新的細胞表面蛋白質的制作方法

專利名稱：新的細胞表面蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及以發酵工藝繁殖用于生產有用物質如L-氨基酸的微生物，以及使用上述微生物以發酵工藝生產有用物質如L-氨基酸的方法。具體地說，本發明涉及衍生于乳糖發酵短桿菌(BrevibacteriumLactofermentum)的新的細胞表面層蛋白質，含有編碼該蛋白質之基因的DNA片段及其應用。
棒狀細菌[或稱棒狀桿菌或棒桿菌(Coryneformbacteria)]是大量產生L-氨基酸如L-谷氨酸或L-賴氨酸的微生物，已為改善L-氨基酸之生產能力的目的對其進行了繁殖。已進行了各種研究工作，并且迄今已報導了使用基因操作技術繁殖氨基酸生產菌的實例(Biotechnologyletters，2(1980)525-530，Appln.Environ.Microbiol.144(1979)181-190，AbstructofLecturefortheMeetingoftheSocietyofAgriculturalChemistryofJapan(1981)8)。然而，所有這些工作都是針對著利用氨基酸微生物合成系統中的基因作為材料并通過提高基因表達來改善每個細胞之目的氨基酸的生產量，而不是針對在分析細胞表面結構的功能的基礎上改善氨基酸生產能力。
順便提到的是，用發酵工藝生產氨基酸時，通常要在純化所生產的氨基酸的過程中進行離子交換層析，但是如果細菌細胞留在發酵培養基中，當發酵培養基通過離子交換樹脂柱時就會阻塞樹脂柱，因此必須有一個從發酵培養基中除去細菌細胞的步驟。此步驟通常是通過離心、過濾等方法進行的，如果能夠安全而又簡化地進行細胞分離則在工業上將是非常有用的。
已經知道，由于在培養后依據微生物的類型而出現細胞聚集等現象，致使微生物細胞在培養基中沉淀出來，并極其容易地從培養基中分離這些微生物細胞。然而，尚未報導過具有這種性質的用于氨基酸生產的棒狀細菌，并且也還不知道提供有聚集或沉降性質之微生物細胞的方法。
WO93/03158號的已公開文本中描述了一種與本發明的K蛋白質相似的新的細胞表面層蛋白質，但這種蛋白質顯然不同于K蛋白質。此外，該說明書中公開了一種利用細胞表面層蛋白質之信號肽的蛋白質表達-分泌系統，但尚不知道此蛋白質有助于摻入棒狀細菌營養素以及細菌細胞的聚集性質。
再者，雖然棒狀細菌已作為L-氨基酸生產菌在工業上使用，但最近才發現它們是有高度分泌性的，并且已在利用桿菌的實踐中嘗試將其用于生產不同的蛋白質。上述國際公開WO93/03158號文本中也說明了這種技術。
本發明將解決的主題是得到有助于摻入棒狀細菌營養素的新的細胞表面層蛋白質及其基因，并得到經在棒狀細菌細胞中擴增此基因而獲得的轉化體。本發明還有一個目的是使用具有產生有用物質如L-氨基酸之活性的棒狀細菌作為轉化體的宿主，并改善使用上述宿主細菌經發酵工藝生產有用物質如L-氨基酸的方法，以及得到缺失該新的細胞表面層蛋白質和具有聚集性質的棒狀細菌，以便簡化氨基酸生產工藝。
作為一個重要的研究成果，本發明人已成功地獲得了一種有助于摻入細菌營養素的新的細胞表面層蛋白質和其基因，并已完成了本發明。
具體地說，本發明提供了衍生于乳糖發酵短桿菌、分子中具有以下兩序列且分子量約為63，000道爾頓的新的細胞表面層蛋白質(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr，和(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys，含有編碼該蛋白質之基因的DNA片段，將該DNA片段與能夠在棒狀細菌細胞中自動復制之載體連接而得到的重組DNA，在棒狀細菌的細胞中引入并擴增該DNA片段而得到的轉化體以及以發酵工藝生產有用物質如L-氨基酸的方法，該方法包括在培養基中培養具有產生有用物質如L-氨基酸之活性的轉化體，在培養基中生成并積聚有用物質，并從培養基中收集該有用物質。
本發明提供了具有細胞聚集性質并缺失上述細胞表面層蛋白質或與上述存在于棒狀細菌細胞表面上的蛋白質基本相同之蛋白質的棒狀細菌。
本發明還提供了具有細胞聚集性質并缺失細胞表面層蛋白質的棒狀細菌，其中編碼所說的細胞表面層蛋白質的基因或編碼基本上與上述蛋白質相同并存在于棒狀細菌細胞表面中之蛋白質的基因，由于含有至少一部分編碼細胞表面層蛋白質之基因的DNA片段與染色體上與該DNA片段相同或同源的DNA序列間發生同源重組而被破壞。
本發明進一步提供了生產有用物質的工藝，其中包括培養具有產生有用物質如L-氨基酸之活性的棒狀細菌;
在培養基中生成并積聚有用物質;
從培養基中收集有用物質，其中棒狀細菌缺失上述新的細胞表面層蛋白質并具有細胞聚集性質，該工藝還包括在完成培養后靜置培養基，從而沉淀出棒狀細菌細胞。
如下文所述，本發明中所指的棒狀細菌是一族桿狀、需氧、革蘭氏陽性、不抗酸且不產孢子的微生物(如BargeysManualofDeterminativeBacteriology，8thedition，P599(1974)中所定義的)。屬于這種棒狀細菌的特定微生物在下文中也可簡單地稱為“棒狀細菌”。另外，棒狀細菌缺失本發明中所述的細胞表面層蛋白質，并且編碼細胞表面層蛋白質的基因被破壞的棒狀細菌有時可統稱為“K蛋白質缺失菌株”。
1.新的細胞表面層蛋白質，它的基因，其轉化體以及生產L-氨基酸的方法按下述方法制得本發明新的細胞表面層蛋白質。例如使用超聲波發生器(OHTAKE5202PZT)破壞乳糖發酵短桿菌例如菌株2256(ATCC13869)的細胞，然后在比3000xg，4℃，5分鐘，較好12000xg，4℃，1分鐘更強的條件下離心細胞溶菌產物以回收上層清液。再于比100，000xg，4℃，20分鐘，較好100，000xg，4℃，30分鐘更強的條件下離心上層清液，以沉淀并回收細胞表面層部分。大量存在于該部分中、分子量約63，000的蛋白質便是根據本發明的新細胞表面蛋白質，即K蛋白質。
按下述方法純化K蛋白質。所制備的細胞表面層部分含有胞漿膜和細胞壁。然后使用表面活性劑溶解細胞漿膜以分離之。因為增溶的強度依據表面活性劑的種類和濃度、增溶處理的時間和溫度以及外加甘油和/或NaCl的濃度等因素而有所不同，所以只有在找到純化的最佳條件時才可完成本發明。已根據本發明第一次確定了所需的最佳條件。即，將30μg細胞表面層部分加到1ml含有1.25%(w/v)SDS的緩沖液(50mM磷酸鉀，pH8.0，0.1mM二硫菌糖醇)中，于4℃至90℃，較好于37℃保持30分鐘以上，較好1小時;然后于比145，000xg，20分鐘，較好145，000xg，30分鐘更強的條件下離心，并回收沉淀物。將沉淀物懸浮在含有0.1%SDS的50mM磷酸鉀(pH8.0)中，以使懸浮液含有0.01-10μg蛋白質/μl，較好0.2μg蛋白質/μl，然后煮沸約3分鐘使之溶解。
