專利名稱：一種用于造血祖細胞培養的無血清培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于正常和惡性造血祖細胞半固體克隆培養的無血清培養基，也可用于其液體懸浮培養。
造血干(祖)細胞的半固體克隆培養是研究正常和惡性造血干(祖)細胞增殖、分化和成熟及其調控的不可缺少的手段。自1961年Till和Mcculloch建立CFU-S以來，目前人類各系造血祖細胞的體外半固體培養體系均已建立，并對造血機理和調控的研究發揮了巨大作用，然而迄今為止，大多數報道均采用傳統的有血清培養方法，血清的成分十分復雜，至今尚未完全弄清。血清中的未知物質和可變因素往往影響研究結果的準確性和重復性，特別是現代應用高純度基因重組生長因子進行細胞體外調控研究時，更需要一個精確度較高的細胞培養體系。排除了血清干擾的無血清培養體系就可以達到這一要求。國外很早就已開始了動物和人類細胞無血清培養法的研究，1976年Ilayashi等報道了大鼠垂體GII3細胞的無血清培養，他們用激素、生長因子和其他一些基本營養物質代替血清，此后又發展了各種無血清培養基用于培養許多不同來源的細胞，但是均為液體懸沲培養。近年來，開始將無血清培養法用于培養條件要求較高的半固體培養，如BFV-e等，但用無血清培養法培養包括正常和惡性淋巴祖細胞的研究國內外尚未見報道。
本發明的目的是研制一種適用于正常和惡性造血祖細胞，其中包括惡性B淋巴祖細胞，如非霍奇金淋巴瘤B淋巴祖細胞(NHL B細胞)在內的半固體克隆培養和長期培養的無血清培養基，并用此培養基結合現代生物學方法(如重組生長因子和基因分析)重點研究NHL B細胞的生物學特點，為研究B細胞腫瘤的發病機理和調控提供了有效方法和理論依據。
本發明是這樣來實現的。以急性白血病祖細胞(CFU-ALL和CFU-ANLL)、正常人T淋巴祖細胞(TL-CFU)正常人粒單祖細胞(GM-CFU)和正常人B淋巴祖細胞(BL-CFU)為代表，建立各自的有血清半固體克隆培養，然后篩選出較為理想的適合于這些祖細胞培養的無血清培養基配方，進一步用此培養基研究惡性B淋巴祖細胞NHL B細胞的半固體克隆培養和長期培養。
我們采用的無血清培養基是以Dulbecco′s modifiedEagle′smedium(DMEM)為基礎補充以國產氨基酸、維生素、無機鹽及抗菌素等11種成份，制成IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)，作為基礎培養基，再添加血清替代物。通過造血祖細胞測定，對多種血清替代物進行了省略試驗和劑量反應試驗，最后確定血清替代物的配方和最佳濃度為牛血清白蛋白(BSA)10mg/ml、人轉鐵蛋白(Tf)1ug/ml、胰島素(Ins)8ug/ml、膽固醇(Chol)20ug/ml和過氧化氫酶(Cata)20ug/ml，此為SFM-1。參考國外有關文獻，又設計了2種無血清培養基SFM-2(高濃度)和SFM-3(低濃度)，將這3種無血清培養基與有血清培養基(SCM)和基礎培養基IMDM進行了比較，結果發現，SFM-1對上述幾種祖細胞均有生長支持作用，與SCM比較無顯著性差異(CP＜0.05)。為了探討無血清培養基對培養細胞形態、表型和結構的影響，我們對每次實驗均進行了培養前后細胞形態學和細胞表面標志的檢查，并對1例ALL和1例ALL患者進行了培養前后細胞的染色體檢查，結果表明在培養前后細胞的形態學、表型均無特殊改變，2例急性白血病患者，細胞培養前后亦具有相同的染色體異常。
