分離的在植物轉(zhuǎn)化中可作為嵌合基因終止區(qū)的dna順序的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：分離的在植物轉(zhuǎn)化中可作為嵌合基因終止區(qū)的dna順序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物轉(zhuǎn)錄基因中分離得到的終止區(qū)的用途，以及含該區(qū)域的新的嵌合基因的用途，和它們?cè)谥参镛D(zhuǎn)化方面的用途。
很多的表型特征與一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因的表達(dá)有關(guān)，這些基因可以被整合入植物的基因組，從而賦于這些轉(zhuǎn)基因植物有利的農(nóng)業(yè)性狀。在一定程度上，這些性狀包括有對(duì)作物病原物的抗性，對(duì)具有植物毒性的植物保護(hù)產(chǎn)物的抗性，生產(chǎn)具有食物或藥物價(jià)值的物質(zhì)。除了對(duì)編碼這些不同特性的基因進(jìn)行分離和定性之外，還必須提供適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)。這合適的表達(dá)包括定性和定量?jī)煞N水平。在定性水平上，例如在空間水平在特定組織中的優(yōu)先表達(dá)，或者在時(shí)間水平上誘導(dǎo)表達(dá)。在定量水平，通過(guò)導(dǎo)入基因表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量的積累。很大程度上，這種合適的表達(dá)取決于與轉(zhuǎn)移基因(transgene)相關(guān)的調(diào)節(jié)基因的存在，尤其與定量和定性的因素有關(guān)。在提供這種合適的調(diào)節(jié)的原始因素中，使用同源的或異源的，單一的或組合的啟動(dòng)子區(qū)域在科學(xué)文獻(xiàn)中已有大量描述。對(duì)于轉(zhuǎn)移基因下游的終止區(qū)的使用僅僅是為了設(shè)定一個(gè)邊界，使轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程停止，而沒(méi)有考慮到它們?cè)谵D(zhuǎn)移基因的定性或定量表達(dá)方面的作用。
本發(fā)明涉及從植物轉(zhuǎn)錄基因中分離得到的終止區(qū)的用途，以及含該區(qū)域的新的嵌合基因的用途，以及它們?cè)谥参镛D(zhuǎn)化方面的用途。尤其涉及到同時(shí)使用從同一植物轉(zhuǎn)錄基因中分離得到的終止區(qū)和啟動(dòng)子的同時(shí)效用。它使轉(zhuǎn)移基因的合適表達(dá)，無(wú)論是定性的還是定量的，可以在這些基因調(diào)節(jié)因子的控制下進(jìn)行。通過(guò)使用本發(fā)明而獲得的合適的表達(dá)涉及諸如對(duì)作物病原物的抗性、對(duì)具有植物毒性的植物保護(hù)產(chǎn)物的抗性以及生產(chǎn)具有食物或藥物價(jià)值的物質(zhì)之類(lèi)的特征。尤其，通過(guò)在植物的快速生長(zhǎng)區(qū)域優(yōu)先地、定性和定量地表達(dá)嵌合基因的表達(dá)產(chǎn)物，可以將提高的除草劑耐受性賦予轉(zhuǎn)基因植物。這種特定的耐除草劑基因的適當(dāng)表達(dá)，是通過(guò)同時(shí)使用擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)的H4A748組蛋白基因的啟動(dòng)子和終止區(qū)調(diào)控因子的同時(shí)效用而實(shí)現(xiàn)的。正如上面所提到的，通過(guò)使用調(diào)節(jié)因子賦于植物提高的耐除草劑性，這種表達(dá)模式可用于所有有價(jià)值的性狀。本發(fā)明也涉及到用這些基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及這些細(xì)胞再生而得的轉(zhuǎn)化植物，以及用這些轉(zhuǎn)化植物通過(guò)雜交而得到的植物。
在用來(lái)保護(hù)作物的植物保護(hù)產(chǎn)物中，系統(tǒng)的特征在于它們被使用后轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物，而且對(duì)于有效作物，在生長(zhǎng)的部分，尤其是莖和根尖積累，因此在除草劑存在的情況下會(huì)造成敏感植物的損傷，直至死亡。對(duì)于某些表現(xiàn)這種類(lèi)型的除草劑，其主要的作用方式是已知的，它能使與靶植物中正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的化合物的生物合成途徑中有關(guān)的特征酶失活。這些產(chǎn)物的靶酶可以位于不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，而且對(duì)已知產(chǎn)物的作用方式的觀(guān)察表明在大多數(shù)情況下其常常位于質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。
