專利名稱：含咖啡堿脫甲基酶基因的dna片段和生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法
技術領域：
本發明涉及含有由假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物產生并能代謝咖啡堿之咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段;用含所說的DNA片段之重組DNA轉化而得到的新的假單胞菌屬的菌株;以及產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法。
3-甲基-7-烷基黃嘌呤是一種重要的用于制備成藥的中間產品。例如，3，7-二甲基黃嘌呤(可可堿)是1-(5-氧代己基)-3，7-二甲基黃嘌呤(Pentoxyfylline)的重要中間產品，3-甲基-7-丙基黃嘌呤是1-(5-氧代己基)-3-甲基-7-丙基黃嘌呤(Propentophylline)的重要中間產物。
可按常規方法從可可豆中提取得到3，7-二甲基黃嘌呤，或者也可從3-甲脲合成得到。
通常是按JP-BP-52-33120(術語“JP-B”在這里是指“已審查的日本專利公開”)中所述，將5-氧代己基基團引入3-甲基-7-丙基黃嘌呤中來合成可用作治療腦血管病之藥物的Propentophylline。可通過各種化學方法合成起始材料3-甲基-7-丙基黃嘌呤。這種方法的一個典型例子是包括用堿處理1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤，以得到4-甲基氨基-5-甲基氨甲酰-1-丙基咪唑，后者與脲反應得到N-甲基-N-(5-甲基氨基酰-1-丙基咪唑-4-基)脲，然后按JP-A-1-180883(術語“JP-A”在這里是指“未審查的已
公開日本專利申請”)所術方法使之環化。但這些已知的化學合成方法在其工業生產應用中有許多問題，包括需要使用非常復雜的步驟。因此，期望開發更為簡單的合成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法。
另外，已研究了合成3，7-二甲基黃嘌呤的微生物技術。例如，Hoope-Seyler′s Z.Physiolo.Chem.，Vol.358，P.807(1977)，JP-B-4-12117和EP-A-0509834中提出使用能同化咖啡堿的微生物或其突變菌株，將1，3，7-三甲基黃嘌呤(咖啡堿)轉化成3，7-二甲基黃嘌呤。
然而，除3，7-二甲基黃嘌呤外，微生物合成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法是未知的。另外，從轉化效率等角度看，合成3，7-二甲基黃嘌呤的已知微生物方法仍不能令人滿意地進行工業規模生產。
鑒于上述情況，本發明廣泛地研究了能夠使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤位點特異性地脫甲基的微生物，并出乎預料地發現以前由本發明人從自然界分離的一個假單胞菌屬的菌株當培養在含1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的培養基中時，能同化咖啡堿而在培養基中產生相應的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發明人原先通過將從土壤中分離的同化咖啡堿的微生物突變而得到組成型的代謝咖啡堿的突變菌株，又進一步突變該微生物使之缺失令可可堿脫甲基而成為7-甲基黃嘌呤的能力，從而得到其雙突變的菌株(見EP-A-0509834)。
本發明人已發現，上述雙突變菌株比從自然界分離的親代菌株有更強的將相應1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力。
如果在由上述微生物完成的咖啡堿代謝途徑的第一個步驟能更有效地進行，使從相應1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力得到進一步地提高。為此，本發明人進行了深入的研究，以期提高已知可催化該反應的咖啡堿脫甲基酶的活性。結果，他們成功地克隆了此前尚不明了其蛋白質知識的咖啡堿脫甲基酶的基因。已基于這些發現完成了本發明。
本發明提供了(1)一種分離并純化的DNA片段，其含有衍生于假單胞菌屬之細菌的咖啡堿脫甲基酶基因;
(2)根據上述(1)的DNA片段，它是由
圖1中所示的限制性核酸內切酶裂解圖譜限定的;
(3)根據上述(2)的DNA片段，其中由SEQ ID NO1表示位于Acc I位點和Nde I位點間的堿基序列，其含有咖啡堿脫甲基酶基因;
(4)一種分離并純化的DNA片段，其含有編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的堿基序列;
(5)將上述(1)或(4)的DNA片段整合到其載體中所得到的重組DNA;
(6)包括用上述(5)的重組DNA轉化的宿主的假單胞菌菌屬的新的細菌菌株;
(7)上述(6)的假單胞菌菌屬的新的細菌菌株，其中宿主是臭味假單胞桿菌(Pseudomonas putida)以及;
(8)上述(7)的假單胞菌菌屬的新的細菌菌株，其中宿主是臭味假單胞菌IF-3-9C-21。
本發明還提供了生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法，該方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養培養基中培養用含有咖啡堿脫甲基酶基因的重組DNA轉化的微生物，以在培養物中產生相應的3-甲基-7-烷基黃嘌呤并從培養物中回收所產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發明進一步提供了生產3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法，該方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養培養基中培養能夠將1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬的微生物或由之衍生的突變體，以在培養物中產生3-甲基-7-丙基黃嘌呤并從培養物中回收所產生的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
