專利名稱：同時測定葡萄糖和蔗糖的雙電極復合酶傳感器的制作方法
技術領域：
本發明是關于生物傳感器，特別是流動注射式雙電極復合酶傳感器的發明。該傳感器由葡萄糖酶電極、固定化過氧化氫酶和蔗糖酶電極共同組成，可同時測定樣品中的葡萄糖和蔗糖。
在食品和發酵工業及其相關科研中，常常需要測定葡萄糖和蔗糖。在各種測定方法中，以酶電極法最為快捷低耗。葡萄糖酶電極已經商品化，蔗糖酶電極也有一些研究報告，其酶促使反應原理如下
測定O2的消耗或H2O2的產生可以對蔗糖定量。然而，當樣品中葡萄糖與蔗糖共存時(簡稱G/S溶液)，電極也對葡萄糖響應，蔗糖測定受到干擾。已知有三種解決辦法(1)在蔗糖酶電極表面加一層固定化GOD膜，使共存葡萄糖在擴散進入電極反應前被除去[Scheller and Renneberg，Anal.Chim.Acta，152(1983)∶265]，該方法可排除葡萄糖干擾但不能測定葡萄糖;(2)結合采用GOD電極和固定化INV，G/S樣品溶液經分流，一部分被GOD電極直接測定出葡萄糖濃度，另一部分以含固定化INV(酶管或酶柱)的旁路，其中庶糖被轉化成葡萄糖，再被GOD電極測定，根據兩次響應值之差可算出蔗糖濃度[Masoom and Townshend，Anal.Chim.Acta，171(1985)∶185]，該方法能同時測定葡萄糖和蔗糖，但酶柱(管)制作工藝較復雜，耗酶量大，易滯留氣泡產生干擾;(3)用一只GOD電極先測定G/S樣品中葡萄糖濃度，再用一只蔗糖電極對樣器測定，將總的葡萄糖濃度減去GOD電極測定的葡萄糖濃度即為蔗糖濃度[Xu and Guilbault，Anal.Chem.61(1989)∶782;胡偉平，張先恩等，生物工程學報，7(1991)∶339]，該方法的不足在于測定分兩步進行，耗時較長。
本發明的任務是建立(提供)一種能適用于流動注射分析的雙電極復合酶傳感器，該傳感器能用于G/S樣品的葡萄糖和蔗糖同時測定。
解決的方案是將一只葡萄糖酶電極(K1)和一只蔗糖酶電極(K2)固定(制作)在一個流通測定池中，G/S樣器一次性流過雙電極流通池，葡萄糖和蔗糖同時被測出。
下文及附圖描述了本發明的一個實施例
圖1為雙碳糊電極復合酶傳感器及流通池結構示意圖。
流通測定池由有機玻璃上下基座(1)和(2)，流通池(3)，GOD電極K1(4)和蔗糖酶電極K2(5)組成，在K1和K2之間的池底有一層固定化過氧化氫酶(CAT)(6)，(1)和(2)通過螺絲(7)緊固。
酶電極的制作方法6份石墨粉與4份礦物油(W∶W)混合調勻，填充到插有銅導線的兩個電極腔、壓實，形成平坦表面;在K1碳糊電極表面滴注1ul GOD(2～4units/ul)，1ul牛血清白蛋白(BSA)(20%，W/V)和0.5ul戊二醛(5%)，均勻混合復蓋碳糊，室溫交聯成酶膜;在K2碳糊電極表面滴注1ul GOD，2ul MUT(1-2units/ul)，4ul INV(80-100units/ul)，1ul BSA和2ul戊二醛，均勻混合復蓋碳糊，室溫成膜。
CAT酶膜的制作2ul CAT(4000-6000units/ul)，0.5ul BSA和0.5ul戊二醛滴注到流通池兩電極之間的槽中，混均擴散，室溫交聯成膜。
圖2為測定工作系統。
載流液為磷酸緩沖液(PBS，0.02mol/L，pH6.8)(1)，液流驅動力由蠕動泵(2)提供，G/S樣品經注射閥(3)定量注入PBS載流，經混合圈(4)混合后流經K1(5)，K2(6)，Ag/AgCl參比電極(7)和對電極(8)，而后被排出(9)。K1和K2輸出的響應電流信號由檢測器(10)檢出并由記錄儀(11)記錄。檢出信號也可通過接口電路(12)送至單片計算機進行數據處理。