對(duì)該組除草劑中的物質(zhì)敏感、且其主要靶酶已知的植物的耐受性，可以通過(guò)將編碼靶酶的基因穩(wěn)定地導(dǎo)入其基因組中而實(shí)現(xiàn)，該基因可以來(lái)自于任一系統(tǒng)發(fā)育(phylogenetic)的起源，至于通過(guò)除草劑該基因表達(dá)產(chǎn)物的抑制特性可以改變，也可以不發(fā)生變化。另一種方法是在敏感植物的基因組中穩(wěn)定地導(dǎo)入任一葉遺傳性起源、能編碼將除草劑代謝成為對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)活性或者無(wú)毒的化合物的酶的基因。在后一種情況下，并不需要確定除草劑的靶目標(biāo)的特性。
如果已知這種的除草劑在所防治的植物中的積累和分布模式，那么表達(dá)這些基因的翻譯產(chǎn)物，從而使之在這些除草劑積累的地方，即植物快速生長(zhǎng)的區(qū)域優(yōu)先表達(dá)和積累是有利的。此外，當(dāng)這些產(chǎn)物的靶目標(biāo)位于除細(xì)胞質(zhì)之外的其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)中時(shí)，以前體形式表達(dá)這些基因的翻譯產(chǎn)物是有利的，該前體含有一段多肽順序，這段多肽順序使具有耐受性的蛋白質(zhì)可被定位于適當(dāng)?shù)募?xì)胞結(jié)構(gòu)中，尤其是質(zhì)體結(jié)構(gòu)。
為了闡明該方法，可以例舉的除草劑有草甘膦，sulphosate和fosametin它們都是膦?；谆拾彼峒易宓膹V譜系統(tǒng)的除草劑。相對(duì)于PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，這些除草劑主要是作為5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS，EC2.5.1.19)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物(PEP為EPSPS的底物)。在它們施用于植物后，它們被輸送入植物中快速生長(zhǎng)的部位，尤其是在莖和根尖積累，從而使敏感植物受到損傷，直至死亡。
這些除草劑的主要靶目標(biāo)，EPSPS是芳香族氨基酸生物合成途徑中的一個(gè)酶，它位于質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。該酶由一個(gè)或多個(gè)核基因編碼并以細(xì)胞質(zhì)前體的形式合成，然后被輸送入質(zhì)體并在此以其成熟形式積累。
植物對(duì)草甘膦以及該族除草劑的耐受性可以通過(guò)將植物或細(xì)菌來(lái)源的EPSPS基因穩(wěn)定地導(dǎo)入其基因組中而實(shí)現(xiàn)，至于草甘膦抑制該基因產(chǎn)物的特性，可以改變也可以不發(fā)生變化。如果已知草甘磷的作用方式，那么表達(dá)這種基因的釋放產(chǎn)物從而使它在質(zhì)體中高積累，并且在這些除草劑積累的植物的快速生長(zhǎng)區(qū)域積累是有利的。
通過(guò)在植物基因組中導(dǎo)入能夠編碼EPSPS的基因，該EPSPS至少攜帶有一個(gè)突變，從而使該酶對(duì)其競(jìng)爭(zhēng)性抑制物(草甘膦)有更大的抗性，在將該酶定位于質(zhì)體結(jié)構(gòu)中后，可以賦于植物對(duì)上述類(lèi)型的除草劑的耐受性，尤其是對(duì)N-膦?；谆拾彼峄虿莞熟⒌哪褪苄浴５?，為了在農(nóng)業(yè)條件下用這些除草劑處理植物時(shí)更具可靠性，有必要對(duì)這些技術(shù)加以改進(jìn)。
在本發(fā)明的描述中，“植物”意指能進(jìn)行光合作用的任何分化的多細(xì)胞有機(jī)體，“植物細(xì)胞”意指來(lái)自植的，能夠形成脫分化組織如愈傷組織，或者分化的組織如胚或植物部分或植物或者種子的任何細(xì)胞?！敖K止子區(qū)域”是指分離得到的位于編碼區(qū)的下游并且對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)構(gòu)區(qū)的長(zhǎng)度不同的一段DNA順序。對(duì)除草劑有耐受性的基因是指任何經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的起源，或者編碼除草劑的靶酶，該酶具有或不具有一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于除草劑抑制的特性方面的突變;或者編碼能將除草劑代謝成對(duì)植物無(wú)活性或無(wú)毒的組合物的酶的任何基因。植物的快速生長(zhǎng)區(qū)域是指大致上的細(xì)胞分裂繁殖的位點(diǎn)所在的區(qū)域，尤其是指頂端區(qū)域。
