海藻糖-釋放酶及其制備和用途的制作方法

專利名稱：海藻糖-釋放酶及其制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種海藻糖釋放酶，及其制備和用途，特別是，涉及一種新的海藻糖-釋放酶，它能夠特異性水解非還原性多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，所述的非還原性多糖含有作為一個末端單位的海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高，并涉及該酶的制備。本發明還涉及能產生所述酶的微生物，用所述酶得到的海藻糖，及含所述海藻糖的組合物。
已知海藻糖或α，α-海藻糖是一種由葡萄糖單位組成的非還原性多糖。如在Advances in Carbohydrate Chemistry(Vol.18，pp.201-225(1963)，Academic Press，USA出版)和Applied and Environmental Microbiology(Vol.56，pp.3，213-3，215(1990))中描述的那樣，海藻糖廣泛存在于微生物、蘑菇、昆蟲等之中，盡管其含量相對低一些。海藻糖是一種非還原多糖，它既不與含氨基的物質如氨基酸和蛋白質反應，誘導氨基-羰基反應，也不會使含氨基酸的物質變質。因此，可以放心使用海藻糖而不必害怕引起令人不滿的焦化及變質。由于這些原因，迫切要求能夠工業化大規模制備海藻糖。
海藻糖的傳統制備方法是，例如，在日本專利公開No.154，485/75中公開的利用微生物的方法，和日本專利公開No.216，695/83中報道的方法，其中將麥芽糖-和海藻糖-磷酸化酶結合起來使用，將麥芽糖變成海藻糖。然而，前者，由于(以干固體(d.s.b)計算)作為起始材料的微生物中，海藻糖的含量通常低于15w/w%(除非特別說明，本說明書中的術語“w/w%”縮寫為“%”)，并且提取和純化步驟復雜，因此不適于工業化生產。后者有下列缺點由于海藻糖是經葡萄糖-1-磷酸形成的，不可能將作為底物的麥芽糖的濃度調整到符合要求的高水平;(ⅱ)磷酸酶的酶反應系統是可遞反應，并且實際的海藻糖產率比較低，且(ⅲ)基本上很難獲得穩定的反應系統并順利地將酶反應連續進行。因此，實際上，這些傳統制備方法不能作為工業化生產方法。
關于海藻糖的制備方法，在“Food Chemicals”(No.88，pp.67-72(1992，8))題為“Oligosaccharides”的專欄中，標題為“Current Status of Starch Application Development and Related Problems”的文章中指出“盡管海藻糖的應用廣泛，但在該領域已經報道過的，經直接多糖-轉移反應或水解反應的酶制備方法，從理論上講幾乎是不可能的。”因此，從專業角度考慮，認為用淀粉作材料，通過酶反應制備海藻糖是非常困難的。
已經知道，從原料淀粉如液化淀粉、糊精和麥芽糖寡糖(maltooligosaccharides)制備的淀粉部分水解產物，因其還原末端基團而表現出還原能力。通常用“右旋糖當量(DE)值”(以干重計)表示這些還原性淀粉部分水解產物的還原能力。已經了解，在這些還原性淀粉部分水解產物中，其有相對高的DE值的那些，通常分子重和粘度相對低，以及甜度及反應性水平相對高，并容易與帶有氨基的物質如氨基酸和蛋白質反應，從而引起令人討厭的焦化、氣味并損害其質量。
由于還原性淀粉部分水解產物的性質隨其DE值而改變，因此，還原性淀粉部分水解產物與其DE值之間的關系顯著。在該領域中，甚至不能相信可擺脫這種關系。
然而，本發明人確實改變了這種普遍觀點，并成功地創立了一種象日本專利申請No.362131/92中所描述的那種制備海藻糖的方法，其中，將葡萄糖淀粉酶與能形成非還原多糖(有一個作為一個末端單位的海藻糖并具有3或更高的葡萄糖聚合度)的非還原多糖-形成酶一起使用，以便對由原料淀粉制備的，葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解產物發生作用，從非還原性淀粉部分水解產物直接生產海藻糖。盡管，用此海藻糖制備方法，從非還原性淀粉部分水解產物生產海藻糖的產率為約30%，并且是一種可行的工業化制備方法，但從海藻糖產率看，仍存在著導致生產成本高的顧慮。因此，迫切需創立一種新的海藻糖制備方法，它可以提高由非還原性淀粉部分水解產物生產海藻糖的產率。
本發明的目的是以相對低的成本和從可穩定供應的淀粉，提供具有相對高的產率的海藻糖的制備方法。
為了達到上述目的，本發明人廣泛篩選了能夠生產一種新酶的微生物，所述酶可以具有海藻糖結構作為一個末端單位并且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原性淀粉部分水解產物中釋放海藻糖。結果，我們發現，如在日本專利申請No.362，131/92中公開的，從土壤中分離的根瘤菌屬中能形成非還原多糖的微生物，即根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031);和如在日本專利申請No.265，416/93中公開的，從土壤中分離的節桿菌屬中能形成非還原多糖的微生物;即節桿菌(Arthrobacter sp.)Q36(CCTCCM94030)生產一種新的海藻糖-釋放酶。我們還發現，當與非還原多糖-形成酶結合使用時，這種新的海藻糖-釋放酶能夠促進以令人滿意的高產率形成海藻糖的反應，并且通過讓這種新的海藻糖-釋放酶和一種非還原多糖-形成酶對還原性淀粉部分水解產物起作用，并回收含相對高純度海藻糖的反應混合物，容易制備海藻糖。我們從已知的微生物中廣泛地篩選了產生上述海藻糖-釋放酶的微生物。結果，我們發現，短桿菌(Brevibacterium)和微球菌(Micrococcus)屬的微生物產生能夠由(具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的)非還原多糖形成海藻糖的海藻糖-釋放酶，與來自根瘤菌和節桿菌屬的微生物的海藻糖-釋放酶相似，并完成了本發明。我們也研制了含由上述制備方法制備的海藻糖的組合物，如食品、化妝品和藥物，并完成了本發明。


圖1表示從用“DEAE-Toyopearl”凝膠裝的柱上洗脫本發明海藻糖-釋放酶和非還原多糖-形成酶的洗脫圖譜。
圖2表示溫度對從根瘤菌M-11微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶活性的影響。
圖3表示pH對從根瘤菌M-11微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶活性的影響。
圖4表示溫度對從根瘤菌M-11微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶穩定性的影響。
圖5表示pH對從根瘤菌M-11微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶穩定性的影響。
圖6表示溫度對從節桿菌Q36微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶穩定性的影響。
圖7表示pH對從節桿菌Q36微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶活性的影響。
圖8表示溫度對從節桿菌Q36微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶穩定性的影響。
圖9表示pH對從節桿菌Q36微生物得到的本發明海藻糖-釋放酶穩定性的影響。
根據本發明，一種根瘤菌屬的微生物，即根瘤菌M-11的鑒別試驗得出下列結果。按“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分類和鑒定)(由Takeji Hasegawk編輯;JapanScinticfic Socities Press，Tokyo，Japan，(1985)出版)中描述的方所完成試驗A.形態學在27℃，于營養瓊脂中培養時，細胞的特征通常以0.6-0.8xl.0-1.5μm的棒狀形式存在;
單個存在，但罕見按順序成對的或相連的形式;
不存在多形性;
具有游動性，不產孢子和有鞭毛;
非抗酸性;
革蘭氏染色陰性;
莢膜陰性;
異染粒陽性;和積累聚-β-羥基丁酸。
B.培養特性(1)在27℃，營養瓊脂板上培養時形成的菌落特征形態培養24小時后，得到直徑為約1.5mm的圓形菌落;
邊緣邊緣光滑;
投影平的或半球形;
光澤陽性;
表面光滑;
顏色形成沒有粉色素的奶油狀半透明菌落。
(2)27℃在瓊脂板上與右旋糖和胰胨培養時形成的菌落特征粘液樣的奶油狀半透明菌落。
(3)27℃，在瓊脂板上與酵母提取物和甘露醇一起培養時形成的菌落特征形態培養5天后，形成直徑約3mm的圓性菌落;
顏色粘液樣的奶油狀半透明菌落。
(4)27℃，在瓊脂板上與酵母提取物、甘露醇和剛果紅一起培養形成的菌落特征既不是淡粉色基本上也沒吸收剛果紅;
(5)27℃，在瓊脂板上，與酵母提取物，甘露醇和2%NaCl一起生長;
(6)27℃，在營養瓊脂斜面上培養時形成的菌落特征生長令人滿意;
形態線狀;和(7)27℃，在營養明膠中穿刺培養時，不能液化明膠。
C.生理特征(1) 硝酸鹽的還原陽性;
(2) 脫氮反應陰性;
(3) 甲基紅試驗陰性;
(4) VP-試驗陰性;
(5) 吲哚的形成陰性;
(6) 硫化氫的形成陽性;
(7) 淀粉水解陰性;
(8) 檸檬酸的利用陽性;
(9) 無機氮源的利用利用銨鹽和硝酸鹽;
(10) 色素的形成無;
(11) 脲酶陽性;
(12) 氧化酶陰性;
(13) 過氧化氫酶陽性;
(14) 生長條件在5.5-9.0的pH及4-35℃的溫度范圍內生長;
(15) 氧要求需氧(16) 碳源的利用和酸形成碳源 利用 酸形成D-葡萄糖 + +D-半乳糖 + +D-果糖 + +L-阿拉伯糖 + +D-木糖 + +L-鼠李糖 + +麥芽糖 + -蔗糖 + +乳糖 + -海藻糖 + -棉子糖 + +
甘露糖 + -糊精 + -衛矛醇 + -(17) 對氨基酸的脫羧酶試驗對L-Lys，L-Arg和L-鳥氨酸陰性;
(18) 氨基酸的利用利用L-谷氨酸鈉，L-天冬氨酸鈉，L-組氨酸和L-脯氨酸;
(19) DNase陰性(20) 3-酮乳糖(3-ketolactose)的形成陰性;和(21) DNA鳥嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的摩爾%61%。
將細菌學特征與Bergeys Manual of Systematic Bacteriology(第1版(1984))中已知微生物的特征進行比較。結果，表明將這種微生物鑒定為根瘤菌屬的微生物。這種微生物與苜蓿根瘤細菌種的那些相似，但可將其與它們區別開，原因是，這種微生物利用麥芽糖，乳糖和甘露醇但不形成酸，而且它既產生當作用于還原性淀粉部分水解產物時，能形成具有海藻糖結構的非還原多糖的酶，也產生可特異性水解非還原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，從而釋放海藻糖部分的新型海藻糖-釋放酶。還未報道過有這些特征的微生物。
本發明人將這種微生物命名為“Rhizobium sp M-11”，并于1992，12，24保藏在Fermentation Reasearch Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ibaraki，Japan。當天該微生物保藏被接受，并由該機構以FERM BP-4130的保藏號予以保藏。
除上述鑒定的微生物外，根瘤菌屬的其它菌株和其突變體只要能產生本發明的海藻糖-釋放酶，就適用于本發明。
根據本發明，一種節桿菌屬微生物，即節桿菌Q36的鑒定試驗得出下列結果。按“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分類與鑒定)(由Takeji Hasegawa編，Japan Scien tific Societies Press，Tokyo，Japan(1985)出版)中的描述完成試驗。結果如下A.形態學(1)27℃在營養瓊脂中培養時的細胞特征通常為0.5-0.7×0.8-1.6μm的棒狀形式;單個存在;
表現多態性;
沒有游動性、鞭毛且不產孢子;
非抗酸性;
革蘭氏染色陽性;
莢膜陰性;和(2)27℃在EYG瓊脂中培養時的細胞特征呈現一個棒球環。
