專利名稱：水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基的合成基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學，具體地說涉及采用計算機輔助設計基因DNA順序，DNA的全合成和重組技術以及基因表達調控等基因工程學，使大腸桿菌產生與從水稻葉子中分離得到的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基具有相同氨基酸順序的多肽。
核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，EC4，1，1，39，縮寫Rubisco)廣泛存在于光合自養生物中。在高等植物中Rubisco存在于葉綠體質體中，含量一般占可溶性葉蛋白50%以上，是自然界最豐富的一種蛋白[Ellis，R.J.，Trendg in Biol，Sci.(1979)4，241-244]。它是一雙功能酶，作為羧化酶，它催化碳固定循環(光合成)中的第一步反應，即核酮糖1，5二磷酸(RUBP)與CO2的反應，據估計地球上的植物每年約固定5x1014千克CO2使之成為有機碳;作為加氧酶，它催化光呼吸過程的第一個反應，光呼吸導致一部分被固定的碳再被釋放到空氣中去。Rubisco顯然是光合作用中的關鍵性酶，但是它的催化活性不高，不是一種高效的催化劑。因此，“改良”Rubisco，即改善其羧化與加氧的相對活性并提高其催化效率，使之更有效地固定有限的CO2，從而加快植物生產，是眾多科學家研究Rubisco的最終目標。
Rubisco具有復雜的亞基結構，除去某些紫色非硫細菌中的Rubisco僅由一種亞基組成外，所有其他來源的Rubisco大多數是由8個大亞基(分子量各為50-55kD)和8個小亞基(分子量各為12-18kD)組成，即這種蛋白質的亞基結構為L8Sa。催化部位在大亞基上，但是沒有小亞基結合在大亞基上，酶的活性極其微弱(約為全酶的0.5%)[Piarce，J.，Plant Biol.(1989)8，189]。
水稻是亞洲地區主要的糧食作物，選擇水稻Rubisco作為研究對象，探索其結構與功能的關系，提高水稻的光合作用效率，具有現實意義。已有的研究表明，象其它植物一樣，水稻Rubisco由8個相同的大亞基(縮寫rbcL)和8個相同的小亞基(縮寫rbcS)組成，其大亞基(簡稱RrbcL)由葉綠體基因編碼，基因順序已被測定，從DNA順序推導的RrbcL具有477個氨基酸殘基[參見文獻Nishizawa，Yoko and Hirai，Atgushi，Jpn，J，Genet.(1987)62，389-395][
圖1]。
分子生物學技術的應用是改變Rubisco光合作用效率的一個有效途徑。通過重組DNA技術(特別是基因突變技術)可以系統地進行Rubisco結構與功能關系的研究，從而得到高效率Rubisco的基因。隨著DNA合成技術的發展，合成基因由于其操作簡便性而越來越顯示出它在基因工程上的優勢，這包括在合成基因中設置均勻分布的單一的限制性內切酶位點從而使基因突變變得容易，通過在合成基因的兩端加上轉錄或翻譯的控制元件，省去了從基因組中克隆和表達目標基因所遇到的改變原基因的麻煩;通過在合成基因中選擇適合于給定宿主細胞高表達體系的密碼子，使合成基因能高效地表達。[參見文獻Ferretti，L.，Karnick，S.S.，Khorana，H.G.，Nassal，M.，and Oprian，D.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83，599-603.]。
為此，本發明的目的是設計合成一個水稻Rubisco大亞基結構基因，能直接在大腸桿菌中高表達出與天然水稻Rubisco大亞基具有相同氨基酸順序的多肽，并且在結構基因中設置多而且分布均勻的單一的限制性內切酶位點，以提供一個便于進行基因突變研究的基因工程體系。
本發明是一種能在大腸桿菌中高表達的水稻Rubisco大亞基的合成基因，是按大腸桿菌高表達體系的密碼子分配系數，經計算機輔助設計和全合成的水稻Rubisco大亞基結構基因(簡稱RrbcL G)，能以高產率(180mg/L)表達出單一的RrbcL，經檢查這個基因的產物具有與天然RrbcL相同的長度(從SDS-PAGE判斷)和相同的免疫性(免疫印跡)，能與水稻Rubisco小亞基(RrbcS)進行裝配，并且該基因便于對RrbcL通過突變進行系統的結構與功能研究。
