專利名稱：一種固定化活細胞或酶的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種固定化活細胞或酶的制備方法，特別是采用聚乙烯醇作載體的固定化方法。
固定化活細胞技術是近幾年來繼固相酶技術后迅速發展起來的生物工程新技術，該技術采用包埋法將肉眼看不清的微生物活細胞固定在載體上，形成直觀的固定化活細胞實體，活細胞仍能增殖，新陳代謝，其酶系完整，可迅速完成一系列復雜的生化反應，得到有用產物。
在固定化方法中，載體可以是天然或合成高分子材料，例如，褐藻膠，K-卡拉膠，聚丙烯酰胺等，其中，褐藻膠，K-卡拉膠存在強度差、使用壽命短等缺點(只有1000多個小時)，而聚丙烯酰胺由于其單體分子及聚合促進劑等皆具毒性，不利于微生物活細胞的生長，在高分子材料中，采用聚乙烯醇(PVA)材料不具毒性甚至對人體亦公認無害、價格低，較適合于包埋微生物活細胞，已有以PVA為載體的固定化方法，尚存在一些缺點，例如將微生物或酶與PVA溶液混合后，置于飽和硼酸溶液中短時間內使其形成球體，隨之將球體與磷酸鹽溶液接觸，使其完全硬化，制成微生物或酶固定化產物，這種方法存在步驟多，無機鹽濃度高，對微生物生長不利等缺點;有些采用PVA載體的固定化方法中，需要有真空干燥脫水步驟，工藝復雜，費時;有的需用模具成形，或加油類作為成形劑，其效果均不太理想。
本發明的目的是提供一種固定化活細胞或酶的制備方法，該方法簡便，不需在模具中成形，機械強度高，適合于工業化生產，并能長期反復使用。
為達到上述目的，本發明采用以下技術方案制備方法中采用PVA為載體，首先將聚乙烯醇溶液與活細胞懸浮液混合，以無菌淀粉為隔離成形劑，經冷凍定型、解凍、漂洗后絞碎加工成顆粒狀產物。
在固定化活細胞混合液中，聚乙烯醇濃度控制在10-20%(W/W)，活細胞懸浮液濃度在2-15%(W/W)，其余為水;無菌淀粉與混合液的重量比為0.5-2∶1;冷凍溫度在-10--30℃，時間48小時-12小時，解凍溫度一般控制在5-40℃，最好是10-25℃的室內，自然空氣中解凍5-48小時。聚乙烯醇的聚合度在400-1900之間，最好控制在1750±75，PVA聚合度過高，流動性差，操作不便，過低不易成型，聚乙烯醇濃度最好為15±0.5%(W/W)。
無菌淀粉制備普通淀粉100℃，干熱滅菌1小時，或常壓干蒸15分鐘(上汽計時)，務使其中心溫度達100℃，然后冷卻至20-30℃，即為無菌淀粉。
制得固定化微生物活細胞可直接用于生產，邊增殖邊發酵，也可先在適宜的培養基中培養增殖一段時間后再用于生產。
以下結合實施例對本發明作進一步說明實施例1制備固定化啤酒酵母活細胞6Kg，各組分配比啤酒酵母懸浮液(活細胞數106-109個/ml)0.6Kg，聚乙烯醇0.9kg，水4.5kg，淀粉5kg，其操作步驟是將PVA放入水中，攪勻，用沸水浴或蒸汽浴加熱溶解，溫度在80-120℃，溶解后冷卻至室溫，加無菌水補足溶解時損失的水量，隨后加入啤酒酵母懸浮液，混合均勻，將上述粘液進行成形處理，即以一直徑為5-25mm的噴嘴，以均勻速度注入予置滅菌淀粉的容器中，形成線條層狀，條間、層間以無菌淀粉隔離成型，再經冷凍處理定型，溫度為-30℃，時間12小時，將冷凍產物進行自然解凍，溫度為20℃，時間36小時，(全部軟化為止)，除去大部分淀粉后，漂洗2-5次，至水清亮為止。產物以Φ8mm的無菌絞肉機絞碎處理，得到直徑為2-5mm的顆粒狀產物。
上述所使用的淀粉可回收重復使用。將制得的固定化酵母活細胞取出4.3kg，放入容積12.5升的酒化生物反應器中，從下部泵入16%(折光計)糖化液，上部流出8%(折光計)的酒化液，流速0.1L/h，溫度10-30℃，酒化液乙醇7.3%(V/V)，總酸0.15%(W/V，以HAC計)還原糖1.1%(W/V，以葡萄糖計)。
連續發酵4800小時，載體強度無任何降低。可使用1年甚至數年。
實施例2制備固定化醋酸菌活細胞6kg，其各組分的配比，聚乙烯醇0.9kg、水4.5kg、淀粉5kg、醋酸菌體懸浮液(活細胞數108個/ml)0.6kg，其操作步驟同實施例1。