B.培養特征(1)27℃在營養瓊脂板中培養時形成的菌落特征形態培養3天后，形成直徑約2-2.5mm的圓形菌落;
邊緣邊緣光滑;
投影半球形;
光澤有分泌物的光澤;
表面光滑;
顏色半透明和白色或淡黃色。
(2)27℃，在營養瓊脂板中培養時形成的菌落特征生長率令人滿意;和形狀線狀(3)27℃，在含酵母提取物和蛋白胨的瓊脂板中，斜面培養時的細胞特征生長率令人滿意;
形態線狀;和(4)27℃在肉湯和明膠中穿刺培養時的細胞特征液化肉湯和明膠。
C.生理特征(1) 硝酸鹽的還原陽性;
(2) 脫氮反應陰性;
(3) 甲基紅試驗陰性;
(4) VP-試驗陽性;
(5) 吲哚的形成陰性;
(6) 硫化氫的形成陽性;
(7) 淀粉水解陰性;
(8) 纖維素水解陰性;
(9) 檸檬酸的利用陽性;
(10) 無機氮源的利用;
利用銨鹽和硝酸鹽;
(11) 色素的形成陰性;
(12) 脲酶陽性;
(13) 氧化酶陰性;
(14) 過氧化氫酶陽性;
(15) 生長條件在5-10的pH和4-37℃的溫度范圍內生長;
(16) 氧需求需氧;
(17) 碳源的利用和酸形成碳源 利用 酸形成D-葡萄糖 + -D-半乳糖 + -D-果糖 + -L-阿拉伯糖 + -D-木糖 + -L-鼠李糖 + -麥芽糖 + -
蔗糖 + -乳糖 + -棉子糖 + -甘露糖 + -糊精 + -衛矛醇 + -(18) 氨基酸的利用利用L-谷氨酸鈉，L-天冬氨酸鈉，L-組氨酸和L-脯氨酸;
(19) DNase陽性(20) 3-酮乳糖(3-ketolatose)的形成陰性;
(21) 細胞壁的主要二氨基酸賴氨酸;和(22) DNA鳥嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的摩爾%63%。
將細菌學特征與Bergeys Manual of Systematic Bacterio Cogy(Vol.2(1986))中已知微生物的特征進行比較。結果，表明，將這種微生物鑒定為節桿菌屬的一種微生物。這種微生物的特征在于，它產生一種當作用于還原性淀粉部分水解產物時，能形成(具有海藻糖結構的)非還原多糖的非還原多糖-形成酶，和一種特異性水解非還原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，從而釋放海藻糖部分的海藻糖-釋放酶。未公開報道過有這些特征的上述微生物。
本發明人已將這種微生物命名為“節桿菌Q36”，并于1993，6，3保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology，Ibaraki，Japan。當天微生物的保藏被接受，并由該機構以FERMBP-4316的保藏號予以保藏。
除上述微生物外，節桿菌屬的其它菌株和其突變體;只要能產生本發明海藻糖-釋放酶，就適用于本發明，所述的海藻糖-釋放酶能夠特異性水解(具有海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的)非還原糖性淀粉部分水解物中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。
其它微生物只要產生本發明的酶，就可用在本發明中。例如，除上述的根瘤菌M-11(FERM BP-4130)和節桿菌Q36(FERM BP-4316)外，至今為止，其它已知的微生物菌種如微黃短桿菌(Brevibacterium Helvolum)(ATCC11822)和玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC186)也很適用于本發明。
任何營養培養基只要上述微生物能生長于其上，且能產生本發明的海藻糖-釋放酶，就可用于本發明。例如，可隨意使用合成的和天然營養培養基。任何含碳的物質只要它能被所述微生物利用，就可作為碳源用于本發明。所述碳源的實例是多糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜和淀粉部分水解產物;和有機酸如檸檬酸和琥珀酸。適當選擇這些碳源在營養培養基中的濃度。例如，在用淀粉部分水解物時，從所述微生物生長和繁殖的角度看，優選的濃度通常是20%或更低，最好是5%或更低(d.s.b.)。可用于本發明的氮源是，例如，無機氮化合物，如銨鹽和硝酸鹽;含有機氮的物質，如脲，玉米漿，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉膏。可用于本發明的無機成分是，例如鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽和鎂，鋅，鐵，銅，鉬和鈷的其它鹽。如果需要，可以使用氨基酸和維生素。
將在本發明中可用的微生物于需氧條件下，通常在4-40℃的范圍，優選的20-35℃的范圍;及4-10的pH;優選的5-9的pH下培養。將在本發明中適用的培養時間調整至比所述微生物生長開始所需的時間更長，優選的是，10-100小時。沒有特別限制營養培養基中溶解氧(DO)的濃度，通常，使用0.5-20ppm范圍的DO是令人滿意的。通過控制通氣率，攪拌營養培養基，通氣補充氧，及增加發酵容器的內壓，可將DO濃度保持在該范圍內。
在微生物培養完成后，回收本發明的酶。在細胞和無細胞上清液中，都發現具有活性的本發明酶，可將其回收并用作粗酶。可將所得的培養物原封不動地用作粗酶。在本發明中，可以使用傳統的液-固分離方法，以便從培養物中除去細胞。例如，可以用將所得的培養物直接離心的方法，以及預涂布濾器將其過濾或通過使用平板濾器或空心纖維的膜過濾分離細胞的方法。可將因此得到的無細胞濾液原封不動地用作酶溶液或在使用前將其濃縮。本發明中可用的濃縮方法是，例如，使用硫酸銨的鹽析，使用丙酮和醇的沉淀法，和使用膜如平板濾器和空心纖維的濃縮法。
可將無細胞濾液和其濃縮物用于傳統的固定方法。傳統方法的實例是使用離子交換劑的結合法，使用樹脂和膜的共價鍵和吸收法，以及使用高分子量物質的包埋法。可以將從所得培養液中分離的細胞用作粗酶而不需任何進一步的處理或在使用前將其固定。例如，將細胞與藻酸鹽混合，在氯化鈣溶液中滴所得的混合物，將珠滴膠凝成顆粒，從而固定細胞。可以用聚亞乙基亞胺或戊二醛固定所得的顆粒。可以將由細胞提取的酶制品，在本發明中，作為粗酶溶液使用。通過從細胞中提取本發明的酶，包括用超聲波，使用玻璃珠和氧化鋁的機械破碎，法蘭西壓力(freneh-press)破碎等，使得到的提取物經離心或膜過濾，從而得到含本發明酶的粗酶澄清溶液。
可以原封不動地使用由此得到的粗酶溶液或在使用前，用傳統方法將其純化。例如，在電泳上呈現一個帶的純酶制品可以通過滲析粗酶制品而制備，通過用硫酸銨鹽析粗酶培養物并將所得產物濃縮，然后，在用“DEAE-Toyopearl ”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換柱上層析;用“Butyl-Toyopearl ”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析;和使用“Toyopearl HW-55”(一種凝膠過濾樹脂)的凝膠過濾層析(所有產品均是TosohCorpration，Tokyo，Japan的產品)，成功地純化滲析過的溶液，從而制備所述的粗酶制品。
由此得到的本發明海藻糖-釋放酶有下列物理化學特性(1) 作用特異性水解具有海藻糖結構為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;
(2) 分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000-68，000道爾頓;
(3) 等電點(pI)在用兩性電解質的等電點電泳上為約3.3-4.6;
(4) 最佳溫度在pH7.0培養30分鐘時，約35-45℃;
(5) 最佳pH在40℃培養30分鐘時，約6.0-7.5;
(6) 熱穩定性在pH7.0，培養30分鐘時，可穩定的溫度達到約30-45℃;
(7) pH穩定性25℃培養16小時，在5.0-10.0的pH內穩定。
按下列步驟檢測本發明海藻糖-釋放酶的活性將1ml酶溶液加到4ml 1.25w/w%麥芽三糖基海藻糖(別名α-麥芽四糖基α-葡糖苷)的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，將混合物在40℃培養30分鐘。將所得的反應混合物加到一銅溶液中進行Somogyi反應，以終止酶反應，然后，用Somogyi-Nelson方法確定還原能力。作為對照，在100℃將酶溶液預熱10分鐘以使酶失活，按與上述相似的方法檢測。將1單位的本發明酶活性定義為用上述方法檢測時，每分鐘增加1μmol葡萄糖還原能力的酶量。
任何物質只要它是一種含有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖，就可作為本發明酶的底物。所述底物的實例是糖基海藻糖如葡糖基海藻糖，麥芽糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻糖，麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻糖，這些糖是由非還原多糖-形成酶作用于麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽七糖而形成的。除這些底物外，通過用淀粉酶或酸部分水解淀粉物質如淀粉、支蓮淀粉和直蓮淀粉而制備的(具有海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的)相對低的還原性淀粉部分水解產物也適用于本發明。
部分水解淀粉的所述淀粉酶的實例是在Handbook of Amyloses and Related Enzymes(由Pergamon Press;Tokyo，Japan(1988)出版)中公開的α-淀粉酶、麥芽五糖-形成淀粉酶和麥芽六糖-形成淀粉酶。可以將這些淀粉酶與脫支酶如支鏈淀粉和異淀粉酶結合使用。
對在本發明中用作底物的還原性淀粉部分水解產物的濃度沒有特別的限制。根據本發明甚至可以在含0.1%或50%底物的溶液中進行酶反應，形成海藻糖。在本發明中也可使用含不可溶底物的懸浮物。在本發明酶反應中可用的反應溫度可以是本發明酶不失活的溫度，即最高達約55℃，優選的在40-55℃。在本發明酶反應中可用的反應pH是5-10pH，優選的是6-8pH。僅根據酶反應條件來選擇本發明酶反應所用的時間，通常，當以0.1-100單位/g底物d.s.b.使用本發明的酶時，大約需0.1-100小時。
關于從材料底物制備海藻糖的產率，特別是，在由具有相對低DE值的非還原性淀粉部分水解產物(即具有相對高的葡萄糖聚合度的那些)制備海藻糖的情況下，本發明的海藻糖制備方法具有提高海藻糖產率的優點，其產率大于用日本專利申請No.362，131/92中公開的制備方法(其中非還原多糖-形成酶與葡糖淀粉酶結合使用)所得的產率。本發明的制備方法，其中，非還原多糖-形成酶與本發明的海藻糖釋放酶結合使用，以約60%或更高的高產率形成海藻糖，而日本專利申請的制備方法，形成海藻糖的產率只有約30%。
本發明的酶機制如下首先用非還原多糖-形成酶將具有相對高的葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解產物轉變成1摩爾具有海藻糖結構作為末端單位的非還原多糖，然后，用本發明的海藻糖-釋放酶將所得的非還原多糖水解成1摩爾海藻糖和1摩爾比原材料還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度低2的還原性淀粉部分水解產物。對于新形成的葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解物，可以將其進一步轉化為有一個海藻糖作為末端單位的非還原多糖，然后，用海藻糖-釋放酶轉變成1摩爾的海藻糖和淀粉部分水解產物。因此，重復前述非還原多糖-形成酶和海藻糖-釋放酶的酶反應，可以從1摩爾還原性淀粉部分水解物形成一個或更多的海藻糖分子和數量比形成的海藻糖分子多2倍的，葡萄糖聚合度低于原料淀粉部分水解產物的非還原性淀粉部分水解產物。
在本發明制備方法中，可以同時使用非還原多糖-形成酶和本發明的海藻糖-釋放酶以作用于葡萄糖聚合度為3或更高的非還原性淀粉部分水解產物，或以該順序連續使用這兩種酶以作用于非還原性淀粉部分水解產物。為了進一步提高海藻糖產率，可使所得的反應混合物進一步經葡糖淀粉酶的作用。