1.基因的設計將477個殘基的氨基酸順序輸入計算機后，運轉有關程序，按大腸桿菌高表達基因簡并密碼子的相對使用數據[參見文獻Sharp，P.M.，et al.，Nucl.Acids Res.(1986)14，5134.]、設計盡可能多的常用的單一的限制性內切酶位點和合成基因能在大腸桿菌中有效起始表達的要求設計了含1466b.p.的RrbcL結構基因(圖1)，它含有編碼基因1437b.p.，核糖體結合部位，雙重終止密碼子，以及兩端的粘性末端EcoRI和BamHI。在這個合成基因中，除了兩端的EcoRI和BamHI外，我們還設置了45個常用的單一的限制性內切酶位點，它們的分布情況見圖2，而相應的RrbcL天然基因中只有12個這種位點。另外，對照RrbcL天然基因，在編碼區有284個堿基不一樣，這是為了改變266個氨基酸(占477殘基的56%)的密碼子，使RrbcL G適應于大腸桿菌高表達系統。顯然，RrbcL G更能有效地在大腸桿菌中高表達并且更有利于進行基因的定位突變和盒式突變，以便系統地從事水稻Rubisco的結構和功能關系的研究。
2、基因的全合成本發明參照該領域新穎而又簡單易行的方法[參見文獻Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878;Rossi，J.J.et al.，J.Biol.Chem.，(1982)257，9226-9229]，加以改進并有所創新后完成了RrbcL G的合成。用DNA連接酶經單鏈法催化連接化學合成的寡核苷酸片段成為單鏈DNA(ssDNA)大片段，或用DNA聚合酶將3’端部分配對的兩條寡核苷酸互補鏈復制成雙鏈，然后用DNA重組技術將連接成的RrbcL G的單鏈或雙鏈大片段克隆進一種質粒載體，并且在載體中裝配成完整的RrbcL G，得到含此基因的克隆質粒并且轉化一種大腸桿菌。
圖3表示RrbcL G被劃分為RL01、RL02、RL03三個大片段和它們由A、B、C、D……等等32個寡核苷酸片段組成。圖4、圖5、和圖6分別說明RL01、RL02、RL03三大片段的合成路線。在每個片段經DNA順序分析證明已正確獲得后，將它們組裝到載體pWR13中(圖7)，得到含完整RrbcL G的克隆質粒pC1RrbcL(于1994年11月14日提交中國典型培養物保藏中心，中國武漢，保藏編號CCTCC NOM94069)。
3、全合成RrbcL G的表達為了使全合成的RrbcL G能在大腸桿菌中高表達，本發明選擇了由強啟動子控制的表達載體質粒pPLc2833，并且在設計基因的DNA順序時(見前)綜合考慮了下述兩點要求(1)，按大腸桿菌高表達基因簡并密碼子分配系數選擇密碼子，(2)，在基因的5’-端設置與表達質粒和基因本身相匹配的核糖體結合部位(SD順序、ATG以及相關的核苷酸順序)。
如圖7所示，通過DNA重組將RrbcL G從pC1RrbcL中取出并插入表達載體pPLc2833得到表達質粒pE1RrbcL(于1994年11月14日提交中國典型培養物保藏中心，中國武漢，保藏編號CCTCC NOM94070)，轉化大腸桿菌C600(pcI857)。轉化子經預培養并誘導表達后，表達產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明(圖8)在與天然RrbcL G泳距相同的部位，出現一條隨表達時間延長產物數量逐漸增加的蛋白質條帶。
4、RrbcL G表達產物的純化與鑒定RrbcL G表達產物在大腸桿菌中以不溶物形式(即所謂的包涵體)存在，經過實施例4的操作可得到純度為95%以上的RrbcL純品(圖9)120mg/L。N-端氨基酸順序分析表明，純化產品的N-端順序與天然RrbcL的相同;免疫印跡試驗表明純化產品與天然Rubisco抗體有特異反應。
5、RrbcL G表達產物純化后與合成的RrbcS的裝配大亞基只有與小亞基結合并裝配成Rubisco整分子，才能表現出活性。本發明采用實施5的方法，將大小亞基一起以較稀的濃度溶于變性劑溶液中，然后逐步透析除去變性劑，離心澄清透析液并超濾濃縮，裝配產物經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析及免疫印跡試驗表明，在與天然水稻Rubisco相同位置處有一能與天然Rubisco抗體特異反應的條帶。
6、RrbcL突變體結構基因的構建和表達為了利用RrbcL G進行RrbcL突變，原則上先找出要突變的氨基酸密碼子(一個或幾個)在圖1中的部位，然后找到待突變氨基酸密碼子附近的二端限制性內切酶，決定要置換的限制性內切酶片段，并合成含有新密碼子的限制性內切酶片段后，用類似上述方法進行DNA重組構建突變體質粒，并進行突變體質粒的基因表達。
這里介紹RrbcL V377N突變體先在質粒pC1RrbcL上進行將第377位纈氨酸密碼子GTT變換成天冬酰胺密碼子AAC的限制性內切酶片段的置換，即用新合成的限制性內切酶片段，BsaHI-NgoMI，取代pC1RrbcL中原來的BsaHI-NgoMI片段的DNA重組，得到含突變體V377N結構基因的質粒pC1RrbcL-V377N，然后用實施例3相同的方法將突變體V377N結構基因從突變體質粒pC1RrbcL-V377N轉入表達載體pPLc2833得到突變體表達質粒pE1RrbcL-V377N，并轉化大腸桿菌C600(pcI857)后進行基因表達和表達產物的分離純化、分析鑒定等等。用相似的步驟對RrbcL G進行基因突變可以構建許多突變體基因，然后基因表達可得到許多RrbcL的突變體，通過與小亞基的裝配而獲得Rubisco全酶。研究這些酶的結構與功能的關系，從中可發現一些性能優良的Rubisco衍生物或新品種。
