專利名稱：白細胞介素2-乙肝病毒前s抗原融合蛋白及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物制品。
以往研究表明IL-2是由T淋巴細胞分泌的一種細胞因子，可作用于T、B細胞，NK細胞和巨噬細胞，增強抗感染、抗腫瘤的免疫功能，IL-2還具有免疫佐劑效應，增加抗原的免疫原性。它是治療腫瘤、免疫性疾病及病毒感染性疾病的重要生物制品。
HBV Pre-s抗原有強的誘導T和B細胞免疫應答的表位，具有和肝細胞膜受體結合的位點。Pre-s抗原能刺激機體產生保護性抗體，并克服對S抗原的無應答狀態，且所誘導的T和B細胞免疫應答早于S抗原。HBVPre-s抗原與S抗原一起可能構成更有效的乙肝疫苗(MulelJJet al，J.Immunol，1985，135646;EltinghausenSE et al，J.Immunol，1985，1351488;Karray S et al，J.Exp.Med，1988，16885;Veutos et al，Lancet.1987，2119;Alberti A et al，Hepatology;1984，4220;Neurath AR et al，Cell，1986，46492;Franco A et al，J.Exp.Med，1992，1751195;Neurath A R et al，Vaccine，1989，7234;Milich DR et al，Science，1985，2281195;).
目前有IL-2與別的細胞因子、免疫球蛋白、病毒抗原或細菌毒素的基因融合與化學融合產品，并試用于臨床治療與診斷。已有化學合成的IL-2與HBVs抗原10個氨基酸肽和IL-116-3-171位9個氨基酸肽與HBVs抗原20個氨基酸肽的融合分子，后者能刺激產生中和抗體。已有HBV基因工程疫苗，并應用于人群預防，有HBVPre-s抗原中單獨的HBVPre-s1和Pre-s2化學合成抗原和基因重組抗原的研究報導，得出上述研究結果。
上術都是IL-2和HBVPre-s抗原單分子在某些領域的研究。目前尚未見具有IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白的報導。
現有IL-2制品穩定性不高，純化與保存需加微量SDS，另外其在體內半衰期短，用于抗腫瘤和抗病毒感染治療的劑量大，易出現副作用。現有的血源和基因工程乙型肝炎疫苗只有預防作用，沒有治療效果，現在各種藥物對清除HBV慢性感染或攜帶者治療效果均不理想。為了增強IL-2的穩定性，在純化與保存中不加SDS，延長其在體內的半衰期，減少副作用，提高抗腫瘤、抗病毒感染的治療效果，同時為了研制一種既能預防HBV感染，又能誘導慢性乙肝患者或HBV攜帶者對HBV產生有效免疫應答，以清除體內HBV的藥物，我們用基因工程方法制備了IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白。
本發明的目的是通過下述方法實現的。
我們通過優化轉譯起始序列，合成IL-2和Pre-s上下游引物，SD序列和IL-3N端片段接頭，去除IL-2終止密碼子，增設Pre-s下游終止密碼子，經PCR擴增目的基因，分別進行克隆，再經PCR擴增及酶切獲得IL-2和HBVPre-s抗原功能區基因片段，純化后經基因融合，重組到大腸桿菌表達載體pKpL-3a，轉化大腸桿菌誘導表達、分離包涵體，變性，復性及純化獲得具有IL-2HBVPre-s抗原雙活性的融合蛋白。
IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白較IL-2和Pre-s單分子或雙分子聯合應用有更多生物學效應。
圖1為IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白DNA堿基序列(bp)圖2為氨基酸序列3為融合蛋白表達載體示意圖，其中1示IL-2基因，2示中間接頭，3示Pre-s基因，4示pKpL載體DNA。
下面結合附圖對本實施例作詳細說明。
圖1 IL-2-HBV Pre-s抗原融合蛋白由IL-2序列(DNA序列1-405bp)，IL-3N端親水性中間接頭(DNA序列405-448bp)，HBVPre-s抗原序列(DNA序列449-945bp)編碼，中間接頭由Ala、Pro、Met、Thr、Gln、Pro、Leu、Lys、Ser、Trp、Val所組成。IL-2和Pre-s抗原與天然分子實質上一致，可與相應配基結合，轉導生物信息，引起生物活性，并可與相應抗體進行反應。
為獲得最佳堿基排列，避免可能干擾轉譯起始的mRNA二級結構，增加表達的IL-2均一性和穩定性，在構建IL-2cDNA質粒表達克隆pKpL-hIL-2時已除去其起始密碼子ATG。現以人工合成的SD序列為上游引物(5′TCGACCTAAGGAGGTTTAAC3′)，IL-2基因功能區3′端為下游引物(5′-GTTAGTGTTGAG ATGATGCTTT3′)，下游引物去除終止密碼TAG，以pKpL-hIL-2cDNA克隆為模板，經PCR擴增IL-2基因片段，獲得約0.4Kb產物。該PCR產物用PromegaMagic試劑純化，經SalⅠ酶切后再純化，與SmaⅠ接頭連接，再經SmaⅠ酶切，將經上述處理的PCR產物與經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切后的pKpL表達載體重組，轉化pop2136受體菌，挑選克隆，經誘導表達和質粒酶切鑒定獲陽性克隆pKpL-mhIL-2。
