專利名稱：新的dna序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含內含子序列并編碼根據作用位點而稱之為膽汁鹽刺激的脂酶(BSSL)或羧酸酶脂酶(CEL)的人蛋白質的DNA分子。用該DNA分子有助于生產重組人BSSL/CEL，尤其是通過用轉基因非人哺乳動物進行生產。可以將該重組人BSSL/CEL作為可取代人奶喂養嬰幼兒的嬰幼兒食品的組分，或將其用于生產抗如脂肪吸收障礙，囊性纖維性變和慢性胰炎的藥物。
食物脂類的水解食物中的脂類是能量的一個重要來源。富含能量的三酰基甘油占這些脂類的95%以上。一些脂類，如特定的脂肪酸和脂溶性維生素是飲食中必需的成分。在胃腸道吸收前，三酰基甘油以及微量成分，即酯化的脂溶性維生素和膽固醇，以及二酰基磷脂酰甘油需要水解酯鍵以得到疏水性較低的可吸收產物，這些反應由稱之為脂酶的一組特定酶催化。
在成人中，據認為涉及的必需脂酶是胃脂肪酶，胰輔脂酶依賴的脂酶(水解三和二酰基甘油)，胰磷脂酶A2(水解二酰基磷脂酰甘油)以及羧酸酯脂酶(CEL)(水解膽甾烯基和脂溶性維生素酯類)。在哺乳喂養的新生兒中，膽汁鹽刺激的脂酶(BSSL)在上述幾種脂類的水解中起必不可少的作用。脂類消化的產物與膽汁鹽一起形成可開始吸收的混合微膠粒。
膽汁鹽刺激的酯酶喂奶的人的乳腺合成并與奶一起分泌膽汁鹽刺激的脂酶(BSSL)(Bl
ckberg et al.，1987)，在由一級膽汁鹽特定激活后，該酶對哺乳喂養嬰兒的內源性腸內脂肪消化能力產生影響。占全部奶蛋白質總量約1%的這種酶(Bl
ckberg ＆ Hernell，1981)在與奶一起通過胃時并不減少，在十二指腸的內含物中，經胰蛋白酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶失活成膽汁鹽以保護該酶。但當奶經巴氏滅菌，如加熱至62.5℃，30分鐘可使其失活(Bj
rksten et al.，1980)。
體外模式實驗表明，在BSSL存在的情況下，三酰基甘油消化的終產物不同(Bernb
ck et al.，1990;Hernell ＆ Bl
ckberg，1982)。這可能是由于新生兒期間，較低的管腔內膽汁鹽濃度有利于產物吸收。
羧酸酯脂酶人胰液中的羧酸酯脂酶(CEL)(Lombardo et al，1978)似乎與BSSL功能相同，或者至少很相似(Bl
ckberg et al，1981)。它們具有共同的抗原決定簇，有相同的N末端氨基酸序列(Abouakilet al.，1988)，并由絲氨酸酯酶的抑制劑，如毒扁豆堿及二異丙基氟磷酸酯抑制。最近幾個實驗室的研究中對奶脂酶及胰脂酶的cDNA結構進行了定性(Baba et al.，1991;Hui et al.，1991;Nilsson et al.，1990;Reue et al.，1991)并且得出的結論是奶酶與胰酶是相同基因的產物(在本申請中涉及CEL基團，EC3.1.1.1)。在WO91/15234(Oklahoma Medical Research Foundation)和WO91/18923(Aktiebolaget Astra)中描述了CEL基因的cDNA序列及推斷的氨基酸序列。
因此認為CEL與BSSL相同，且由CEL基因編碼的多肽在本發明說明書中稱為BSSL/CEL。
脂類吸收障礙脂類吸收障礙，并由此產生營養不良的普通原因是管腔內胰輔脂酶依賴的脂酶和/或膽汁鹽水平降低。脂酶缺陷的典型例子是患有囊性纖維性變和慢性胰炎的患者，80%囊性纖維性變的患者是普通的遺傳無序導致終身缺陷，慢性胰炎經常起因于慢性酒精中毒。
患有胰脂酶缺陷的患者目前的治療是口服很大劑量的豬胰酶粗制劑。但是在胃中，低PH值使輔酶依賴性胰脂酶失活。而使用大劑量的酶并不能完全克服這種影響。因此，對于大多數患者來說，口服大劑量是不合適的，此外，該制劑不純并且味道不好。
已經制成可通過胃酸區域并僅在空腸的相對堿環境中釋放酶的特定片劑。然而，許多胰不正常的患者有一副不正常的酸性空腸，因而在這種情況下，片劑不可能釋放出酶。
此外，由于目前市場上的制品不是來源于人，因而有免疫反應的危險，這種免疫反應可能對患者有不良影響或者導致治療效果減弱。現有制劑的另一缺點是沒有說明其內含物中除輔脂酶依賴性脂酶外其他脂解活性。事實上，這些制劑大多數包含有很低的BSSL/CEL活性水平。這可能是盡管進行補充治療，但許多患囊性纖維性變的患者仍患有脂溶性維生素和必需的脂肪酸缺陷癥的一個原因。
因此，很需要具有人脂酶特性及結構并具有廣泛的底物特異性的產品，可以讓患一種或幾種胰脂解酶缺陷癥的患者口服該產品。應用本發明得到的產品，其本身或與含其它脂酶的制劑一起滿足這種需要。
嬰兒食物在家都知道，對嬰幼兒來說，人奶喂養是最好的喂養方式。人奶不僅提供了十分平衡的營養，而且很容易被嬰兒消化。因此，在嬰兒中已知有生理功能的幾種生物學活性組分要么是人奶中的成分，要么就是在其消化期間產生的，包括抵抗感染的成分以及有利于從人奶中吸收營養的成分。
盡管在制備嬰兒食品中已化費了巨大努力，還不可能生產在任何顯著的范圍內均有人奶優點的產品。因此，嬰兒食品通常是在牛奶的基礎上制備的，一般不能完全被嬰兒消化，并且缺少對嬰兒生理功能有影響的已知物質。為了得到營養價值與人奶相似的嬰兒食品，將包括蛋白質片段，維生素、礦物質等(在嬰兒消化人奶期間形成或吸收的)大量添加劑加到食品中，而這同時會造成增加重要器官如肝和腎臟的負擔并可能長期損壞它們的危險。與使用以牛奶為基礎食品有關的危害是會增加誘發嬰兒抗牛蛋白質過敏反應的危險。
除了以牛奶為基礎的嬰兒食品外，也可使用從所謂奶庫得到的人奶。然而，用來自奶庫的人奶喂養新生兒在近幾年內不會有廣泛的增加，這是由于懼怕人奶中存在的傳染因素如HIV和CMV。為了破壞人奶中的傳染因素，在使用前，必需要進行巴氏滅菌。然而，經過巴氏滅菌，就會降低奶中的營養價值和生物學作用，例如，上文所述使BSSL失活。
將脂酶添加到嬰兒食品中出生時，胰和肝的功能還未完成發育成熟，特別是足月前出生的嬰兒。從生理學因素看，普遍發現脂肪吸收障礙，并且認為是由管腔內胰輔酶依賴性脂酶及膽汁鹽濃度低引起的。但是，由于有BSSL，上述吸收障礙在哺乳喂養的嬰兒中比用巴氏滅菌人奶或嬰兒食品喂養的嬰兒發生頻率低(Bernb
ck et al.，1990)為了避免與經過巴氏滅菌奶及基于牛奶的嬰兒食品有關的上述缺點，因此，需要制備其組分與人奶相近的嬰兒食品，即含有人奶蛋白質的食品。
BSSL/CEL有幾個獨特的性質，使其較理想地適用于補充嬰兒食品·它是按天然的方式設計用于口服。因此，它耐得住通過胃并由小腸的內含物激活。
·它特定的激活機制可防止在貯存及傳遞到其作用的部位期間食物或組織脂類有害的脂類分解作用。
·由于其廣泛的底物特異性，它具有在其自身上介導大多數飲食中脂類，包括脂溶性維生素酯完全消化的潛力。
·在水解含長鏈聚未飽和脂肪酸的酯鍵方面，BSSL/CEL可能比胰輔脂酶依賴性脂酶好。