下面所給出的定義是為了更清楚地說明它們在本發明中使用的含義。
基因是指在生物合成一個蛋白質所需的完整DNA部分，一個基因包括結構基因，結構基因上游的轉錄啟動區，它啟動和調節結構基因的表達，和3’端多聚腺苷酸順序。
結構基因是基因的一個部分，包括編碼蛋白質和多肽的部分，有時包括其中一部分插入的DNA片段。結構基因通常可以在細胞中發現或通常不在其被引入的細胞位置上，在后一種情況下，它被稱之為異源基因。異源基因可以全部或部分地來自該領域已知的任何來源。結構基因在編碼區或翻譯區有一個或多個修飾，它們能影響表達產物的生物活性或化學結構、表達率或表達控制方式。這些修飾包括(但不局限于)突變、插入、缺失和一個或多個核苷酸的置換。
合成基因是指一個結構基因的DNA順序中編碼區的全部或大部分是化學合成的，如這里所列舉的，寡核苷酸片段是采用該領域熟知的過程化學合成，經退火和酶催化連接而形成基因片段，然后用酶催化進一步裝配這些基因片段成完整的基因。與這里所描述的合成基因的功能和結構相當的基因可采用該領域中所用的定位突變或其它有關的方法來制備。
簡并密碼子的使用是指一個特定的宿主細胞使用密碼子編制一個給定的氨基酸時所表現的選擇，在特定密碼子的選擇上有一定的優先。特定的密碼子在基因中的使用頻率是以基因中該密碼子出現的次數被編碼基因中相同的氨基酸的所有密碼(即所有簡并密碼子)出現的次數除來測定的。與此相似，宿主細胞，如本發明所用的大腸桿菌，密碼子使用的頻率可以通過在宿主細胞中表達的大量基因中密碼子使用的平均頻率而計算。這種分析局限于宿主細胞高表達的基因時則較好。為直觀起見，這種頻率往往表示成簡并密碼子的相對使用，即以密碼子的使用頻率乘以該密碼子相應氨基酸的簡并密碼子數。
當為提高宿主細胞中的表達而合成一個基因時，把該基因設計成其簡并密碼子的使用符合宿主細胞高表達基因的簡并密碼子的相對使用，這樣可使所合成的基因在宿主細胞中獲得高表達。本發明采用Sharp，P.M.等發表的大腸桿菌高表達基因的簡并密碼子相對使用數據[參見文獻Sharp，P.M.，et al.，Nucl.Acids Res.(1986)14，5134.](表1)。
克隆是指一群細胞中的每一個都衍生自同一個祖先細胞。克隆最重要的用處是將DNA片段，包括整個基因或一部份，通過載體(質粒、噬菌體和柯斯質粒)在宿主細胞中擴增。本發明合成的RrbcL G按此領域的常規方法重組進質粒后轉化大腸桿菌而得到擴增。
轉化是指穩定地將攜帶功能基因的一個DNA片段引入一個以前不含有該基因的生物體內。上述RrbcL G通過重組進質粒后轉化引入以前不含有該基因的大腸桿菌中。
基因表達是指結構基因轉錄和翻譯(或轉譯)而產生所編碼的蛋白質或多肽。本發明合成的RrbcL G在大腸桿菌中能產生與RrbcL天然基因在葉綠體中的產物相同的多肽，并且比天然基因在大腸桿菌中有更高的表達效率。
亞基裝配是指亞基單位以一定的比例和特定的結合方式聯合形成一完整的單位或構造。很多的酶都是由多個多肽亞基組成的，它們以特異的結合方式聚集生成有催化活力的一個整體。亞基的裝配，在體內是由一種叫分子伴侶(Molecular Chaperone)的蛋白質來完成的，在體外則往往是通過變性～復性過程來進行的，必要時也需要有分子伴侶的幫助。本發明水稻Rubisco大亞基和小亞基的裝配是在體外進行的。
本發明有下列優點1.不僅設計了RrbcL的編碼基因的核苷酸順序，而且也設計了與其5’端順序和表達載體相匹配的核糖體結合位點SD順序和起始密碼子ATG及有關核苷酸順序，這樣可使本發明的RrbcL基因在合成后轉入表達載體即可有效地進行表達。
2.按表達的宿主細胞高表達基因密碼子使用體系設計相應的結構基因，從根本上克服了天然基因在密碼子選擇上的缺陷。我們在RrbcL基因的密碼子選擇上消除了原天然基因中42個在大腸桿菌高表達體系中分配頻率極低的密碼子[表1]，為在大腸桿菌中實現高表達奠定了基礎。
3.在RrbcL G中，通過計算機輔助設計了盡可能多方便常用的限制性內切酶位點。不包括兩端粘性末端，RrbcL G中設置了45個常用的單一的限制性內切酶位點，還有多個常用的在其中有二～三個位點限制性內切酶部位，這些位點在合成的基因片段中出現時也是單一的。這樣，二個相鄰位點之間平均間隔約為30b.p.，因此可以很方便地利用RrbcL G進行基因的定點突變或盒式突變研究。
4.本發明RrbcL G的合成步驟簡單，采用了兩種新穎實用的方法并進行了推廣和改進。如RL02大片段的合成，將連接得到的DNA長單鏈復制成雙鏈后再克隆入宿主細胞，避免了單鏈克隆未知的復雜性，保證了合成片段克隆的準確性。
