專利名稱：雷怕霉素檢測法的制作方法
技術領域：
本發明涉及雷怕霉素及其衍生物的單克隆抗體，它們可用于例如檢測血藥濃度的檢測試劑盒中。
雷怕霉素是由吸水鏈霉菌產生的大環內酯抗菌素，有廣泛的制藥學用途，尤其可作為一種免疫抑制劑，例如可應用于治療和預防器官移植排斥和自身免疫疾病。但是，雷怕霉素在大劑量時會有副作用，并且它的生物利用度在一定程度上可變。在用雷怕霉素治療的病人中，為了能夠及時調整劑量以保持有足夠藥理作用的最低雷怕霉素含量，以及避免副作用產生的任何過度危害，監測患者血液中雷怕霉素濃度就變得尤為重要。但在臨床中缺少能夠快速簡易操作的靈敏、可靠的檢測方法，仍是目前雷怕霉素藥物研究的一個主要障礙。
以前有關臨床檢測雷怕霉素的檢測試劑盒的研究都不太成功。例如，EP041795描述了一種微生物學檢測法，其中雷怕霉素濃度由其抗真菌活性函數來測定。WO92/02946提供了一種間接測定雷怕霉素的檢測系統，即測定其與嗜巨噬因子(macrophilin)間的競爭結合。這兩種測定方法都繁瑣且不太靈敏。更重要的是，實驗條件稍有不同，這兩種方法的結果都會有很大變化，難以在不同醫院間進行實驗結果的比較。
在此之前還沒有關于識別雷怕霉素的單克隆抗體的報導。由于雷怕霉素不是致免疫的，而且它自身是極強的免疫抑制劑，因此制備雷怕霉素的單克隆抗體非常困難。此外，由于在文獻中雷怕霉素的代謝產物沒有明顯的特征，因此我們就很難發現能夠區分雷怕霉素及其代謝產物的單克隆抗體。
本發明提供的單克隆抗體對雷怕霉素有高度敏感性。用一個新的致免疫的軛合物進行接種可制得本發明的抗體，該致免疫的軛合物包括與致免疫蛋白連接的新的雷怕霉素衍生物。使用這些抗體的檢測試劑盒適合于臨床應用，它可以提供比以前更精確、可重復的結果。該抗體還可用于雷怕霉素的純化和分離。
提供雷怕霉素的免疫抑制衍生物的檢測方法面臨同樣的困難。讓人特別感興趣的是雷怕霉素的40-氧-衍生物，即雷怕霉素環己基環(第40位)上羥基的氧被取代，如在US5285389和PCT/EP93/02604(氧-芳基雷怕霉素和氧-烷基雷怕霉素)中所述(在此引入作為參考)；尤其是40-氧-烷基化的雷怕霉素，其中40-氧-取代基為烷基或取代烷基，如羥烷基、羥烷氧烷基、酰氨烷基、氧烷基、這里“烷基”指支鏈或直鏈的C1-6烷基，優選C1-3烷基，其中碳鏈可被醚(-O-)鍵任意斷開；最為特別的是40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素、40-氧-(3-羥丙基)-雷怕霉素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷怕霉素，和40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷怕霉素。因此，本發明的另一目的是提供上述40-氧衍生物的單克隆抗體。這些抗體可用于診斷分析，還可用于純化和生產上述雷怕霉素衍生物。
用于制備本發明新的致免疫軛合物的新的活化的雷怕霉素衍生物是通過雷怕霉素上的一個羥基基團(優選位于雷怕霉素環己基部分(第40位)上的羥基或第28位上的羥基)使雷怕霉素與一個活化的偶合基團[即該活化的偶合基團能夠直接與蛋白質反應生成共價鍵，而不需要應用偶合劑(如碳化二亞胺試劑)]，以實現、引起或促進與蛋白質的反應。該活化的偶合基團最好有一個活化的酯或羧基基團，即，式-CO-O-X，其中X是一個羧基活化的基團，如對-或鄰-硝基苯基，1-苯并三唑，五氟苯基或尤其是N-琥珀酰亞胺基。其它合適的活化偶合基團有例如i)可與雷怕霉素連接的活化的聯硫基，如式-S-S-Z，其中Z是聯硫基活化的基團，如2-吡啶基，或ii)環氧基，如環氧甲基。活化的偶合基團可以通過酯、醚、酰胺、硫或其它合適的鍵與雷怕霉素連接，但優選酯鍵。最優選的是帶有雙酯部分的活化的偶合基團，如琥珀酰，它的一端通過酯鍵與雷怕霉素連接，另一端有一活化的酯或活化的羧基。
本發明優選的雷怕霉素衍生物是按以下反應I得到的式III 反應I其中式I為雷怕霉素，a)在適當的條件下使式I與-酰化劑反應，并且如果需要脫去保護，得到式II的雷怕霉素，其中y是間隔基基團，優選低級亞烷基，如C2-6亞烷基，最好是亞乙基，反應a)中的酰化劑可選用例如環酐或二羧酸(任意地以半-氧-保護的形式)。b)式II的雷怕霉素與-羧基活化的基團反應，生成式III活化的雷怕霉素，其中羧基活化基團可為HO-X，這里X如前述定義。