·在有胃脂酶和沒有，或低水平輔脂酶依賴性脂酶的情況下，即使膽汁鹽水平低，如在新生兒中，BSSL/CEL也能在體外完全消化三酰基甘油。在有BSSL/CEL的情況下，三酰基甘油消化的終產物是游離脂肪酸和游離甘油，而不是由其它兩種脂酶產生的游離脂肪酸和單酰基甘油(Bernb
ck et al.，1990)。這可有利于產物吸收，特別是在管腔內的膽汁鹽水平低的情況下。
利用BSSL/CEL補充嬰兒代乳品需要利用大量的產物。雖然可以從人奶中直接純化人奶蛋白質，但為了得到大量用于大規模代乳品生產所需的人奶蛋白質，這不是一條現實并且足夠經濟的途徑，而且在制備含人奶蛋白質的嬰兒代乳品前，必須因此發展其它方法。本發明提供大量制備BSSL/CEL的上述方法。
用基因突變動物的奶生產蛋白質分離出編碼藥物學活性蛋白質的基因使得可以在異源系統中較廉價地生產上述蛋白質。對于奶蛋白質有吸引力的表達系統是基因突變動物(參見Hennighausen et al.，1990的綜述)。在EP317，355(Oklahoma-Medical Reasearch Foundation)中描述了用從如基因突變動物技術衍生得到的含有膽汁鹽激活的脂酶的膳食組合物。
在基因突變動物中，可以將蛋白質編碼序列作為cDNA或基因組序列導入。由于內含子對于被調節的基因在突變動物中表達時是必需的(Brinster et al.，1988;Whitelaw et al.，1991)，所以，在許多情形下，最好使用基因組形式而不是結構基因的cDNA形式。WO90/05188(Pharmaceutical Proteins Limited)描述了在基因突變動物中使用編碼蛋白質的DNA，該DNA含有至少一個，但不是全部在一個編碼蛋白質基因中天然存在的內含子。
本發明的目的是提供以高產率及現實的價格生產用于嬰兒代乳品的重組人BSSL/CEL的方法，以避免巴氏滅菌奶及以牛蛋白質為基礎的代乳品所存在的不足。
通過克隆并測定人CEL基因的序列達到本發明的目的。為了提高BSSL/CEL的產率，已經用得到的含人CEL基因內含子序列的DNA分子代替已知的cDNA序列，以在基因突變的非人哺乳動物中生產人BSSL/CEL。
相應地，本發明一方面涉及序列目錄中SEQ ID NO1所示的DNA分子，或者在嚴緊雜交條件下，與序列目錄中SEQ ID NO1所示的DNA分子雜交的所述DNA分子的類似物或其特定的部分。
在下列實施例中描述了分離人BSSL/CEL DNA分子的方法。
以其經典意思理解上文提到的嚴緊雜交條件，即按著普通實驗室操作如Sambrook等人(1989)完成雜交。
本發明另一方面是提供含有編碼人BSSL/CEL的DNA序列的哺乳動物表達系統，其中該DNA序列插入到非人哺乳動物的編碼奶蛋白質的基因中以便形成雜交基因，該雜交基因可在含所述雜交基因的成年雌性哺乳動物的乳腺中表達，以便在表達雜交基因時，生產人BSSL/CEL。
另一方面，本發明涉及生產可表達人BSSL/CEL的基因突變的非人哺乳動物的方法，包括將上述哺乳動物表達系統注射到哺乳動物的受精卵或胚胎細胞中，以便將表達系統摻入哺乳動物的幼體中，并將得到的注射過的受精卵或胚胎發育成成年雌性哺乳動物。
在序列目錄中列出了如全長為11531bp，作為SEQ ID NO1的DNA分子，它具有下列特征特征 起始堿基 終止堿基5'側區域 1 1640TATA盒 1611 1617外顯子1 1641 1727轉譯起始 1653 1653外顯子2 4071 4221外顯子3 4307 4429外顯子4 4707 4904外顯子5 6193 6323外顯子6 6501 6608外顯子7 6751 6868外顯子8 8335 8521
外顯子9 8719 8922外顯子10 10124 10321外顯子11 10650 114903'側區域 11491 11531在本發明中，術語“基因”用于說明DNA序列，該DNA序列存在于生產多肽鏈并包括前導區域以及隨后的編碼區域(5′上游和3′下游序列)以及所謂內含子的中間序列，內含子位于兩個單獨的編碼片段(所謂外顯子)之間或在5′上游或3′下游區域。5′上游區域含有控制基因表達的調節序列，典型地指啟動子。3′下游區域含有涉及基因轉錄終止的序列以及可能含有負責轉錄產物多聚腺苷酸化的序列以及3′非轉譯區。
本文所解釋的本發明的DNA分子可包括天然的以及合成的DNA序列，該天然序列一般是直接從正常哺乳動物的基因組DNA得到的，如下文所述。可以按合成制備DNA分子的經典方法制備合成序列。DNA序列也可以是基因組與合成序列的混合物。
另一方面，本發明涉及可復制的表達載體，該載體可攜帶并能介導編碼人BSSL/CEL的DNA序列的表達。
在本發明中，術語“可復制”的意思是指載體能夠在其已導入到的所給的宿主細胞中復制。在確保分泌由含載體的宿主細胞所表達的人BSSL/CEL的情況下，緊接著人BSSL/CEL DNA序列的上游可能提供編碼信號肽的序列。該信號序列可以是與人BSSL/CEL DNA序列有關的天然信號序列或其它來源的信號序列。
載體可以是任何可進行重組DNA操作的載體，載體的選擇常取決于它所導入的宿主細胞。因此，載體可以是自我復制載體，即載體可作為染色體外的實體存在，其復制不依賴于染色體的復制，上述載體的舉例是質粒，噬菌體，粘性質粒，小染色體或病毒。另外，載體可以是一種當導入宿主細胞后，整合到宿主細胞基因組中并與其所整合的染色體一起復制的載體。適宜的載體的例子是細菌表達載體和酵母表達載體。本發明的載體可攜帶任何上述所說的本發明DNA分子。
本發明還涉及含有上述定義的可復制的表達載體的細胞。理論上，該細胞可以是任何類型的細胞，即，原核細胞，單細胞的真核生物或從多細胞生物，如哺乳動物中得到的細胞。哺乳動物細胞特別適宜于本發明的目的，下文還將對其作進一步討論。
在另一重要方面，本發明涉及生產重組人BSSL/CEL的方法，其中，將編碼人BSSL/CEL的DNA序列插入到能夠在特定宿主細胞中復制的載體中，將所得的重組載體導入能在合適的條件下合適的培養基中或表面生長的宿主細胞中，以表達人BSSL/CEL并回收人BSSL/CEL。
用于生長細胞的培養基可以是任何適于本發明目的的常規培養基。適宜的載體可以是任何上述的載體，適當的宿主細胞可以是任何上述列出的細胞類型。用于構建載體并將其有效地導入宿主細胞的方法，可以是任何重組DNA領域已知的可達到本發明目的方法。由細胞表達的重組人BSSL/CEL可以分泌，即通過細胞膜輸出但這取決于細胞的類型以及載體的組成。
如果人BSSL/CEL是由重組細胞在細胞內生產的，即不能由細胞分泌，那么可能用標準方法回收它們，該方法包括由機械方法如聲處理或均漿，或由酶或化學方法破碎細胞，然后純化。
為了能被分泌，在編碼人BSSL/CEL的DNA序列前應加上一個編碼信號肽的序列;在確保從細胞分泌人BSSL/CEL的情況下，以便將所表達的至少顯著比例的人BSSL/CEL分泌到培養基中并將其回收。