根據在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(GelElectrophoresisofProteins，IRLPress(1981)B.D.Hammes，et al.)中的遷移率估測K蛋白質的分子量。估計K蛋白質的分子量約為63，000道爾頓。
按下述方法確定K蛋白質的氨基酸序列。將純化的K蛋白質懸浮在含有0.1%SDS的50mMTris-HCl(pH7.3)中，以使懸浮液含有10μg-2mg蛋白質/ml，較好200μg蛋白質/ml，并將懸浮液煮沸約5分鐘以溶解K蛋白質。溶液冷卻后，向溶液內加入蛋白質鏈內切酶Lys-C(BoeringerManhaimCo.制造)，從而使可溶于表面活性劑中之蛋白質部分和Lys-C的比例約為10∶1-200∶1，較好為50∶1(w/w)，并于37℃保溫30分鐘以上，較好3小時。
以反相層析分級分離用Lys-C部分消化的K蛋白質。可適當選擇用于層析的市售層析柱，例如可使用Senshu Pac VP-318-1251 4.6Φ×250mm柱。使用梯度溶液如CH3CN-0.1%TFA進行洗脫。流速可在1ml/分鐘。使用如此得到的各層析部分中有較高肽含量的部分測定氨基酸序列。按已知方法(P.Edman，Arch.Biochem.22，475(1949))，例如使用Applied Biosystems Co.制造的470-A型氣相序列儀按其操作手冊所述進行序列測定。
K蛋白質分子中具有下列兩個序列(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr(序列表SEQIDNO∶1)和(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys(序列表SEQIDNO∶2).
按下述方法分離K蛋白質。首先從乳糖發酵短桿菌例如菌株2256(ATCC13869)中，例如使用H.Saito和K.Miura在Biochem.Biophys.Acta72，610(1963)中描述的方法提取染色體DNA，并用適當的限制酶消化之。如果通過調節反應條件例如反應時間來控制染色體DNA的消化程度，則可以使用多種不同的限制酶。
連接該DNA片段和能在埃希氏桿菌屬(Escherichia)微生物的細胞中復制的載體DNA以形成重組DNA，然后用該重組DNA轉化埃希氏桿菌屬細菌，例如大腸桿菌菌株JM109，以制備基因組DNA庫。可使用具有從已知氨基酸序列推斷之核苷酸序列的合成DNA作為探針，以集落雜交法從DNA庫中分離K蛋白質基因。
具體地說，用限制酶例如Sau3AI在高于30℃，較好37℃的溫度下，以1-10單位/ml的酶濃度將乳糖發酵短桿菌菌株2256(ATCC13869)的染色體DNA部分消化不同時間(1分鐘至2小時)，以得到不同大小的染色體DNA片段的混合物。使用能造成與用于消化染色體的限制酶Sau3AI有相同末端堿基序列的限制酶例如BamHI，在高于30℃的溫度下并以1-100單位/ml的酶濃度將能夠在埃希氏桿菌屬細菌細胞中復制的載體DNA完全切割1小時以上，較好1-3小時，以得到被切割并成線性化的DNA。然后將含有如上制得的來自乳糖發酵短桿菌菌株2256(ATCC13869)之K蛋白質基因的DNA片段混合物與線性化的載體DNA混合，并于4至16℃的溫度，以1-100單位的酶濃度，使用DNA連接酶較好是T4DNA連接酶進行1小時以上，較好6至24小時的連接反應，以得到重組DNA。
作為可用于本發明的載體DNA，優選質粒載體DNA，例如可以是pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399和RSF1010。另外也可使用噬菌體DNA載體。為有效地表達K蛋白質基因，也可使用在微生物中發揮功能的啟動子如lac、trp、PL。本文所指的重組DNA可包括以使用轉座子(Berg.D.E.andBerg.C.M.Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌體(日本專利公開90-109985)方法，或以同源重組技術(ExperimentsinMolecularGenetics，ColdSpringHarborLab.(1972))將K蛋白質基因整合到染色體中所得到的重組DNA。
用上述重組DNA轉化例如大腸桿菌K-12的JM109菌株，制備基因庫。制備基因庫的方法詳見MolecularCloning，第2版(ColdSpringHarborPress(1989)Maniatis，etal.)。可用D.M.Morrison的方法(MethodsinEnzymology68，326，1979)或用氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.andHiga，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))進行轉化。
接著，用集落雜交方法從基因庫中分離含有包括K蛋白質基因之DNA片段的重組DNA。可按照MolecularCloning，第2版(ColdSpringHarborPress(1989)Maniatis，etal.)中所述的方法進行集落雜交。
可使用具有從純化之K蛋白質的氨基酸序列推斷之堿基序列的合成DNA作為用于集落雜交的DNA探針。例如，可優先提到的是使用Applied BiosystemsCo.制造的DNA合成儀合成的具有5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′序列(SEQIDNo∶3)的30mer寡核苷酸。測定序列時，因存在相當于一種氨基酸殘基的多個密碼子而造成很大障礙。鑒于這一情況，可選擇其中相當于各氨基酸之密碼子的簡并性程度低的區域，或者查找短桿菌屬的慣用密碼子來確定序列。可使用AppliedBiosystemsCo.制造的380B型DNA合成儀，并以phosphoamidide方法(參見TetrahedronLetters，22，1859(1981))按常規合成寡核苷酸。