用常規方法過濾并濃縮由此得到的反應混合物以除去不可溶物質，然后用活性炭將所得的溶液脫色，用H-和OH-形式的離子交換劑脫鹽，在濃縮成漿狀產品。可以隨意地將糖漿產品干燥成粉狀產品。
如果需要，用一種或多種方法，如離子交換柱層析、用活性炭或硅膠的柱層析分級分離進行純化;用有機溶劑如乙醇和丙酮分離法;和降解并除去剩余的還原多糖的堿處理法，很容易將粉狀產品加工成高純度的海藻糖產品。
如果需要，按照本發明，可以用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解含海藻糖的多糖產品，或使其經使用環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶和/或糖基轉移酶的多糖-轉移反應以控制其甜度和還原力并降低其粘度。此外，可以隨意地使多糖產品氫化以將其轉變成糖醇，從而降低其還原力。可以用上述的純化方法，如離子交換柱層析從所得的產品中除去葡萄糖以制備海藻糖含量高的流份。可以很容易將由此得到的流份純化并濃縮成糖漿產品，且，如果需要，可以進一步將糖漿產品濃縮成過飽和濃液并結晶以得到含水的晶狀海藻糖或無水的晶狀海藻糖。
在本發明中可用的離子交換柱層析技術包括，例如，在日本專利公開No.23，799/83和72，598/83中公開的，使用強酸陽離子交換樹脂的方法。使用這些技術，可以很容易地除去在粗海藻糖產品中所含的隨伴多糖以得到高海藻糖含量的產品。在這種情況下，可以隨意使用固定床，移動床和半移動方法。
為了制備含水的晶狀海藻糖，將約65-90%的海藻糖溶液放在一結晶器中，于95℃或更低，優選10-90℃的范圍內，在存在0.1-20%晶種的情況下，邊攪拌邊逐漸冷卻以得到含有含水晶狀海藻糖的糖膏。可以在本發明中使用傳統方法，如分離法、塊粉碎作用、流化床或成粒作用及噴霧干燥法以便從糖膏或晶狀多糖制備含水的晶狀海藻糖。
在分離時，使糖膏經籃式離心以便從母液中分離含水的晶狀海藻糖，如果需要，用少量冷水噴洗含水的晶狀海藻糖以促進高純度含水晶狀海藻糖的制備。噴霧干燥時，通過從一個高壓泵噴嘴射具有60-85%濃度(以干重計)約20-60%結晶度(以干重計)的糖膏，用約60-100℃不融化所得晶體粉末的熱空氣干燥所得物，邊向其吹約30-60℃熱空氣，邊攪拌所得的粉末約1-20小時，很容易制備沒有或基本沒有吸濕性的結晶多糖。在塊粉碎作用時，使水分含量為約10-25%且結晶度為約10-60%(以干重計)的糖漿放幾小時或3天以便使全部內含物結晶并固化成塊，粉碎或切割所得的塊，并將所得物干燥，從而很容易地制備沒有或基本沒有吸濕性的結晶多糖。盡管可以通過干燥含水的晶狀海藻糖以將其變成無水形式，來制備無水的晶狀海藻糖，但一般是通過提供水分含量低于10%的高海藻糖含量溶液，將該溶液放在結晶器中，在攪拌條件下，于50-160℃，優選80-140℃的范圍，存在晶種的情況下保持溶液以得到含無水晶體海藻糖的糖膏，將其結晶，在干燥和相對高的溫度下，用傳統方法如塊粉碎法、流化床成粒法和噴霧干燥將所得的無水晶體海藻糖粉碎，從而制備無水晶體海藻糖。
由此得到的本發明海藻糖是穩定的且基本上沒有還原能力，并可以與其它物質，特別是氨基酸和含氨基酸的物質如寡肽和蛋白質混合，而不必顧慮引起令人討厭的焦化和氣味以及所述物質的變質。海藻糖本身有令人滿意的高質量和甜度。由于海藻糖很容易被海藻糖酶水解，因此，口服時，能被活體同化，吸收和利用。此外，海藻糖基本上不會被誘發齲齒的微生物發酵，因此，這可使其用作甜味劑而基本上不誘發齲齒。
可以將本發明的海藻糖制成藥劑，如，用于輸血和管飼法的營養藥劑，可以隨意地將其施用于活體并很容易被活體代謝和利用而不必擔心引起毒性和副作用。因此，有利于將這些產品作為用于活體的能量補充藥劑。
海藻糖是穩定的甜味劑，特別是，當與粘合劑如支鏈淀粉，羥乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮結合使用時，晶體海藻糖可隨意被用作片劑的糖包衣劑。另外，海藻糖有許多特性，如控制滲透壓的能力、賦予填料的能力、賦予光澤的能力、保持溫度的能力、賦予粘度的能力、基本不發酵性、防止膠凝化淀粉退化的能力、以及防止其它多糖結晶的能力。
因此，可隨意地將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物作為甜味劑、味道改善劑、質量改善劑、穩定劑和填充劑用于各種組合物如食品、香煙、煙草、飼料、化妝品和藥物。
可將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物原封不動地用作甜味調料。如果需要，可以與足量的一種或多種其它甜味劑，如粉化的糖漿、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、異構糖、蜂蜜、槭糖、赤蘚糖、山梨醇、甘露醇、lactitol、dihydrocharcone、卡哈苡苷、α-糖基卡哈苡苷、rebaudioside、甘草甜、L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、甘氨酸和丙氨酸;和/或填充劑如糊精、淀粉和乳糖一起使用。
可以原封不動地使用含本發明海藻糖和多糖的粉末或晶體形式的本發明海藻糖和多糖組合物，如果需要，使用前，可以將其與賦形劑、填充劑、稀釋劑和粘合劑混合，并制成顆粒、球、短棒，扁片(plate)、錠劑和片劑。
含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物可與有酸味、鹽味、苦味、澀味及美味的其它物質很好地兼容，并有相對高的酸耐受性和熱抗性。因此，一般，可很好地將其用于食品，作為甜味劑、味道改善劑和質量改善劑。
可以將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物用于調味劑中，如氨基酸、肽、醬油、粉末化的醬油、“miso”、“fummatsu-miso”(粉末化的miso)、“moromi”(一種精制日本清酒)、“hishio”(一種精制醬油)、“fwrikake”(一種調味的魚飯)、蛋黃醬、調味品、醋、“sanbai-zu”(糖、醬油和醋的醬油)、“funmatsu-sushi-su”(用于sashi的粉末化的醋)、“chuka-no-moto”(用于中國菜的即溶混合物)、“tentsuga”(用于日本多脂肪煎食品的醬油)、“mentsuyu”(用于日本vermiui的醬油)、醬油、catsup、“yakiniku-no-tare”(用于日本烤肉的醬油)、curry roux、即食的燉混合物、即食的湯混合物、“dashi-no-moto”(即食的湯料混合物)、核酸調味品、混合調料、“mirin”(甜清酒)、“shin-mirin”(合成的mirin)食糖和咖啡糖。
可以將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物隨意用于增加以下食品的甜味“wagashi”(日本糕點)如“sendei”(大米餅干)、“arare-mochi”(大米糕點方糖)、“okoshi”(小米-和-大米糕點)，“mochi”(大米面團)，“manju”(帶有豆醬的甜點)，“uiro”(甜大米果胨)，“an”(豆醬)，“yokan”(豆子作的甜果胨)，“mizu-yokan”(軟adzuki豆果胨)，“kingyoku”(一種yokan)，果胨，paode Castella和“amedama”(日本乳脂糖);甜食如甜點心，餅干，干酪，小甜餅，派，布丁，黃油，牛奶蛋糊，奶油酥，牛奶雞蛋格子甜餅，海綿蛋糕，油炸餅圈，巧克力，口香糖，焦糖和糖果;冷凍甜點如冰激凌和甜味果汁粉，糖漿如“kajitsu-no-syrup-zuke”(保藏的水果)和“korimitsu”(用于刨冰的糖漿);加工過的水果和蔬菜如果醬，marmalade，“syrup-zuke”(腌水果)和“toka”(蜜餞);腌菜和腌制食品如“fukujin-zuke”(腌紅蘿卜)，“bettare-zuke”(一種腌的整個新鮮的蘿卜)，“senmai-zuke”(一種片狀的腌鮮蘿卜)和“rakkyo-zuke”(腌制的青蔥);腌菜和腌制食品的預混合物如“takuan-zuke-no-moto”(腌蘿卜的預混合物)和“hakusai-zuke-no-moto”(新鮮白油菜腌菜的預混合物);由產品如火腿和香腸;魚肉產品如魚火腿，魚腸，“kamaboko”(一種蒸魚團)，“chikuwa”(一種魚團)和“tenpura”(一種日本多脂肪煎魚團)，“chinmi”(開胃菜)如“uni-no-shiokara”(海膽的鹽腸)，“ika-no-shiokara”(烏賊的鹽腸)，“su-konbu”(加工過的tangle)，“sakic surmun”(干烏賊條)和“fugu-no-mirin-boshi”(干的mirin調味的河豚);“tsukudani”(在醬油中煮的食物)如紫菜，可食用的野生植物，干烏賊，魚和水生貝殼類動物，日常菜如“nimane”(烹飪的豆角)，西紅柿沙拉和“konbu-maki”(tangle roll);奶產品;罐裝和瓶裝產品如肉，魚肉，水果和蔬菜;含醇飼料如合成的清酒，葡萄酒和烈酒;軟飲料如咖啡，茶，可可，果汁，碳酸飲料，酸牛奶飲料和含乳酸菌的飲料;即食食品如即食布丁混合物，即食熱糕點混合物和“sokuseki-shirueo”(adzuki豆湯與大米糕點的即食混合物)和即食湯混合物;和飲料，如嬰兒食品、治療用食品、營養品飲料;并改善上述食品的味道和質量。
也可將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物用于動物如家養動物、家禽、蜜蜂、蠶和魚的鉰料和寵物食品，以改善其口味愛好。可以在團和液體形式和其它產品中，將海藻糖和多糖組合物用作甜味劑、味道改善劑、質量改善劑和穩定劑。如煙草、香煙、牙膏和牙膏粉、口紅、胭脂、唇膏、內服藥、片劑、錠劑、滴劑形式的魚肝油、cachou、口服致冷劑、含漱劑、化妝品和藥物。
可將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物作為質量改善劑和穩定劑用于對其有效成分和活性的喪失敏感的生物活性物質，以及含生物活性物質的健康食品和藥物組合物。上述生物活性物質的實例是淋巴細胞活素如α-，β-，和γ-干擾素，α-腫瘤壞死因子(TNF-α)，β-腫瘤壞死因子(TNF-β)，巨噬細胞遷移抑制因子，集落刺激因子，轉移因子和白細胞介素2(IL-2);激素如胰島素，生長激素，泌乳素，紅細胞生成素和卵泡刺激素;生物制品如BCG疫苗，日本腦炎疫苗，麻疹疫苗，活脊髓灰質炎疫苗，天花疫苗，破傷風類毒素，Trimeresurus抗毒素和人免疫球蛋白，抗生素如青霉素，紅霉素，氯霉素，四環素，鏈霉素和硫酸卡那霉素;維生素如硫胺，核黃素，L-抗壞血酸，魚肝油，類胡蘿卜素，麥角甾醇和生育酚;酶如脂酶，彈性蛋白酶，脲激酶，蛋白酶，β-淀粉酶，異淀粉酶，聚葡糖酶和乳糖酶;提取物如人參提取物，濃烏龜提取物，小球藻提取物，蘆薈提取物光蜂膠提取物;可存活的微生物，如病毒，乳酸菌和酵母;其它生物活性物質如蜂王漿。通過使用含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物，可以很容易將上述生物活性物質加工成具有令人滿意的高穩定性和質量的健康食品和藥物組合物，而不必擔心喪失或失活其有效成分和活性。
按上文所述，將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物摻入上述物質的方法包括傳統方法，例如，混合、捏合、溶解、融化、浸泡、滲透、噴淋、敷、涂上、噴、注射、結晶和固化。通常以0.1%或更高，優選的1%或更高(以干重計)的量，將含本發明海藻糖和多糖的本發明海藻糖和多糖組合物摻入上述的物質和組合物中。
下列實施例說明從根瘤菌M-11和節桿菌Q36微生物，以及迄今已知的微生物中生產并純化本發明的海藻糖-釋放酶。
實施例1用根瘤菌M-11生產海藻糖-釋放糖將含2.0w/v%“PINE-DEX井4”(Matstani Chemical Znd.Co.Ltd.Kyoto，Japan的淀粉產品)、0.5w/v%蛋白胨，0.1w/v%酵母提取物，0.1w/v%磷酸氫二鈉，0.1w/v%磷酸氫鉀和水的液體營養培養基，調pH到7.0。將約100ml等份的液體營養培養基放在500mlErlenmeyer燒瓶中，在120℃高壓滅菌20分鐘以滅菌，冷卻，用根瘤菌M-11(CCTCC M 94031)種子培養物接種，并于130rpm的攪拌條件下，于27℃培養24小時。收集所得的培養物并用作種子培養物。