按照反應II可得到下式III’的琥珀酰亞氨基衍生物，它是優選的雷怕霉素活化衍生物， 反應II其中式I為雷怕霉素，反應II為a)在DMAP和吡啶存在下，用琥珀酐將雷怕霉素氧-酰化，得到式II’的雷怕霉素半琥珀酸酯(40-氧-(3-羧基)丙酰基-雷怕霉素)；b)在EDC、Et3N和CH2Cl2存在下，用N-羥基琥珀酰亞胺活化式II’，得到式III’的40-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰雷怕霉素，該反應在實施例1中有詳盡描述。用半抗原制備的單克隆抗體通常會在雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧-衍生物(如前所述)間發生交叉反應，該半抗原常被連接在第40位上。如以下所述，這些單隆抗體可被選為識別雷怕霉素或雷怕霉素40-氧-衍生物的特殊部位(如在結合區或效應區)的化合物。
在某些情況下，要求單隆抗體對環己基部份的修飾有較好的敏感性，如為了區分雷怕霉素和雷怕霉素40-氧-衍生物，或為了確定環己基部份的代謝產物。這時，半抗原優選連接在28-氧位置，而不是連接在40-氧位置。例如，式A的雷怕霉素衍生物， 式A按照反應I進行反應(如果需要，脫去保護)，生成類似的28-氧活化的半抗原，如式B化合物； 式B式A中R是氧-保護基團或如上所述的取代基，如羥烷基，羥烷氧烷基，酰氨烷基或氨烷基，它們任選被保護的形式，式B中R1是氫或如前所述的氧-取代基，如羥烷基，羥烷氧烷基、酰氨烷基或氨烷基，Y是如前所述的連接基團，X是前述的羧基活化基團。制備上述半抗原時(其中R是氧-保護基團或氧-被護的取代基)，酰化劑優選以半-氧被護形式的二羧酸，這樣酰化過后，兩個氧-保護基團在加入羧基活化基團之前可以一步脫去。例如，能夠識別40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素單克隆抗體的半抗原可以按反應III制備保護伯羥基，用半-氧被護形式的二羧酸酰化第28位上的羥基，脫去保護，活化羧基。 反應III
同樣地，雷怕霉素自身也可以在第28-氧位而不是40-氧位被活化，其過程如反應IV所示保護C40羥基的氧，用半-氧-被護的二羧酸酰化28位的羥基，脫去保護，活化羧基。 反應IV
然后將活化的雷怕霉素或雷怕霉素衍生物連接于一個合適的致免疫蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，鑰孔血藍素(KLH)等)上，以便形成致免疫軛合物。單克隆抗體可用常規方法制備，例如將此新的致免疫軛合物給予某種適合的動物，以產生致免疫的激發作用，收集被這種軛合物致敏的產生抗體的細胞；將產生該抗體的活存的細胞與合適的骨髓瘤細胞融合，從如此建立并選擇的存活細胞系中收集單克隆抗體。
然后本發明的抗體可用于適合的檢測方法中。熟悉本專業的技術人員都清楚有幾種可能的方法供選擇。一種方法為競爭性測定法，需使用抗體和一個雷怕霉素示蹤物如其中微量滴定板用抗體包被，在存在和不存在被認為可能含有雷怕霉素的待測液(如病人的血漿或全血)的情況下，暴露于一個競爭物，這里競爭物是一個被標記的雷怕霉素(如用熒光或放射性同位素標記，尤其是可用生物素標記)。清洗滴定板，測定結合于抗體的被標記的競爭物的量，這個量與待測液中雷怕霉素含量成反比。另一種方法是ELISA法，該法需用抗體、雷怕霉素蛋白軛合物和一個被標記的(例如酶標記的)示蹤抗體，并且該抗體能識別小鼠IgG，例如其中微量滴定板可用雷怕霉素-蛋白軛合物(如前所述的含有連接于雷怕霉素或40-氧-烷基化雷怕霉素的一個蛋白質的致免疫軛合物)包被。然后在存在和不存在待測液的情況下暴露于抗體，清洗滴定板，結合于雷怕霉素軛合物的抗體通過把示蹤抗體結合在已結合于雷怕霉素軛合物的抗體上來測定。同樣，結合抗體的量與待測液中雷怕霉素的量成反比例。在上述兩種方法中，測定均可用含有己知濃度雷怕霉素的待測液來使之標準化。本發明提供的檢測試劑盒包括(i)本發明的單克隆抗體，最好以冷凍干燥的形式或包被在微量滴定板上，(ii)還可選擇地包括一個雷怕霉素蛋白軛合物，(而此軛合物也可以是將其包被在滴定板上)，和/或一個被標記的雷怕霉素衍生物，(iii)任選一個進而還可選擇地包括一個用于標準化的雷怕霉素溶液和使用說明。這樣一個試劑盒可以測定低于10ng/ml濃度的雷怕霉素，例如低于1ng/ml，甚至低至0.25-0.5ng/ml 。