本發明生產重組人BSSL/CEL目前優選的方法是使用能將人BSSL/CEL分泌到其奶中的基因突變的非人哺乳動物。使用基因突變的非人哺乳動物的優點是，可以以合理的價格得到高產率的重組人BSSL/CEL，特別是當非人哺乳動物是母牛時，將重組人BSSL/CEL用作為基于牛奶的產品中的營養添加物時在作為如嬰兒代乳品的正常組分的奶中生產重組人BSSL/CEL就不必進行進一步的純化。此外，在較高級的生物如非人哺乳動物中生產時，一般會導致正確地加工哺乳動物蛋白質，如上述描述的相應的轉譯后加工以及恰當的折疊。也可以得到大量基本純化的人BSSL/CEL。
相應地，在另一重要的方面，本發明還涉及哺乳動物表達系統，它含有插入到非人哺乳動物奶蛋白質編碼基因中的編碼人BSSL/CEL的DNA序列以便形成雜交基因，在含所述雜交基因的成年雌性哺乳動物的乳腺中可表達該雜交基因。
編碼人BSSL/CEL的DNA序列較好地是在序列目錄中以SEQ ID NO1所示的DNA序列或基因組的人BSSL/CEL基因或其類似物。
一般認為，作為表達組織的乳腺和編碼奶蛋白質的基因是特別適用于在基因突變的非人哺乳動物中生產異源蛋白質，象在乳腺中以高表達水平天然生產奶蛋白質一樣。另外，奶容易收集并可大量得到。在本發明中，在生產重組人BSSL/CEL中使用奶蛋白質基因還具有的優點是，按照表達的調節和生產場所(乳腺)，可以在與其天然生產條件相似的條件下生產重組人BSSL/CEL。
本文中的術語“雜交基因”一方面是指含有上文所定義編碼人BSSL/CEL的DNA序列，另一方面指能介導表達雜交基因產物的奶蛋白質基因DNA序列的DNA序列。術語“編碼奶蛋白質的基因”是指能介導并表達雜交基因到所需組織即乳腺中表達的完整基因和其亞序列。通常，所述的亞序列至少含一個或多個啟動子區域，轉錄起始位點，3′和5′非編碼區及結構序列。編碼人BSSL/CEL的DNA序列最好基本上沒有如與其克隆后的DNA序列有關的原核序列，如載體序列。
最好在體外，用本領域已知的技術，將編碼人BSSL/CEL的DNA序列插入到奶蛋白質基因中，形成雜交基因。另外，可通過體內同源重組將編碼人BSSL/CEL的DNA序列插入。
通常，將編碼人BSSL/CEL的DNA序列插入到所選擇奶蛋白質的第一種外顯子之一中或含有第一外顯子和優選的據認為有調節重要性的5′側面序列的基本部分的其有效亞序列中。
雜交基因較好地是含有編碼信號肽的序列以便能將雜交基因產物正確地分泌到乳腺中。信號肽一般是通常發現存在于所述奶蛋白質基因中的或與編碼人BSSL/CEL的DNA序列有關的。然而，能促使雜交基因產物分泌到乳腺中的其它信號序列也是可以的。當然，也應以上述方法融合雜交基因的各種成分以便正確地表達和加工基因產物。因此，通常應將所選擇的編碼信號肽的DNA序列精確地融合到編碼人BSSL/CEL的DNA序列的N末端部分。在雜交基因的酪蛋白基因，如牛αS1酪蛋白和鼠β酪蛋白。本發明優選的基因是鼠WAP基因，發現該基因在不同基因突變動物的奶中，能提供高水平表達的大量外源人蛋白質(Hennighausen et al.，1990)。
與本發明表達系統相關的較好的另一序列是所謂能介導高水平表達的表達穩定化序列。大量事實說明上述穩定化序列在奶蛋白質基因的附近和下游存在。
插入到本發明表達系統的編碼人BSSL/CEL的DNA序列可以是基因組的或合成的或其任何方法結合。為了得到令人滿意的表達，已經發現一些表達系統需要含有內含子和其它調節因子(Hennighausen et al.，1990)。在一些情況下，最好將基因組結構而不是cDNA元素作為多肽編碼成分導入載體構建體(Brinster et al.)。當使用cDNA為基礎的載體時，內含子及外顯子結構可能會導致得到較高的穩定狀態的mRNA水平。
另一方面，本發明涉及雜交基因，它含有插入到編碼非人哺乳動物奶蛋白質基因中的編碼人BSSL/CEL的DNA序列，以及以上述方式插入到奶蛋白質基因中的DNA序列，以便在含該雜交基因的成年雌性哺乳動物的乳腺中使其得到表達。在上文已詳細討論了雜交基因及其組成。在構建如上文所公開的本發明的表達系統中，雜交基因構成了一個重要的中間產物。
另一方面，本發明涉及含上文所定義的表達系統的非人哺乳動物細胞。哺乳動物細胞最好是胚胎細胞或原核。用下文解釋并在下文實施例具體說明的方法，將表達系統適當地插入到哺乳動物細胞中。
在另一重要方面，本發明涉及生產能表達人BSSL/CEL的突變基因非人哺乳動物的方法，包括將上文定義的本發明表達系統注射到哺乳動物的受精卵或胚胎細胞中，以便將表達系統摻入哺乳動物的幼體中并使所得的注射過的受精卵或胚胎發育成成年雌性哺乳動物。
可以用任何適當的技術，如在“Manipulating the Mouse Embryo”;(A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Perss，1986)中的描述完成將表達系統摻入哺乳動物的幼殖體中。例如，可以直接將數非分子的表達系統注射到受精卵中，如一個受精的卵細胞或其原核，或所選擇哺乳動物的一個胚胎，然后將微注射的卵轉移到假孕撫育母親的輸卵管中，并使其發育。通常，并不是所有注射過的卵都能發育成表達人BSSL/CEL的成年雌性。因此，從令人樂觀的觀點看，從下列繁殖孕育雌性動物的方法中，將有一半的哺乳動物是雄性。
一旦整合到幼殖體中，就可以以高水平表達編碼人BSSL/CEL的DNA序列以便在所述哺乳動物的穩定種系中生產正確加工過的并有功能的人BSSL/CEL。
另外所需的是生產基因突變的非人哺乳動物的方法，所述的突變非人哺乳動物能表達人BSSL/CEL，而基本不能表達其自身的BSSL/CEL，該方法包括(a)破壞哺乳動物表達其自身的BSSL/CEL能力以便基本上不表達該哺乳動物的BSSL/CEL并用上述方法將上述的本發明表達系統或編碼人BSSL/CEL的DNA序列插入到該哺乳動物的幼殖體中以便在該哺乳動物中表達人BSSL/CEL;和/或(b)用上述的本發明的表達系統或編碼人BSSL/CEL的DNA序列取代哺乳動物的BSSL/CEL或其部分。
通過將突變導入負責BSSL/CEL表達的DNA序列中可以很方便地破壞哺乳動物的BSSL/CEL表達能力。上述突變含有使DNA序列沒有閱讀框的突變，或導入終止密碼子或缺失DNA序列的一個或多個核苷酸。
用已知的同源重組理論，用上述的表達系統或編碼人BSSL/CEL的DNA序列取代哺乳動物的BSSL/CEL基因或其部分。
在另一方面，本發明涉及用上述描述的方法制備的基因突變非人哺乳動物。
在最廣泛的方面，本發明的基因突變哺乳動物并不限于任何特定的哺乳動物，哺乳動物通常選自于含有小鼠、大鼠、兔、羊、豬、山羊和牛的組中。為了大規模生產人BSSL/CEL，較大的動物如羊，山羊、豬及特別是牛由于其高產量生產奶，所以通常是優選的。然而，由于小鼠、兔和大鼠的操作更簡單，且比牛能更快地得到基因突變動物，所以這些動物也是令人感興趣的。
能生產人BSSL/CEL的上述基因突變動物的子代也在本發明范圍內。
本發明另一方面也包括含有重組人BSSL/CEL的非人哺乳動物的奶。
在本發明另一方面，本發明涉及含有重組人BSSL/CEL，特別是上述本發明多肽的嬰兒代乳品。可以通過將重組人BSSL/CEL或多肽以純化或部分純化的形式加到嬰兒代乳品的正常組分中來制備嬰兒代乳品。然而，優選的是從本發明上述的奶，特別是來源于牛的奶制備嬰兒代乳品可以用傳統方法制備嬰兒代乳品，并且可含有任何必需的添加劑如礦物質，維生素等。