將約20升在上述培養中所用的所述液體營養培養基的新鮮制備物放在30升的發酵罐中，滅菌，冷卻到27℃，用1w/v%的種子培養物接種，并在27℃，pH6.0-8.0，攪拌并通氣的條件下培養約72小時。
在培養物中，積累的非還原多糖-形成酶和本發明海藻糖-釋放酶的活性分別為約1.5單位/ml和約2單位/ml。將部分培養物離心，分離成細胞和上清液，并將細胞懸浮于50mM磷酸緩沖液(pH7.0)得到相同體積部分，接著檢測細胞懸浮液和上清液的酶活性。在細胞懸浮液中，非還原多糖-形成酶和本發明海藻糖-釋放酶的活性分別是約0.6單位/ml和約0.8單位/ml，而上清液含有0.9單位/ml的非還原多糖-形成酶和約1.2單位/ml的本發明海藻糖-釋放酶。
非還原多糖形成酶的檢測如下將1ml酶溶液加到4ml 1.25w/v%麥芽五糖的50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)中，該混合溶液于40℃培養10分鐘，并在100℃加熱10分鐘中止該酶反應。用一緩沖液將該所得反應混合物精確地稀釋到10倍，并以Somogyi-Nelson′S方法測定其還原能力。作為對照，一種酶溶液，在100℃預熱10分鐘，使該酶失活，再用如上方法進行檢測。該非還原多糖形成酶的一個活性單位定義為當使用上述方法檢測時，每分鐘消除1微摩爾的麥芽五糖的還原能力的酶量。
實施例2酶的純化對由實施例1方法得到的約18L培養液進行處理，用“MINI-RABO”(一種超高壓細胞破裂儀，由日本東京Dainippcn Pharmaceutical Co.，Ltd.經銷)破裂細胞。所得懸浮液于10，000，rpm下離心30分鐘得到約16L上清液。將硫酸鋁加到上清液中并使其溶解得到0.2的飽和度，并將得到的溶液于4℃放置1小時，在10，000rpm下離心30分鐘得到上清液。
將硫酸鋁加到所得的上清液中并使其溶解得到0.6的飽和度，并將所得溶液于10，000rpm下離心30分鐘，重新得到沉淀并將其溶于10mM磷酸緩沖液(pH7.0)中。如此得到的溶液在新鮮制備的相同的磷酸緩沖液中透析24小時，于10，000rpm下離心30分鐘除去不溶物。將所得的360ml透析液分成兩份，然后每份分別用以300ml“DEAE-Toyopearl”(由日本東京Tosoh Corporation上市的一種離子交換劑)裝填的柱進行柱層析。
目標的非還原多糖形成酶和海藻糖釋放酶被吸附于離子交換劑上，用新鮮制備的以不同鹽濃度的鹽補充的磷酸緩沖液將它們分別從柱上洗脫下來。圖1表示了該柱或柱層析的洗脫圖譜。在鹽濃度為約0.2M時，非還原多糖形成酶被從柱上洗脫下來，而在鹽濃度為約0.3M時，海藻糖釋放酶被從柱上洗脫下來。分別合并含有任何一種目標酶的流份并精制。
把合并的含有非還原多糖形成酶的流份在新鮮制備的用2M硫酸銨補充的同一磷酸緩沖液中透析。透析液于10，000rpm下離心30分鐘除去不溶物，所得上清液用以300ml“Butyl-Toyopearl 650”(一種疏水性凝膠，由日本東京Tosoh Corporation上市)裝填的柱進行疏水性柱層析。用從2M到0M范圍的線性梯度緩沖液將吸附于凝膠的酶從柱上洗脫下來，回收具有酶活性的流份。將所得流份用以300ml“Toyopearl HW-55”(一種凝膠層析樹脂，由日本、東京Tosoh Corporation上市)裝填的柱進行凝膠過濾層析，回收具有酶活性的流份。
對“DEAE-Toyopearl ”柱洗脫的具海藻糖釋放酶活性的合并流份，通過采用相似于非還原多糖形成酶制備中的純化步驟進行處理，此種方法即在含2M硫酸銨的緩沖液中進行透析，隨后進行疏水性柱層析和凝膠過濾層析。
表1顯示了每個純化步驟中非還原多糖形成酶的總酶活性、比活性及收率，而表2顯示了海藻糖糖釋放酶的相應內容。
表1純化步驟總酶*活性(單位) 比活性收率(%)(單位/mg蛋白)原料培養液 28,500 - 100細胞破裂后上清液 22,900 0.12 80鹽析后透析溶液 21,100 0.43 74離子交換柱洗脫液 15,200 6.2 53疏水性柱洗脫液 7,950 101 28凝膠過濾柱洗脫液 5,980 197 21注“＊”符號表示非還原多糖形成酶。
表2純化步驟總酶**活性(單位) 比活性收率(%)(單位/mg蛋白))原料培養液 37,400 - 100細胞破裂后上清液 31,500 0.17 84鹽析后透析溶液 29,200 0.60 78離子交換柱洗脫液 25,400 5.3 68疏水性柱洗脫液 18,700 98.5 50凝膠過濾柱洗脫液 11,600 240 31注“＊＊”符號表示海藻糖釋放酶。
純化過的酶制品(由表1和2中凝膠過濾柱得到的洗脫液)，使用7.5%聚丙烯酰胺，在電泳上測定其純度。結果，觀察到每種酶制品均呈單一蛋白譜帶，這表明它是具有較高純度的電泳單一制品。
實施例3海藻糖釋放酶的性質使用含10%十二烷基磺酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，將由實施例2中方法得到的部分純化的海藻糖釋放酶制品進行電泳，并通過將它與日本東京Japan Bio-Racl Laboratories上市的標識蛋白進行比較，測得其分子量為約57，000-68，000道爾頓。
使用含2v/v%“AMPHOLINE”(一種瑞典Uppsala Pharmaci a LKB Biotechnology AB上市的兩性電解質)，將另外部分的純化酶制品進行等電點電泳(isoeletrohopresis)。將所得凝膠切成片，然后測定它們的pH值，得到該酶的pI為約3.3-4.3。
根據對酶活性的分析來研究溫度和pH對該酶活性的影響。圖2(溫度的影響)和圖3(pH的影響)分別顯示了這些結果。
當于pH7.0培養30分鐘時，該酶的適宜溫度為約45℃，在40℃培養30分鐘時，該酶的適宜pH為約6.0-7.5。
通過將在50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中的酶在不同溫度下培養60分鐘，然后用冷水冷卻測試試管中的緩沖液并測定每份緩沖液中殘留的酶活性，從而來測定該酶的熱穩定性。通過將在不同pH的50mM磷酸緩沖液中的酶于25℃下培養16小時，調整這些緩沖液至pH7.0，然后分析每份緩沖液中殘留的酶活性來測定該酶的pH穩定性。圖4和5分別顯示了該酶的熱和pH穩定性結果。該酶在溫度高達約40℃和pH約5-10下是穩定的。
實施例4從末端為海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖制備海藻糖按日本專利申請No.362，131/92所述的方法來制備非還原多糖，該糖用作底物，它具有海藻糖結構的末端且葡萄糖聚合度為3或更高。往作為底物的含20%麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液中加入由實施例2方法得到的純化的酶制品，2單位/g底物(d.s.b.)，將所得混合物于40℃和pH7.0下進行酶反應48小時。將該反應混合物加熱，使殘留的酶失活，過濾、脫色、脫鹽并濃縮得到一種濃的糖溶液，然后用“XT-1016(Na型，聚和度為4%的一種離子交換劑，由日本東京Tokyo Oranic Chemical Industries，Ltd.上市)對該溶液進行柱層析。在柱層析中，用內徑為2.0cm，長為1m的3個套層的不銹鋼柱裝填離子交換劑，然后將這些柱順序級聯并加熱至柱內溫達55℃，將5v/v%濃糖溶液(對樹脂量)上樣，當溫度保持在55℃，且在SV(體積速度)為0.13下用55℃熱水洗脫(feed)，得到高純度的非還原多糖，該糖具有海藻糖結構的末端且葡萄糖聚合度為3或更高。在得到的制品中，葡糖基海藻糖制品含葡糖基海藻糖的純度為97.6%(d.s.b.)，麥芽糖海藻糖、麥芽三糖基海藻糖、麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻糖在它們的高純度制品中的純度分別為98.6%、99.6%、98.3%和98.1%(d.s.b.)。
配制含20%(d.s.b.)上述5種非還原多糖制品，即糖基海藻糖制品中的一種的水溶液，然后將該溶液與實驗例2中得到的純化的海藻糖釋放酶混合，2單位/g底物(d.s.b.)，然后將所得溶液于40℃和pH7.0進行酶反應48小時。把得到的每種反應混合物脫鹽并經高壓液相色譜(HPLC)(使用日本東京Wako Pure Chemical Industries Ltd.的“WAKOBEADSWB-T-330柱”)分析其組成。作為對照，將新鮮制備的同樣的海藻糖釋放酶作用于麥芽糖寡糖，例如麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖，并經HPLC分析得到的每種反應混合物的組成。表3顯示3該結果。


表3中的結果表明1、根據本發明的海藻糖釋放酶特異地水解具有海藻糖結構末端和葡萄糖聚合度為3或高于3的非還原多糖中的海藻糖部分和糖基部分之間的鍵，形成海藻糖和一種葡萄糖聚合度為1或大于1的非還原糖;且2、麥芽糖寡糖不被本發明的海藻糖釋放酶所水解。
這些結果證實本發明的海藻糖釋放酶是一種新酶，它具有特異地水解帶有海藻糖結構末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖中的海藻糖部分和糖基部分間的鍵，從而將海藻糖從非還原多糖中釋放出來。
為純化各種反應混合物中的海藻糖，將該反應混合物用以“XT-1016(Na+型)”(一種堿金屬型強酸陽離子交換樹脂，由日本東京Tokyo Organic Chemical Industries，Ltd.上市)裝填的柱進行柱層析，之后回收含97%或更高的海藻糖的流份。將這些流份合并并濃縮至約65%濃度，將該濃縮物于25℃放置2天使其結晶出水合結晶海藻糖，然后分離出這些結晶并真空下干燥得到純度為99%或更高的高純度海藻糖制品(d.s.b.)。用葡糖基海藻糖、麥芽糖基海藻糖、麥芽三糖基海藻糖、麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻糖為底物制備海藻糖的收率分別為9.5%、14.9%、16.0%、18.5%和17.7%(d.s.b.)。研究了高純度海藻糖制品和市場上購得的海藻糖樣品(作標準品)的熔點、融化熱、比旋光、紅外吸收光譜、粉末的X-衍射圖譜及被從豬腎中得到的海藻糖酶樣品(從美國St.Lauise，Sigma Chemical Co.購得)水解的容易性。結果，各種海藻糖制品顯示的熔點為97.0±0.5℃、融化熱為57.8±1.2KJ/mol和比旋光為+182±1.1°，這些數值與標準海藻糖樣品的數值十分吻合，還有海藻糖的紅外吸收光譜和粉末X-衍射圖也與標準海藻糖樣品十分吻合。與標準的海藻糖樣品相似，這些海藻糖制品分解為葡萄糖單體。
這些結果明確證實，由本發明的海藻糖釋放酶作用于具有海藻糖結構末斷且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖形成的非還原多糖是海藻糖。
實施例5從非還原性的淀粉部分水解產物制備海藻糖經加熱使含5%蠟狀玉米淀粉的懸浮液明膠化，調至pH4.5，加熱到50℃，與一種異淀粉酶(isoamylase)樣品(由日本Okayama，Hayashibara Biochemical Laboraloies Inc.上市)以4，000單位/g淀粉(d.s.b.)的量混合，并使該酶反應持續20小時。該反應混合物于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至60℃，然后用以750ml“Toyopearl 50s凝膠”(由日本東京Tosoh Corporation上市)裝填的柱進行凝膠過濾層析，得到葡萄糖聚合度為35-10的還原性淀粉部分水解產物。
將作為底物的一種如此得到的還原性淀粉部分水解產物或葡萄糖聚合度為3的麥芽三糖溶于10mM磷酸緩沖液(pH7.0)制成1%溶液，然后將該溶液與純化的非還原多糖形成酶和純化的海藻糖釋放酶(以實施例2中方法制備)以4單位/g底物(d.s.b.)的量混合，并于40℃進行酶反應24小時。待酶反應完全后，將得到的每種反應混合物進行脫鹽并經HPLC分析其組成。
將剩余的每種反應混合物加熱到50℃，調pH至4.5，以50單位/g底物(d.s.b.)的量與葡糖淀粉酶樣品(由日本東京Seikagakukogyo Co.，Ltd.上市)混合，然后進行24小時酶反應。與上面相似，將得到的部分反應混合物進行脫鹽并以HPLC分析其組成。表4顯示了該結果。