5.通過將合成的RrbcL和RrbcS溶解于強變性劑溶液后，稀釋到另一種較弱的變性劑溶液中，再逐步透析除去變性劑的方法，觀察到Rubisco分子的形成。雖然裝配效率很低，但這是高等植物Rubisco體外裝配的首次獲得，值得進一步的研究，為體外研究高等植物Rubisco的結構與功能的關系開辟道路。
以下的實施例可用作本發明的具體方案，它們不限制本發明的范圍。
材料與方法除下述材料與方法之外的參見文獻[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res，(1990)18，871-878.]。
Sep-pak C18反相柱來自Waters公司;
低熔點瓊脂糖凝膠和考馬斯亮蘭R-250來自GIBCO BRL公司;
限制性內切酶，多核苷酸磷酸化激酶，T4 DNA連接酶來自New English Biolabs或Boehringer Mannheim公司;
DNA順序分析所需的引物由本實驗室合成純化;ATP來自Amersham公司;
Sepharose CL 4B和質粒pUC18來自Pharmacia-LKB公司;
表達質粒pPLc2833和大腸桿菌C600(pcI857)系麻省理工學院Khorana教授贈送;
質粒pWR13和大腸桿菌JM83系中國科學院上海細胞生物學研究所郭禮和教授贈送;
十二烷基磺酸鈉(SDS)來自Boehringer Mannheim公司;
硝化纖維素膜來自美國Micro Filtration System公司;
4-氯-萘酚來自Sigma公司;
天然Rubisco抗體由上海市免疫學研究所周光炎教授幫助制備;
其它化學試劑均為市售國內產品。
寡核苷酸片段間的連接按單鏈法[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]進行。
3’-端部分配對的兩條寡核苷酸的互補鏈復制成雙鏈按Rossi等[Rossi，J.J.et al.，J.Biol.Chem.，(1982)257，9226-9229]的方法加以改進后進行。等摩爾的3’-端部分配對的兩條寡核苷酸片段在30℃配對半小時后，加入DNA聚合酶大片段在四種dNTP存在下，依次保溫反應25℃，5min;37℃，45min;25℃，10min。反應完成后，用乙醇沉淀出雙鏈DNA。
質粒的構建對需要進行重組的質粒先按選擇的限制性內切酶進行雙酶解，酶解物經低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離，按常規方法制備線性質粒大片段，然后與合成的基因片段或從另一個質粒雙酶解后分離的基因片段連接，連接產物按常規方法轉化大腸桿菌并以特定的抗菌素篩選轉化子。從pUC18或pWR13衍生的質粒轉化大腸桿菌JM83用氨芐青霉素37℃培養;從pPLc2833衍生的質粒轉化大腸桿菌C600(pcI857)用氨芐青霉素和卡那霉素30℃培養。從克隆出的菌落中挑選單菌落于LB培養液中按常規方法擴增和制備構建的質粒。[參見文獻Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniats，T.，Molecular Cloninga laboratory manual(2nd ed)(1989)，Cold Sping Harbor Laboratory Press，New York，]質粒中的基因DNA順序分析按文獻[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]的條件用pUC18或pWR13多接頭區兩端的通用引物或基因合成中用作配對的短寡核苷酸為引物。
基因表達這里介紹以pPLc2833為載體[參見文獻Remaut，E.，Tsao，H.，and Fiers，W.，Gene(1983)22，103-113.]的基因表達。
過夜培養的含表達質粒的菌液，稀釋后在30℃培養使A650nm升高到0.5-0.8轉入41℃熱誘導，直到A650nm不再增加為止，約誘導4小時。
表達產物的分離純化上述表達后的菌體經高速冷凍離心收集，懸浮于Tris.HCl緩沖液中，超聲破碎并分離收集包函體，后者經尿素、Triton、鹽酸胍等試劑的洗滌和處理后，溶于含鹽酸胍的緩沖液中，并且在鹽酸胍和巰基乙醇的存在下經凝膠過濾進一步分離純化，最后得到純度為95%、對天然水稻Rubisco抗體有特異免疫反應的基因工程RrbcL。
表達產物與RrbcS的體外裝配將RrbcL G表達產物與基因工程產品RrbcS [Chen，H.-B.and Wang，G.-A.，Curr.Plant Sci.Biotechnol.Agric.(1993)15(Biotechnology in Agriculture)，160-164]一起溶解于含鹽酸胍的緩沖液中，再將此溶液稀釋到含尿素的緩沖液中，然后依次對尿素濃度逐漸減少的緩沖液透析，最后離心除去沉淀并超濾濃縮。對濃縮液進行非變性電泳分析。