我們用所研制的無血清培養體系進一步進行了NHL B細胞的半固體克隆培養和長期培養的研究，結果8例B細胞型NHL病人中有7例在無血清半固體培養中形成了集落，用T、B淋巴細胞單克隆抗體，經間接免疫堿性磷酸酶法檢查單個集落，證實為B細胞集落。另用1例病人的腦脊髓液及骨髓細胞，建立了長達4個月以上的無血清長期培養。發現B細胞型NIIL病人，其細胞的膜結構和激活狀態存在異質性，可通過體外培養結果將病人進行分類，有助于臨床診斷和治療預后的判斷。比外證實了BCGF對NHL B細胞有刺激增殖的作用，為NHL病人的治療提供了線索。
除用于研究NHL B細胞外，還可用此培養基進行其他造血組細胞的研究。
本發明的優點在于無血清培養正常和惡性造血祖細胞的成功，將為醫學、生物學以及免疫學領域的學者們所利用，對推動這些領域內科學研究的發展將起一定的作用。使用本培養基能在排除血清干擾的情況下，比較精確地研究造血祖細胞的生物學特性和生長調控，用于細胞因子的分離、純化和調控研究，以及抗原抗體特性異免疫反應的研究等具有獨特的優點。對血液病發病機理，臨床診斷和治療的研究有很大的實用價值。推而廣之，也可用于其他動物細胞培養，對農業畜牧業的發展有一定作用。我們也可將此無血清培養基在國內外市場上出售，以獲得直接的經濟效益。
以下是實施本發明方法的具體實施例。
例一血清替代物的配制1、人轉鐵蛋白將人轉鐵蛋白溶于IMDM(90mg/ml)，每mg轉鐵蛋白加7.4×10-9mol/L Fe3+(以溶于0.1mmol/L鹽酸中的Fecl3形式，使1/3Fe2+飽和)此為貯存液，經過濾除菌后-20℃保存。
2、牛血清白蛋白稱取BSA100g使之溶于182ml三蒸餾水(或去離子水)中，置4℃過夜，次日與10g樹脂珠混合，置4℃2小時，每15分鐘攪拌一次，去樹脂珠，再與10g樹脂珠混合，先后置4℃1小時及室溫1小時，去樹脂珠，測BSA的容量，每15mlBSA加1.1mlDulbecco′s磷酸緩沖鹽水(-Mg2+-Ca2+)10倍濃縮液，再用Dulbecco′s磷酸緩沖液鹽水工作液稀釋為10%BSA(W/V)。過濾除菌，-20℃保存，使用前每20mlBSA加7%NaIIco30.5ml和1.9%L-谷酰胺1.2ml。
3、脂類物質的配制膽固醇50mg加在50ml酸性培養基中，用超聲波粉碎器(2cm直徑的肽探頭)在0℃以最大振幅蕩1小時，使之完全分散，然后將懸液先后通過1.2um和0.45um的濾膜過濾酸性培養基為不加碳酸氫鈉的IMDM，PH值為5.1。
4、胰島素及過氧化氫酶的配制胰島素先用少量PBS溶解，緩緩滴加0.01mol/L HCL，使之完全溶解，再用IMDM將其稀釋至所需濃度。過氧化氫酶用IMDM直接溶解，配成1mg/L濃度，將上述血清替代物加入基礎培養基即成無血清培養基。
為了比較血清替代物的濃度，制備了含3種不同濃度血清替代物的無血清培養基(見表1)。
表1 無血清培養基編號 BSA(mg/ml) Tf(ug/ml) INS(ug/ml) Chol(ug/ml) Ca+a(ug/ml)SFW-110 1 8 20 20SFW-210 1 80 80 80SFW-30.41100有血清培養基(SCM)則以IMD和10%新生牛血清(NBCS)組成。
例二半固體培養體系為0.8%甲基纖維素，10%無血清PIIA-LCM，無血清培養基(SFM-1，SFM-2或SFM-3)或有血清培養基(SCM)。細胞濃度為正常人和急性淋巴細胞白血病(ALL)外周血單個核細胞為5×105/ml(TL-CFU為1×106/ml)，正常人及急性非淋巴細胞白血病(ANLL)骨髓單個核細胞為2×105/ml。對TL-CFU，需加0.25%PHA-P，BL-CFU需加葡萄球菌A蛋白50ug/ml。對CFU-ALL和BL-CFU，培養細胞在培養前需和半乳糖氧化酶(GO)10u/2×107細胞/ml一起孵育30分鐘。