表4還原性淀粉部分水解 反應產物 組成(%)產物的葡萄糖聚合度A*B**海藻糖 80.8 83.5葡萄糖 0.2 16.534.1 還原寡糖 14.4 0.0糖基海藻糖 4.6 0.0海藻糖 79.7 82.5葡萄糖 0.2 17.526.2 還原寡糖 15.3 0.0糖基海藻糖 4.8 0.0海藻糖 77.7 80.7葡萄糖 0.2 19.318.1 還原寡糖 17.0 0.0糖基海藻糖 5.1 0.0海藻糖 75.0 78.5葡萄糖 0.3 21.515.2 還原寡糖 18.6 0.0糖基海藻糖 6.1 0.0海藻糖 66.1 70.1葡萄糖 0.3 29.910.0 還原寡糖 27.6 0.0糖基海藻糖 7.7 0.0海藻糖 4.2 20.83 葡萄糖 2.1 79.2(麥芽三糖) 麥芽三糖 65.0 0.0糖基海藻糖 28.7 0.0注符號“＊”表示一種非還原多糖形成酶與本發明的海藻糖釋放酶的酶反應后的組成，符號“＊＊”表示葡糖淀粉酶的酶反應后的組成。表中“糖基海藻糖”一詞表示具有海藻糖結構末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖。
如表4所示，在使用葡萄糖聚合度為3的麥芽三糖為底物的情況下，經非還原多糖形成酶與本海藻糖釋放酶發生酶反應后的海藻糖收率比較低，即4.2%，但在使用葡萄糖聚合度為10-34.1的淀粉部分水解產物為底物的情況下，該海藻糖的收率比較高，即66.1-80.0%。并發現還原性淀粉部分水解產物的葡萄糖聚合度越高，所得海藻糖的純度也越高。還發現通過使葡糖淀粉酶作用于由兩種酶水解還原性淀粉部分水解產物制得的反應混合物，將伴生的具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖水解成海藻糖和葡萄糖分子，能提高所得海藻糖的濃度。
實施例6美拉德反應將含1%甘氨酸、10%高純度海藻糖制品(純度為99.5%，d.s.b.，通過實施例4的方法得到)和50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的溶液于100℃保持90分鐘，然后冷卻該所得溶液并在1-cm槽中測定它在480nm波長處的吸收。作為對照，對葡萄糖和麥芽糖進行與上面相似的處理，再測定所得溶液于480nm波長處的吸收。表5顯示了該結果。
表5糖制品 顏色程度(480nm)海藻糖(本發明) 0.006葡萄糖(對照) 1.671麥芽糖(對照) 0.926表5的結果明顯地揭示本發明的海藻糖制品經美拉德反應誘導僅表現出較淺的顏色，即其顏色程度僅為葡萄糖和麥芽糖的約0.4-0.6%。
該結果表明，本發明的海藻糖基本上不參與美拉德反應。因此，本發明的海藻糖是一種當它們與氨基酸混合時，對氨基酸的破壞威脅性較小的一種糖。
實施例7體內利用試驗按照Atsuji等在“Rinsho-Eiyo”，Vol.41，No.2，pp200-208(1972)上報道的方法，把通過實施例4的方法得到的30g高純度的海藻糖制品(純度為99.5%，d.s.b.)溶于水中制成20w/v%的水溶液，然后將該溶液給六名健康的男性志愿者(26、27、28、29、30和31歲)口服。按計劃時間間隔采集這些志愿者的血樣，分析每份采集血樣的血糖和胰島素水平。用葡萄糖作為對照。結果，海藻糖表現出與葡萄糖相同的動力學，即在他們口服后約0.5-1小時后，其血糖和胰島素的水平最高。還表明該海藻糖制品很容易被消化、吸收、代謝并被機體用作能量來源。
實施例8急性毒性試驗給小鼠口服由實施例4中方法得到的高純度海藻糖制品(純度為99.5%，d.s.b.)來進行其急性毒性試驗。結果表明該海藻糖是一種毒性較低的物質，并且在以最高的可能劑量施用于小鼠時沒有小鼠死亡。雖然不太精確，該海藻糖制品的LD50為50g/kg或更高。
實施例9由節桿菌Q36生產海藻糖釋放酶與實施例1相似，用一發酵器，用節桿菌Q36的種子培養物代替根瘤菌M-11(CCTCC M94031)的種子培養物培養72小時。在所得的培養液中，非還原多糖形成酶和本發明的海藻糖釋放酶活性分別為約1.3單位/ml和約1.8單位/ml。與實施例1相似，對由所得到的培養液制備的細胞懸浮液和培養液上清液進行分析。前者的非還原多糖形成酶活性為約0.5單位/ml和海藻糖釋放酶的活性約為0.5單位/ml，而后者的非還原多糖形成酶活性為約0.8單位/ml和海藻糖釋放酶活性為約1.3單位/ml。
實施例10酶的純化用通過實施例9中方法得到的18L培養液，與實施例2相似來純化生成的非還原多糖形成酶。表6表示了每一純化步驟的結果。
表6 注符號“＊”表示非還原多糖形成酶。
表7 注符號“＊＊”代表本發明的海藻糖釋放酶。
通過采用與實施例2相似的電泳方法，對從表6和7中凝膠過濾層析柱洗脫液得到的純化的非還原多糖形成酶和海藻糖釋放酶的活性進行研究。結果分別觀察到它們為單一蛋白譜帶，這表明它們是純度較高的酶制品，在電泳上顯示出單一譜帶。
實施例11酶的性質在SDS-PAGE上測定用實施例10的方法得到的純化海藻糖釋放酶制品的分子量為約57，000-67，000道爾頓。以相似于實施例3中的等電點電泳法測定該酶的pI值為約3.6-4.6。與實施例3相似研究溫度和pH對該酶活性的影響及其熱穩定性和pH穩定性。圖6，7，8和9分別顯示了該溫度影響、pH影響、熱穩定性和pH穩定性。
從這些圖明確該酶制品的適宜溫度為約45℃;適宜pH為約6.0-7.5;熱穩定性高達約45℃;且pH穩定性為約5.0-10.0。
實施例12從具有海藻糖結構末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖來制備海藻糖按實施例4的方法，通過使用以實施例10中的方法得到的純化酶制品來試驗性地從具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖來制備海藻糖。結果表明，該酶制品從非還原多糖(與從根瘤菌 M-11得到的糖相似)中釋放出了海藻糖。
實施例13由已知微生物生產的海藻糖釋放酶及其性質迄今已知的微生物菌株中的微黃短桿菌(ATCC11822)和玫瑰色微球菌(ATCC186)，已被發明者證實它們能產生本發明的海藻糖釋放酶，與實施例1相似，將這兩種菌株分別在發酵器中于27℃培養72小時。將所得的每種菌株的18L培養液于細胞破裂儀上使細胞破裂，并離心得到上清液，然后順序用硫酸銨鹽析、透析，再經離子交換柱得到部分純化的酶制品，然后研究它的性質。根瘤菌M-11和節桿菌Q36的那些結果一起列于表8中。

按實施例12的方法，試驗性地從具有海藻糖結構末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖來制備海藻糖。結果表明，與由根瘤菌M-11得到的海藻糖形成酶相似，試驗的每種酶制品都從非還原多糖生成了海藻糖。
實施例14含N-末端的氨基酸序列將由根瘤菌M-11得到的部分純化酶制品(通過實施例2中方法得到)和由節桿菌Q36得到的部分純化酶制品用蒸餾水滲析，使用每種得到的制品的約80μg蛋白為樣品測定它們的含N-末端的氨基酸序列。用“PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A”(一種美國Foster城Applied Biosystem，Inc.的儀器)分析氨基酸序列，揭示了其N-末端的10個氨基酸殘基。表9表示了部分酶制品的含N-末端的氨基酸序列。
表9起始菌 含N-末端的部分氨基酸序列根瘤菌M-11 Ala-lys-Pro-Val-Gln-(CCTCC M 94031) Gly-Ala-Gly-Arg-Phe節桿菌Q36 Thr-Pro-Thr-Tyr-Pro-(CCTCC M 94030) Arg-Glu-Arg-Ala-lys表9明確表明從根瘤菌M-11得到的酶制品的N-末端是Ala.，Ala接下來的氨基酸序列是Lys-Pro-Val-Gln-Gly-Ala-Gly-Arg-Phe。在從節桿菌Q36得到的酶制品中，N-末端是Thr.，其接下來的氨基酸序列為Pro-Thr-Tyr-Pro-Arg-Glu-Arg-Ala-Lys。
實施例14(2)內部氨基酸序列將從根瘤菌M-11得到的酶制品(通過實施例2的方法獲得)和從節桿菌Q36得到的酶制品(通過實施例10的方法獲得)在10mM Tris-Hcl緩沖液中進行透析，得到的透析液分別用新鮮配制的相同的緩沖液稀釋得到約1mg/ml濃度溶液。往所得的每份1ml等份的溶液中加入10μg“LYSYL ENDOPEPIDASE”(一種日本，東京，Wako Pure Chemcal Industries，Ltd.的產品)，使其于30℃反應22小時生成肽，然后運用反相高壓液相層析(反相HPLC)分離出該肽。分離從根瘤菌M-11得到的酶制品的肽所用的反相HPLC的設備和條件是“CAPCELL PAK C18柱”，直徑為4.6mm，長250mm(日本東京Shiseido Co.，Ltd.的產品);流速，0.6ml/min;溫度，室溫;洗脫時間，60min;梯度，含有0.1V/V%三氟乙酸和16～48V/V%乙腈的線性梯度溶液。分離從節桿菌Q36得到的酶制品的肽所有的反相HPLC的設備和條件為“μ-BONDAPAK C18柱”，直徑2.1mm，長150mm(美國Milford，Chromatography Div.，MILLPORE Corp.的產品);流速，0.9ml/min;溫度，室溫;洗脫時間，60min;梯度，含有0.1V/V%三氟乙酸和30～55V/V%的乙腈的線性梯度溶液。通過測定210nm波長處的吸收來檢測從柱上洗脫下來的肽。從根瘤菌M-11的酶制品得到的三種肽稱為RT41、RT46和RT54的肽(其保留時間分別為約41、46和54)被從其它伴生的肽中分離出來，從節桿菌Q36的酶制品中得到的三種稱為AT7、AT30和AT48的肽(其保留時間分別為約7、30和48)被從其它伴生的肽中分離出來，之后真空干燥該分離出的肽，并將所得的肽溶于0.1～50V/V%不同濃度乙腈的200μl溶液中。在-蛋白序列儀上分析如此得到的肽樣品的多至10個氨基酸殘基的氨基酸序列。表10顯示了分析出的內部氨基酸序列。

如表10所示，從根瘤菌M-11得到的酶的肽RT41的內部氨基酸序列中10個氨基酸殘基中的9個與從節桿菌Q36得到的酶的肽AT30的內部氨基酸序列中10個氨基酸殘基中的9個相一致，而肽RT46中10個氨基酸殘基中的9個與肽AT48中的相一致。在肽RT54和AT7中，它們的10個氨基酸殘基中的8個是一致的。因此，可以斷定從根瘤菌M-11菌種得到的酶與從節桿菌Q36菌種得到的酶在其內部氨基酸序列上具有比較高的同源性，該序列可表示為Leu-Asn-Trp-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(“X1”代表“Ser”或“Ala”，“X2”代表“Ala”或“Glu”);Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(X3代表“Glu”或“Asp”);和X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asn-Ser(其中“X4”代表“His”或“Gln”)。
下述實施例A描述了本發明海藻糖釋放酶的制備，用該酶制備的海藻糖及含海藻糖的糖組合物;實施例B描述了含一種或多種這類海藻糖和糖的組合物實施例A-1按實施例1的方法，將根瘤菌M-11(CCTCC M94031)的種子培養物接種到一營養培養基上，并在發酵器中培養80小時。發酵完后，將所得的培養液用-SF-膜過濾除去細胞，得到約18L濾液，再用SF-膜將該濾液濃縮成約1L的酶溶液，該溶液含17.2單位/ml的非還原多糖形成酶和20.8單位/ml的海藻糖釋放酶。
往15%的土豆淀粉懸浮液(d.s.b.)中加入碳酸鈣使其終濃度達0.1%(d.s.b.)，將所得溶液調至PH6.0，與0.2%(重量)的“TERMAMYL 60L”(一種α-淀粉酶樣品，從丹麥、哥本哈根NoVo Industri A/S上市)混合，接下來于95℃進行酶反應15分鐘。該反應混合物在2Kg/Cm2壓力下高壓滅菌消毒30分鐘，冷卻至45℃，以1，000單位/g淀粉(d.s.b)的量與“PULLULANASE(EC3、2、1、41)”(一種由日本Okayama的Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.上市的酶樣品)混合，及以0.2ml/g淀粉(d.s.b.)的量與上述酶溶液混合，接下來進行48小時的酶反應。如此得到的反應混合物于95℃保持10分鐘，冷卻并過濾，所得濾液以常規方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化，之后再將得到的溶液濃縮得為60%糖漿，收率約為92%(d.s.b.)。