本發(fā)明涉及通過(guò)用含有對(duì)這些除草劑產(chǎn)品有耐受性的基因的新的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且再生后，生產(chǎn)對(duì)防治植物時(shí)積累于快速生長(zhǎng)區(qū)域的除草劑具有提高的更大耐受性的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明的主旨還在于，通過(guò)用含有對(duì)這些除草劑有耐性的基因的新的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并且再生后，生產(chǎn)出對(duì)膦?；谆拾彼峒易宓某輨┚吒竽褪苄缘霓D(zhuǎn)化植物。本發(fā)明還涉及這些新的嵌合基因，以及因?yàn)樵谶@些植物的快速生長(zhǎng)部位的耐受性更佳，從而更具耐受性的轉(zhuǎn)化植物，和用這些轉(zhuǎn)化植物雜交而得的植物。本發(fā)明的主旨還在于用于構(gòu)建上述嵌合基因的新的終止子區(qū)域。
更具體地，本發(fā)明的主旨是一種能賦于植物尤其是針對(duì)以EPSPS為靶目標(biāo)的除草劑的更大的耐受性的嵌合基因，它包括，在轉(zhuǎn)錄方向上，一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，一轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域，一個(gè)編碼對(duì)膦?；谆拾彼峒易宓某輨┯锌剐缘拿傅男蛄泻鸵粋€(gè)終止子區(qū)域，其特征在于，該終止子區(qū)域由植物組蛋白基因的終止子區(qū)域的一個(gè)片段構(gòu)成，該片段與其在衍生出該片段的基因中的最初定向相比處于任何定向，從而允許對(duì)除草劑具有抗性的蛋白質(zhì)能夠在該除草劑所積累的區(qū)域優(yōu)先表達(dá)和積累。
本發(fā)明中的終止子區(qū)域來(lái)自于組蛋白基因，該組蛋白基因來(lái)自于單子葉植物，如小麥、玉米或水稻，或者更好的可以來(lái)自于雙子葉植物，如苜蓿、向日葵、大豆、菜子或者更佳的是擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)。最好使用H3或更好的是H4組蛋白基因。
轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域包括，在轉(zhuǎn)錄方向上，至少一個(gè)來(lái)自編碼酶的質(zhì)體定位的植物基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，一部分編碼酶的質(zhì)體定位的植物基因的N-末端成熟部分的順序，和來(lái)自編碼酶的質(zhì)體定位的植物基因的另一段轉(zhuǎn)運(yùn)肽，較好的是根據(jù)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)/PCT 508，909的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亞基基因。該特征區(qū)域的作用是能夠最高效率地將成熟的多肽，最好是天然形式的，釋放進(jìn)入質(zhì)體結(jié)構(gòu)。
能用于本發(fā)明的嵌合基因的編碼順序來(lái)自于任何系統(tǒng)發(fā)育起源的具除草劑抗性的基因。該順序尤其可以是具有一定程度耐草甘磷的突變的EPSPS的順序。
根據(jù)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)/PCT 507，698，啟動(dòng)子區(qū)域可以是任何來(lái)源的，可以是單一或雙重形式，或者是在植物中與天然表達(dá)的基因相結(jié)合的形式，即，例如可以是細(xì)菌來(lái)源的，如胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子，或是病毒來(lái)源的，如花椰菜花葉病毒的35s轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，或者更佳的是植物來(lái)源的，例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亞基的啟動(dòng)子或者更佳的是植物組蛋白基因的啟動(dòng)子，而且最好來(lái)自于擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)。最好使用H3或更佳為H4組蛋的基因的啟動(dòng)子。
