母二雜種系統的能力來說可能是太大了(例如＞108個突變)。使用噬菌體作為顯露整個功能性蛋白質的載體，將會大大提高篩選大數目突變的能力(如參見Bass et al，ProteinsStructure，Function&Genetics 84(1990)309-14；McCafferty et al.Nature 348，6301(1990)552-4和Hoogenboom，Nuci.Acids Res.19，15(1991)4133-7)。如果不能用酵母二雜種系統鑒定所需的高親和力補償性突變體，則可以用噬菌體載體在hFKBP12上造成大數目的組合突變。可以用帶隆起之FK506-Sepharose作為親和性基質(其可按我們按原來合成基于FK506的親和基質的相似方法合成，參見Fretz et al，J.Am.Chem.Soc.113，4(1991)1409-1411)，篩選突變的hFKBP12融合噬菌體。重復進行結合和噬菌體擴增循環即可鑒定高親和力補償性突變體。
(C)“帶隆起的(CsA)2s”的合成MeVal(11)CsA的修飾如上文詳述的，我們已證明在細胞死亡信號發生途徑相關的解決方案中，使用親環素作為二聚合區和(CsA)2作為HOD試劑的可行性。然而，為了使(CsA)2試劑的細胞活性最佳化，應依據如就FK1012所描述的相似策略。因此，在應用中應優選經過修飾的(產生隆起基團的)基于CsA的低聚合試劑，此時特別希望該試劑將能夠從內源性親環素中區別出它的靶，即人工蛋白質構建體。
本發明的一類被修飾的CsA衍生物是CsA類似物，其中(a)NMeVal 11被NMePhe(其可以是被取代或未被取代的)或NMeThr(其可以是未被取代或在蘇氨酸β羥基基團上被取代的)取代，或(b)NMeVal 11的前S甲基基團被至少有2個碳原子，較好有3個或更多個碳原子的大基團取代，所說的取代基可以是直鏈、分支鏈的和/或含有環部分的，并可以是烷基(乙基，或更好是丙基、丁基包括叔丁基等)、芳基或芳基烷基。這些化合物包括在MeVal 11的位置上包含NMeLeu、NMeIle、NMePhe或特別是非天然的NMe[βMePhe]的CsA類似物。“(b)”CsA化合物是有結構式2的化合物，其中R代表如上所述的功能性基團。
本發明包括其中含有一個或多個這樣的CsA類似物的同和異二聚體及更高級低聚體。優選本發明的包含它們的化合物和寡聚體以至少0.1％，較好至少約1％，更好至少約10％的親和力，如大至CsA對親環素的親和力與天然的，或較好是突變的親環素蛋白質的結合。
可以使用兩步驟策略從CsA開始制備經修飾的[MeVal11]CsA衍生物。第一步中，從大環上去掉殘基MeVal11。第二步中，在(在先的)MeVal11位點上引入選擇的氨基酸并使線性肽環化。與總體合成相比較，該策略的優點是易于通向幾種經修飾的[MeVal11]CsA衍生物。合成流程如下 為了區分酰胺鍵，已在MeBmt1的氨基和羥基基團間實現了N，O移換，從而得到TsoCsA(Ruegger et al，Helv.Chim.Acta 59，4(1976)1075-92)(參見上列流程)。反應在甲磺酸存在下于THF中進行(Oliyai et al，Pharm.Res.95(1992)617-22)。以一罐法在吡啶和乙酐存在下用乙酰基團保護游離胺。N-乙酰基保護的lsoCsA的總產率為90％。然后于N-甲基酰胺鍵存在下，例如使用DIBAL-H選擇性地還原酯MeBmt1-MeVal11鍵。將所得到的二醇轉化成有另一個酸誘導的N，O移換的相應的二酯。如此將制得通過用含水堿水解新形成的酯除去的N-乙酰基團和MeVal11殘基。
在保護游離氨基基團之后，例如用PyBrop偶聯劑引入新的氨基酸殘基。在DMAP存在下用BOP使線性肽去保護并環化(A1berg andSchreiber，Science262，5131(1993)248-250)以完成2的合成。用估測FK506和FK1012的同樣方法估測帶隆起的CsA與親環素的結合親和力。一旦鑒定了有補償性突變的親環素，即可按照以前描述過的方法合成帶隆起基因的(CsA)2HED和HOD試劑。其中特別有用的是可形成二聚體的帶隆起的CsA化合物，其本身可按1∶2化學計算量與親環素蛋白質結合。可以設計至少含有一個這樣的CsA或被修飾的CsA部分的同二聚體和更高級同低聚體、異二聚體和更高級異低聚體，并使用為FK1012A和(CsA)2而建立的方法估計之，同時按研究FK1012的相以方法使接頭元件最佳化。