該糖漿含有70.2%海藻糖、2.4%葡糖基海藻糖、3.3%麥芽糖基海藻糖、0.7%葡萄糖、10.1%麥芽糖、12.9%麥芽三糖和0.4%的麥芽四糖和高級寡糖(d.s.b.)，它具有中等和高質感甜味，較低的還原性及適宜的粘度和保濕性能。由于這些性質，它可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質劑(quality-improving agent)、穩定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實施例A-2通過實施例1的方法得到的糖溶液為原料溶液，用以“XT-1016(Na+-型，4%的聚合度)(一種堿金屬型強酸陽離子交換樹脂，由日本東京Tokyo Organic Chemieal Industries Ltd.上市)填裝的柱分離。該過程如下用內徑為5.4Cm的4個套層的不銹鋼柱裝填樹脂，將該柱順序級聯使得到的總凝膠床深度為20m。將該柱加熱到柱內溫度為55℃，并在該溫度保持下，以5V/V%的糖溶液(對樹脂)上柱，用55℃熱水洗脫(feed)分離該糖溶液，以除去伴生的糖，例如麥芽糖和麥芽三糖，之后收集富集海藻糖的流份。將得到的該流份合并、純化、濃縮、真空干燥并粉碎得到高濃度海藻糖粉，收率為約56%(d.s.b.)。
該產物中海藻糖的濃度為約97%(d.s.b.)，且該產物具中等及高質感的甜味，因此它可任意地用于食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑。
實施例A-3通過實施例A-2方法得到的高濃度海藻溶液，以常規方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽，并濃縮成70%溶液，然后將該溶液放入結晶皿中，混入約2%水合海藻糖結晶作為晶種，再逐漸冷卻得到-糖膏，其結晶率為約45%。該糖漿在150kg/Cm2的高壓下經安裝于干燥塔頂部的噴嘴噴霧。在噴霧過程中，同時以從干燥塔頂部送入的85℃熱空氣使糖漿通風，用位于干燥塔底部的金屬絲網收集得到的結晶粉末，并在45℃的空氣流從下向上流經金屬絲網時緩緩移出結晶粉末。得到的結晶粉末注入老化塔中老化10小時使完全結晶并干燥，再重新得到粉狀水合結晶海藻糖，收率為約90%(對高含量海藻糖流份而言，d.s.b.)。
該產物基本上不吸濕，便于保存，因此使它可任意地用于食品、化妝品和藥用，作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑。
實施例A-4
與實施例A-3相似，純化通過實施例A-2方法得到的高濃度海藻糖流份，將所得溶液置于蒸發器中，真空蒸發得到糖漿，其濕度約為3.0%。所得糖漿放在結晶皿中，混入占糖漿干重1%的水合結晶海藻糖，在攪拌下于120℃結晶5分鐘，將得到的混合物置于一鋁質平面容器中，于100℃老化6小時得到塊狀物。
將所得塊狀物用一切削器粉碎，并經流化床干燥得到粉狀無水結晶海藻糖(其溫度為約0.3%)，收率為約85%(對高濃度海藻糖流份而言)。該產物可任意在食品、化妝品、藥品及它們的原料和中間體中用作干燥劑，也可用于各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中作白色粉狀甜味劑。
實施例A-5按實施例A-1的方法，將根瘤菌M-11(CCTCCM94031)的種子培養物接種到營養培養基上，用發酵器培養70小時，培養完后，用SF-膜濾去細胞得到約100L濾液，該濾液再用SF-膜濃縮至5L酶溶液，該溶液含有約410單位/ml的非還原多糖形成酶和490單位/ml的海藻糖釋放酶。
通過加熱將6%的土豆淀粉懸浮液明膠化，調至PH4.5，加熱至50℃，以500單位/g淀粉的量(d.s.b.)混入異淀粉酶樣品(由日本Okayama的Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.上市)，接下來進行20小時的酶反應。將該反應混合物調到PH6.5，于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至95℃，以0.1%/g淀粉的量(d.s.b.)混入“TERMAMYL 60L”(一種α-淀粉酶樣品，由丹麥哥本哈根的NoVo Industri A/S上市)接下來進行15分鐘酶反應。該反應混合物于130℃高壓滅菌30分鐘，冷至45℃，以0.01ml/g淀粉(d.s.b.)的量混入上述酶溶液，之后進行酶反應64小時。所得反應混合物于95℃保持10分鐘，冷至50℃，調PH至5.0，以10單位/g淀粉的量(d.s.b.)混入“GLUCOZYME”(一種葡糖淀粉酶樣品，由日本東京Nagase Biochemicals，Ltd.上市)，之后進行酶反應40小時，并加熱使殘留的酶失活。將如此得到的溶液以常規方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽并濃縮為約60%溶液(含80.5%的海藻糖，d.s.b.)。該溶液濃縮成84%溶液，之后置于結晶皿中并混入約占該溶液干重2%的水合結晶海藻糖作為晶種，在攪拌下結晶出海藻糖。將所得結晶放入平面塑料容器中，于室溫放置3天使結塊，用切削器將該塊狀物粉碎得到粉狀水合結晶海藻糖，收率90%(對原料淀粉而言，d.s.b.)。
該產物基本上不吸濕，且易于保存，因此使得它可任意用于各種組合物中，例如食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑。
實施例A-6按實施例9中的方法，將菌種節桿菌Q36(CCTCCM94030)的種子培養物接種于營養培養基中，在發酵器中培養72小時。所得培養液于10，000rpm下離心30分鐘除去細胞，用UF-膜濃縮得到的上清液，得1L酶溶液，它含有16.3單位/ml的非還原多糖形成酶和25.1單位/ml的海藻糖釋放酶。
將1份重的土豆淀粉與6份重的水和0.01份重的“NEOSPITASE”(一種α-淀粉酶樣品，由日本、東京的Nagase Biochemicals Ltd.上市)混合，攪拌，調至PH6.2并加熱至85～90℃使淀粉明膠化和液化。所得液態淀粉于120℃高壓滅菌10min使剩余的酶失活，冷至45℃，以500單位/g淀粉(d.s.b.)的量與異淀粉酶樣品(由日本Okayama，Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.上市)混合，和以0.2ml/g淀粉的量與上述酶溶液混合，然后進行酶反應48小時。待反應完全后，于95℃將該反應混合物加熱10min使剩余酶失活，調至50℃和PH5.0，以10單位/g淀粉量與“GLOCOZYME”(一種葡糖淀粉酶樣品，由日本東京，Nagase Biochemicals Ltd.上市)混合，之后進行酶反應40小時，并加熱使剩余的酶失活。如此得到的反應混合物以常規方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽并濃縮成約60%溶液，該溶液含78.3%的海藻糖(d.s.b.)。與實施例A-2的方法相同，只是使用“CG6000(Na+型)”(一種堿金屬型強酸陽離子交換樹脂，由日本東京，Japan Organ Co.Ltd.上市)作為離子交換劑，將濃縮的溶液進行離子交換柱層析，得到高濃度海藻糖流份，它含有約95%的海藻糖(d.s.b.)。將所得流份濃縮到75%的濃度，置于結晶皿中，攪拌下加入2%水合結晶海藻糖為晶種使其結晶，將結晶轉移到一平面塑料容器中，于室溫放置并老化3天，使結塊，然后將該塊狀物用切削器粉碎，得到粉狀水合結晶海藻糖，收率為約70%(對原料淀粉而言，d.s.b.)。
該產品基本上沒有吸濕性且易于保存，能任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、矯味劑、增質劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實施例A-7
按實施例13的方法，將微黃短桿菌(ATCC 11822)菌種的種子培養物接種到營養培養基上，在發酵器中培養72小時，得到的培養液用細胞破裂儀處理。所得混合物于10，000rpm下離心30min除去殘留物，用UF-膜濃縮得到的上清液，得到700ml溶液，該溶液含8單位/ml的非還原多糖生成酶和12單位/ml的海藻糖釋放酶。
33%的木薯淀粉懸浮液與碳酸鈣混合使其終濃度為0.1%，并調其PH至6.0，與0.3%“TERMAMYL 60L”(一種α-淀粉酶，由丹麥哥本哈根的NoVo Industri A/S上市)混合，然后在95℃進行酶反應20min。所得反應混合物在2kg/Cm2壓力下高壓滅菌30min，冷至40℃，再以200單位/g淀粉量與異淀粉酶樣品(由日本Okayama的Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.上市)混合，以0.2ml/g淀粉量與上述酶溶液混合，之后進行酶反應48小時。如此得到的反應混合物于95℃保持10min，冷卻并過濾，得到濾液，該濾液以常規方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽，再濃縮成60%糖漿，收率為約90%(d.s.b.)。
該產物含有60.1%海藻糖、1.4%葡糖基海藻糖、1.5%麥芽糖基海藻糖、1.0%葡萄糖、6.5%麥芽糖、8.3%麥芽三糖、21.2%麥芽四糖和高級寡糖，它具有中等和高質感的甜味，還具有較低還原性和適當的保濕性能。由于這些因素，它可任意地用于各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實施例A-8
將通過實施例A-6方法得到的含約95%海藻糖的高濃度溶液，以常規方法脫色和脫鹽。將所得溶液濃縮成75%溶液，然后將該溶液轉移到-結晶皿中，混入2%的水合結晶海藻糖作為晶種，加熱至50℃，攪拌下逐漸冷至25℃，用藍式離心分離出結晶。噴入少量水洗滌所得晶體得到純度為99%的高純度水合結晶海藻糖，收率為約50%。
實施例B-1甜味劑往通過實驗例A-5方法得到的1份重的粉狀水合結晶海藻糖中加入0.01份重“αGSWEET”(一種α-糖基卡哈苡苷產品，由日本東京Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.購得)和0.01份重“ASPARTAME”(一種L-Asp-L-Phe甲基酯產品，由日本東京Ajinomoto Co.，Ltd.投入市場)，將該得到的混合物送入制粒機，得到粒狀甜味劑。該產品有令人滿意的甜味，且甜度為蔗糖的2.5倍，熱量值低至蔗糖的2/5。
由于該產品具有令人滿意的穩定性，不會分解混入的其它甜味劑，它適宜作為為肥胖者和糖尿病患者提供的低熱量食品的低熱量甜味劑，這兩類人被限制攝入較少的熱量。
當誘導齲齒的細菌作用于該產物時，它基本上不形成酸和不溶性的葡聚糖，因此可使得它可用于甜味食品而避免齲齒的產生。
實施例B-2硬糖果加熱時，將100份重的55%蔗糖溶液與30份重的海藻糖糖漿(通過實施例A-7方法得到)混合，所得溶液于真空濃縮至濕度低于2%。該濃溶液與1份重的檸檬酸和足量的檸檬芳香劑及著色劑混合，用常規方法將該得到的混合物制成所需產品。
該產品是一種高質量的硬糖果，它具有令人滿意的味道和咀嚼特性，并且不用擔心會產生蔗糖結晶。
實施例B-3口香糖將3份重的膠基加熱至熔化變軟，之后與4份重的蔗糖和3份重的水合結晶海藻糖粉(通過實施例A-3方法得到的)混合，再與足量芳香劑和著色劑混合。用常規方法將所得混合物用輥揉制成型并包裝得所需產品。
該產品是一種具有令人滿意的結構和味道的口香糖。
實施例B-4甜濃縮牛奶將通過實施例A-1方法得到的三份重的海藻糖漿和1份重的蔗糖溶于100份新鮮牛奶中，所得溶液經平板加熱器加熱滅菌并濃縮成70%的濃度，隨后將得到的濃縮物無菌裝罐成所需產品。
該產品具有牛奶甜味和令人滿意的味道，這使它可任意地用在嬰兒食品、新生兒食品、水果、咖啡、可可和茶中作調料。
實施例B-5乳酸飲料將170份重的脫脂牛奶、130份重的海藻糖糖漿(通過實施例A-1的方法得到)和50份重的高含量乳蔗糖(lactoglucose)粉(如日本專利公開No.281，795/92中所公開)溶于1，150份重的水中。所得溶液于65℃滅菌30min，冷卻至40℃并接種30份重乳酸菌作為起始物，之后于37℃培養8小時得到所需產品。