例三克隆測定用TL-CFU和GM-CFU測定法對下述5種培養基進行了比較，見表2。
表2 五種培養基對TL-CFU和GM-CFU支持作用的比較TL-CFU P CM-CFU P培養基 值 值實驗 生長 集落數 實驗 生長 集落數例數例數 (1×105) 例數例數 (2×104)SFM-1 6 6 222±164 >0.05 7 5 170±154 >0.05SFM-2 5 4 17±18 <0.01 5 3 13±21 <0.01SFM-3 5 5 131±124 >0.05 5 4 29±23 >0.01IMDM 5 4 16⊥18 <0.01 5 3 12⊥15 <0.01SCM 6 6 152±141 7 5 158±179注P值為各組與SCM比較的結果。
SFM-1對TL-CFU和GM-CFU，以及SFM-3對TL-CFU的生長支持作用與SCM無顯著性差異(P＞0.05)，而SFM-2和IMDM對兩者的作用均比SCM差(＜0.01)。SFM-1和SCM比較并無顯著性差異(P＞0.05)，見表3。
表3 半固體培養條件下SFM-1和SCM對幾種造血祖細胞生長支持作用的比較SFM-1 SCM P克隆測定 細胞數 值實驗 生長 集落數 實驗 生長 集落數(1×104) 例數例數例數例數TL-CFU 10 6 6 222±164 6 6 152±141 >0.05BL-CFU 5 10 6 23±41 10 8 52±41 >0.05CFU-ALL 5 20 20 92±85 20 12 141±101 >0.05CFU-ANLL 2 18 13 83±57 18 13 122±121 >0.05CM-CFU 2 7 5 170±154 7 5 158±179 >0.0權利要求
1.一種用于造血祖細胞培養的無血清培養基，是以DMEM為基礎，補充國產氨基酸、維生素、無機鹽及抗菌素等成份，制成IMDM，作為基礎培養基，再添加血清替代物，構成適合于各種造血祖細胞培養的無血清培養基。
2.根據權利要求1的無血清培養基，血清替代物的配方和最佳濃度為牛血清的蛋白(BSA)10mg/ml、人轉鐵蛋白(Tf)1ug/ml、胰島素(Ins)3ug/ml、膽固醇(Chol)20ug/ml和過氧化氫酶(Cata)20ug/ml。
3.根據權利要求1的無血清培養基，細胞是以急性白血病人祖細胞(CFV-ALL和CFU-ANLL)正常人T淋巴細胞(BL-CFU)、正常人粒單祖細胞(GM-CFU)和正常人B淋巴細胞(BL-CFU)為代表，建立適合于這些祖細胞培養的培養基。
全文摘要
本發明提供了一種適合于造血祖細胞克隆培養的無血清培養基，經多種造血祖細胞的克隆測定證明，該培養基支持細胞生長的效果與有血清培養無明顯差異，可用于各種造血祖細胞的生物學特點和生長調控的研究。由于使用該培養基可排除血清的干擾，可大大提高研究工作的準確性和重復性，在進行細胞產物的分離純化和抗原抗體特異性免疫反應的研究時具有獨特的優點。本發明適用范圍廣，可用于醫學、生物學等領域。該培養基可在國內外市場上銷售，能產生較大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N5/08GK1088984SQ93114630
公開日1994年7月6日 申請日期1993年11月11日 優先權日1993年11月11日
發明者戴育成 申請人:江西省醫學科學研究所