實施例1RrbcL G的設計(A)編碼DNA順序的設計在計算機VAX/11-780輔助下進行RrbcL G的設計，將已知的RrbcL氨基酸順序輸入計算機后，運轉美國國家生物醫學研究基金會(NBRF)贈送的軟件PSQ和NAQ，檢查由計算機逆翻譯的由簡并密碼子組成的RNA順序中可能出現的限制性內切酶的識別順序，然后按照(1)、大腸桿菌高表達基因密碼子使用頻率(表1)，(2)、在選定的克隆質粒pWR13中均勻安置單一的限制性內切酶在RrbcL合成基因中，和(3)、合成基因片段分段和消除自身配對等三項要求人工選定每個氨基酸的密碼子而確定RrbcL編碼基因的DNA順序如圖1中-25-1441的核苷酸排列次序。
(B)部分表達調控順序的設計如前述。我們采用質粒pPLC2833作為RrbcL合成基因的表達載體。為了使這個載體能實際運作，必須在啟動子與合成基因的5’端之間加上一個翻譯的啟動軟件，即核糖體結合部位，它包括SD順序和起始密碼子ATG及有關核苷酸順序。考慮到基因表達時轉錄出來的mRNA的5’端的200個核苷酸會形成二級結構，以及SD順序在這個初生態mRNA5’端二級結構中的狀況對表達的起始和產率會有很大影響[參見文獻Chen，H.-B.et al.，(1995)待發表]。這樣在計算機的輔助下，通過選擇5’-端密碼子的第三碼和SD順序和起始碼ATG之間的核苷酸順序，以使SD順序和ATG處于mRNA二級結構的環區，從而得到了圖1所示的順序。
最后，在這個設計的基因順序的3’-端加上二個終止密碼子TAA和TAG以及兩端為分子克隆所需要的EcoRI和BamHI限制性內切酶識別順序的粘性末端，得到圖1所示長度為1466b.p.的DNA順序。
實施例2RrbcL G的全合成(A)寡聚脫氧核苷酸的制備RrbcL G被劃分為如圖3所示的RL01、RL02和RL03三個大片段。RL01(476b.p.)進一步劃分為A、B、C、D、E、F和G七個正股寡核苷酸片段，二個末端負股片段A’b和fG’，以及中間四個短的連接用的橋式負股寡核苷酸bc、cd、de和ef。RL02(496b.p.)被劃分為H、I、J、K、L和M六個正股寡核苷酸片段，二個末端負股短片段hh和mm，以及五個橋式負股寡核苷酸片段hi、ij、jk、kl、和lm。RL03(490b.p.)的片段劃分與上面不一樣，它被劃分為正負股三組共計六個片段，即N(+)和O(-)、P(+)和Q(-)以及R(+)和S(-)。
總計32個寡核苷酸片段在DNA合成儀(ABI 381A型)上用固相亞磷酰胺三酯法合成。每個片段被單獨合成后，經濃氨水55℃處理8小時，使之從固相上脫落并切除保護基團，粗產品濃縮后溶于水，用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，含純產物的凝膠帶經碳酸氫三乙胺(1mol/l)浸出，用Sep-pek C18反相柱按Lo等人的方法[參見文獻Lo，K-M.，Jones，S.S.，Hackett，N.R. & Khorana，H.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81，2285-2289]脫鹽得到純的寡核苷酸片段。
純的寡核苷酸用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常規方法進行5’-磷酸化。
(B)寡核苷酸間的連接合成基因大片段a.RL01的合成如圖4所示，十三個片段分三組進行配對，即A、B、C、A’b和bc，D、E和de，F、G和fG’，然后合并，加入片段cd和ef，30℃保溫五分鐘后冷卻到0℃，加入T4 DNA連接酶，在16℃反應16小時。反應產物經低熔點瓊脂糖凝膠分離制備后，與已被EcoRI和ApaI雙消化了的線性質粒載體pUC1802＊相連，直接轉化大腸桿菌JM83。對轉化子擴增后提取質粒進行酶解分析，并且對初步肯定含有RL01片段的質粒作DNA順序分析，用原有的寡核苷酸片段對克隆片段中的減基缺失進行修復，最后再經DNA順序分析檢查，得到含RL01基因片段的質粒pRL01。
b.RL02的合成如圖5所示，用類似制備RL01的方法，分三組配對一次連接(由于片段較長，連接溫度宜在30℃進行)，制備出基因單鏈。單鏈基因片段與hh配對后與被ApaI和SalI消化過的pUC1802線性質粒相連。連接產物被酒精沉出后，與mm片段配對，在DNA聚合酶大片段＊ 此質粒系發明人實驗室從質粒pUC18衍生而來，用DNA重組技術將后者的多接頭區改為EcoRI-XhoI-ApaI-BamHI-XbaI-SalI-PstI-HindIII。存在及其相應的條件下反應一小時，然后加入T4 DNA連接酶和ATP，在16℃繼續反應六小時，轉化大腸桿菌JM83。對轉化子擴增提取質粒進行酶解鑒定和DNA順序分析，得到含RL02基因片段的質粒pRL02。