另外，也可例如借助PCR(聚合酶鏈反應WhiteT.J.etal∶TrandsGenet，5，185(1989))使用H.Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))的方法，從所得染色體DNA中擴增K蛋白質基因而制得K蛋白質基因。用于PCR的DNA引物互補于包括部分或完整K蛋白質基因之雙股DNA的兩個3′末端序列。在只擴增K蛋白質基因之部分區域的情況下，須使用上述DNA片段作為探針從基因庫中篩選包括完整K蛋白質基因的DNA片段。在擴增完整基因的情況下，可用瓊脂凝膠電泳法分離PCR反應混合物，然后從瓊脂糖凝膠上切掉含所需DNA片段的帶以回收包括K蛋白質基因的DNA片段。
使用具有從純化的K蛋白質氨基酸序列推測之堿基序列的合成DNA作為DNA引物。測定序列的過程中，因存在相應于一種氨基酸殘基的多重密碼子而產生很大障礙。鑒于上述情況，可選擇其中相當于各氨基酸之密碼子的簡并性程度低的區域，或者找出短桿菌屬細菌的適用密碼來確定序列。可使用AppliedBiosystemsCo.制造的380B型DNA合成儀并以phosphoamidide方法常規合成DNA。可使用TakaraShuzoCo.制造的PJ2000型DNA熱循環器，使用TaqDNA聚合酶并按照產品提供者指定的方法進行PCR反應。
將經用PCR反應擴增的含完整K蛋白質基因或其部分區域的DNA片段連接到能夠在埃希氏桿菌屬細菌細胞中復制的載體DNA上，以形成重組DNA。然后將此重組DNA導入埃希氏桿菌屬細菌的細胞內。這里所用的載體DNA和轉化方法與以前描述者相同。在只擴增K蛋白質基因之部分區域的情況下，可用上述DNA片段作為探針從基因庫中分離包含整個K蛋白質基因的DNA片段。可使用以前描述過的集落雜交法作為分離方法。
不管分離的含K蛋白質基因的DNA片段是否真的含有K蛋白質基因，都要使用用于集落雜交或PCR的合成DNA作為引物對該DNA片段進行核苷酸序列測定，并要證明測知的核苷酸序列是否編碼上述氨基酸序列。可使用二脫氧方法測定核苷酸序列(參見MolecularCloning，2ndedition，ColdSpringHarborPress(1989)，Maniatisetal.)。
不管K蛋白質是否為有助于摻入棒狀細菌營養素的新的細胞表面層蛋白質，都要通過制備K蛋白質缺失菌株并檢測該缺失菌株摻入銨離子的活性來證實之。結果顯示，與K蛋白質非缺失型菌株的銨離子摻入活性相比，其所得數值顯著降低。
接下來，將對通過連接含有K蛋白質基因的DNA片段與能夠在棒狀細菌細胞中自動復制的載體所得到的重組DNA，通過在細胞內引入并擴增該DNA片段所得到的棒狀細菌轉化體以及通過發酵工藝生產L-氨基酸的方法作出解釋，其中所說的發酵工藝包括培養具有L-氨基酸生產能力的上述轉化體，在培養基中生成并積聚L-氨基酸以及從培養基中收集L-氨基酸。
本發明的棒狀細菌例如屬于短桿菌屬(Bervibacterium)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的微生物是一族在BargeysManualofDeterminativeBacteriology(8thedition，p599(1974))中限定的、呈桿狀、需氧、革蘭氏陽性、不抗酸且不產孢子的微生物。短桿菌屬或棒狀桿菌屬微生物中，下述屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬的L-谷氨酸生產菌均可用于本發明中。
作為屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬之谷氨酸生產菌的野生型菌株，可得到的例子有
Brevibacterium dibaricatumATCC14020Brevibacterium saccharoriticumATCC14066Brevibacterium immariofilmATCC14068Brevibacterium lactofermentumATCC13869Brevibacterium roseumATCC13825Brevibacterium flabumATCC13826Brevibacterium thiogenetallisATCC19240Brevibacterium acetoacidfilumATCC13870Brevibacterium acetoglutamicumATCC15806Brevibacterium calnaeATCC15991Corymebacterium glutamicumATCC13032,13060Corymebacterium lilyumATCC15990Corymebacterium meracecolaATCC17965Microbacterium ammoniafilumATCC15354任何能夠在短桿菌屬或棒狀桿菌屬的細菌細胞內復制的載體DNA均可用于本發明。可舉出的具體實例如下(1)pAM330參見日本專利公開83-67699(2)pHM1519參見日本專利公開83-77895(3)pAJ655參見日本專利公開83-192900(4)pAJ611同上(5)pAJ1844同上(6)pCG1參見日本專利公開82-134500(7)pCG2參見日本專利公開83-35197(8)pCH4參見日本專利公開82-183799
(9)pCG11同上使用在獨特位點切割載體DNA的限制酶切割載體DNA，或使用在其多個識別位點上切割DNA的限制酶部分切割載體DNA。
用切割編碼K蛋白質基因之DNA片段的限制酶切割載體DNA并與所說的DNA片段相連接。如果用形成與編碼K蛋白質基因之DNA片段有不同末端的限制酶切割載體DNA，就將具有互補于線性化載體序列末端之堿基序列的寡核苷酸接頭(linker)連接到所說DNA片段的兩末端，然后再將此末部接有上述接頭的DNA片段與載體DNA相連接。