中，編碼人BSSL/CEL的DNA序列通常含有它自己的終止密碼子，但不是它自己的信息劈開處，和多聚腺苷化位點。編碼人BSSL/CEL的DNA序列下游，一般保留奶蛋白質的mRNA加工序列。
預計許多因子都會影響特定雜交基因的實際表達水平。啟動子的能力以及上述的其它調節序列，表達系統在哺乳動物基因組中的整合位點，編碼人BSSL/CEL的DNA序列在奶蛋白質編碼基因中的整合位點，具有轉錄后調節的能力的成分以及其它類似因子均對所得的表達水平起極重要作用。在了解各種因子對雜交基因表達水平影響的基礎上，本領域專業人員會知道如何設計適用于本發明目的的表達系統。
由乳腺分泌各種不同的奶蛋白質。主要存在兩類奶蛋白質，即酪蛋白和乳清蛋白。來自不同種的奶的組分就這些蛋白質的質量和數量變化。大多數非人哺乳動物產生3種不同的酪蛋白，即α酪蛋白，β-酪蛋白和k酪蛋白。大多數普遍的牛乳清蛋白是α乳清蛋白和β乳清蛋白。Clark等人(1987)進一步描述了各種來源奶的組成。
可以使用的奶蛋白質基因來自于相同于要插入了該表達系統的種。或者也可以是從另一個種得到的。本文已顯示將基因特定地表達到乳腺中的調節成分是種范圍內功能交叉的，它們可能起因于共同的祖先(Hennighausen et al.，1990)。
在構建本發明表達系統時所用的編碼奶蛋白質基因或其有效亞序列的適當例子一般是在各種哺乳動物的乳清蛋白中發現的，如乳清酸性蛋白(WAP)基因，最好來自鼠，以及β乳球蛋白基因，最好來自羊。也可以發現適于基因突變生產人BSSL/CEL的各種來源實施例實施例1CEL基因的基因組結構，序列分析及染色體定位如果沒有另外提到，就使用標準分子生物學技術(Maniatis et al.，1982，Ausubel et al.，1987;Sambrook et al.，1989)。
分離基因組重組體用各種亞克隆的cDNA限制片段(Nilsson et al.，1990)作為探針，用[α-32P]dCTP經寡聚標記技術(Feinberg et al.，1983)標記，通過噬菌斑雜交篩選兩種不同的人基因組噬菌體文庫，λDASH(Clonentech Laboratories Inc.，Palo Alto，Ca，USA)和λEMBL-3SP6/T7(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。
基因組克隆的圖譜，亞克隆和定序用各種限制酶消化陽性克隆，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，然后將其真空轉移(Pharmacia LKB BTG，Uppsala，Sweden)到尼龍膜上。將膜與各種cDNA探針雜交。用等速電泳方法( fverstedt et al.，1984)分離與探針雜交的限制片段。將＜800bp的較小片段直接插入到M13mp18，M13mp19，M13BM20或M13BM21載體中并用大腸桿菌TG1作為宿主細胞將其定序，而用大腸桿菌DH5α作為宿主細菌，而將較大的片段亞克隆到pTZ18R或pTZ19R載體中，并將其進一步消化。(相應地生產在下面實施例2中所用的質粒pS309，pS310，和pS451)。在雜交中，將一些分離的片段也用作探針。用Klenow酶通過雙脫氧鏈末端方法(Sanger et al.，1977)以及或者特定寡核苷酸M13通用定序引物確定全部核苷酸序列。用Sj
berg等人(1989)描述的軟件MS-Edseq從放射自顯影得到序列資料。用從UWGCG軟件包裝得到的程序(Devereux et al.，1984)分析該序列。
引物延伸用異硫氰酸鹽鈲-CsCl方法(Chirgwin et al，1979)從人胰腺，哺乳乳腺和脂肪組織中分離總RNA。用總RNA和一個反義26-體寡核苷酸(5′-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-3′)，nt33-58位點，按照Ausubel等人(1987)所述完成引物延伸。在30μl的0.9M NaCl，0.15M Hepes PH7.5和0.3M EDTA中于30℃過夜完成引物與20μg總RNA的雜交。在用反轉錄酶的延伸反應后，通過6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析延伸產物。
體細胞雜交將從NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository(Coriell Institute for Medical Research Camden，NJ)得到的16個人-嚙齒類體細胞雜交細胞系的DNA用于CEL基因的染色體測定。經由GM09940得到的人-小鼠體細胞雜交物GM09925是從人胎男性成纖維母細胞(IMR-91)與胸苷激酶缺陷型小鼠細胞系B-82(Taggart et al.，1985;Mohandas et al.，1986)融合得到的。GM10324與GM02860與HPRT和APRT缺陷型小鼠細胞系A9(Callen et al.，1986)雜交，而雜交物GM10611是從反轉錄載體SP-1感染的人淋巴母細胞細胞系GM07890與中國倉鼠卵巢細胞系UV-135(Warburton et al.，1990)微細胞融合得到的。雜交物GM10095是將帶有平衡的46，x，t(x;9)(q13;34)核型的雌性淋巴細胞與中國倉鼠細胞系CHW1102(Mohandas et al.，1979)融合得到的。表1中列出了經細胞遺傳學分析以及Southern印跡分析和原位雜交分析確定的雜交細胞系的人染色體內含物。用EcoRI消化從小鼠，中國倉鼠和人親代細胞系以及16個雜交細胞系中分離的高分子量DNAs，在0.8%的瓊脂糖凝膠中分餾并將其轉移到尼龍濾膜上。經寡聚物標記(Feinberg and Vogelstein，1983)制備[α-32P]dCTP標記的CEL cDNA探針并將其與濾膜雜交。在65℃，分別于6×SSC/0.5%SDS和2×SSC/0.5%SDS中將濾膜各洗滌60分鐘。
多聚酶鏈反應用從白細胞分離的全部人基因組DNA，來自體細胞雜交物和部分陽性基因組重組體的DNA以及來自哺乳期人乳腺和人胰腺的總RNA擴增其外顯子10和外顯子11。使用2μg的DNA，在表2中列出了所用的引物。在100μl體積[10mM Tris-HCl，PH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，各200μM的dNTP，100μg/ml明膠，各100pmol的引物，1.5U Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA)]及全部引物對的退火溫度55℃完成了30個循環的PCR。用結合的互補DNA(cDNA)及PCR方法擴增RNA序列。在42℃，經30分鐘，在含50mM Tris-HCl，PH8.3，50mM KCl，10mM MgCl2，10μg/ml BSA，各1mM dNTP，500ng寡(dt)12-18，40U核糖核酸酶抑制劑，及200U反轉錄酶(MoMuLV)，(BRL，Bethesda Research Laborataries，N.Y.，USA)的40μl溶液中，用共10μg RNA合成cDNA。將該cDNA沉淀并再懸浮于25μl H2O中;按上文所述擴增其中的2μl。在2%瓊脂糖凝膠上分析擴增的片段。進一步亞克隆其中的一些片段，并將其定序。