c.RL03的合成采用了完全不同于RL01和RL02的方法。如圖6所示，RL03大片段分成三組來完成N(+)和O(-)，P(+)和Q(-)，R(+)和S(-)。以N(+)+O(-)為例，N(+)和O(-)在50℃到25℃冷卻過程中配對，加入DNA聚合酶大片段在30℃反應一小時，沉淀出產物后，對其進行HindIII和SalI的雙消化，產物乙醇沉淀出后與HindIII和SalI雙消化的線性質粒pWR13相連，轉化大腸桿菌JM83，得到質粒pRL0301。類似地從另外四片段可分別得到pRL0302和pRL0303。但是，由于這四個片段較長(最長可達124核苷酸單位)，聚合反應的溫度必須在37℃，必要時[如R(+)+S(-)]還要加短片段(rr)以消除單鏈的二級結構。
對得到的三個質粒分別進行DNA順序分析，然后如圖6所示將酶解釋放出的三個片段一起重組進pWR13，得到pRL03，并作全順序分析。
d.如圖7所示，對pRL01、pRL02和pRL03分別作相應的酶解，放出的三個片段經常規方法純化后一起克隆入pWR13，轉化大腸桿菌JM83，最終獲得含整個基因的質粒pC1RrbcL。
實施例3合成的RrbcL G在大腸桿菌中的表達如圖7所示，質粒pC1RrbcL與pPLc2833分別經EcoRI/BamHI雙酶解，前者取較小的結構基因片段，后者取線性質粒較大片段，連接重組成表達質粒pE1RrbcL，并轉化大腸桿菌C600(pcI857)。取克隆的單菌落于20ml LB培養液中30℃搖蕩過夜，然后此培養液稀釋50倍至A650nm＝0.05-0.06，30℃培養約兩小時至A650nm＝0.5-0.8時，轉入41℃熱誘導表達，分別于15’、30’、60’、120’和240’各取樣1ml，離心后沉淀部分加入100ul菌體裂解液，懸浮并100℃煮三分鐘，離心后取等光密度的樣品量上樣，經15%十二烷基磺酸鈉變性的PAGE分離，然后用考馬斯蘭顯色。結果顯示在電泳遷移速度與天然RrbcL泳速相同的部位出現一條隨表達時間延長而蛋白量不斷增加的色帶(圖8)。
實施例4RrbcL G表達產物的純化及其免疫鑒定離心收集(7，000xg，15min，4℃)誘導表達且在41℃培養四個小時的500ml大腸桿菌(含pE1RrbcL和pcI857)菌體(約1.4g)，用TE緩沖液(pH 8.0)洗一遍后，懸浮于20毫升Tris.HCl緩沖液(pH 8.0，0.1mol/l)中，冰水浴中超聲破碎細胞5分鐘(超聲30秒，間隙30秒)，高速冷凍離心收集包涵體(10，000xg，10min，4℃)，4毫升含尿素(2mol/l)和2‰Triton的水溶液重新懸浮并放置半小時后，以同上一步的速度收集不溶物，再用上述相同的Tris.HCl緩沖液洗去尿素、Triton以及少量的雜蛋白。這樣得到的包涵體用10毫升含鹽酸胍(8mol/l)的緩沖液[Tris.HCl(pH7.8，100mmol/l)，NaCl(50mmol/l)，DTT(100mmol/l)]溶解(100℃3分鐘)，離心除去不溶物(26，000xg，15min，10℃)。
上述澄清液(5ml)加樣至-Sepharose CL 4B層析柱(2.2x50cm)中，此柱預先以洗脫液[Tris.HCl(pH7.8，100mmol/l)，NaCl(40mmol/l)，BME(1‰)，NaN3(0.2‰)，鹽酸胍(6mol/l)]平衡，以3cm/hr的速度淋洗產物，整個洗脫過程只出現一蛋白質峰，Kav＝0.55。合并，以Bradford法定蛋白量，得到約30mg的大亞基。產品經15%SDS-PAGE分離并電轉移至一硝化纖維素膜上，膜再被3%的牛血清蛋白飽和后，依次以抗水稻Rubisco的兔抗體和辣根過氧化酶(HRP)偶聯的羊抗兔抗體洗，最后用二氨基聯苯(DAB)顯色(圖9)，結果表明合成的RrbcL G的表達產物與水稻Rubisco抗體有特異反應。
實施例5RrbcL G表達產物與基因工程產品RrbcS的裝配下述實驗除注明外，都在室溫進行。取實施例4的柱層析溶液二毫升(1.5mg/ml)和一毫克基因工程產品RrbcS(0.5ml)，將它們稀釋到200毫升緩沖液[尿素(4mol/l)，Tris.HCl(pH7.8，40mmol/l)，MgCl2(10mmol/l)，BME(1‰)，EDTA(1mmol/l)，甘油(10%v/v)]中，依次對含不同濃度尿素的相同緩沖液分別透析24小時，尿素濃度依次為2.5mol/l、2.0mol/l、1.0mol/l、0.1mol/l。對含5%甘油的雙蒸水透析一次，最后對緩沖液[Tris.HCl(pH7.8，10mmol/l)，MgCl2(1mmol/l)，BME(5mmol/l)，EDTA(0.1mmol/l)]在10℃透析兩次。用100KD膜將透析液超濾濃縮到一毫升(10℃)，再真空濃縮到0.1毫升(0℃)。取樣分別用變性和非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移到硝化纖維素膜上，進行免疫印跡試驗(同上一實施例)。結果表明，得到了與天然Rubisco相比，具有相同的電泳性能和免疫性能的裝配分子(圖10)。