除了上述所提及的基本部分之外，本發(fā)明的嵌合基因還可以包括，位于啟動(dòng)子區(qū)域和編碼區(qū)域之間的不翻譯的中間區(qū)域(連接區(qū)域)，它也可位于編碼區(qū)域和終止子區(qū)域之間且來(lái)源于任何系統(tǒng)發(fā)育。
實(shí)施例1嵌合基因的構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明，嵌合基因的構(gòu)建由下列因子開(kāi)始進(jìn)行1)組蛋白基因啟動(dòng)子該啟動(dòng)子是從擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)的Strasboury的品種的H4A748克隆中分離得到的(M.E.Chaboute，Strasbourg大學(xué)，論文，1987和M.E.Chaboute等人(1987)Plant Mol.Biol.8，179-191)。該啟動(dòng)子，在用來(lái)分離它的AvaI位點(diǎn)之間含有約900 bp。在用Klenow聚合酶填平SalI和AvaI的突出末端后，將該啟動(dòng)子亞克隆入pUC18的SalI位點(diǎn)。pUc18可從目錄中得到(pharmacia ＃ 27-4949-01)。在所獲得的一個(gè)亞克隆中，啟動(dòng)子的5′端接近pUC18中，多連接物的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，而啟動(dòng)子的3′端接近pUC18中多連接物的XbaI酶切位點(diǎn)，此克隆隨后被使用，并且稱(chēng)之內(nèi)prom H4A 748/AvaI/SalI-pUC18。
2)轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及所用的成熟蛋白質(zhì)因子，和它們的裝配方式已有描述(M.Lebrun等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)/PCT508，909)。該區(qū)域包含約350bp并被稱(chēng)多為優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Optimized Transit Peptides OTP)。
3)抗除草劑的CT7基因它是由Salmonella thyphymurium中的EPSPS的突變的CT7基因分離得到的。(Pro 101至Ser)，由Stalker等人分離而得(1985)J.Biol.Chem.，260，4724-4728。由Calgene提供的pGM34-2克隆，在用XbaI酶線(xiàn)性化后，再用Vigna radiata(豇豆屬)核酸酶處理。再用SmaI重新酶切后，連接兩個(gè)鈍末端。所獲得的克隆在翻譯起始子ATG處有一個(gè)NcoI位點(diǎn)，并且在密碼終止子下游區(qū)域17bp處有一個(gè)SalI位點(diǎn)。該克隆被稱(chēng)為pRPA-BL-104。
4)OTP/CT7的融合含有按照閱讀框架將CT7基因與優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(OTP)相融合的表達(dá)片段(B.Leroux等人，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)/PCT 507，608)被克隆入pBSII SK(一)載體(Stratagens目錄＃212206)。該5′-OTP/CT7-3′片段在其5′端含有一個(gè)XbaI位點(diǎn)，在3′編有一個(gè)SstI位點(diǎn)。
5)GUS報(bào)告基因它是一個(gè)編碼β-葡糖苷酸酶(GUS)的基因，存在于質(zhì)粒pBI101-I上，該質(zhì)粒可從目錄(Clontech ＃ 6017-1)上得到。
6)組蛋白終止子區(qū)域它從擬南芥菜中的H4A748組蛋白基因分離得到(M.E.Chaboute，Strasbourg大學(xué)，論文，1987年和M.E.Chabout等人(1987)Plant Mol.Biol.，8，179-191)。分離出的一個(gè)661bp的Sau 3AI片段，用Klenow聚合酶處理后產(chǎn)生平頭末端，然后被亞克隆入phagemide pBluescript Ⅱ KS(+)的SmaI位點(diǎn)(Stratagene目錄 ＃ 212207)。該片段的DNA順序列于下達(dá)的“順序清單”部分。通過(guò)S1譜圖法(mapping)表明，該分離的DNA片段在其內(nèi)部的5′端處的200bp區(qū)域，沿起始的轉(zhuǎn)錄方向，含有對(duì)應(yīng)于分離得到的從該基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的mRNA的聚合腺嘌呤化位點(diǎn)前的順序。位于661 bp順序中的165位置處的核苷酸A(腺嘌呤)對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄中存在的增加聚合腺嘌呤化的位點(diǎn)(Chaboute M.E.等人，(1988)Gene，71，217-223)。所保存的兩個(gè)亞克隆中，其中一個(gè)的插入是按照H4A 748基因的起始的轉(zhuǎn)錄方向排列的，處于SstI-EcoRI片段的形式，被稱(chēng)為t-正向(轉(zhuǎn)錄正向)H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS，另一個(gè)克隆的插入處于相反方向，并處于SstI-EcoRI片段的形式，被稱(chēng)為t-反向(轉(zhuǎn)錄反向)H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS。