本發明的抗體還可能具有對免疫抑制的子囊菌素(如KF-506)相對結合親合性的特征。FK-506是一個具有免疫抑制作用的大環內酯，它與雷怕霉素在結合區有一定的結構相似性。雷怕霉素族(如雷怕霉素及其免疫抑制衍生物)和FK-506都可與嗜巨噬因子(FKBP)結合，對于兩者，據信與嗜巨噬因子結合對其免疫抑制活性是一個必要的但不充分的條件。但是雷怕霉素的效應區與FK-506有很大的差別，而且確實這二個化合物具有完全不同的作用機理。(例如FK-506似乎主要通過抑制IL-2轉錄而引起免疫抑制作用，而雷怕霉素對IL-2轉錄沒有明顯的作用。)因此，雷怕霉素的特征可能是具有一個FKBP結合區和一個效應區，這樣就可以將在FKBP結合區被修飾的雷怕霉素代謝產物和在效應區被修飾的雷怕霉素代謝產物區分開來，區分方法可通過用本發明的單克隆抗體測定本發明的單克隆抗體與KF-506的相對交叉反應性(例如用競爭性ELISA法測定交叉反應性)具有高程度交叉反應性(例如大于50％)的單克隆抗體可識別與FK-506類似的雷怕霉素FKBP結合區的抗原決定基。具有低程度交叉反應性(例如小于20％，或者小于10％)的單克隆抗體可識別雷怕霉素所特有的效應區的抗原決定基。
本發明的抗體還可以根據它們區分雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧衍生物(如前所述)的能力來篩選和鑒定。在此希望抗體不能識別雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧衍生物，可選擇在雷怕霉素和其40-氧衍生物間至少有70％(最好大于90％)交叉反應性的抗體。在這種情況下，用于制備單克隆抗體的半抗原最好是40-氧活化的雷怕霉素，例如反應I中的式III。在此希望抗體能識別雷怕霉素及其40-氧衍生物或其代謝產物，可選擇具有低于30％(最好選低于10％)的交叉反應性的抗體。這樣，用于制備抗體的半抗原最好是28-氧-活化的雷怕霉素或雷怕霉素衍生物，例如式B。實施例1. 40-氧-活化的雷怕霉素的制備a)雷怕霉素的40-氧-半琥珀酸酯的制備向1.5g(1.64mmol)雷怕霉素和0.577g(5.77mmol)琥珀酐的12ml吡啶的攪拌溶液中，加入195mg(1.64mmol)DMAP。生成的混合物在環境溫度下攪拌19小時，減壓濃縮。剩余物溶于乙酸乙酯中，并用水洗滌3次。有機溶液用無水硫酸鈉干燥過濾并減壓濃縮。剩余物用硅膠柱(9∶1 CH2Cl2-MeOH)層析純化。收集含有產品的部分，并再次用硅膠柱層析(19∶1 CH2Cl2-MeOH)純化。減壓除去溶劑，得到40-氧-(3-羧基)-丙酰基-雷怕霉素(即上述式II’所示的雷怕霉素半琥珀酸酯)，為一白色泡沫狀物質。有以下特征光譜學性質1H NMR(CDCl3)δ2.68(7H，m，H33，H25和O2CCH2CH2CO2H)，3.14(3H，s和m，OCH3和H39)，3.34(3H，s，OCH3)，338(3H，s，OCH3)，4.68(1H，m，H4O)，4.72(1H，broad s，10-OH)；MS(FAB)m/z1036([M＋Na]+)，982([M-CH3O]+)，964([M- (CH3O＋H2O)]+)，946([M-(CH3O＋2H2O)]+)。
b)40-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰雷怕霉素的制備向120mg(0.118mmol)雷怕霉素半琥珀酸酯(步驟a)中的產物)，16.5μL(0.118mmol)Et3N和22.7mg(0.118mmol)EDC的8mLCH2Cl2的攪拌溶液中，加入13.6mg(0.118mmol)N-羥基琥珀酰亞胺。生成的混合物在室溫下攪拌18小時，用乙酸乙酯稀釋，用水洗滌2次。有機溶液用無水硫酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮。用硅膠柱層析(乙酸乙酯)純化剩余物，得到40-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰-雷怕霉素(即反應II中的式III’)，為一白色泡沫狀物質，有以下特征光譜學性質1H NMR(DMSO)δ2.67(2H，t，O2CCH2CH2CO2)，2.81(7H，s，CH3O和琥珀酰亞胺CH2)，2.92(2H，t，O2CCH2CH2CO2)，4.55(1H，m，H40)，5.26(1H，d，28-OH)，6.43(1H，s，1O-OH)；MS(FAB)m/z1133([M＋Na]+)，1111([M＋H]+)，1092([M-H2O]+)，1079([M-CH3O]+)，1061((M-(CH3O＋H2O)]+)，1043([M-(CH3O＋2H2O)]+).實施例2.雷怕霉素的28-氧-活化的40-氧衍生物的制備a)40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素的28-氧-半琥珀酸酯向攪拌和冷卻(0℃)的958mg(1.00mmol)40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素的2.2mL10∶1二氯甲烷-吡啶溶液中加入0.160mL(1.50mmol)烯丙基氯甲酸酯。在0℃繼續攪拌，將1份0.080mL(1.00mmol)吡啶和1份0.053mL(O.50mmol)烯丙基氯甲酸酯分別于反應3小時后和4小時后加入。待全部加完后繼續攪拌1個多小時，用1M碳酸氫鈉水溶液終止反應。反應混合物用乙酸乙酯提取3次。有機溶液依次用1N鹽酸水溶液，1N碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓過濾、濃縮。剩余物用硅膠柱層析(50∶50己烷-乙酸乙酯)純化，得到烯丙氧羧基-被保護的化合物(如反應III中式2所示)，為-白色泡沫狀物質。
向冷卻(0℃)和攪拌的208mg(0.200mmol)上述產物的2ml二氧甲烷溶液中，加入2.4mg(0.020mmol)DMAP和82mg(0.400mmol)DCC，隨后加入63mg(0.400mmol)單烯丙基琥珀酸酯的0.5ml二氯甲烷溶液。反應混合物在0℃攪拌14小時，生成的懸浮液用多孔玻璃漏斗過濾，有機溶液經減壓濃縮，剩余物用硅膠柱層析(30∶70己烷-乙酸乙酯)純化，得到-白色泡沫狀產物(如反應III中式3所示)。
向177mg(0.150mmol)上述產物的5ml二氯甲烷的攪拌溶液中加入17.3mg(0.015mmol)四(三苯膦)鈀和0.08mL(0.3mmol)氫化三丁基錫。該黃色溶液在環境溫度下攪拌2小時，用乙酸乙酯稀釋，用2N冷的檸檬酸水溶液洗滌1次，用飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓，濃縮。用硅膠柱層折(85∶15乙酸乙酯-甲醇)純化，得到半琥珀酸酯(如反應III中式4所示)，為淺黃色油狀物質。
b)28-氧-琥珀酰亞胺基氧琥珀酰基-40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素將53mg(0.050mmol)上述步驟a)的產物半琥珀酸酯的2.5mL二氯甲烷溶液用2mgDMAP，24mg(0.125mmol)EDC和14mg(0.125mmol)N-羥基琥珀酰亞胺處理。在環境溫度下攪拌2小時之后，用1N碳酸氫鈉水溶液終止反應。用3份乙酸乙酯提取混合物。有機溶液用碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，再用無水碳酸氫鈉干燥，過濾，濃縮，得到標題活化的半抗原(如反應III中式5所示化合物)，它不用再純化就可用于制備蛋白-半抗原軛合物。它有以下特征光譜學性質1H NMR(CDCl3)δ2.43(1H，dd，H33a)，2.50-2.98(10H，m，H25，H33b，琥珀酸酯的氫，琥珀酰亞胺的氫)，3.58(2H，m，H6b，1羥乙基的氫)，3.68(3H，m，H16，2羥乙基的氫)，3.81(2H，m，H14，1羥乙基的氫)，3.93(1H，d，H27)，5.28(2H，m，H2，H30)，534(1H，d，H28)；MS(FAB)1161([M＋Li]+).