人CEL基因的基因結構在每個基因組文庫中，篩選106個重組體并且這些篩選物中產物數個陽性克隆，將它們全部分離出來并作圖。進一步分析稱作λBSSL1和λBSSL5A的兩個克隆。用幾種酶進行限制酶消化Southern印跡分析，接著用cDNA探針雜交，說明λBSSL5A克隆覆蓋了全部CEL基因，λBSSL1克隆覆蓋了5′-的一半和5′側區域的10kb(圖1)。這兩個克隆一起共覆蓋了約25kb的人基因組。
亞克隆及限制酶消化后，得到適宜定序的片段，并可以確定CEL基因的全部序列，包括1640bp的5′側區域的41bp的3′側區域。這些資料說明，人CEL基因(SEQ ID NO1)跨9850bp的區域，含由10個內含子間隔的11個外顯子(圖1)。這意味著外顯子和特定的內含子是相當小的。事實上，外顯子1-10的大小范圍分別從87-204bp，外顯子11是841bp長。內含子的大小范圍分別從85-2343bp。在表3中可以注意到，所有的外顯子/內含子界線都遵守AG/GT法則，并與Mount等人(1982)指出的一致序列符合得很好。將CEL基因的編碼部分與cDNA(Nilsson et al.，1990)相比，僅發現核苷酸序列中有一個不同，在外顯子1中第2nt是ac，在cDNA序列中是aT。由于該位置是在轉譯起始密碼子ATG上游的10nt，所以這種差別并不影響氨基酸序列。重復DNA因子的7個Alu類成員居定序區，標記為Alu1-Alu7(5′-3′)(圖1)，其中一個在5′側區域，其它6個在CEL基因內。
轉錄起始位點和5′側區域為了繪制人CEL基因轉錄起始位點的圖譜，用來自人胰腺、哺乳期乳腺和脂肪組織的總RNA完成引物延伸分析。結果表明，主要的轉錄起始位點位于起始因子甲硫氨酸上游的12bp，而一個較小的起始位點位于8個堿基處。在胰腺和哺乳期乳腺中的轉錄起始位點相同，而在脂肪組織中未檢測到信號(圖2)。定序區包括5′側DNA的1640nt。以序列相似性為基礎，在轉錄起始位點的上游發現了一個TATA盒的類似序列，CATAAAT(圖4)。在該區域既沒有CAAT盒結構也沒有GC盒。
計算機篩選兩個鏈的5′側序列作為其它乳腺-和胰腺特異性基因轉錄子結合序列的核苷酸序列，發現幾個推測的識別序列，見圖4。CEL基因的染色體定位在人對照DNA中，CEL cDNA探針檢測到4個約13kb，10kb，2.2kb及2.0kb的EcoRⅠ片段，在小鼠及倉鼠對照DNA中，分別檢測到約25kb和8.6kb的單一片段。在雜交克隆中，人CEL基因序列的存在僅與人第9染色體的存在有關(表1)。被分析的16個雜交物僅有1個是人CEL基因陽性;該雜交物含有僅作為人染色體的第9染色體。沒有發現有關該染色體定位的不一致性，而有關其它任何染色體定位的不一致性至少有兩個(表1)。為了進一步亞定位CEL基因，我們利用一個人-中國倉鼠雜交體(GM10095)，它保留一個作為唯一人DNA的der(9)易位染色體(9pter→9q34∶Xq13→Xqter)。在該雜交體中，用Southern印跡檢測不到任何CEL基因序列，這說明，CEL基因保留在9q34-qter區域。
實施例2 構建表達載體為了構建用于在來自基因突變動物的奶中生產重組人CEL，使用下列方案(圖5)。
用上文所述的方法得到三個含人CEL基因不同部分，以pTZ為基礎的質粒，pS309，pS310，和pS311。質粒pS309含一個SphI片段，該片段覆蓋從5′非轉錄區到部分第4內含子的CEL基因。質粒pS310含一個SacI片段，該片段含從部分第1內含子到部分第6內含子的CEL基因。第三，質粒pS311含一個BamHI片段，該片段含第5內含子主要部分及內含子/外顯子結構剩余部分的CEL基因變異體。在該質粒中，將一般編碼16個重復片段的外顯子11的重復序列突變，以編碼有9個重復的平截變異體。
另一個質粒pS283含有克隆到pUC 19HindⅢ和SacI位點的部分人CEL cDNA，用該質粒融合基因序列。用pS283也可得到一個很方便的限制酶位點，KpnI，該位點位于CEL5′非轉譯的前導序列。然后用NcoI和SacI消化質粒pS283，分離一個約2.7kb的片段。用NcoI和BspE1消化質粒pS309，分離出一個含CEL基因5′部分的約2.3kb的片段。用BspE I和SacI消化質粒pS310分離出一個含CEL基因部分中間區域的約2.7kb的片段。連接這3個片段，并將其轉化到感受態大腸桿菌菌株TG2中，用氨芐青霉素選擇分離轉化體。從大量的轉化體中制備質粒，含有所需的構建體的一個稱為pS312的質粒(圖6)用于進一步實驗。
為了得到pS311的修飾物，其中將位于終止密碼子下游的BamHI位點變成SalI位點以便于進一步克隆，使用下列方法。用部分BamHI消化，使pS311線性化。分離線性化的片段，并插入將BamHI轉變成SalI位點(5′-GATCGTCGAC-3′)并由此破壞BamHI位點的一個合成DNA接頭。由于有兩個整合合成接頭的潛在位置，所以用限制酶裂解分析所得的質粒。分離在外顯子11下游所需位置插入有接頭的質粒并命名為pS313。
為了得到含CEL基因組序列并編碼平截CEL變異體的表達載體構建體，使用一個用于中間步驟并在定位期間在乳腺細胞中進行組織特異性表達的質粒pS314。質粒pS314含有一個作為NotI片段克隆的來自鼠乳清酸性蛋白質(WAP)基因(Campbell etal，1984)的基因組片段。該基因組片段有約4.5kb的上游調節序列(URS)，完整的可轉錄的外顯子/內含子區域以及約3kb的最后一個外顯子的下游序列。唯一的Kpn I位點位于天然WAP轉譯起始密碼子上游的第一外顯子24bp處。另一個唯一的限制酶位點是位于外顯子3中的Sal I位點，在pS314中，通過消化破壞該Sal I位點，用klenow填平并再連接。代之以在外顯子1中Kpn I位點的下游直接導入一個新的Sal I位點。通過Kpn I消化，并在該位置導入退火的合成寡聚物SYM2401 5′-CGTCGACGTAC-3′和SYM24025′-GTCGACGGTAC-3′完成上述方案(圖8)。用下列方法將人CEL基因組序列插入這兩個位點Kpn I和Sal I之間。首先，用Kpn I和Sal I消化pS314，并電泳分離代表裂解質粒的片段。第二步，用Kpn I和BamH I消化pS312并分離人CEL基因的5′部分的約4.7Kb片段。第三步，用BamH I和Sal I消化pS313并分離人CEL基團的3′部分。連接這三個片段，并轉化到感受態大腸桿菌細菌中，在氨芐青霉素選擇后分離轉化體。從幾個轉化體制備質粒并用限制酶圖譜和序列分析仔細分析。確定出代表所需表達載體的質粒并命名為pS317。