實施例6RrbcL V377N突變體結構基因的構建與表達(A)RrbcL V377N基因突變體限制性片段選擇和設計首先，我們從RrbcL G結構圖(圖1)中找到編碼第377位氨基酸(即纈氨酸，V377)的密碼子GTT，然后在其兩端選擇兩個合適的限制性位點，BsaHI和NgoMI。將密碼子GTT改成天冬酰胺的密碼子AAC，同時也將第384位纈氨酸密碼子GTA改為GTT，此處核苷酸順序的改變導致原有的BsaAI限制性位點的消失，這就方便了突變體基因與原基因的比較鑒定。這樣我們合成了下述雙鏈限制性內切酶片段BsaHINgoMICGTCATTCCGAACGCATCTGGTGGCATCCACGTTTGGCATATGAGTAAGGCTTGCGTAGACCACCGTAGGTGCAAACCGTATACGGCC黑體表示改變了的堿基，劃線部分說明BsaAI位點的消失。
(B)含V377N突變體基因克隆質粒的構建首先將質粒pC1RrbcL進行BsaHI的部分酶解，再用NgcMI對制備出的BsaHI單消化質粒徹底消化，分離制備最長的線性質粒大片段，然后以120的比例與上述新合成的BsaHI/NgoMI限制性DNA片段連接，連接產物轉化大腸桿菌JM83，轉化子經長度及BsaAI酶解情況與原質粒的比較，證實已得到含RrbcL V377N突變體基因的質粒pC1RrbcL-V377N。
(C)含RrbcL V377N突變體基因的表達和產物鑒定按實施例3相同的方法將質粒pC1RrbcL-V377N與pPLc2833重組得到表達質粒pE1RrbcL-V377N，轉化大腸桿菌C600(pcI857)并進行基因表達，然后按實施例4和例5相同的方法純化表達產物、進行產物鑒定和與小亞基的裝配試驗。結果類似，不再附圖。
此外，類似于實施例5，可以逐步突變本發明的合成基因，直到其中238個密碼子被改變，即使這樣得到的突變體基因，其密碼子與本發明的水稻Rubisco大亞基合成基因相對應的密碼子仍有50%以上相同。
權利要求
1.一種在大腸桿菌中高表達的水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(縮寫Rubisco，EC4，1，1，39)大亞基合成基因，其特征在于該基因的DNA核苷酸順序是如下所顯示的-25～1441的核苷酸。-2.5AATTCCTCTAAGGAGGTAAGAACAAA -1ATGTCCCCACAGACTGAAACTAAAGCTAGCGTTGGTTTTAAAGCAGGCGTTAAGGACTH S P Q T K T K A S V O F K A G V K DACAAGTTGACCTACTACACCCCGGAATATGAA 90Y K L T Y Y T P E Y EACTAAAGACACTGATATCCTGGCGGCTTTCCGTGTAACCCCGCAGCCGGGTGTTCCGCT K D T D I L A A F R V T F Q F G V FCTGAGGAAGCTGGCGCAGCTGTAGCGGCTGAA 180F E E A G A A V A A ETCTTCCACTGGTACCTGGACCACCGTATGGACTGACGGTCTGACGAGCCTGGATCGTTS S T G T W T T V W T D G L T S L D RACAAAGGCCGCTGCTACCACATCGAGCCCGTT 270Y K G R C Y H I K P VGTTGGTGAAGACAACCAGTACATCGCTTACGTTGCATATCCGCTGGACCTGTTCGAGGV G E D N Q Y I A Y V A Y P L D L R EAAGGTTCGGTAACCAATATGTTCACTTCTATC 360E G S V T N M F T S IGTTGGTAACGTGTTTGGCTTCAAAGCCCTGCGTGCACTGCGTCTGGAGGATCTGCGCAV G N V F G F K A L R A L R L K D L RTCCCGCCAACTTACTCTAAAACTTTCCAGGGC 450I P P T Y S K T F Q GCCGCCACACGGTATCCAGGTTGAACQTQACAAACTGAACAAATACGGCCGCCCGCTGCP P H G I Q V K R D K L N K Y G R P LTGGGTTGTACCATCAAACCGAAACTGGGCTTA 540L G C T I K P K L G LAGCGCTAAAAACTACGGTCGCGCGTGCTACGAATGTCTACGCGGTGGCCTGGACTTCAB A K N Y G R A C Y E C L R G G L D FCCAAGGATGACGAAAACGTTAACTCTCAGCCA 630T K D D E N V N S Q