可按照已報道的適用于大腸桿菌K-12(Mandel，M.andHiga，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))的方法用氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性，或者用已報導的涉及枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)的將DNA在細胞對數生長期摻入細胞(所謂感受態細胞)內的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung.F.E.，Gene，1，153(1977))，將連接有載體DNA和編碼K蛋白質基因之DNA片段的重組DNA導入屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬受體細胞內。另外，亦可按照已知的涉及枯草芽胞桿菌、放射菌(Actinomycetes)和酵母的，將細胞改變成能夠容易地摻入重組DNA之原生質體或原生質球的方法將重組DNA導入細菌細胞內(參見Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168，111(1979);Bibb，M.J.，Ward，J.M.andHopwood，O.A.，Nature，274，398(1978);Hinnen，A.，Hicks，J.B.andFink，G.R.，Proc.Natl，Acad.Sci.，USA，75，1929(1978))。
在原生質體方法中，可以使用前述適用于枯草芽胞桿菌的方法達到足夠高的轉化頻率，但其中也可利用如日本專利公開82-183799號中公開的于聚乙二醇、聚乙烯醇和二價金屬離子存在下將DNA摻入短桿菌或棒狀桿菌的原生質體中。采用促進DNA摻入的方法，例如加入羧甲基纖維素、萄聚糖、菲科爾(ficoll)或BulronicF68(SelbaCo.制造)代替聚乙二醇或聚乙烯醇也可獲得相似的效果。
另外，也可用電脈沖方法(也稱為電穿孔法)(Sugimoto，etal.，日本專利公開90-207791號)將重組DNA導入屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬的受體細菌中。
培養按前述方法制得的攜帶含有編碼K蛋白質之DNA片段的重組DNA的L-氨基酸生產轉化體，并在培養基中產生和積聚所需的L-氨基酸，然后收集該產物。
用于L-氨基酸生產的培養基是含有碳源、氮源、無機離子及必要時的其他有機成分的常用培養基。
作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解物等糖，甘油和山梨糖醇等醇，以及富馬酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸。
作為氮源，可以使用硫酸銨、氯化銨和磷酸銨等無機銨鹽，大豆水解物、氣態氨和氫氧化銨等有機氮。
作為有機微量營養素，可在培養基中加入適當量維生素B1和酵母提取物等必需物質。另外，必要時可加入少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、鎂離子等。
培養最好在需氧條件下進行16至72小時，同時培養期間將培養溫度控制在30-45℃，pH控制在5-7。可使用無機或有機酸性或堿性物質以及氣態氨調整pH。可結合使用常規離子交換樹脂法，沉淀法和其他已知方法從發酵液中收集L-氨基酸。
順便提到的是，棒狀細菌是大量產生L-氨基酸的微生物并已逐漸應用于發酵生產L-氨基酸。此外，棒狀細菌的高分泌性質也已被利用來生產其他各種物質。
因為考慮到K蛋白質存在于細胞表面層中并且它有助于在其胞漿中摻入營養素，如果在細胞中引入并復制含K蛋白質基因的DNA片段所得到的棒狀細菌轉化體具有有用物質生產能力，那么也就認為可以對以發酵工藝生產有用物質的方法作出改進，所說的工藝方法包括在培養基中培養轉化體，在培養基中生成和積聚有用物質以及從培養基中收集該有用物質。
上述生產有用物質的方法與本文主要部分中所描述的生產氨基酸的方法完全相同。
這里提到的有用物質包括作為調味器原料的核酸。例如，產生核酸的棒狀桿菌包括日本專利公開82-22558號中公開的CorynebacteriumequiAJ11347。
另一方面，有用物質是指外來蛋白質。也就是可以提到的人干擾素、人白介素或人激素、酶或抗體等生理活性物質。已經知道了使用埃希氏桿菌或芽胞桿菌屬微生物生產外來蛋白質的方法，但相似技術也已發展到使用棒狀細菌。所用技術基本上包括將能夠在棒狀細菌細胞中自動復制的載體與能在棒狀細菌細胞中發揮功能啟動子以及編碼外來蛋白質的DNA片段相連接以制備重組DNA，將重組DNA引入棒狀細菌中并通過重組DNA上編碼蛋白質之DNA的表達以產生蛋白質。例如日本專利公開87-151184或日本專利公開87-244382號中描述了這一技術。
(2)K蛋白質缺失菌株和利用它們生產L-氨基酸的方法如上所述，業已證實根據本發明第一次發現K蛋白質有助于摻入棒狀細菌的營養素，并且本發明進一步公開了棒狀關細菌也對細菌細胞的聚集性質有所貢獻，K蛋白質缺失性棒狀細菌表現有聚集性質。
對例如乳糖發酵短桿菌的K蛋白質基因造成一種實質上不產生K蛋白質的突變而制得K蛋白質缺失菌株。另外，也可以從自然界中篩選具有實質上不產生K蛋白質之突變的自發突變菌株。
另外，也可使至少含有一部分編碼K蛋白質之基因的DNA片段與染色體上K蛋白質基因之間發生同源重組，借以破壞K蛋白質基因而得到K蛋白質缺失菌株。
再者，預期甚至除乳糖發酵短桿菌以外的棒狀細菌也具有與細胞表示層中K蛋白質完全相同或基本上相同的蛋白質(下文稱之為“K蛋白質樣蛋白質”)。例如，已公開的WO93/03158號說明書中描述了一種與本發明的K蛋白質相似但完全可以區別開的細胞表面層蛋白質。
可以期望這樣的K蛋白質樣蛋白質也有助于營養素的摻入或使細菌細胞具有聚集性質，而且缺失此K蛋白質樣蛋白質的棒狀細菌也具有聚集性質。
可按照得到K蛋白質缺失菌株的同樣方法，對K蛋白質樣蛋白質基因造成實質上不產生K蛋白質樣蛋白質的突變，以得到缺失K蛋白質樣蛋白質的棒狀細菌。另外也可從自然界篩選具有實質上不產生K蛋白質樣蛋白質之突變的自發突變菌株。再者，還可使至少含有一部分K蛋白質基因DNA片段與染色體上與此DNA片段同源的編碼K蛋白質樣蛋白質的基因發生同源重組，借以破壞編碼K蛋白質樣蛋白質的基因而得到缺失K蛋白質樣蛋白質的棒狀細菌。
以下描述得到K蛋白質缺失菌株的方法。下文描述中，如果用K蛋白質樣蛋白質取代K蛋白質，則也可按同樣方法得到缺失K蛋白質樣蛋白質的菌株。