將制得的固定化醋酸菌活細胞載體取出4.8kg，放入容積為12.5升的醋化生物反應器中，下部通入無菌空氣，上部流入酒化液，溫度30℃轉化率80-100%，日產0.8升食醋，總酸4.0-4.4%(W/V，以HAC計)，進行半連續發酵4800小時，載體除有小于1/4的磨損外，強度沒有降低，將可繼續使用1年-數年。所生產的食醋達到ZB×66004-86，GB2719-81標準要求。
實施例3固定化魯氏酵母、球擬酵母、乳鏈球菌活細胞各5kg的制備。
各組分配比同實施例1、2。
其操作步驟同實施例1將分別制得的固定化魯氏酵母菌、球擬酵母菌，乳鏈球菌活細胞各5kg，對以低鹽固態發酵工藝(前酵)生產的醬油浸淋液為底液，于20℃溫度下，進行半連續或者批次后酵增香，多次反復使用4800小時，載體完好如初，可使用1-數年，所生產的醬油符合國家標準ZB×66013-87，GB2717-81，質量風味明顯提高，總酯及乙醇含量提高1.5-9倍，批次后酵周期3-15天。
本發明優點制作簡單，造價低，強度高，使用壽命長，適于工業化生產，應用范圍廣泛，例如可用于制酒工業，以固定化酵母菌活細胞發酵制酒精;食用酒精、啤酒、白酒、低度白酒、黃酒、葡萄酒、汽酒等，利用固定化酵母，可使發酵速度大大加快，前發酵由傳統發酵法7天縮短至2天，后酵時間由20-60天縮短至10天左右，另外，可采用分別包埋不同菌株，混和發酵，避免菌種間相互拮抗;調味品工業在食醋醬油的生產方面，采用本發明的固定化酵母菌、醋酸菌活細胞于食醋生產的兩個重要生化階段-酒精發酵階段和醋酸發酵階段，可克服上述傳統工藝的諸多缺點，不需輔料和翻坯，不僅改善和減輕勞動條件和強度，解決醋渣成災的問題。而且生產周期縮短1/2，轉換率達80-100%，出品率相應提高，實現食醋生產機械化、半連續化、管道化、安全衛生;醫藥方面，利用固定化微生物活細胞生產或轉化出昂貴的抗生素、干擾素等;微生物學領域可在短期內制取大量微生物，可將用基因工程獲得新種微生物進行快速培養，并應用到實際生產，造福于人類社會;食品工業;用于氨基酸、維生素的生產;還可用于廢水處理等等。
權利要求
1.一種固定化活細胞或酶的制備方法，其特征在于所用載體為聚乙烯醇，首先將聚乙烯醇溶液與活細胞懸浮液混合，以無菌淀粉為隔離成形劑成型，再經低溫冷凍定型室溫自然解凍，漂洗后加工成顆粒狀產物。
2.按權利要求1所述固定化活細胞或酶的制備方法其特征在于在固定化活細胞混合液中聚乙烯醇含量為10-20%(W/W)，活細胞懸浮液含量為2-20%(W/W)，其余為水;無菌淀粉與上述混合液的重量比為0.5-2∶1;，所述冷凍溫度為-10--30℃，其對應冷凍時間為48小時-12小時。
3.按權利要求2所述固定化活細胞或酶的制備方法其特征在于所述聚乙烯醇其聚合度為400-1900，最好為1750±75;聚乙烯醇濃度15±0.5%;
4.按權利要求1或2或3所述的活細胞或酶的固定化方法，其特征在于所述加工成顆粒狀產物是采用鉸碎機鉸碎。
5.按權利要求1或2或3所述固定化活細胞或酶的制備方法其特征在于所述的固定化活細胞混合液通過直徑5-25mm的噴嘴注入裝有無菌淀粉的容器中隔離成型。
全文摘要
一種固定化活細胞或酶的制備方法，它以聚乙烯醇為載體，首先將聚乙烯醇溶液與活細胞懸浮液混合，以無菌淀粉為隔離成型劑成型，再經低溫冷凍定型、解凍、漂洗后加工成顆粒狀產物。本發明提供的方法簡便、可大批量生產。適用于所有微生物的固定化，造價低，產物無論在中性介質酸性介質或高濃度無機鹽介質中，強度都很高，使用壽命4800小時以上，實際上可使用1至數年，可廣泛應用于食品發酵工業和醫藥工業，改進傳統發酵工藝。
文檔編號C12N11/08GK1101943SQ9411508
公開日1995年4月26日 申請日期1994年8月26日 優先權日1994年8月26日
發明者邱懷廣, 施柔遠 申請人:北京市食品釀造研究所, 北京市釀造六廠