沿基團(tuán)的起始轉(zhuǎn)錄方向的擬南芥菜H4A748組蛋白基因的661bp的終止子區(qū)域的順序如下
7)終止子區(qū)域“nos”該片段含有pTi37中胭脂堿合成酶(nopaline synthase，nos)基因的終止子區(qū)域的信號(hào)(Bevan M.等人(1983)Nucl，Acids. Res.，11，369-385)，它位于質(zhì)粒pBI101-1上(Clontech ＃ 6017-I)，該質(zhì)?？捎赡夸浬峡傻?。
所有這些因子的裝配，以通過(guò)根癌農(nóng)桿桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化植物的二元載體，pBI 101-1的骨架結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，按以下方式進(jìn)行(pBI 101-1見(jiàn)Clontech 目錄 ＃ 6017-1)pRA-1的構(gòu)建來(lái)自擬南芥菜的H4A748組蛋白的啟動(dòng)子，以約900bp的Hind Ⅲ/XbaI片段的形式從質(zhì)粒prom.H4A748/AvaI/SalI-pUC 18上切下。通過(guò)連接將該片段插入用Hind Ⅲ/XbaI消化后的質(zhì)粒pBI 101-1中。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/GUS/nos終止子區(qū)域，并被稱(chēng)為pRA-1。
pRA-4的構(gòu)建來(lái)自擬南芥菜的H4A748的終止子區(qū)域，以約670bp的SstI/EcoRI片段形式從質(zhì)粒t-正向(轉(zhuǎn)錄正向)H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS上切下。在用SstI/EcoRI消化質(zhì)粒pRA-1后，通過(guò)連接，將H4A748終止子區(qū)域片段插入替代nos終止子區(qū)域。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/GUS/H4A748沿正向起始的終止子(引導(dǎo)方向)區(qū)域，并被稱(chēng)為pRA-2。
pRA-3的構(gòu)建來(lái)自擬南芥菜的H4A748終止子區(qū)域，以約670bp的SstI/EcoRI片段的形式，從質(zhì)粒(t-反向)轉(zhuǎn)錄反向H4A748/Sau 3AI/SmaI-pKS上切下。在用SstI/EcoRI消化質(zhì)粒pRA-1后，通過(guò)連接將該片段插入替代nos終止子區(qū)域。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/GUS/H4A748終止子(反向)區(qū)域，并被稱(chēng)為pRA-3。
pRPA-RD-146的構(gòu)建在用XbaI/Sst I消化質(zhì)粒PRA-1后，通過(guò)連接，將含有OTP/CT7的約1.75kbp的XbaI/Sst IDNA片段插入替代GUS基因。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/OTP/CT7/nos終止子區(qū)域，并被稱(chēng)為pRPA-RD-146。
pRAA-RD-147的構(gòu)建在用XbaI/SstI消化質(zhì)粒pRA-2后，通過(guò)連接將含OTP/CT7的約1.75Kbp的XbaI/SstIDNA片段插入替代GUS基因。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/OTP/CT7/H4A748沿正向起始的終止子區(qū)域，并被稱(chēng)為pRPA-RD-147。
pRPA-RD-148的構(gòu)建在用XbaI/SstI消化質(zhì)粒pRA3后，通過(guò)連接將含OTP/CT7的約1.75kbp的XbaI/SstI片段插入替代GUS基因。所獲得的重組質(zhì)粒，在嵌合基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄方向上，含有H4A748啟動(dòng)子/CTP/CT7/H4A748終止子區(qū)域(反向)，并被稱(chēng)為pRPA-RD-148。