實施例3. 28-氧活化的雷怕霉素的制備a)雷怕霉素的28-氧半琥珀酸酯向攪拌、冷卻(0℃)的914mg(1.00mmol)雷怕霉素的2.2mL10∶1二氯甲烷-吡啶溶液中加入0.212mL(2.00mmol)烯丙基氯甲酸酯。3小時后加入0.080mL(1.000mmol)吡啶和0.053mL(0.50mmol)烯丙基氯甲酸酯。繼續攪拌1個多小時，用1M碳酸氫鈉水溶液中止反應。反應混合物用甲基-t-丁基醚提取3次。有機溶液依次用1N冷的鹽酸水溶液，1N碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮。剩余物用硅膠柱層析(70∶30(正)己烷-乙酸乙酯)純化，得到烯丙氧基羰基保護的化合物(反應IV中式2所示)，為-白色泡沫狀物質。
向冷卻(0℃)和攪拌的400mg(0.400mmol)上述產物的5mL二氯甲烷溶液中加入4.8mg(0.040mmol)DMAP和164mg(0.800mmol)DCC，再加入127mg(0.800mmol)單烯丙基琥珀酸酯的1ml二氯甲烷溶液。反應混合物在-15℃攪拌14小時，生成的懸浮液用多孔玻璃漏斗過濾。有機溶液減壓濃縮后，剩余物用硅膠柱層析(40∶60己烷-甲基-t-丁基醚)純化，得到反應IV中式3化合物，為-白色泡沫狀物質。
向285mg(0.250mmol)上述產物的5ml二氯甲烷的攪拌溶液中加入28.8mg(0.025mmol)四(三苯膦)鈀和0.133mL(0.5mmol)氫化三丁基錫。該黃色溶液在環境溫度下攪拌1小時，用甲基-t-丁基醚稀釋，用2N冷的檸檬酸水溶液洗滌2次，用飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥、過濾、減壓濃縮。用硅膠柱層析(90∶10至60∶40甲基-t-丁基醚-甲醇)純化，得到28-氧雷怕霉素半琥珀酸酯(反應IV中式4所示化合物，為-淺黃色油狀物質。
6)28-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰基-雷怕霉素將51mg(0.050mmol)上述步驟a產物的2ml二氯甲烷溶液用2mgDMAP，24mg(0.125mmol)EDC和14mg(0.125mmol)N-羥基琥珀酰亞胺處理。在環境溫度下攪拌4小時，用1N碳酸氫鈉水溶液中止反應。用3份甲基-t-丁基醚提取混合物，有機溶液依次用碳酸氫鈉水溶液和食鹽水洗滌，用無水碳酸氫鈉干燥，過濾，濃縮，得到活化的標題化合物，它不用再純化就可用于制備蛋白-半抗原軛合物，它有以下特征光譜學性質1H NMR(CDCl3)δ2.43(1H，dd，H33a)，2.55-3.02(11H，m，H25，H33b，H39，琥珀酸酯的氫，琥珀酰亞胺的氫)，3.56(1H，m，H6b)，3.68(1H，dd，H16)，3.83(1H，m，H14)，3.93(1H，d，H27)，5.28(2H，m，H2，H30)，534(1H，d，H28)；MS(FAB)1117([M＋Li]+).實施例4.致免疫軛合物的制備a)40-氧連接的雷怕霉素軛合物將17.4mg實施例1中40-氧-活化的雷怕霉素溶于400μlDMF或DMSO中。將此溶液120μl(即含5.22mg活化的雷怕霉素)在劇烈攪拌下滴入含有8mgKLH的2ml0.1MNaHCO3緩沖液(PH7.7)的溶液中。反應混合物在室溫下攪拌2小時。將所得的雷怕霉素-KLH軛合物在4℃時對51PBS透析48小時以上，換液3次，使之純化。軛合物用微型濃縮試管通過離心進一步隨意濃縮。雷怕霉素-BSA和雷怕霉素-OVA軛合物可用同樣的方法制備，只需分別用BSA或OVA代替上述方法中的KLH。
b)28-氧-連接的(任選40-氧-烷基化的)雷怕霉素軛合物將5mg實施例2中28-氧-活化的化合物溶于2mLDMSO中，并在劇烈攪拌下滴加到含有5mgKLH的1ml50mM磷酸緩沖液(pH 7.3)中。反應混合物在室溫下攪拌2小時。將所得軛合物通過在4℃下對21PBS透析48小時以上，換液3次，使之純化。與BSA的軛合物和OVA軛合物可用同樣的方法制備。用實施例3中28-氧活化的化合物按同樣的方法，可使雷怕霉素通過第28位置與KLH，BSA和OVA軛合。實施例5.單克隆抗體的制備a)雷怕霉素的單克隆抗體單克隆抗體可用常規技術制備，基本上按照Khler和Milstein在Nature25649中的敘述。每只雌性Balb/C小白鼠(20-25g)各給予10或50μg用0.2ml弗羅因德氏完全佐劑配制的實施例4