可用對微生物造成人工突變的常規方法如紫外光照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍等誘變劑處理，對K蛋白質基因造成實質上不產生K蛋白質的突變。
作為從受到誘變的棒狀細菌中選擇K蛋白質缺失菌株的方法，可提到的例如有用抗K蛋白質抗體的方法如Western吸收方法。更具體地說，在薄膜如鋪敷在瓊脂培養皿上的尼龍薄膜上形成已突變之棒狀細菌的菌落，以在薄膜上固定細胞蛋白質。在這種情況下，在分立的瓊脂培養皿上制得復制板，這樣即可用膜上的菌落制得1∶1對應物。然后，將薄膜相繼地分別浸入含有抗K蛋白質抗體、抗被免疫動物(原用于制備抗K蛋白質抗體)之免疫球蛋白部分的酶標記第二抗體、以及通過由標記酶引起的酶促反應而顯色之染料的溶液中，經保溫后即在K蛋白質非缺失菌株的細胞蛋白質被固定的位置上顯出顏色。從而可通過鑒定不引起染料顯色的菌落并從相應于該菌落的復制板中分離菌落來選擇K蛋白質缺失菌。較好的是對如此選擇的K蛋白質缺失菌株之細胞表面層部分中的蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以進一步證實實質上沒有表達K蛋白質。
按照免疫和采血的常規制備方法，使用如上文(1)所示的從乳糖發酵短桿菌細胞表面層部分制備的蛋白質免疫動物如小鼠，制得抗K蛋白質抗體。也可以將用K蛋白質免疫之動物的脾細胞與具有持續生長活性的培養細胞如小鼠骨髓瘤細胞相融合，以制備雜交瘤細胞并培養所得雜交瘤細胞，從而制備并使用如此得到的抗K蛋白質單克隆抗體。
可使酶如β半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶與抗用來制備抗K蛋白質抗體之被免疫動物的免疫球蛋白部分中的抗免疫球蛋白抗體之間形成共價鍵，以得到酶標記的第二抗體。抗各種動物之免疫球蛋白的酶標記抗體是常用的并可從市場上購得。
下面說明從被誘變的棒狀細菌中選擇K蛋白質缺失菌株的另一種方法。按上文(1)中所述的方法制備各單一菌落之細胞的細胞表面層部分，并對所得到的細胞表面層部分進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。檢測出的在分子量約63，000處附近沒有K蛋白質帶的菌株即是K蛋白質缺失菌株。雖然該方法極費時間，但因為它能可靠地選擇K蛋白質缺失菌株，所以可以將其用于次級篩選步驟。
使用如上所述的同樣方法，可以從自然界選擇出具有實質上不產生K蛋白質之突變的突變菌株。
接下來，說明用基因分割或破壞手段得到K蛋白質缺失菌株或K蛋白質樣蛋白質缺失菌株的方法。將包含一部分K蛋白質基因的DNA片段引入棒狀細菌的細胞中，然后使含有一部分K蛋白質基因的DNA片段和染色體上與該DNA片段相同或同源的DNA序列發生同源重組，從而能夠破壞染色體DNA上的K蛋白質基因或K蛋白質樣蛋白質基因，以使之缺失K蛋白質或K蛋白質樣蛋白質。基因分割的機制圖解顯示于

圖1中。
具體地說，使含有部分K蛋白質基因的DNA片段與載體質粒DNA連接，以制備進行基因分割的質粒。將用于基因分割的質粒導入棒狀細菌如乳糖發酵短桿菌中得到轉化體。為進行導入，可以使用已報導的適用于埃希氏桿菌K-12的用氯化鈣處理受體細胞而增加DNA通透性的方法(Mandel，M.andHiga，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、已報導的用于枯草芽胞桿菌的使DNA在能夠摻入DNA的細胞生長期(所謂的感受態細胞)內導入的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andyoung，F.E.，Gene，1，153(1977))、已知用于枯草芽胞桿菌、放線菌和酵母的將細胞轉變成能夠容易地摻入DNA并將重組質粒導入DNA受體中之原生質體或原生質球的方法(Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168，111(1979)，Bibb，M.J.，Ward，J.M.andHopwood，O.A.，Nature，274，398(1978);Hinnen，A.，Hicks，J.B.andFink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))，或如上文(1)中所述的電脈沖方法(Sugimoto，etal.，日本專利公開90-207791)。
就用于制備進行基因分割之質粒的載體質粒來說，較好使用具有溫度敏感性復制原點的載體，例如pHSC4(Sugimoto，etal.，法國專利公開No.2667875/1992號)，并在復制抑制溫度下培養所得轉化體。如此可以防止質粒在細胞內染色體外自動復制，并使其中質粒摻入到染色體DNA內的轉化體能夠優先生長。另外，為了有利于選擇轉化體，期望使用這樣一種具有標志基因例如藥物抗性基因的載體質粒。
當在含有相應于標志基因之藥物的培養基中，較好在復制抑制溫度下培養其中已導入了基因分割所需質粒的棒狀細菌時，只有其中該質粒已整合到染色體內的轉化體才能生長。在這樣的轉化體細胞中，用于基因破壞的質粒通過含有該質粒中所具有的基因破壞K蛋白質基因之一部分的DNA片段與染色體上K蛋白質基因或K蛋白質樣蛋白質基因間的同源重組，被整合到染色體上的K蛋白質基因中，結果即可能分割染色體的K蛋白質基因。可對轉化體的細胞表面層部分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以進一步證實如此得到的轉化體是否缺失K蛋白質。另外，也可根據轉化體細胞的聚集性質來證實之。
作為為了得到K蛋白質缺失菌株而欲被誘變的或者將用K蛋白質基因分割的棒狀細菌，可以是如上文(1)中指出的短桿菌屬或棒狀桿菌屬微生物。
接下來，描述生產L-氨基酸的方法，該方法包括培養具有產生L-氨基酸的活性的棒狀細菌，在培養基中生成并積聚L-氨基酸并從培養基中收集L-氨基酸，其中棒狀細菌缺乏K蛋白質或K蛋白質樣蛋白質，并且進一步包括在完成培養后靜置培養基并因此沉淀棒狀細菌細胞的步驟。
培養具有產生L-氨基酸的活性并缺乏K蛋白質或K蛋白質樣蛋白質的棒狀細菌，并在培養基中生成和積聚所需的L-氨基酸。用于生產L-氨基酸的培養基是含有碳源、氨源、無機離子，必要時還含有其他有機成分的常用培養基。