按已公布的HBV ayw亞型DNA序列設計Pre-s功能區基因上游和下游引物，上游引物為Pre-s1基因上游序列(5′CCACACAATCTTTCCACCACCAAT3′)去掉了起始密碼子ATG;下游引物為Pre-s2下游序列(5′ACTCTAGATGTTCTCCATGTTCAGCG3′)引入XbaⅠ酶切位點和終止密碼子TAG。以pHBV-1克隆為模板，PCR擴增Pre-s基因片段，獲得約0.5Kb產物，經Promega Magic試劑純化，XbaⅠ酶切，再經純化后，與帶IL-3N端親水性氨基酸中間接頭的pKpL表達載體重組;經清除后，轉化受體菌pop2136，經誘導表達和質粒酶切鑒定獲得陽性克隆pKpL-Pre-s。
圖2顯示pKpL-3a表達載體，由溫度誘導抑制子基因cⅠ857ts，pL啟動子，SD序列及緊跟的多克隆位點(SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ、HindⅢ)，Cat基因，Ampr基因，復制起始點等組成。將純化的pKpL-mhIL-2經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切，Promega Magic試劑純化;以IL-3N端親水性氨基酸中間接頭序列(5′GCTCCCATGACCCAGACAACG3′)為上游引物，Pre-s下游序列為下游引物(見上)，pKpL-Pre-s克隆為模板，PCR擴增中間接頭-Pre-s功能區基因片段，經Promega Magic試劑純化，XbaⅠ酶切，再純化，將純化的表達載體pKpL-3a用SalⅠ和XbaⅠ雙酶切，純化。將上述三種酶切純化產物在最適條件下重組，轉化受體菌pop2136，經誘導表達和質粒鑒定獲得IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白的表達克隆pKpL-ⅠP1。
將pKpL-ⅠP1克隆轉化pop2136受體菌，以2%接種量種于LA液體培養基，30℃水浴振蕩約7小時，加等體積新鮮LA液體培養基，42℃誘導4小時，8000rpm，5min收獲菌體，裂解，SDS-PAGE電泳，用薄層掃描儀測得表達蛋白占菌體總蛋白31%，蛋白帶的分子量為33-35KD，與理論計算值相符，融合蛋白氨基酸序列與圖1序列相應氨基酸一致。
將上述收獲菌體置冰浴超聲破碎，10000rpm，10min4℃，包涵體沉淀用含2M尿素洗滌液(含TritonX-100)洗滌一次，再用0.01MpH7.4PBS洗一次，8M尿素變性(含-ME，Glycine)37℃1小時，室溫過夜復性，透析后過離子交換層析柱，可獲得純度大于95%的純品。
用IL-2依賴細胞株CTLL經MTT化學顯色比色法測定融合蛋白制品中IL-2活性單位，比活性>107u/mg蛋白。用ELISA和Western Blot方法證明融合蛋白含有Pre-s抗原性和pHSA受體活性。
本發明的優點是1、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白使IL-2溶解度增加，穩定性增強。
2、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白可使IL-2在體內半衰期處長，因而能提高IL-2抗癌治療效果。
3、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白由于IL-2的佐劑效應及免疫調節效應和Pre-s強免疫原性，能使對HBVs抗原無應答的個體和HBV攜帶者產生中和抗體和特異性細胞免疫。
4、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白具有雙重導向性，有利于激活免疫活性細胞，特別是增強肝臟局部免疫功能，有利于肝炎與肝癌的治療。
5、本制備方法簡單可靠，產量高，成本低，有利于大規模生產。
權利要求
1.一種白細胞介素2-乙肝病毒前S抗原的融合蛋白，其特征在于是由白細胞介素2-親水性氨基酸中間接頭-乙肝病毒前S抗原多肽序列組成，分子量為33-35KD。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的親水性氨基酸中間接頭序列的長度為30-45bp DNA。
3.根據權利要求1和2的融合蛋白，其特征在于所述的親水性氨基酸中間接頭由白細胞介素-3N端序列的氨基酸Ala、Pro、Met、Thr、Gln、Pro、Leu、Lys、Ser、Trp、Val所組成。
4.根據權利要求1的融合蛋白編碼序列，其特征在于含有圖1DNA序列。
5.根據權利要求1的融合蛋白，其特征在于含有圖1DNA序列相應的氨基酸序列。
6.一種白細胞介素2-乙肝病毒前S抗原融合蛋白的制備方法，其特征在于(1)白細胞介素3N端親水性氨基酸中間接頭與乙肝病毒前S抗原功能區基因的克隆。(2)白細胞介素2功能區基因去除終止密碼的克隆。(3)融合蛋白表達載體pKpL-3a進行表達。(4)大腸桿菌的高效表達融合蛋白。(5)經變性、復性和液相層析而獲得純品。
7.根據權利要求1的融合蛋白，可應用于免疫調節抗癌和乙型肝炎預防與治療的藥劑。
全文摘要
本發明涉及一種生物制品，它為白細胞介素2(IL-2)與乙肝病毒前S(Pre-s)抗原的融合蛋白，具有免疫佐劑和疫苗性能。通過優化轉譯起始序列，合成IL-2和Pre-s功能區基因上下游引物、SD序列及中間接頭，去除IL-2終止密碼子，增設Pre-s下游終止密碼子TAG，經基因融合與基因表達程序獲得具有IL-2和Pre-s雙活性融合蛋白。它可做為免疫增強劑用于多種疾病的治療。
文檔編號C12N15/19GK1113952SQ94106490
公開日1995年12月27日 申請日期1994年6月23日 優先權日1994年6月23日
發明者陳章國, 馬大龍, 張穎妹 申請人:北京醫科大學, 衡陽醫學院