a)的40-氧-連接的雷怕霉素-KLH致免疫軛合物，給藥途徑為在4個部位作皮下注射給藥。二周后作第二次強化注射，給予用0.2ml弗羅因德氏完全佐劑乳化的、含有同樣劑量致免疫軛合物，再次同樣作皮下注射。可用下述實施例6中所述的直接ELISA法檢測動物血清中是否出現了對抗原產生反應的抗體。對小鼠隨意作進一步選擇，以獲得對效應區的抗體(與FK-506有低交叉反應性)和對FKBP結合區的抗體(與FK-506有高交叉反應性)。例如
圖1表示了二只小白鼠的抗體滴定曲線小鼠(M1)對雷怕霉素的結合區具有了高水平的抗體，另一只小鼠(M7)對效應區具有較高水平的抗體。對表現出相當特異性最大血清抗體水平的小鼠給于強化注射每次10μg抗原，在倒數第3天注射(其中一半腹膜內注射另一半靜脈內注射)，在倒數第2天和第1天腹膜內再注射一次。最后一天小鼠被處死，分離其脾細胞并與PAI-O細胞或其它適合的骨髓瘤細胞系融合。培養產生的雜交瘤細胞，并用ELISA法挑選出對雷怕霉素有高親和性抗體的細胞。
b)40-(羥乙基)-雷怕霉素的單克隆抗體雌性Balb/C小鼠給予用0.2ml弗羅因德氏完全佐劑配制的10或50μg40-(羥乙基)-雷怕霉素KLH致免疫軛合物(實施例4b))，在4個部位作皮下注射。二周后，以同樣劑量的致免疫軛合物用0.2ml弗羅因德氏完全佐劑乳化后對鼠作第2次皮下注射(強化注射)。用下述的直接ELISA法檢測對抗原反應的抗體是否已在動物血清中出現。另外，可對小鼠作進一步選擇，以獲得針對雷怕霉素分子區域的抗體，該分子已在40-氧區內通過連接一個BSA雷怕霉素軛合物而進行了修飾，并與連接一個BSA-40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素軛合物相比較。得到了二種抗體，其中一種只與40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素軛合物相結合但不與已軛合的雷怕霉素相結合，另一種抗體既與40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素相結合又與雷怕霉素軛合物結合。對出現相當特異性的最大血清抗體含量的小鼠給予強化注射，每次注射10μg抗原，在倒數第3天注射(其中一半腹膜內注射，另一半靜脈內注射，在倒數第2天和第1天腹膜內再注射一次)。最后一天將小鼠處死，分離其脾細胞并與PAI-O細胞敲合。培養所得到的雜交瘤細胞并用ELISA法進行選擇，得到對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素具有高親和力的抗體。實施例6.酶聯免疫吸附測定法(ELISA)a)雷怕霉素的BLISA法于37℃，將微量滴定板用在PBS中的1-2μg/ml雷怕霉素-BSA軛合物包被2小時，然后在37℃用含2％BSA的PBS將其飽和1小時，并用0.05％Tweem-PBS洗滌3次。將被篩選的雜交瘤細胞上清液用含1％BSA的PBS溶液稀釋，室溫下培育過夜(或4℃18小時或37℃2小時)。用以堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG羊球蛋白來測定被結合抗體的量，以對-硝基苯基磷酸鹽作為底物。37℃時培育2小時后，酶的底物被水解(在室溫1小時)、在405nm處測光吸收值。挑選出產生高親和力單克隆抗體的雜交瘤細胞。
用含已知濃度雷怕霉素的溶液(如在血清中1-140ng/ml)來制作測定某一選擇抗體與雷怕霉素相對親合性的標準曲線。例如圖2表示單克隆抗體M7-91的標準曲線，它證明被選擇對雷怕霉素有較高專一性的單克隆抗體能夠檢測出低至0.25ng/ml水平的雷怕霉素。