現在有可能通過在配體上容納額外的大基團制備結合我們的11位CsA變異體(2)突變的親環素。可以通過在FK1012研究中所述的基于結構的位點特異性和隨機誘變/篩選方法鑒定帶有這些補償性突變的親環素。
上述結果表明，本方法和組合物在生產野生型變種細胞中的廣泛通用性。利用本發明的構建體，可將細胞用于治療目的，其中細胞可在使用前保持無活性狀態，并在給予一種安全的藥物后使之被激活。因為細胞在宿主體內有野生品種的生活史，所以有機會處理慢性和急性病癥以提供短期或長期保護作用。另外，可以提供將被導向特定部位，如解剖部位或功能部位的細胞，并借以在該部位提供治療效果。
可提供將導致分泌各種品種蛋白質的細胞，其可用于糾正缺陷或抑制不希望的后果，如激活溶胞性細胞、失活有害因子、殺死受限制的細胞群體等。由于細胞在限定的期間內存在于宿主中，所以給予足可導致細胞在宿主中的迅速反應之劑量的藥物即很容易將細胞激活。可以提供使其中被表達的嵌合受體存在于細胞內的細胞，故可避免由于細胞表面上的外來蛋白質引起的免疫反應。此外，細胞內嵌合受體蛋白質在為配體結合后的有效信號轉導提供了條件，這顯然比在細胞外受體區上的受體結合更為有效。
使用與嵌合膜結合受體結合的相對簡單的分子，導致有用產物的表達或抑制該產物的表達，從而可提供細胞治療效果。可以以多種途徑使用可安全給藥的化合物，并可保證出現很特異的反應，以致不會攪亂體內平衡。
本說明書中列出的所有出版物和專利申請都摻入本文作參考文獻，如同個別出版物或專利申請特別地和各自地指出其列為本文參考文獻一樣。
雖然為了清楚了解本發明的目的在一定程度上詳細舉例描述了本發明，但對本發明技術教導的某些沒有超出待批權利要求書之精神實質或范圍的改變和改動，對于本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。
權利要求
1.編碼嵌合蛋白質的DNA構建體，所說的嵌合蛋白質包括(a)至少一個能夠與所選配體結合的受體區域；和(b)異源蛋白質區域，在細胞暴露于配體之后，它能啟動含有所說嵌合蛋白質的細胞的程序化死亡；所說配體能夠結合兩個或更多個嵌合蛋白質分子。
2.根據權利要求1的DNA構建體，其中嵌合蛋白質進一步包括能夠將嵌合蛋白質導向預期之細胞對應部分的細胞內靶向區域。
3.根據權利要求2的DNA構建體，其中細胞內靶向區域包括分泌性前導序列、跨膜序列區域、膜結合區域或者指導蛋白質與泡囊或與核聯系的序列。
4.根據權利要求1的DNA構建體，其中嵌合蛋白質與所選配體結合的Kd值小于或等于大約10-6M。
5.根據權利要求1的DNA構建體，其中所選配體的分子量小于約5kDa。
6.根據權利要求1的DNA構建體，其中異源蛋白質區域含有人Fas或人TNFα受體的胞質區域。
7.根據權利要求1-6中任一項的DNA構建體，其中嵌合蛋白質能結合于FK506型配體，環孢菌素A型配體，四環素或類固醇配體。
8.DNA載體，其包含根據權利要求1-7中任何一項的DNA構建體和允許將DNA構建體轉染到宿主細胞中并選擇含有該構建體之轉染體的可選擇標志。
9.根據權利要求8的DNA載體，其中載體是病毒載體。
10.根據權利要求9的病毒載體，其為腺病毒載體、腺相關病毒載體或反轉錄病毒載體。
11.由根據權利要求1-7中任何一項的DNA構建體編碼的嵌合蛋白質。
12.含有并能夠表達至少一種根據權利要求1-7中任何一項之DNA構建體的細胞。
13.根據權利要求12的細胞，將之與所選配體接觸后可變為程序化死亡。
14.根據權利要求12的細胞，其為哺乳動物細胞。
15.根據權利要求13的細胞，其進一步含有(a)編碼嵌合蛋白質的DNA構建體，其中嵌合蛋白質包括(i)至少一個能夠與第二個所選配體結合的受體區域和(ii)另一個蛋白區域，它對于所述受體區域來說是異源的，但當在與一個或多個其他相似區域低聚合后能夠激發處于對所說的低聚合起反應的轉錄控制元件之轉錄控制下的靶基因轉錄的活化；和(b)處于對所說的低聚合有反應的轉錄控制元件之表達控制下的靶基因；將此細胞暴露于所說第二個所選配體后可表達靶基因。
16.根據權利要求13的細胞，其含有編碼下列蛋白質的系列DNA構建體；(a)含有DNA結合區和至少一個能夠與第一個所選配體部分結合的受體區的第一種另外的嵌合蛋白質；和(b)含有轉錄激活區和至少一個能夠與第二種選擇的配體(其可以相同或不同于第一種選擇的配體部分)結合之受體區域的第二種另外的嵌合蛋白質；和以及編碼靶基因的第二個DNA構建體，所說的靶基因處于異源轉錄控制序列的轉錄控制之下，而所說的轉錄控制序列與DNA結合區結合并對轉錄激活區有反應；所說的細胞在接觸到含有選擇之配體部分的物質后即表達靶基因。