作為碳源，可以使用例如甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物等糖，甘油和山梨糖醇等醇，以及富馬酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸。
作為氮源，可使用例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機銨鹽，大豆水解物、氣態氨和氫氧化氨等有機氮。
作為有機微量營養素源，可在培養基中加入適當量維生素B1或酵母提取物等必需物質。此外，必要時可在培養基中加入小量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子和錳離子。
培養較好在需氧條件下進行16至72小時，同時在培養期間將培養溫度控制在30至45℃，pH值控制在5至7。可使用有機或無機酸性或堿性物質并進一步使用氣態氨控制pH。
因為培養基組成和培養條件可對細菌細胞的聚集性質產生影響，所以可適當地選用適于所得K蛋白質缺失菌株的條件。
接著，在完成培養過程后，將培養基靜置并使聚集的細菌細胞沿降下來，以將其與培養物上層清液分離開。可通過回收上層清液使沉降的細菌細胞不會侵入其中而將培養物上層清液與細菌細胞分離開。另外，可借助常規離心分離法或過濾法完成細胞分離過程，并且因細菌細胞發生聚集而有利于分離過程的完成。
在分離出細菌細胞后，可結合使用常規離子交換層析法、沉淀法和其他已知方法從發酵培養基中收集L-氨基酸。通常在將發酵溶液的pH值調到4左右后用陽離子交換層析法純化堿性氨基酸如L-賴氨酸。因為本發明的K蛋白質缺失菌株在pH值約為4時可進一步增加聚集性質，所以如果在調整pH后實施細胞沉降步驟，即可在較短時間內完成沉降，從而能夠更有效地分離細菌細胞。再者，培養物上層清液與細菌細胞分離開后原料通過陰離子交換樹脂柱。
本發明顯示K蛋白質對細胞的聚集性質有貢獻，并且這一概念也可應用于除生產L-氨基酸以外的發酵工業中下游階段的細胞清除步驟，應用于細胞循環型生物反應器，以及進一步應用于改善活性菌泥的沉降作用，而且可適用于生產L-氨基酸以外的發酵工業。
例如，當具有產生有用物質活性的棒狀細菌缺失K蛋白質或K蛋白質樣蛋白質并具有細胞聚集性質時，即可改善以發酵工藝生產有用物質的方法，該方法包括在培養基中培養上述細菌，在培養基中生成并積聚有用物質并從培養物中收集該有用物質。這是因為在這些生產工藝中細胞分離操作也是必不可少的步驟。
即是說，在以發酵工藝生產有用物質的方法中，也可以與如上所述的氨基酸生產工藝的同樣方式有助于細胞分離操作，所說的方法包括培養具有產生有用物質之活性的棒狀細菌、在培養基中生成并積聚有用物質以及從培養基中收集有用物質，其中棒狀細菌缺失K蛋白質或K蛋白質樣蛋白質并具有細胞聚集性質，該方法還進一步包括在完成培養后靜置培養基的步驟，從而沉降出棒狀細菌細胞。
這里所指的有用物質包括作為調味品之原料的核酸。產生核酸的棒狀細菌包括例如日本專利公開82-22558號中公開的CorynebacteriumequiAJ11347。
另外，有用物質也包括外來蛋白質。即，可提到的有人干擾素或人白介素(interleukin)等生理活性物質、酶或抗體。使用微生物生產外來蛋白質的方法已知主要涉及屬于埃希氏桿菌屬或芽胞桿菌屬的細菌，并且也已發展了涉及使用棒狀細菌的同樣技術。這些技術基本上包括將能夠在棒狀細菌細胞內自動復制的載體與能夠在棒狀細菌細胞內發揮功能的啟動子和編碼外來蛋白質的DNA相連接以形成重組DNA，將重組DNA導入棒狀細菌中并通過在重組DNA上表達編碼蛋白質的DNA來生產該蛋白質。該技術例如已公開在日本專利公開87-151184號中。
附圖簡要說明圖1借助同源重組進行基因分割的示意圖。
圖2顯示K蛋白質對銨離子摻入的貢獻。
○…K蛋白質非缺失菌株(AECr2256)●…K蛋白質非缺失菌株(AECr2256)，加CCCP□…K蛋白質缺失菌株(AJ12760)■…K蛋白質缺失菌株(AJ12760)加CCCP圖3圖解顯示K蛋白質缺失菌株和K蛋白質非缺失菌株的沉降度(碳源蔗糖、完成培養后將培養基調到pH4.0)。
×…2256菌株(ATCC13869)+…YSR菌株◇…AECr2256菌株△…AJ12760▲…AJ12956上列符號也用于圖4-6。
圖4圖解顯示K蛋白質缺失菌株和K蛋白質非缺失菌株的沉降度(碳源蔗糖，完成培養后將培養基調到pH4.0)。
圖5圖解顯示K蛋白質缺失菌株和K蛋白質非缺失菌株的沉降度(碳源葡萄糖，完成培養后不調整培養基的pH)。
圖6圖解顯示K蛋白質缺失菌株和K蛋白質非缺失菌株的沉降度(碳源蔗糖，完成培養后不調整培養基的pH)。
CCCP羰基氰化物m-氯苯基肼。
現借助實施例更具體地描述本發明。
實施例1新的細胞表面層蛋白質K蛋白質(1)新的細胞表面層蛋白質的發現在CM2G培養基(酵母提取物10g，bactotryptone10g，葡萄糖5g，NaCl5g，加水至1升)中將乳糖發酵短桿菌ATCC13869于30℃振蕩培養過夜，并從1ml培養液中收集細胞。用緩沖溶液A(50mm磷酸鉀，pH8.0，10mM硫酸鎂)洗凈后，將細胞懸浮在1ml緩沖液A中，冷凍和融化，并保持于0℃時用超聲波破碎機(OHTAKE 5202 PZT)破碎細胞。然后以12，000xg于4℃將溶胞產物離心1分鐘并回收上層清液。再次以100，000xg于4℃下將所得上層清液離心30分鐘并回收作為細胞表面層部分的沉淀。這些部分中對相當于5×109細胞的部分進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果，在分子約63，000處附近具有以大量存在的蛋白帶，并將此蛋白質命名為K蛋白質。
本發明期望該細胞表面層蛋白質具有促使其從細菌細胞外部攝入營養素的功能，并進行了下述實驗。
(2)K蛋白質的純化首先，按照以前(1)中所述的方法制備細胞表面層部分。細胞表面層部分含有胞漿膜和細胞壁。然而，試圖使用表面活性劑增加胞漿膜可溶性以分離之。作為對表面活性劑的種類和濃度、增溶化的時間與溫度、以及加入甘油的效果和加入NaCl的效果進行詳細研究的結果，表明可用下述方法純化K蛋白質。將3.0μg細胞表面層部分的蛋白質(用BioRadCo.制造的BC蛋白質檢測藥盒進行定量)懸浮在1ml含1.25%(w/v)SDS的緩沖液(50mM磷酸鉀，pH8，0.1mM二硫蘇糖醇)中并將懸浮液于37℃保持1小時。然后將懸浮液以145，000×g離心30分鐘并回收沉淀物。將沉淀物懸浮在含有0.1%SDS的50mM磷酸鉀，pH8.0中以使其中含有0.2μg蛋白質/μl，并煮沸3分鐘。對表面活性劑不溶性部分的15μg蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進一步證實其為具有分子量63，000的均一蛋白質。