實(shí)施例2報(bào)告基因活性的表達(dá)1)轉(zhuǎn)化和再生按照Bevan M.(184)Nucl.Acids Res.，12，8711-8721所述的轉(zhuǎn)化程序，用大腸桿菌HB101中的幫助質(zhì)粒pRK2013，通過(guò)三親結(jié)合法將載體引入根癌農(nóng)桿菌的非致癌性菌株LBA 4404(clontech目錄＃6027-1)中。
按照Valvekens D.等人(1988)Proc，Natl.Acad.Sci.USA，85，5536-5540中所述的轉(zhuǎn)化程序，用來(lái)自擬南芥菜L-生態(tài)型C24的根外植體，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)而言之，有3個(gè)步驟是必須的在補(bǔ)充了2，4-D和激動(dòng)素的Gambory B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的形成;在補(bǔ)充了2iP和IAA的Gambory B5培養(yǎng)基上形成芽;在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上生根和產(chǎn)生種子。
2)測(cè)量植物中的GUS酶活性a-組織化學(xué)觀(guān)察在大量的轉(zhuǎn)基因植物器官中GUS酶活性的顯示(Jefferson R.A.等人，(1987)EMBO J.，6，3901-3907)表明，GUS酶活性在分生組織區(qū)域內(nèi)優(yōu)克表達(dá)是由載體pRA-2和3所維持的。此外，載體pRA-2使得有可能在成熟組織(葉，根，穗狀花序)中觀(guān)察到GUS酶活性而對(duì)于載體pRA-1則不出現(xiàn)此情況。
b-熒光檢測(cè)對(duì)于每個(gè)載體PRA-1，2和3，通過(guò)熒光法測(cè)量來(lái)自12株植物的花芽和小玫瑰的葉子的提取物來(lái)確定GUS酶活性(Jefferson R. A.等人(1987)EMBO J.，6，3901-3907)。這12株植物分別對(duì)應(yīng)于各自的轉(zhuǎn)化過(guò)程。
積累數(shù)據(jù)的平均值，以pmol MU/min.mg prot.為單位表示，列于下表。
載體 葉(L) 芽(B) B/L比pRA-1 850.25 3965.33 4.66pRA-2 4890.67 33683.75 6.89pRA-3 4211.73 27752.45 6.59這些測(cè)量值清楚地表明，H4A748終止子區(qū)域，無(wú)論是正向或是反向，都能夠誘導(dǎo)嵌合基因表達(dá)活性的增加，尤其是在植物快速生長(zhǎng)的部位。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植物對(duì)除草劑的抗性1)轉(zhuǎn)化和再生按照Bevan M.(1984)Nucl.Acids Res.，12，8711-8721所述的轉(zhuǎn)化程序，用大腸桿菌HB101中的“幫助”質(zhì)粒pRK2013，通過(guò)三親結(jié)合此將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌的非致癌性菌株LBA 4404(Clontech目錄＃6027-1)中。
對(duì)煙草葉外植體的轉(zhuǎn)化是以Horsh R.等人(1985)，Science，227，1229-1231所描述的程序?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行的。從葉外植體再生的PBD6煙草(來(lái)源SEITA-法國(guó))是在含有30g/l蔗糖以及200μg/ml卡那霉素的Murashige和Skong(MS)基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，通過(guò)三個(gè)連續(xù)步驟進(jìn)行的第一步是在附加有30g/l蔗糖并含有0.05mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/l 6-芐基嘌呤(BAP)的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽，時(shí)間為15天。在第一步中有芽的形成，接著在附加有30g/l蔗糖但不含激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)10天。然后收集分化生長(zhǎng)的芽，將其在1/2MS培養(yǎng)基中生根(含有1/2原含量的鹽、維生素和糖但不含激素)。約15天之后，生根的芽被稱(chēng)栽于土壤中。