通過測定抗體與FK-506的交叉反應性可以進一步明確抗體的如下特征它能與雷怕霉素的效應區或FKBP結合區相結合，即用一個類似的直接ELISA測定法用FK506-BSA軛合物包被微量滴定板，而該軛合物的制備方法與雷怕霉素-BSA軛合物制備方法類似。例如在圖3中比較了17種經選擇的單克隆抗體對雷怕霉素-BSA和FK-506的測定，圖4表示了交叉反應性的百分率。可見在比較對雷怕霉素-BSA和FK506-BSA的結合中，可檢測出有極低親合性的單克隆抗體。
上述直接ELISA測定法可以轉化為競爭性ELISA測定法只需將一個競爭物加到單克隆抗體溶液中，分別測定在加有競爭物和未加競爭物時單克隆抗體與軛合物的結合程度。在此競爭物為FK506或雷怕霉素，將競爭物的乙醇溶液如(1mg/ml)直接加入單克隆抗體溶液中(如，2μl/200μl/孔)，并在微量滴定板中將其進一步稀釋。例如在圖5中給出了一條抑制曲線，顯示在有不同濃度游離雷怕霉素存在時，M7-91抗體(M7.91.13)對BSA-雷怕霉素的結合作用。與直接ELISA測定法相比，在這種競爭性ELISA測定中比較單克隆抗體對游離的雷怕霉素以及對游離的FK506的結合作用，可見在雷怕霉素與FK506之間僅有很低的交叉反應性。這種競爭性測定法在用于選擇單克隆抗體時是較好的，因為據信在溶液中游離狀態下一些單克隆抗體可能由于親和力太低，以至于往往不能與抗原相結合，但這些抗體仍然顯示對多價抗原有二價或多價結合，這種抗原含有許多半抗原，它們在一個大的蛋白質分子上彼此緊密結合。競爭性測定法可排除這種低親合性抗體。圖6顯示了這種競爭性測定法的結果將具有較低交叉反應性的M7-91抗體(M7.91.13)與具有較高交叉反應性的M1-303(M1.303.3)抗體進行了比較。
6)40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素的ELISA測定法該ELISA測定法與a)中所述的程序相似。用40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素-BSA包被微量滴定板，用BSA飽和并洗滌。需篩選的雜交瘤細胞上清液在4℃培育18小時或37℃時培育2小時。用以堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG羊球蛋白來測定被結合抗體的量，以對-硝基苯基磷酸鹽作底物。用結合的雷怕霉素-BSA作平行ELISA測定，用以選擇能區別雷怕霉素和40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素的單克隆抗體。如圖7所示，雜交瘤細胞B3-203的上清液可選擇性地結合于40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素-BSA(在圖中被標為BSA-28-RAD)(圖7A)，雜交瘤細胞B3-113的上清液能識別40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素-BSA和由第28位置共軛結合的雷怕霉素-BSA(圖7B)，雜交瘤細胞B3-164的上清液還能識別由第40位置與BSA偶合的雷怕霉素(圖7C)。
抗體對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素和對雷怕霉素的相對親合性，還可用下述方法進一步測定即通過對已包被的40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素-BSA軛合物和對溶液中游離的40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素或雷怕霉素的競爭性的結合來測定。如圖8表明，由雜交瘤細胞B3-203產生的抗體對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素具有很強的反應，而對雷怕霉素只有弱交叉反應性(圖8A)，由雜交瘤細胞B3-113和B3-164產生的抗體對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素和雷怕霉素有同樣較強的結合活性(圖8B和8C)。其它雜交瘤細胞，包括B3-22，B3-127和B3-156產生的抗體，對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素的結合作用比對雷怕霉素的結合作用至少強10-100-倍。另幾株雜交瘤細胞B3-29，B3-265和B3-539產生的抗體對40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素和雷怕霉素的親和力相同。