該產品是一種具有令人滿意的味道和芳香的乳酸飲料。因為該產品含有寡糖，所以它可以保持乳酸菌的穩定并促進二裂菌的生長。
實施例B-6粉末果汁將33份經噴霧干燥得到的粉狀橘汁與50份重高含量海藻糖粉(通過實施例A-2方法制得)、10份重的蔗糖、0.65份重無水檸檬酸、0.1份重蘋果酸、0.1份重L-抗壞血酸、0.1份重檸檬酸鈉、0.5份重支鏈淀粉和足量粉狀芳香劑混合均勻。將所得混合物粉碎并送入制粒機制粒，同時以作為粘合劑的海藻糖糖漿(通過實施例A-1方法得到)噴霧并用400空氣通風。將如此得到的粒狀物進行稱重并包裝得所需產品。
該種含30%橘汁(d.s.b.)的產品能在較長時間內保持其高品質而不會產生令人不滿意的味道或難聞的氣味。
實施例7牛奶蛋糊凍將100份重玉米淀粉、100份重海藻糖糖漿(通過實施例A-7方法得到)、80份重乳糖、20份重蔗糖和1份重鹽混合均勻。所得混合物中混入280份重雞蛋、再逐漸加入100份重沸牛奶。這樣得到的混合物繼續加熱攪拌，當混合物中淀粉完全明膠化時停止加熱，得到半透明物，然后冷卻該混合物并往其中加入足量香草香精。將所得混合物稱重并注裝得所需產品。
該產品表面光滑并具光澤，并有牛奶味和甜味。
實施例B-8
Uiro-no-moto(淀粉糊預混物)將90份重米粉、20份重玉米淀粉、40份重蔗糖、80份重粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法得到)和4份重香草香精混合均勻，得到Uiro-no-moto。該產品用足量的matcha(綠茶)和水捏和，再將該混合物置于一容器中蒸60min，得到matcha-uiro。
該產品具有令人滿意的光澤和咀嚼特性，還有令人滿意的芳香和味道，還由于它很好地抑制了淀粉的降解，因而有較長的保存期。
實施例B-9An(豆糊)用10份重的adzuki豆為原料，以常規方法與水混合并煮沸，之后除掉豆的澀味和粗糙感及水溶性雜質，得到約21份重的“adzuki-tsubu-an”。往所得物中加入14份重蔗糖、5份重海藻糖糖漿(通過實施例A-1方法得到)和4份重的水，并將所得混合物煮沸，與少量沙拉油混合并小心捏合到使豆不成糊狀。這樣，就制得了約35kg所需產品。
不因煮沸而褪色的該產品具有令人滿意的味道和香味，這使它可用作豆醬面包、填豆醬包、湯團、填豆醬薄脆餅、冰糕和冰激凌的原料。
實施例B-10面包將100份重麥粉、2份重酵母、5份重糖、1份重粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法得到)、0.1份重無機食用酵母按一般方法與水捏合，于26℃發酵2小時，老化30分鐘并烤制。
該產品是一種高品質的面包，具有令人滿意的顏色和漲大及令人滿意的彈性和中等甜度。
實施例B-11火腿往1000份重的切成片的火腿肉中加入15份重鹽和3份重硝酸鉀并均勻磨碎，將該火腿肉片堆起并放在冷藏室過夜。然后，將該火腿肉片先于冷藏室在鹽溶液中浸泡7天，該鹽溶液含500份重的水、100份重鹽、3份重硝酸鉀、40份重非還原多糖的粉末(通過實施例A-6方法制備)及足量胡椒，再以常規方法用冷水洗，掛起薰制，烹煮，冷卻包裝得所需產品。
該產品是一種高質量的火腿，具有令人滿意的顏色、味道和芳香。
實施例B-12粉末狀肽將1份重“HINUES”(一種含40%可食大豆的肽溶液，由日本東京Fuji oil Co.推入市場)與兩份重含粉狀結晶海藻糖粉末(通過實施例A-6的方法制備)混合，所得混合物放入塑料器皿中，于50℃真空干燥并粉碎得到粉末肽。
該產品具有令人滿意的味道和芳香，可任意地用作糖果，例如預混物、冰糕和冰激凌的原料，也用作口服或飼喂形式的嬰兒食品和治療用營養品的原料。
實施例B-13粉末miso往1份重akamiso(一種miso)中加入3份重粉狀無水結晶海藻糖(通過實施例A-4的方法得到)。將所得混合物放入表面帶有半球形井的金屬盤中，并室溫下放置過夜，得到miso固體，每份重約4g，然后將該miso放入-粉碎器中，得到所需產品。該產品可任意地用作即食品和湯，還有miso糖果的調料。
實施例B-14粉末蛋黃用新鮮雞蛋制得的蛋黃，用平板加熱器于60～64℃滅菌，將1份重的所得液體與4份重粉狀無水結晶海藻糖(通過實施例A-4方法得到)混合(對-份重該液體而言)。將所得混合物轉入-容器中，放置過夜使結塊，此時無水結晶海藻糖轉化成水合結晶海藻糖。將這樣得到的塊狀物用切削器粉碎得到粉末蛋黃。
該產品可任意地用作糖果，例如預混物、冰糕、冰激凌和乳制品的原料，還有口服或飼喂形式的嬰兒食品和治療用營養品的原料。該產品也可用作皮膚護理劑(skin refiner)和生發劑。
實施例B-15化妝霜按常規方法加熱溶解2份重聚乙二醇單硬脂酸酯、5份重單硬脂酸甘油酯(自身乳化的)、2份重高含量海藻糖粉(通過實施例A-2方法得到)、1份重α-糖基蘆丁、1份重液態凡士林、10份重三-2-乙基環已酸甘油酯和足量抗菌劑。將所得溶液與2份重L-乳酸、5份重1，3-丁二醇和66份重純化水混合，并用均化器乳化所得混合物，再在攪拌下混入足量香精，得到化妝霜。
該產品有較高穩定性，可任意地用作高質量防曬霜、皮膚護理劑和皮膚增白劑。
實施例B-16
粉末人參提取物將半份重人參提取物與1.5份重粉狀無水結晶海藻糖(通過實施例A-4方法得到)混合，所得混合物轉入平面容器中，使之放置2天將無水結晶海藻糖轉化為水合結晶海藻糖，結塊。用切削器粉碎所得塊狀物，分份得到粉末人參提取物。
該產物和足量維生素B1和B2裝入制粒機制得含維生素的粉末人參提取物。
這樣得到的該產品可任意地用作滋補劑、疲勞恢復劑和強身劑。該產品也可用作生發劑。
實施例B-17固體藥品將天然的人干擾素-α制品(由日本東京Cosmo Bio.推入市場)用常規方法上固定有抗人干擾素-α抗體的柱以吸附干擾素-α，并將作為穩定劑的一種含牛血清蛋白的緩沖液上柱，然后除去過量蛋白。此后，用含5%高含量海藻糖粉(通過實施例A-2方法得到)的生理鹽水將干擾素-α從柱上洗脫下來，此時生理鹽水的PH發生變化。將所得洗脫液進行膜過濾，濾液通過加入20倍體積的“FINETOSE ”(一種無水結晶麥芽糖粉，由日本Okayama，Hayashibara Shoji，Inc.推入市場)。然后粉碎得到的脫水產物，并將所得粉末通過制片機制片，得到每片含約150單位天然人干擾素-α的藥片，每片重約200mg。
該產品可作為舌下片給患者口服，劑量為1-10片/或人/天，并任意地用于治療病毒性疾病、變態反應、關節炎、糖尿病和腫瘤。更具體地，該產品適于用作治療AIDS和肝炎的藥劑，患有這類疾病的患者數顯著增加。混在該產品中的海藻糖和麥芽糖作為天然人干擾素-α的穩定劑，因此其活性甚至在室溫下也能較好地保持較長的時間。
實施例B-18糖包衣片重150mg的未加工的片，用溶液進行包衣直至片的總重達230mg，該包衣用溶液組成為40份重粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法得到)、2份重香草香精(平均分子量為200，000)、30份重的水、25份重滑石粉和3份重二氧化鈦;將所得片劑再用一種溶液包衣，該溶液組成為65份新鮮制備的相同的水合結晶海藻糖、1份重香草香精和34份重水，并用液態石蠟上光，得到具有令人滿意光澤和外觀的糖包衣片。
該產品有較高的貯存耐受性(shock tolerance)并能在相當長的時期內保持其高質量。
實施例B-19牙膏通過將下列組份混合，用常規方法制備牙膏一氫磷酸鈣45.0%香草香精2.95%月桂基磺酸鈉1.5%甘油20.0%聚氧乙烯脫水山梨醇月0.5%桂酸酯抗菌劑0.05%
粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法制備) 12.0%Maltitol5.0%水13.0%該產品由于有足夠的甜味，可令人滿意地作為新生兒用牙膏。
實施例B-20飼喂用固體制品制備由下列組份組成的組合物500份重粉狀水合海藻糖結晶(通過實施例A-6的方法制備)、270份重粉末蛋黃、209份重脫脂牛奶、4.4份重氯化鈉、1.8份重氯化鉀、4份重硫酸鎂、0.01份重硫胺素、0.1份重抗壞血酸鈉、0.6份重維生素E乙酸酯和0.04份重尼克酰胺。將該組合物以25g每等份裝入防潮的層樣小袋并熱封制得所需產品。
將1袋該產品溶于約150～300ml的水制成流食，通過飼喂經口或非胃腸道施用到鼻腔、胃或腸道，以補充機體能源。
實施例B-21超級營養液將通過實施例A-8方法制備的高純度水合結晶海藻糖溶于水中制成10w/v%海藻糖水溶液，然后以常規方法將該水溶液進行膜過濾除去熱原，無菌條件下裝入塑料瓶中，封口得所需產品。
該產品，它是一種令人滿意的穩定超級營養液，存放時基本上不會產生變化，適于靜脈和腹內施用。該產品的10w/v%溶液與血液是等滲透，并表明它可以高于葡萄糖2倍的濃度向機體提供能量。
實施例B-22
超級營養液將通過實施例A-8方法制備的高純度水合結晶海藻糖和由下組份組成的氨基酸組合物攪拌下溶于水中，得到濃度分別為5w/v%和30w/v%，且與實施例B-10相似地純化該得到的溶液，獲得不含熱原的溶液，再將它注入塑料瓶中，封口制得所需產品。
氨基酸組合物的組成組份mg/100mlL-異亮氨酸180L-亮氨酸410L-賴氨酸單鹽酸鹽620L-甲硫氨酸240L-苯丙氨酸290L-蘇氨酸180L-色氨酸60L-纈氨酸200L-精氨酸鹽酸鹽270L-組氨酸單鹽酸鹽130甘氨酸340雖然該產品是一種含有海藻糖和氨基酸的復合超級營養液，但它具有令人滿意的穩定性，存放時基本上不會發生變化，所以可適于經靜脈和腹膜內施用于機體。該產品可任意地用于向機體補充能源和氨基酸。
實施例B-23治療損傷用軟膏將200份重高含量的海藻糖粉(通過實施例A-2方法制得)和300份重麥芽糖與含有3份重碘的50份重甲醇溶液混合，該所得溶液再與200份重的10w/v%的香草香精水溶液混合，得到具有令人滿意的伸展性和粘著性的所需產品。
該產品中含有的碘表現出殺細菌活性，該產品中的海藻糖作為活細胞的能量補充劑，由于這些性質，該產品縮短了創傷表面的愈合期，并使其恢復令人滿意。
由上可見，當本發明的海藻糖釋放酶與非還原多糖生成酶一起，作用于還原性淀粉部分水解產物時，它能以較高收率從非還原多糖中釋放生成海藻糖，所述非還原多糖具有海藻糖結構末端且葡萄糖聚合度為3或高于3。這樣得到的海藻糖可被簡便地分離和純化，所得的海藻糖和含有它的糖組合物具有令人滿意的穩定性及較高的質量和中度甜味。當口服未加工的產品或經胃腸道施用輸液劑時，該海藻糖可方便地被機體消化、吸收和利用。海藻本身和含有它的糖組合物可任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定性、賦形劑和填充劑。
因此，本發明提供了一種工業規模制備海藻糖和含有它的糖組合物的新技術，該技術以價廉和資源豐富的淀粉制備的淀粉部分水解產物為原料，具有較低成本。所以，本發明給許多領域帶來了不可預測的巨大影響，這些領域例如淀粉、酶和生化科學，和其它工業領域，制別是食品、化妝品和藥品工業，還有林業、漁業及農業、家蓄和化學工業。因此，本發明對這些領域的影響是深不可測的，是巨大的。
考慮到在此的描述是本發明的優選實施方案，但仍應明白其中可進行各種修飾，并且本發明旨在覆蓋落入本發明實質精神和范圍內的附屬權利要求中的所有此類修飾。
權利要求
1.一種海藻糖-釋放酶，所述酶特異性水解具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。
2.根據權利要求1中的酶，其中所述糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
3.根據權利要求1中的酶，有下列物理化學特性(1)作用特異性水解具有一個海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000到68，000道爾頓;(3)等電點(PI)在用兩性電解質的等電點電泳上約3.3到4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定的溫度為約30～45℃;(7)PH穩定性在25℃培養16小時，可穩定的PH為5.0～10.0。
4.根據權利要求1的酶，它有一個或更多選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中，X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