為了構建編碼全長CEL的基因組CEL表達載體，按下列步驟修飾pS317(圖5)。首先，用HindⅢ和Sac I消化含第5內含子到第11外顯子下游人CEL基因的約5.2kb BamH I片段的pTZ18R質粒(Pharmacia)，pS451。該消化產生一個約1.7kb的片段，它包括從內含子9中的HindⅢ位點到外顯子11中的Sac I位點。第二步，用SaCI和Sal I消化質粒pS313，分離含外顯子113′部分和所產生的Sal I位點的71bp片段。第三步，從pS317中分離作為約20kb Sal I/HindⅢ片段的WAP/CEL重組體基因以及質粒序列的剩余部分。連接這3個片段并轉化到細菌中。從幾個轉化體制備質粒。用各種限制酶消化質粒并進行序列分析。鑒定出一個含所需重組基因的質粒。將該最終的表達載體命名為pS452(圖7)。
為了除去原核質粒序列，用Not I消化pS452。然后用瓊脂糖電泳分離重組載體元素，該重組載體元素由位于人CEL基因組片段側面的鼠WAP序列組成。在注射到小鼠胚胎中之前，用電洗脫進一步純化分離的片段。
在圖8中列出了用于在基因突變動物乳腺中表達的重組WAP/CEL基因。
寄存根據布達佩斯條約，已經將下列質粒寄存于DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen)
<p>實施例3 基因突變動物的繁殖按照實施例2，從質粒pS452中分離Not I片段。該DNA片段含有與編碼人BSSL/CEL的基因組序列相連的鼠WAP啟動子。將分離的片段以3ng/μl的濃度注射到350C57B1/6JXCBA/2J-T2胚胎的前核中，該胚胎是從為了排卵過盛而用5IU懷孕母馬的血清促性腺激素灌注的供體小鼠中得到的。C57B1/6JXCBA/2J-f1動物是從Bomholtgard Breeding和Research Ceutre LTD，Ry，Denmark得到的。從輸卵管收集胚胎后，在M2培養基(Hogan et al.，1986)中從用透明質酸酶處理的一群細胞中分離它們。洗滌胚胎后，將其轉移到培養基M16(Hogan et al.，1986)中，并保持在含5%CO2氣體的孵育箱中。用Narishigi水壓顯微操作器和裝配Nomarski鏡片的Nikon倒轉顯微鏡，在輕石蠟油下，M2微滴中完成注射。注射后，將看起來健康的胚胎植入腹腔給過0.37ml2.5%阿佛丁的假孕C57B1/6JXCBA/2J-f1受體中。用來自尾活體解剖標本DNA的PCR分析鑒別已整體轉移基因的小鼠，該標本是從出生3個星期的動物得到的。用Southern印跡分析確認陽性結果。
實施例4在基因突變小鼠中表達BSSL/CEL通過分析從解剖尾樣品制備的DNA，鑒別基因突變小鼠。將組織樣品與蛋白酶k一起培養并用酚/氯仿提取。如果存在代表表達載體片段的異源導入DNA，測將分離的DNA用于帶引物的多聚酶鏈反應以擴增特異性片段。再用DNA雜交試驗分析動物以確定PCR數據并檢測可能的重排，整合載體元素的結構，并獲得關于整合載體元素拷貝數的資料。
在一組實驗中，用兩種方法分析18個小鼠所得的結果說明了1個小鼠攜帶來自pS452的異源DNA載體元素。PCR分析和雜交實驗的結果是相同的(圖9)。
然后將鑒別的攜帶載體DNA元素的小鼠(建立者動物)配對，并用同樣方法分析F1仔的基因空變。
用2IU催產素腹腔注射雌性哺乳期動物，10分鐘后，用0.40ml 2.5%阿佛丁腹腔麻醉。經一硅化管，將一個奶收集裝置與奶頭相連，緩緩按摩乳腺，將奶收集到1.5ml Eppendorf管中。每只小鼠的奶量在0.1和0.5之間變化，這取決于哺乳的天數。
經SDS-PAGE，轉移到硝酸纖維素濾膜上，并與產生抗天然人BSSL/CEL的多克隆抗體一起培養來分析重組人BSSL/CEL的存在。得到的結果說明，在基因突變小鼠奶中表達有重組人BSSL/CEL。圖10說明在基因突變小鼠奶中存在重組人BSSL/CEL該譜帶在約116.5。
產生穩定的基因突變動物種系。
用相似的方法，也可以制備能表達人BSSL/CEL的其它基因突變動物如牛或羊。
參考文獻Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D.
(1988): Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308.
Ausubel, F. M., Brent, R. E., Moore, D.D., Smiyh, J.A.,Seidman, J.G. and Struhl, K.: Current Protocols inMolecular Biology.(Wiley Interscience, New York 1987)Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W.,Tang, J. and Wang,C.S.(1991): Biochemistry 30, 500-510.
Beato, M.(1989): Cell56, 335-344.
Bernbāck, S., Blackberg, L. & Hernell, O. (1990):J.
Clin. Invest. 221-226.
Bjōrksten, B., Burman, L.G., de Chateau, P., Fredrikzon,B., Gothefors, L. & Hernell, O.(1980): Br. Med. J.
201, 267-272.
Blāckberg, L., Angquist, K.A, & Hernell, O.(1987):
FEBS Lett. 217, 37-41.
Blāckberg, L. & Hernell, O. (1981): Eur. J. Biochem116, 221-225.
Blāckberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. &
Olivecrona, T.(1981): FEBS Lett. 136, 284-288.
Boulet, A. M., Erwin, C. R.and Rutter, W. J. (1986):
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83,3599-3603.
Brinster, R. L., Allen, J. M., Behringer, R. R., Gelinas,R.E. & Palmiter, R.D.(1988): Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85, 836-840.
Callen, D.F.(1986): Ann. Genet. 29, 235-239.