17.使用能啟動根據權利要求13的基因工程細胞程序化死亡的配體以制備消除所說細胞群體的藥用組合物的用途，所說的配體具有下列結構式接頭-{rbm1，rbm2，…rbmn}其中n是2至大約5的整數，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或不同的并能夠與嵌合蛋白質結合的受體結合部分，所說的rbm部分被共價結合到接頭部分上，后者則是能夠與兩個或多個rbm部分共價連接(“-”)的雙或多功能分子。
18.根據權利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細胞群體的藥用組合物，其中配體具有小于約5kDa的分子量。
19.根據權利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細胞群體的藥用組合物，其中配體含有FK506型部分、環孢菌素型部分、類固醇或四環素。
20.根據權利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細胞群體的藥用組合物，其中配體以大于約10-5M的Kd值結合于天然存在的受體上。
21.根據權利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細胞群體的藥用組合物，其中配體包含FK506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或兩者上被修飾之衍生物的分子。
22.根據權利要求20的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細胞群體的藥用組合物，其中配體含有接頭部分，該部分包括C2-C20亞烷基、C4-C18氮雜亞烷基、C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基、C6-C18亞芳基、C8-C24芳二亞烷基(ardialkylene)或C8-C36雙-羧酰氨基亞烷基部分。
23.消除根據權利要求13的基因工程細胞群體的方法，包括將細胞暴露于有效量的能與嵌合蛋白質結合的配體中以導致發動細胞死亡。
24.根據權利要求23的方法，其中細胞生長于培養基中，并經向培養基中加入配體而使細胞與配體接觸。
25.根據權利要求23的方法，其中細胞存在于宿主生物體內，并經給宿主生物體施用配體而使細胞與配體接觸。
26.根據權利要求25的方法，其中宿主生物體是哺乳動物，并且配體經口服、口內、舌下、透皮、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內及吸入途徑，在其適當載體中給藥。
27.產生能被有選擇地殺死之細胞的方法，包括將根據權利要求1-7中任一項的DNA構建體引入宿主細胞。
28.根據權利要求2 7的方法，進一步包括選擇含有引入DNA構建體的那些細胞。
29.包含至少一種根據權利要求1-7中任何一項的DNA構建體的試劑盒。
30.根據權利要求29的試劑盒，其還包含由DNA構建體編碼的一種或多種嵌合蛋白質與之結合的配體。
31.根據權利要求29的試劑盒，其還包含作為配體-嵌合蛋白質結合之拮抗劑的單體配體試劑。
32.含有根據權利要求12-16中任一項的細胞的宿主生物體。
33.根據權利要求32的宿主生物體，其是植物或動物生物體。
34.根據權利要求33的動物，其為蠕蟲、昆蟲或哺乳動物。
35.根據權利要求34的哺乳動物，其為小鼠或其他嚙齒動物或人。
全文摘要
我們開發了一種調節(可誘導的)細胞內蛋白質二聚或低聚合的通用方法，并公開了使用此方法以可調節地啟動基因工程細胞中細胞特異性的細胞程序死亡(程序化的細胞死亡)的方法和材料。
文檔編號C12N15/00GK1130401SQ9419325
公開日1996年9月4日 申請日期1994年7月18日 優先權日1993年7月16日
發明者G·R·克拉特里, S·L·施賴伯, D·M·施潘塞, T·J·萬列斯, P·貝肖 申請人:萊蘭斯坦福初級大學評議會, 哈佛大學校長及研究員協會