PTTCATGCGTTGGCGTGATCGATTTGTATTCTGCGCTGAAGCTATCTACAAGTCTCAAGF H R W R D R W V F C A B A I Y R S QCAGAGACTGGCGAAATCAAGGGCCATTATCTG 720A E T G E I K G E Y LAATGCTACTGCAGGTACTTGCGAAGAAATGATCAAACGTGCTORATTCGCGCGTGAGCH A T A G T C E E M I Q R A V W A R ETCGGTGTTCCGATTGTTATGCTCGACTACCTG 810L G V P I V H E D Y LACAGGCGGTTTCACCGCTAACACTAGTCTGGCACACTACTGCCGTGACAACGGCCTGCT G G W T A N T S L A E Y C R D N G LTTCTGCACATCCACCGTGCTATGCATGCTGTA 900L L H X H R A M H A VATCGACCGCCAGAAAAACCACGGTATGCACTTCCGTGTACTGGCAAAAGCTTTGCGTAI D R Q K N H G M H F R V L A K A L RTGTCTGGTGGCGATCACATCCACGCGGGCACC 990M S G G D H I H A G TGTGGTTGGTAAACTCGAGGGTGAACGCGAAATGACTCTGGGTTTTGTCGACCTGCTGCV V G K L E G E R K M T L G F V D L LGTGATGACTTCATCGAAAAGGACCGTGCGCGC 1080R D D F I K K D R A RGGTATCTTCTTTACCCAGGACTGGGTTTCCATGCCGGGCGTCATTCCGGTTGCATCTGG I F F T Q D W V S H P G V I P V A SGTGGCATCCACGTATGGCACATGCCGGCGCTG 1170G G I H V M H M P A LACTGAGATCTTCGGTGACGACTCTGTTCTCCAATTCGGTGGCGGCACCCTGGGCCATCT E I F G D D E V L Q F G G G T L G HCTTGGGGCAACGCACCTGGTGCTGCGGCAAAC 1260P W G N A P G A A A NCGTGTGGCCCTGGAGGCCTGCGTTCAGGCTCGTAACGAAGGTCGCGATCTGGCTCGTGR V A L K A C V Q A R N E G R D L A RAAGGCAACGAAATCATTCGTTCCGCTTGCAAA 1350E G N E I I R S A C KTGGTCTCCGGAACTGGCCGCGGCTTGCGAAATCTGGAAAGCGATCAAGTTCGAATTTGW E P E L A A A C H I W K A I K F E FAGCCGGTTGATAAACTGGACAGCTAATAG 1441E P V D K L D So(CCTAG)
2.如權利要求1所述的合成基因，其特征在于由這個合成基因衍生的突變體基因，與權利要求1所述的合成基因相對應的密碼子有50%以上相同。
3.如權利要求1和2所述的合成基因，其特征在于可應用于產生水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基及其突變體，包括將合成基因插入大腸桿菌質粒載體組成克隆質粒pClRrbcL和表達質粒pElRrbcL，然后轉化大腸桿菌宿主細胞，以及在大腸桿菌中的基因表達和表達產物的純化，并將其與水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基進行裝配，形成Rubisco整分子。
4.如權利要求3所述的合成基因，其特征在于所述大腸桿菌質粒載體是pWR13或pPLc2833。
5.如權利要求3所述的合成基因，其特征在于所述的大腸桿菌宿主細胞是JM83、C600或C600(pcI857)。
全文摘要
水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酰/加氧酶(縮寫Rubisco)大亞基的結構基因(1466 b，p，)已按大腸桿菌高表達密碼子分配系數重新設計和被全合成。這個含有45個單一的限制性核酸內切酶部位的合成基因已在大腸桿菌中高表達(180mg/l)，純化后的表達產物與基因工程產生的水稻Rubisco小亞基重組經免疫印跡法分析鑒定生成了分子量和免疫性與天然水稻Rubisco相同的產物。
文檔編號C12N15/70GK1106862SQ94114008
公開日1995年8月16日 申請日期1994年11月30日 優先權日1994年11月30日
發明者陳海寶, 王國安 申請人:中國科學院上海有機化學研究所