圖3為電極K2的響應信號。
當測定池中無固定化CAT時(圖3A)，K2的響應蜂有較長的拖尾，表明電極洗脫回復時間長(約5-6min)，不能迅速進入第二輪測定，其原因是K1表面的酶促反應產生的H2O2部分地擴散至K2，導致K2的持續響應。在兩電極間固定一層CAT后(圖1)，H2O2由K1向K2擴散的途中被CAT轉化成H2O2和O2，使K2的響應峰拖尾消失，電極迅速被洗脫回復(圖3B)，所產生的O2還可彌補因K1耗氧而可能造成K2的供氧不足。
測定G/S樣品時采用兩點標定法(two-point calibration)。分別用線性范圍內的兩種濃度的標準葡萄糖溶液和兩種濃度的標準蔗糖溶液注射，以響應值為Y，濃度值為X，建立線性方程。
Y1＝a1+b1XG(1)Y2＝a2+b2XG(2)Y3＝a3+b3XS(3)這里，式(1)為K1的葡萄糖濃度一應值校準式，式(2)為K2的葡萄糖濃度一響應校準式，式(3)為K2的蔗糖濃度一響應值校準式，XG為葡萄糖濃度，XS為蔗糖濃度。當樣品為G/S時，K2的響應值為YtY3＝Yt-Y2Yt-(a2+b2XG) (4)在高的載流速度下(〉1ml/min)，K1消耗的葡萄糖對樣品中總的葡萄糖量可忽略不計，式(2)中的XG與式(1)中的XG近似相等，于是(1)和(2)可以聯立，解出XG并代入(4)，得Y3＝Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1] (5)重排式(3)解出XS并代入式(5)，得XS＝｛Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1]-a3｝/b3(6)該式即為雙電極復合酶傳感器測定并求蔗糖濃度XS的基本計算式，式中an和bn由兩點標定法得出，進行G/S樣品測定時，一次注樣，便同時測出蔗糖和葡萄糖濃度。
倘若an〈〈bn，式(6)可簡化為Xs＝(Yt-b2Y1/b1)/b3(7)此時可采用單點標定法，使用一種濃度標定液即可在該實施例中，測定純的葡萄糖或蔗糖(1mmol/L，進樣量50ul)變導系數CV〈4%(n＝9)，測定G/S樣品中的蔗糖(1mmol/L)，CV〈6.5%(n＝9)。
關于葡萄糖對蔗糖測定的干擾評價，設K2電極對純蔗糖溶液線性范圍內最高濃度的響應值為K3max，在對G/S測定時，若Yt〈70%K3max，葡萄糖濃度對蔗糖測定的干擾可忽略不計。
權利要求
1.一種用葡萄糖酶電極和蔗糖酶電極構成的流通式雙電極復合酶傳感器，其特征是當注入含葡萄糖和蔗糖的混合樣品時，根據響應值Y1和Yt，按式(6)X6={Yt-[a2+b2(Y1-a1)/b1]-a3}/b3或式(7)X6=(Yt-b2Y1/b1)/b3或其衍生式計算出葡萄糖和蔗糖濃度。
2.按照權項1所述，其特征是在傳感器裝置中，若電極K1和電極K2為順序安裝(如圖1)，則在兩電極之間固定有一層過氧化氫酶，以消除電極K1酶促反應產物H2O2對電極K2的干擾，使K2的洗脫回復時間縮短。
全文摘要
本發明是關于生物傳感器，特別是流動注射式雙電極復合酶傳感器的發明。該傳感器由葡萄糖酶電極、固定化過氧化氫酶和蔗糖酶電極共同組成。將一只葡萄糖酶電極(K
文檔編號C12Q1/54GK1097468SQ9310786
公開日1995年1月18日 申請日期1993年6月30日 優先權日1993年6月30日
發明者張先恩, 雷青利斯, 胡偉平, 張治平, 危宏平, 張曉梅, 曲紅波, 張煜 申請人:中國科學院武漢病毒研究所