一旦所希望的抗體被選出，相同的ELISA測定法可用于測定病人血液中的雷怕霉素濃度。按照本實施例制得的檢測試劑盒將提供下列試劑一個或多個被選用的抗體(冷凍干燥形式)一塊以雷怕霉素軛合物(如雷怕霉素-BSA軛合物和40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素-BSA軛合物)包被的微量滴定板，一份雷怕霉素標準和使用說明。本試劑盒還包括一個供選用的標記的雷怕霉素衍生物以用于競爭性測定，還可以另外提供上述的抗鼠IgG-酶軛合物和底物。客戶也可以將本發明的抗體用于他們自己建立的ELISA測定或其它測定系統。
權利要求
1.一種能夠專門識別雷怕霉素的單克隆抗體。
2.權利要求1的能夠識別雷怕霉素FKBP-結合部位上抗原決定基的單克隆抗體。
3.權利要求1的能夠識別雷怕霉素效應區上抗原決定基的單克隆抗體。
4.權利要求1至3中任何一項所述的單克隆抗體，通過以下步驟得到或可以得到a)使帶有活化偶合基團的雷怕霉素與致免疫蛋白反應，生成致免疫軛合物，b)將上述致免疫軛合物給合適種類的動物服用，以產生致免疫激發，收集對上述軛合物敏感的產生抗體的細胞，c)存活產生上述抗體的細胞，d)從上述建立的活存細胞系中收集單克隆抗體。
5.權利要求1至4中任何一項所述的單克隆抗體，其中雷怕霉素是(i)雷怕霉素；或(ii)40-氧-烷基化的雷怕霉素，其中40-氧烷基取代基優選自羥烷基，羥烷氧烷基，酰氨烷基或氨烷基。
6.權利要求5所述單克隆抗體，其中雷怕霉素可選自i)40-氧-(2-羥乙基)-雷怕霉素，ii)40-氧-(3-羥丙基)-雷怕霉素，iii)40-氧-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷怕霉素，和iv)40-氧-(2-乙酰氨基乙基)-雷怕霉素。
7.上述權利要求中任何一項所述能夠識別雷怕霉素和權利要求5或6中所述40-氧-烷基化雷怕霉素的單克隆抗體。
8.一種包括雷怕霉素部分和蛋白質部分的致免疫軛合物。
9.權利要求8所述致免疫軛合物，它由蛋白質和帶有活化偶合基團的雷怕霉素衍生物反應得到。
10.權利要求9所述致免疫軛合物，其中雷怕霉素衍生物可選自i)40-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，ii)28-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，或iii)28-氧-(琥珀酰亞胺氧琥珀酰基)-40-氧-(2-羥乙基)雷怕霉素。
11.一種具有活化偶合基團的雷怕霉素。
12.權利要求11所述雷怕霉素，它可選自i)40-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，ii)28-氧-琥珀酰亞胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，或iii)28-氧-(琥珀酰亞胺氧琥珀酰基)-40-氧-(2-羥基)乙基-雷怕霉素。
13.一種能夠產生權利要求1至7中任何一項所規定的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
14.一種用于檢測血液中雷怕霉素濃度的免疫檢測試劑盒，它含有權利要求1至7中任何一項規定的單克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了雷怕霉素和40-氧-烷基化的雷怕霉素衍生物的單克隆抗體、新型半抗原，致免疫軛合物，以及生產它們的方法和使用它們的檢測試劑盒。
文檔編號C12N15/09GK1120854SQ94191718
公開日1996年4月17日 申請日期1994年3月30日 優先權日1993年4月8日
發明者R·塞蘭尼, V·奎斯尼奧 申請人:山道士有限公司