(3)K蛋白質的性質(3-1)分子量根據在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率估計K蛋白質的分子量約為63，000。
(3-2)部分氨基酸序列的確定將按上文(2)中所述方法純化的K蛋白質懸浮在50mMTris-HCl，pH7.3，0.1%SDS中以使蛋白質濃度為200μg/ml，并煮沸5分鐘以溶解之。冷卻后，向溶液內加入蛋白內切酶Lys-C，使作為表面活性劑不溶性部分的蛋白質與Lys-C的比例為50∶1(w/w)，并于37℃保溫3小時。
為使用Lys-C對K蛋白質溶液進行限制性消化，用反相層析法分級分離相當于500 pmole K蛋白質的部分。所使用的層析柱為Senshu Pac VP-318-1251 4.6Φ×250mm。使用CH3CN梯度(24%CH3CN，0.1%TFA-66%CH3CN，0.1%TFA)以1ml/分鐘的流速進行洗脫。從各洗脫液部分中取兩個高肽含量的部分(即用55.7-57.0%CH3CN和59.3-60.5%CH3CN洗脫的部分)，使用Applied Biosystems Co.制造的氣相序列儀470-A測定氨基酸序列。按照Applied Biosystems Co.的使用說明書進行氨基酸序列測定。結果發現K蛋白質分子中具有下示兩個序列
(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr(SEQIDNO∶1)，和(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys(SEQIDNO∶2).
實施例2K蛋白質基因的分離(1)基因庫的制備按Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta.，8278(1963)619-629)以乳糖發酵短桿菌2256(ATCC13869)制備染色體DNA。在50μg染色體DNA中加入2單位Sau3AI并于37℃保持40分鐘進行部分消化。在蔗糖密度梯度(10%-40%)情況下以120，000×g將反應混合物離心26小時以分級分離DNA片段。
回收約1，500至6，000bps的(1.5ml體積)，并于4℃將其對TE緩沖液(100mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)透析。使用SankoJunyakuCo.制造的SeamlessCelluloseTubingSize8/32作為透析管。對2升緩沖液透析4小時，交換緩沖液后再進行2小時。
透析后，按照Maniatis等人的方法(MolecularCloning，2ndedition，ColdSpringHarborPress(1989)Maniatis，etal.)用2-丁醇提取，1，500-6，000bp的染色體DNA，然后使用T4DNA連接酶(TakaraShuzoCo.制造)將此DNA片段連接到在先已用BamHI(TakaraShuzoCo.制造)切斷的載體pSTV28上。按照TakaraShuzoCo.的說明書用所得的連接混合物轉化大腸桿菌JM109(TakaraShuzoCo.生產)，以制備由5，000個克隆組成的基因庫。考慮到如果以高比率表達K蛋白質基因，則可導致攜帶其中已克隆了K蛋白質基因片段之載體的宿主細胞死亡，因此要使用低拷貝載體pSTV28。
(2)K蛋白質基因的克隆基于實施例1(3-2)中的氨基酸序列，使用AppliedBiosystemsCo.制造的DNA合成儀合成有序列5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′(SEQIDNo∶3)的30mer寡核苷酸，作為用于菌落雜交的探針。確定序列過程中，因相對于一種氨基酸殘基存在多個密碼子而造成很大障礙，而如何解決這一問題是很重要的。在本發明中，可以基于下述兩點考慮來制備好的探針，而這正是成功的重要因素。這兩點是(1)因為可以確定相對長區域的氨基酸序列，所以有可能選擇其中相對于各氨基酸之密碼子的簡并性程度低的氨基酸區域;(2)雖然關于短桿菌的密碼子使用頻率還沒有肯定的知識，但Tsuchiya等人提出的關于克隆脂酶的知識(日本專利公開92-271780號)可供參考。
用集落雜交法從如此制得的基因庫中得到與探針雜交的集落。用Hybond-N(AmershamCo.制造)膜制取集落的復制物，于50°下雜交40小時，然后在40℃，1小時條件下將濾膜洗4次。經集落雜交法對如此得到的雜交陽性集落進行二次篩選。使用上述寡核苷酸作為探針并使用Hybond-N(AmershamCo.制造)作為濾膜制備復制物，于50℃雜交24小時并于4℃，1小時條件下洗3次，再于50℃，1小時條件下洗2次。在二次篩選中選擇出12個克隆。用堿-SDS方法從這12個在二次篩選中呈陽性的集落回收質粒DNA。根據用EcoRI和HindⅢ(均為TakaraShuzoCo.生產)消化這些質粒后檢查酶切圖譜的結果，證實各質粒均有在pSTV28的BamHI位點插入的DNA片段。
按照制造商推供的操作說明書，使用VacuGene(PharmaciaLKBBiotechnologyCo.生產)將如此得到的DNA片段吸收到Hybond-N濾膜上，并使用上述寡核苷酸探針進行Southern雜交。在50℃，26小時條件下進行雜交，并于40℃一次洗1小時。于50℃再一次洗1小時。結果發現，在二次篩選中12個陽性克隆中有6個與探針雜交，并可基于限制性酶切圖譜將此6個克隆分類為3個類型。
使用上述寡核苷酸作引物，以二脫氧方法檢測所得到的三種類型已插入DNA片段的核苷酸序列，發現其中一種類型的已插入之DNA片段含有序列5′-AACAATGCAGATCAGGCTGCACGTGAGCTCTTCCTCGATTGGGACACC-3′(SEQIDNo∶4)。該序列編碼位于在先前確定的氨基酸序列中用于決定探針序列之部分的羧基末端側的氨基酸序列，即Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr(相當于SEQIDNo∶1中的氨基酸序號25-40)，據此可確認該DNA片段至少含有所需基因的一部分。