Campbell, S.M., Rosen, J.M., Hennighausen, L.G.,Strech-Jurk, U. and Sippel, A.E.(1984): Nucleic AcidRes. 12, 8685-8697.
Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., Mac Donald, R.J. andRutter, W.J.(1979): Biochemistry 18, 5294-5299.
Clark, A.J., Simons, P., Wilmut, I. and Lahte, R.
(1987): TIBTECH5, 20-24.
Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies.(1984):
Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Feinberg, A. and Vogelstein, B.(1983):Anal. Biochem.
132,6-13.
Hennighausen, L., Ruiz, L. & Wall, R.(1990): CurrentOpinion in Biotechnology 1,74-78.
Hernell, O. & Blāckberg, L.(1982): Pediatr. Res. 16,882-885.
Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E.(1986):
Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Hui, D.and Kissel, J.A.(1990): Febs Lett.276,131-134.
Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C.(1978): Biochim.
Biophys. Acta 527, 142-149.
Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J.: MolecularCloning. A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor, NY,1982)Mohandas, T., Sparkes, R.S., Sparkes, M.C., Shulkin,J.D., Toomey, K.E. and Funderburk, S.J. (1979): Am. J.
Hum. Genet. 31, 586-600.
Mohandas, T., Heinzmann, C., Sparkes, R.S. Wasmuth, J.,Edwards, P. and Lusis, A.J. (1986): Somatic Cell. Mol.
Genet. 12,89-94.
Mount, S.M.(1982): Nucleic Acids Res. 10, 459-472.
Nilsson, J., Blāckberg, L., Carlsson, P., Enerbāck, S.,Hernell, O. and Bjursell, G.(1990): Eur. J. Biochem.
192, 543-550.
Qasba, M., and Safaya, S.K. (1984): Nature 308, 377-380.
Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H.,Ronk, M., Shively, J. E., Sternby, B., Borgstrōm, B.,Ameis, D. and Schotz, M.C.(1991): J. Lipid. Res. 32,267-276.
Sambrook, J., Fritsch, E.F.and Maniatis, T.E.:
Molecular Cloning. A Laboratory Manual.(Cold SpringHarbor, NY, 1989)Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R.(1977): Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.
Sjōberg, S., Carlsson, P., Enerbāck, S. and Bjursell,G.(1989): Comput. Appl. Biol. Sci. 5,41-46.
Taggart. R.T., Mohandas, T., Shows, T.B. and Bell, G.I.
(1985): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6240-6244.
Warburton, D., Geroen, S., Yu, M.T., Jackson, C.,Handelin, B. and Housman, D.(1990): Genomics 6, 358-366.
Whitelaw et al.,(1991): Transgenic Research1, 3-13.
Yu-Lee, L., Richter-Mann, L., Couch, C., Stewart, F.,Mackinlay, G. and Rosen, J.(1986): Nucleic. Acid. Res.
14, 1883-1902.
*fverstedt, L.G., Hammarstrōm, K., Balgobin, N.,Hjerten, S., Petterson, U. and Chattopadhyaya, J.
(1984): Biochim. Biophys. Acta 782, 120-126.
圖1CEL基因位點。表示兩個部分重疊的克隆λBSSL1和λBSSL5A的位置及限制酶圖譜。在下面表示外顯子-內含子結構以及所用的限制酶位點。編號1-11的盒表示外顯子。Asp＝Asp700，B＝BamHI，E＝EcoRI，S＝SalI，Sd＝SalI，Sp＝SphI以及X＝XbaI。用粗箭頭表示Alu重復元素的位置和方向。a-h表示不同的亞克隆片段。
圖2來自人哺乳期乳腺，胰腺和脂肪組織的RNA的引物延伸分析。用一個末端放射標記的26聚體聚寡核苷酸(與CEL基因的33到58nt位置互補)引發RNA的反轉錄。A泳道是分子大小標記物(測序梯子)，B泳道是胰RNA，C泳道是脂肪組織RNA，D泳道是乳腺RNA。
圖3人CEL及大鼠CEL基因5′側區域的點標繪分析。將同源區標記為A-H，并寫出了代表這些部分的序列，上面的是人的，下面是大鼠的。
圖4人CEL基因5′側序列的分析。推測的識別序列是代表互補鏈的重點畫線或畫線的。粗字表示與rCEL同源的位置(區域A-H)。用點畫線表示TATA盒。
有兩個與糖皮質激素受體結合位點一致序列，GGTACANNNTGTTCT有80%相似性的序列(Beato，M.，1989)，第一個在互補鏈上-231nt位(1A)，第2個在-811nt位(1B)。此外，在nt位-861(2)有一個與雌激素受體結合位點的一致序列AGGTCANNNTGACCT有87%相似性的序列(Beato，M.，1989)。Lubon和Henninghausen(1987)已經分析了乳清酸性蛋白質(WAP)基因的啟動子和5′側序列，并建立了有關哺乳乳腺細胞核蛋白質結合位點。其中之一，在所研究的大量奶蛋白質基因中，如大鼠α-乳清蛋白基因(Qasba et al.，1984)，及大鼠α-酪蛋白基因(Yu-Lee et al.，1986)，存在11bp的保守序列，AAGAAGGAAGT。在CEL基因的5′側區域，在互補鏈nt位-1299(3)上有一個與該保守序列有82%相似性的序列。
在對β-酪蛋白基因調節的研究中，在懷孕或泌乳的小鼠核提取物中發現了一個組織特異性的乳腺因子(MGF)，并鑒定了它的識別序列(ANTTCTTGGNA)。在人CEL基因5′側區域，有兩個序列，一個在互補鏈nt位-368(4A)，另一個在nt位-1095(4B)，它們兩者與MGF結合位點的一致序列均有82%的相似性。除了在5′側區有這兩個推測的MGF結合位點外，在內含子Int275的互補鏈上有一個與MGF結合位點的一致序列有100%同一性的序列，AGTTCTTGGCA。
此外，有四個與大鼠胰特異性增強子元素GTCACCTGTGCTTTTCCCTG有65%相似性的序列(Boulet et al.，1986)，一個在nt位-359(5A)，第二個在nt位-718(5B)，第3個在nt位-1140(5C)，最后一個在nt位-1277(5D)。
圖5生產質粒pS452的方法。有關詳細說明參見實施例2。
圖6質粒pS312的圖示結構。
圖7質粒pS452的圖示結構。
圖8代表如在實施例2中所述，在WAP基因的第1外顯子中自然導入人BSSL/CEL基因組結構的真實結構圖。
圖9A.圖示說明用于鑒別基因突變動物的PCR引物的定位。5′引物位于WAP與BSSL/CEL之間融合的上游-148bp位開始的WAP序列內。3′引物位于融合點下游終點398bp的第1BSSL/CEL內含子中。
B.所用的PCR引物序列。
C.瓊脂糖凝膠表明潛在建立者動物PCR分析的典型分析。M分子量標記物。泳道1從質粒pS452生產的對照PCR產物。泳道2-13用來自潛在建立者動物的DNA制品所進行的PCR反應。