2)對(duì)草甘膦抗性的測(cè)量對(duì)于每個(gè)載體即pRPA-R-A，B和C有20株轉(zhuǎn)化植物再生，它們被移入溫室繼續(xù)生長(zhǎng)。當(dāng)這些植物在溫室中長(zhǎng)至5葉齡時(shí)，用Roundup的水懸浮液，相當(dāng)于每公頃0.8kg草甘膦的活性物質(zhì)，處理溫室中的這些植物。結(jié)果對(duì)應(yīng)于處理3周后所記錄的對(duì)植物毒性值的觀(guān)察。在這些條件下，可以觀(guān)察到，用載體的轉(zhuǎn)化的植物均表現(xiàn)出可接受的抗性(pRPA-RD-146)，或者較好的抗性(pRPA-RD-147和148)，而非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物卻完全死亡。這些結(jié)果清楚地表明了對(duì)于同樣的編碼具草甘膦抗性的基因通過(guò)使用本發(fā)明的基因，所帶來(lái)的抗性的提高。
按照本發(fā)明所得的轉(zhuǎn)化植物可以作為父本用于生產(chǎn)具有與導(dǎo)入的嵌合基因所表達(dá)的表型特征相當(dāng)?shù)钠废岛碗s交種。
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA順序，它可以作為在轉(zhuǎn)化植物中的嵌合基因的終止子區(qū)域，其特征在于，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，它含有至少一個(gè)植物組蛋白基因的終止子區(qū)域，從而使嵌合基因的翻譯產(chǎn)物能夠表達(dá)，尤其是在植物的快速生長(zhǎng)的部位能夠表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA順序，其特征在于，在嵌合基因的轉(zhuǎn)錄方向上，該終止子區(qū)域是定向的，與分離出該終止子區(qū)域的基因的轉(zhuǎn)錄方向上的起始定向相比，此DNA是正向或反向的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于雙子葉植物。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于擬南芥菜。
5.如權(quán)利要求1或2所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于單子葉植物。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于玉米。
7.如權(quán)利要求1-6中所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于H4植物組蛋白基因。
8.如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的DNA順序，其特征在于，組蛋白的終止子區(qū)域來(lái)源于H3植物組蛋白的基因。
9.如權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的DNA順序，其特征在于，終止子區(qū)域包含有幾個(gè)相聯(lián)系的終止子區(qū)域因子。
10.如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的DNA順序，其特征在于，終止子區(qū)域包含有一個(gè)與能在植物中天然表達(dá)的基因的終止子區(qū)域相聯(lián)系的組蛋白的終止子區(qū)域。
11.如權(quán)利要求1-10中任一個(gè)權(quán)利要求所述的DNA順序，其特征在于，它使具除草劑抗性的基因產(chǎn)物能在該除草劑在植物中積累的區(qū)域進(jìn)行表達(dá)。
12.轉(zhuǎn)化植物的嵌合基因，在其轉(zhuǎn)錄方向上至少含有一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，一個(gè)編碼除草劑抗性的基因順序和一個(gè)終止子區(qū)域，其特征在于，該終止子區(qū)域含有如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求中所述的DNA順序。
13.如權(quán)利要求12所述的嵌合基因，其特征在于，其啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)源于植物組蛋白基因。
14.如權(quán)利要求12或13中所述的嵌合基因，其特征在于，其啟動(dòng)子區(qū)域和終止子區(qū)域來(lái)源于同樣的植物組蛋白基因。
15.如權(quán)利要求12-14中任一權(quán)利要求所述的嵌合基因，其特征在于，其啟動(dòng)子區(qū)域含有雙重的植物組蛋白啟動(dòng)子。
16.如權(quán)利要求12-15中任一權(quán)利要求所述的嵌合基因，其特征在于，啟動(dòng)子區(qū)域含有與來(lái)源于在植物中天然表達(dá)的基因的另一不同的啟動(dòng)子相聯(lián)系的至少一個(gè)植物組蛋白基因的啟動(dòng)子。