然后，用二脫氧法確定全長度已插入DNA片段的核苷酸序列。所測得的堿基序列示于序列表SEQIDNo∶5中。發現該片段編碼K蛋白質。根據此核苷酸序列推定的K蛋白質的氨基酸序列也示于序列表SEQIDNo∶5中。
實施例3K蛋白質缺失菌株的制備
(1)K蛋白質缺失菌株的制備使用乳糖發酵短桿菌2256菌株(ATCC13869)作為親代菌株，用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對整個細胞進行突變處理。在2xTY培養基(1.6%Bactotrypton，1%酵母提取物，0.5%NaCl)中培養2256菌株的細胞，當培養基在660nm處的吸光率達到約0.3時收集細胞。用具有表1所示組分的TM緩沖液洗凈細胞后，將其懸浮在NTG溶液中(NTG以0.2mg/ml的濃度溶解在TM緩沖液中)，并于37℃保溫0-90分鐘。用TM緩沖液和2xTY培養基洗凈細胞，然后在2xTY培養基中培養過夜以使突變得以固定。
表1成分濃度Tris50mM馬來酸50mM(NH4)2SO41g/1MgSO4·7H2O 0.1g/1Ca(NO3)25mg/1FeSO4·7H2O 0.25mg/1用NaOH調到pH6.0對按上述方法用NTG誘發突變的細胞進行單菌落分離并分離大約1，000個菌落。檢查形成這些菌落的各克隆是否缺失K蛋白質。用實施例1(1)中所述方法制備各克隆的細胞表面層部分并使用制得的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。用這種方法，如在相應菌株細胞表面層部分的分子量63，000附近未檢測到K蛋白質帶時，即可得到K蛋白質缺失菌株。該菌株被命名為乳糖發酵短桿菌YSR。
檢查如此得到的YSR菌株的染色體DNA，以了解是否該菌株缺失K蛋白質的原因在于基因的缺陷。即，從YSR菌株克隆K蛋白質基因，以按照實施例1所述同樣方法進行結構分析。
按Saito-Miura所述方法(Biochem.Biophys.Acta.，8278(1963)619-629)從YSR菌株制備染色體DNA。約50μgDNA中加入2單位Sau3AI并于37℃保溫40分鐘以進行部分消化。然后在蔗糖密度梯度(10%至40%)情況下離心(12，000xg，26小時)以分級分離經過消化的DNA。
收集相當于約1，500-6，000bp的部分(1.5ml體積)，并于4℃下對TE緩沖液(10mMTris/HCl，1mMEDTA，pH8.0)透析。使用SankoJunyakuCo.制造的SeamlessCelluloseSize8/32作為透析管。對2升緩沖液透析4小時后，更換緩沖液繼續透析2小時。
按照Maniatis等人的方法(MolecularCloning，第二版，ColdSpringHarborPress(1989)Maniatis，etal.)用2-丁醇提取所得到的1，500-6，000bp染色體DNA部分并使用T4DNA連接酶連接到已用BamHI(由TakaraShuzoCo.生產)切斷的載體pUC18上。按照TakaraShuzoCo.的操作說明書用此連接混合物轉化大腸桿菌JM109(TakaraShuzoCo.生產)，以制備基因庫。
使用有下示序列的合成DNA作為探針以集落雜交法從所得基因庫中篩選具有K蛋白質基因的克隆5′-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3′(見實施例2)。使用Hybond-N濾膜(AmershamCo.制造)制備集落的復制物，于50℃下雜交40小時并于40℃，1小時條件下洗4次。用集落雜交法對雜交陽性集落進行二次篩選。使用上述DNA作為探針并使用Hybond-N(AmershamCo.制造)膜制備復制物，于50℃雜交24小時并在40℃，1小時條件下洗3次，再于50℃，1小時條件下洗2次。
用堿-SDS法從這些在該二次篩選中呈陽性的集落中回收質粒DNA。用二脫氧法檢測核苷酸序列，根據限制性酶切圖可知待測克隆中已插入的DNA片段含有K蛋白質基因的完整區域。根據這一結果，已證明從YSR菌株中分離的K蛋白質基因具有序列表中SEQIDNo∶6所示的序列。將該序列與SEQIDNo∶5相比較，發現YSR的K蛋白質基因具有下表所示的突變。表2中的核苷酸序號相當于SEQIDNo∶6中的堿基序號。
表2核苷酸序號突變類型932G插入945T→C突變948A插入1031A插入1215-1216CG插入1238T插入1551-157929堿基插入1688C插入1789-1790C缺失2203-2204AG插入2274C插入2422C插入2438T插入已發現YSR菌株染色體上的K蛋白質基因由于上述核苷酸的缺失或插入而造成移碼，結果YSR菌株不再表達K蛋白質。含有突變K蛋白質基因片段的質粒被命名為pMAK701。攜帶質粒pMAK701的大腸桿菌AJ12759已于1993年1月11日以保藏登記號FERMP-13364保藏在NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology，AgencyofIndustrialScienceandTechnology(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，zipcode305)，并于1994年1月1日由原保藏單位轉為布達佩斯條約規定的國際保藏登記號為FERMBP-4533，后又于1994年2月17日保藏在中國典型培養物保藏中心(中國湖北省武漢大學校內)，保藏號為CCTCCM94003。
順便說明的是，實施例2中包含有序列表SEQIDNo∶5中所述堿基序列之DNA片段的質粒沒有保藏。但本領域技術人員顯然可以使用例如PCR方法或按照利用含U單股DNA的方法對基因進行位點特異性誘變。因此，可以很容易地使用pMAK701作為起始材料制備包含有序列表SEQIDNo∶5中所示堿基序列之DNA片段的質粒。
(2)K蛋白質基因分割菌株的制備從實施例3(1)中制得的含K蛋白質突變基因的DNA片段上切下長度約650堿基對的Bam HI-SalI片段，并與具有溫度敏感性復制起始點之載體pHSC 4(Sugimoto，et al.，法國專利
發明者川崎壽, 土屋誠, 三輪清志, 河原義雄 申請人:味之素株式會社