圖10免疫印跡分析來自基因突變小鼠種的奶中有關pS452重組鼠WAP/人CEL基因。在SDS-PAGE上分離蛋白質，轉移到Immobilon膜(Millipor)上，用高純度人天然CEL產生的多克隆兔抗體，接著用堿性磷酸酶標記的豬抗兔IgG(Dakopatts)反應，肉眼觀察。泳道1低分子量標記物，分別106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa。泳道2高分子量標記物分別205，116.5，80和49.5KDa。泳道325ng來自人奶的純化非重組CEL。泳道4來自CEL基因組突變小鼠，以1∶10稀釋的2μl奶樣品。泳道5和6來自兩個不同非CEL基因突變小鼠以1∶10稀釋的2μl奶樣品，它們作為對照樣品。
序列目錄(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名字ABASTRA(B)街道Kvarnbergagatan 16(C)城市Sodertalje(E)國家Sweden(F)郵政編碼(ZIP)S-151 85
(G)電話+46-8-553 26000(H)傳真+46-8-553 28820(I)電傳19237 astra S(ⅱ)發明題目新的DNA序列(ⅲ)序列數1(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作程序PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)在先申請資料(A)申請號SE 9201809-2(B)申請日1992，6，11(ⅵ)在先申請資料(A)申請號SE 9201826-6(B)申請日1992，6，12(ⅵ)在先申請資料(A)申請號SE 9202088-2(B)申請日1992，7，3(ⅵ)在先申請資料(A)申請號SE 9300902-5(B)申請日1992，3，19
(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度11531一個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)來源(A)生物人類(F)組織種類乳腺(ⅸ)特征(A)名字/關鍵CDS(B)位置連接(1653..1727，4071..4221，4307..4429，4707..4904，6193..6323，6501..6608，6751..6868，8335..8521，8719..8922，10124..10321，10650..11394)(ⅸ)特征(A)名字/關鍵不光滑-肽(B)位置連接(1722..1727，4071..4221，4307..4429，4707..4904，6193..6323，6501..6608，6751..6868，8335..8521，8719..8922，10124..10321，10650..11391)(D)其它資料/EC－數＝3.1.1.1/產品＝“膽汁鹽刺激的脂酶”
(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵5′UTR(B)位置1…1..640(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵TATA－信號(B)位置1611…1617(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置1641…1727(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置4071…4221(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置4307…4429(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置4707…4904(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置6193…6323(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置6501…6608
(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置6751…6868(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置8335…8521(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置8719…8922(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置10124…10321(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵外顯子(B)位置10650…11490(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵3′UTR(B)位置11491…11531(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
權利要求
1.編碼具有生物學功能的BSSL/CEL并含有內含子序列的DNA分子。
2.根據權利要求1的DNA分子，其在序列目錄中以SEQ ID NO∶1列出。
3.根據權利要求2的DNA分子的類似物，其含有內含子序列，并在嚴緊雜交條件下，與序列目錄中以SEQ ID NO∶1所示的DNA序列或其特定部分雜交。
4.一個可復制的表達載體，它攜帶并能促進表達權利要求1-3任何一個DNA分子，并編碼人BSSL/CEL。
5.根據權利要求4的載體，能編碼有生物學功能的BSSL/CEL，并包含指導其在非人動物乳腺中表達的調節元素。
6.根據權利要求4的載體，它是載體pS452(DSM7499)。
7.從多細胞生物得到的并含有權利要求4-6任何一個載體的細胞。
8.生產人BSSL/CEL的方法，包括(a)將權利要求1-3所限定的任何一個DNA分子插入到能在特定宿主細胞中復制的載體中;(b)將所得的重組載體導入宿主細胞;(c)使所得的細胞在培養基中或其上生產，以表達多肽;及(d)回收多肽。
9.哺乳動物表達系統，包括可在含所述雜交基因的成年雌性非人哺乳動物乳腺中表達的雜交基因，在表達雜交基因時可生產人BSSL/CEL，所述雜交基因是通過將權利要求1-3的任何一個DNA分子插入到調節非人哺乳動物奶蛋白質基因的基因中生產的。
10.在權利要求9中限定的雜交基因。
11.含權利要求9所限定的表達系統的哺乳動物細胞。
12.權利要求11的非人哺乳動物細胞是胚胎細胞。
13.生產能表達人BSSL/CEL的基因突變非人哺乳動物的方法，包括(a)將如權利要求9所限定的表達系統導入非人哺乳動物的受精卵或胚胎細胞中以便將表達系統摻入到哺乳動物幼殖體中，(b)將所得的受精卵或胚胎導入成年雌性非人哺乳動物中發育。
14.生產能表達人BSSL/CEL并基本不表達哺乳動物自身BSSL/CEL的基因突變非人哺乳動物的方法，包括(a)破壞哺乳動物的哺乳動物BSSL/CEL表達能力以便基本上不表達哺乳動物的BSSL/CEL并將如權利要求9所限定的表達系統用所述方法插入哺乳動物幼殖體中以便在哺乳動物中表達人BSSL/CEL;和/或(b)取如權利要求9中所限定的表達系統代替哺乳動物的BSSL/CEL基因或其部分。
15.在其基因組中含有權利要求1-3任何一個DNA分子的基因突變非人哺乳動物。
16.根據權利要求15的基因突變非人哺乳動物，其中DNA分子存在于哺乳動物的幼殖體。
17.根據權利要求15或16的基因突變非人哺乳動物，其中DNA分子存在于哺乳動物的奶蛋白質基因中。
18.用權利要求13或14的方法制備基因突變非人哺乳動物。
19.權利要求15至18任何一個基因突變非人哺乳動物是選自小鼠、大鼠、兔、羊、豬和牛。
20.權利要求15-19任何一種基因突變非人哺乳動物的子代。
21.從權利要求15-20任何一種基因突變哺乳動物中得到的奶。
22.一種嬰兒代乳品，含有權利要求21所定義的奶。
23.生產嬰兒代乳品的方法，用權利要求1-3任何一個DNA分子編碼的多肽補充嬰兒食品配方。
24.用權利要求1-3任何一個DNA分子生產人BSSL/CEL。
25.根據權利要求24的用途，生產表達人BSSL/CEL的轉基因非人哺乳動物。
26.根據權利要求24的用途，生產含人BSSL/CEL的奶，該奶是從基因突變的非人哺乳動物得到的。
27.根據權利要求24的用途，生產嬰兒代乳品，包含有含人BSSL/CEL的奶，所述奶是從基因突變的非人哺乳動物得到的。
28.用權利要求1-3任何一個DNA分子制造治療與外分泌胰不足有關的病理學狀態的藥物。
29.根據權利要求28的用途，制造治療囊性纖維病變的藥物。
30.根據權利要求28的用途，加工治療慢性胰炎的藥物。
31.根據權利要求28的用途，加工治療吸收障礙的藥物。
32.根據權利要求28的用途，加工治療脂溶性維生素吸收障礙的藥物。
33.根據權利要求28的用途，加工治療由于生理學因素造成吸收障礙的藥物。
全文摘要
本發明涉及包含內含子序列并編碼根據作用位點稱之為膽汁鹽刺激脂酶(BSSL)或羧酸酯脂酶(CEL)人蛋白質的DNA分子。可以用該DNA分子生產重組人BSSL/CEL，尤其是用基因突變的非人哺乳動物生產。可以將該重組人BSSL/CEL作為取代人奶喂養嬰兒的嬰乳代乳品成分，或將其用于生產抗吸收障礙，囊性纖維性變及慢性胰炎的藥物。
文檔編號A23C9/20GK1086262SQ9310871
公開日1994年5月4日 申請日期1993年6月11日 優先權日1992年6月11日
發明者K·G·比約塞爾, P·N·I·卡爾森, C·S·M·恩納貝克, S·L·漢森, U·F·P·里德堡, J·A·尼爾森, I·B·F·特奈爾 申請人:阿斯特拉公司