5.根據權利要求1的酶，它是一種來自微生物的酶。
6.根據權利要求5的酶，其中所述微生物是選自根瘤菌、節桿菌、短桿菌和微球菌屬的微生物。
7.根據權利要求6的酶，其中所述根瘤菌屬的微生物是根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCCM94031)。
8.根據權利要求6的酶，其中所述節桿菌屬的微生物是節桿菌(Arthrobacter sp.)Q36(CCTCCM94030)。
9.一種制備特異性水解具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵的海藻糖-釋放酶的方法，所述方法含有在營養培養基中培養能生產所述酶的微生物以形成所述的酶，并回收所得的酶。
10.根據權利要求9的方法，其中所述糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
11.根據權利要求9的方法，其中所述酶有下列物理化學特性(1)作用特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更多的非還原多糖中，海藻糖部分和其中糖基部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上為約57，000到68，000道爾頓，(3)等電點(PI)在使用兩性電解質的等電點電泳上約3.3到4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定的溫度為約30～45℃;和(7)PH穩定性在25℃培養16小時，可穩定的PH為5.0～10.0。
12.根據權利要求9的方法，所述酶有一個或多個選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
13.根據權利要求9的方法，所述酶來自一種微生物。
14.根據權利要求9的方法，其中所述微生物選自根瘤菌、節桿菌、短桿菌和微球菌屬的微生物。
15.根據權利要求14的方法，其中根瘤菌屬的所述微生物是根瘤菌M-11(CCTCCM94031)。
16.根據權利要求14的方法，其中節桿菌屬的所述微生物是節桿菌Q36(CCTCCM94030)。
17.一種制備海藻糖的方法，包括(a)使一種酶作用于含有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖溶液，所述酶能特異性水解所述非還原多糖中海藻部分和其余糖基部分之間的鍵;(b)純化所得的海藻糖;和(c)回收純化的海藻糖。
18.根據權利要求17的方法，其中將步驟(a)中的所述酶與非還原多糖-形成酶一起使用，所述的非還原多糖-形成酶能形成一個或多個具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖。
19.根據權利要求17的方法，其中步驟(a)中還包括使葡糖淀粉酶作用于步驟(a)中所得溶液的步驟。
20.根據權利要求17的方法，其中步驟(b)包括使步驟(a)中所得的含海藻糖溶液經裝有強酸陽離子交換樹脂的柱的柱層析以純化海藻糖的步驟。
21.根據權利要求17的方法，其中步驟(b)還包括將步驟(b)中所得溶液中的海藻糖結晶成含水或無水的晶體海藻糖的步驟。
22.根據權利要求17的方法，其中所述的糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
23.根據權利要求17的方法，其中所述酶有下列物理化學特性(1)作用特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000到68，000道爾頓;(3)等電點(PI)在使用兩性電解度的等電點電泳上約3.3到4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定的溫度達約30～45℃;和(7)PH穩定性在25℃培養16小時，可穩定的PH達約5.0～10.0。
24.根據權利要求17的方法，其中所述酶具有一個或多個選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
25.根據權利要求17的方法，其中所述酶來自微生物。
26.根據權利要求25的方法，其中所述微生物是選自根瘤菌、節桿菌、短桿菌和微球菌屬的微生物。
27.根據權利要求26的方法，其中所述的微生物是根瘤菌M-11(CCTCCM94031)。
28.根據權利要求26的方法，其中所述的微生物是節桿菌Q36(CCTCCM94030)。
29.一種制備含海藻糖的多糖組合物的方法，包括(a)使酶作用于具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖，以形成海藻糖，所述的酶能特異性水解所述非還原糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;和(b)回收所得的含海藻糖和其它多糖的多糖組合物。
30.根據權利要求29的方法，其中將步驟(a)中的所述酶與能形成一個或多個具有海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖的非還原多糖-形成酶一起使用。
31.根據權利要求29的方法，其中步驟(a)還含有使葡糖淀粉酶作用于步驟(a)中所得溶液的步驟。
32.根據權利要求29的方法，其中步驟(a)還包括將步驟(a)所得溶液中的海藻糖結晶成含水或無水晶體海藻糖。
33.根據權利要求29的方法，其中，所述糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
34.根據權利要求29的方法，其中，所述的酶有下列物理化學特性(1)作用特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000到68，000道爾頓;(3)等電點(PI)在使用兩性電解質的等電點電泳上約3.3至4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定的溫度達約30～45℃;和(7)PH穩定性在25℃培養16小時時，可穩定的PH達約5.0～10.0。
35.根據權利要求29的方法，其中所述的酶有一個或多個選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
36.根據權利要求29的方法，其中所述酶來自微生物。
37.根據權利要求36的方法，其中所述微生物是選自根瘤菌、節桿菌、短桿菌和微球菌屬的微生物。
38.根據權利要求37的方法，其中，所述的根瘤菌屬微生物是根瘤菌M-11(CCTCCM94031)。
39.根據權利要求37的方法，其中，所述的節桿菌屬微生物是節桿菌Q36(CCTCCM94030)。
40.一種制備含海藻糖的組合物的方法，包括(a)非還原多糖-形成酶(Ⅰ)與海藻糖-釋放酶(Ⅱ)一起作用于含一種或多種葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解產物以形成海藻糖，所述酶(Ⅰ)能形成具有海藻糖結構作一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖;所述酶(Ⅱ)能特異性水解所述非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;(b)回收帶有或不帶有其它多糖的所得的海藻糖;和(c)將帶有或不帶有其它多糖的海藻糖摻入物質構成組合物。
41.根據權利要求40的方法，其中所述的組合物是食品。
42.根據權利要求40的方法，其中所述的組合物是化妝品組合物。
43.根據權利要求40的方法，其中，所述的組合物是藥物組合物。
44.根據權利要求40的方法，其中所述的糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
45.根據權利要求40的方法，其中所述的酶有下列物理化學特性(1)作用特異性水解具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000到68，000;(3)等電點(PI)在使用兩性電解質的等電點電泳上約3.3至4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定溫度達約30～45℃;和(7)PH穩定性在25℃培養16小時時，可穩定的PH達約5.0～10.0。
46.根據權利要求40的方法，其中所述的酶有一個或多個選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
47.根據權利要求40的方法，其中所述的酶來自微生物。
48.根據權利要求47的方法，其中所述的微生物選自根瘤菌、節桿菌、短桿菌和微球菌屬的微生物。
49.根據權利要求48的方法，其中所述的根瘤菌屬微生物是根瘤菌M-11(CCTCCM94031)。
50.根據權利要求48的方法，其中所述的節桿菌屬微生物是節桿菌Q36(CCTCCM94030)。
51.一種降低還原性淀粉部分水解產物的葡萄糖聚合度而不增加其還原能力的方法，包括步驟使非還原多糖-形成酶(Ⅰ)與海藻糖-形成酶(Ⅱ)一起作用于含一種或多種葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解產物的溶液，所述的酶(Ⅰ)能形成一種或多種具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖，而所述酶(Ⅱ)能特異性水解所述非還原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。
52.根據權利要求51的方法，其中所述的糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
53.根據權利要求51的方法，其中所述的酶有下列物理特性(1)作用特異性水解具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余的糖基部分之間的鍵;(2)分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上約57，000到68，000道爾頓;(3)等電點(PI)在使用兩性電解質的等電點電泳上，約3.3到4.6;(4)最佳溫度在PH7.0培養30分鐘時，約35～45℃;(5)最佳PH在40℃培養30分鐘時，約6.0～7.5;(6)熱穩定性在PH7.0培養60分鐘時，可穩定的溫度為約30～45℃;和(7)PH穩定性在25℃培養16小時，可在5.0～10.0內穩定。
54.根據權利要求51的方法，其中所述的酶有一個或多個選自下列的部分氨基酸序列(1)Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(其中X1指Ser或Ala，X2指Ala或Glu);(2)Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(其中X3指Glu或Asp);和(3)X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(其中X4指His或Gln)。
55.根據權利要求51的方法，其中，所述的酶來自微生物。
56.根據權利要求55的方法，其中，所述的微生物選自根瘤菌、節桿菌、短頸細菌和微球菌屬的微生物。
57.根據權利要求56的方法，其中所述的根瘤菌屬微生物是根瘤菌M-11(CCTCCM94031)。
58.根據權利要求56的方法，其中所述的節桿菌屬微生物是節桿菌Q36(CCTCCM94030)。
全文摘要
本文公開的是一種海藻糖-釋放酶，它能特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。在SDS-PAGE上，該酶的分子量為約57,000到68,000，在等電電泳上的等電點是約3.3到4.6。該酶用于工業化制備海藻糖，并可很容易地將這樣制備的海藻糖摻入食品以及化妝品和藥物組合物中。
文檔編號C12N9/24GK1107888SQ9410680
公開日1995年9月6日 申請日期1994年6月17日 優先權日1993年12月9日
發明者丸田和彥, 久保田倫夫, 杉本利行, 三宅俊雄 申請人:株式會社林原生物化學研究所