17.如權(quán)利要求12-16中任一權(quán)利要求所述的嵌合基因，其特征在于，編碼基因能賦于植物提高的針對(duì)除草劑的抗性。
18.如權(quán)利要求17所述的嵌合基因，其特征在于，具除草劑抗性的基因與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域的DNA順序融合，從而使具除草劑抗性的基因的翻譯產(chǎn)物能夠在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中積累。
19.如權(quán)利要求18所述的嵌合基因，其特征在于，轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域能夠使具除草劑抗性的基因的翻譯產(chǎn)物在質(zhì)體結(jié)構(gòu)中積累。
20.如權(quán)利要求18所述的嵌合基因，其特征在于，轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域在沿轉(zhuǎn)錄方向上，包含有至少一個(gè)來(lái)源于編碼質(zhì)體定位的酶的植物基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，任意的編碼質(zhì)體定位的酶的植物基因的N-末端成熟部分的一段順序，和任意的來(lái)源于編碼質(zhì)體定位的酶的植物基因的第二轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
21.如權(quán)利要求13-20中任一權(quán)利要求中所述的嵌合基因，其特征在于，具除草劑抗性的基因所編碼的酶對(duì)于那些以EP-SPS為靶目標(biāo)的除草劑是有活力的。
22.如權(quán)利要求21所述的嵌合基因，其特征在于，具除草劑抗性的基因所編碼的酶對(duì)草甘膦有活力。
23.如權(quán)利要求21所述的嵌合基因，其特征在于，具除草劑抗性的基因可以是任一系統(tǒng)發(fā)育的起源。
24.一種轉(zhuǎn)化植物的載體，其特征在于，它含有如權(quán)利要求13-23中任一權(quán)利要求中所述的嵌合基因。
25.一種根癌農(nóng)桿菌菌株，其特征在于，它含有如權(quán)利要求23中所述的載體。
26.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，它含有如權(quán)利要求12-23中任一權(quán)利要求中所述的嵌合基因。
27.轉(zhuǎn)化的植物，其特征在于，它來(lái)源于如權(quán)利要求26所述的細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求13-23中任一權(quán)利要求中所述的嵌合基團(tuán)的構(gòu)建方法，其特征在于，分別分離如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的來(lái)源于植物組蛋白基因的終止子區(qū)域，至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域，以及至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因和一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，然后按照轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄方向來(lái)裝配這些順序。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的DNA順序，它能夠作為用于植物轉(zhuǎn)化的嵌合基因中的終止子區(qū)域。本發(fā)明還涉及(1)用于植物轉(zhuǎn)化的嵌合基因。(2)在沿轉(zhuǎn)錄方向上，它含有至少一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，一個(gè)轉(zhuǎn)基因和一個(gè)終止子區(qū)域，其特征在于，終止子區(qū)域至少含有一個(gè)來(lái)源于組蛋白的基因的終止子區(qū)域，從而使其在植物的快速生長(zhǎng)區(qū)域中表達(dá)蛋白質(zhì)。(3)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C12R1/91GK1101674SQ9410765
公開(kāi)日1995年4月19日 申請(qǐng)日期1994年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月25日
發(fā)明者R·阿塔納索夫, R·德羅斯, G·弗雷西內(nèi), C·吉戈, M·勒布倫 申請(qǐng)人:羅納-普朗克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司