圖1是含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段的限制性核酸內切酶裂解圖譜。
圖2是圖解顯示在小罐中的培養進程。圖中，分別以白圈代表臭味假單胞桿菌IF-3-9C-21/pCA32A生產可可堿的情況;白三角代表臭味假單胞桿菌IF-3-9C-21產生可可堿的情況;黑圈代表臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A產生3-甲基-7-丙基黃嘌呤的情況，黑三角代表臭味假單胞菌IF-3-9C-21產生3-甲基-7-丙基黃嘌呤的情況。
可用于本發明的微生物包括能將通式(Ⅰ)代表1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤
(-其中R代表直鏈或支鏈的烷基基團-)轉化成式(Ⅱ)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤
(-其中R的定義同上-)的微生物。
本發明中，上述通式(Ⅰ)和(Ⅱ)的R優選是C1-C4烷基基團。
上述微生物包括屬于假單胞菌屬的細菌和由之衍生的突變體。特定例子是從土壤中分離并在EP-A-0509834中描述的臭味假單胞菌IF-3(已按布達佩斯條約以FERM BP-3824為登記號保藏);以及在JP-B-4-12117中描述的假單胞菌菌種188-1(已按布達佩斯條約以FERM P-7073，FERM BP-4282為登記號保藏)。
根據本發明人的研究，假單胞菌188-1(已按布達佩斯條約規定，以保藏登記號FERM P-7073，FERM BP-4282保藏)被鑒定為如下文描述的洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)。下文中將假單胞菌188-1(已按布達佩斯條約規定，以FERM P-7073，FERM BP-4282為保藏登記號保藏)稱為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)FERM BP-4282。
可按已知方法對上述菌株進行突變處理以得到突變菌株，如用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(下文簡稱為NTG)作為誘變劑進行化學處理。另外，也可用2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶，甲磺酸乙酯，硫酸二甲酯，丫啶磺，丫啶桔黃(Acridine Orange)，肼，4-硝基喹啉-N-氧化物、氯化錳等作誘變劑。可使用紫外光照射或X射線、γ射線等放射活性照射等物理方法誘導突變(參見The Molecular Basis of Mutation，John W.Drake(1970)，Holden-Day.Inc.and General Genetics(第2版)，W.H.FREEMAN AND COMPANY)。
可用已知方法分離突變菌株，如包括首先培養已經受突變處理的微生物，然后檢查各菌落發生突變情況的直接方法;按上述方法進行改進的復制方法;使用青霉素等抗生素的凝聚方法;以及適當聯合使用上述方法。
本發明中，采用下述實驗程序選擇出能將1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的菌株。從土壤中分離大約100個有咖啡堿抗性并能夠在含有1.0% Bacto-胨，0.5% Bacto-酵母浸膏，0.5%氯化鈉和2.0%咖啡堿的瓊脂培養基上生長的菌株，分別接種于含有0.3%咖啡堿，0.3%硫酸銨，0.5%二代磷酸鉀，0.1%氯化鈉和0.2%硫酸鎂的瓊脂培養基(pH＝7.0)上并于30℃下培養3天，然后選擇生長良好的菌株。
臭味假單胞菌IF-3和洋蔥假單胞菌FERM BP-4282的菌學性質如下所述。按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of the Identification of Medical Bacteria(MIMB)，Identificaton of Microorganisms和Academic Society Press Center，Japan出版的Classification and Identification of Microorganisms.Vol.Ⅱ所述方法檢驗這些細菌菌學性質。
臭味假單胞菌 IF-3a.形態學特征1)革蘭氏染色陰性2)細胞的形狀和大小桿狀，約0.8×2-3μm3)運動性陽性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學性質1)O-F試驗(Hugh-Leifson方法)需氧產酸2)溶血陽性3)對氧的反應需氧4)由糖產酸D-葡萄糖 +D-木糖 +甘露糖醇 -乳糖 -蔗糖 -
D-麥芽糖 -D-果糖 -L-阿拉伯糖 +棉子糖-菊粉 -水楊苷 -瓊脂糖 -D-山梨糖醇 -D-半乳糖 +甘油 -5)過氧化氫酶試驗陽性6)氧化酶試驗陽性7)在Mac Conkey氏培養基上生長陽性8)在SS瓊脂培養基上生長陽性9)DBH 水解陰性10)PHB 積聚陰性11)檸檬酸利用陽性12)脲分解陰性13)硝酸鹽還原陽性14)脫氮反應陰性15)熱抗性(60℃×30分鐘)無抗性16)生長溫度5℃生長25℃生長
37℃生長42℃不生長17)明膠水解陰性18)石蕊汁反應陽性19)淀粉水解陰性20)酪蛋白水解陰性21)聚集素酶反應陰性22)賴氨酸脫羧陰性23)精氨酸二氫化酶陽性24)鳥氨酸脫羧陰性25)七葉苷水解陰性26)NaCl抗性對0%NaCl有抗性對4%NaCl有抗性對6%NaCl無抗性對7%NaCl無抗性27)酰胺酶陰性28)葡糖酸氧化陰性29)DNA酶存在陰性30)色素產生在King A培養基中陰性在King B培養基中陽性31)TW-80水解陰性32)在NAC培養基中生長陽性
33)瓊脂水解陰性34)從蔗糖產生果聚糖陰性35)苯丙氨酸脫氨基陰性36)在甲烯蘭乳中生長甲烯蘭減少陽性甲烯蘭凝結陰性胨化陰性37)來自TSI的酸陰性/陰性38)在TSI培養基中產生硫化氫陰性39)馬尿酸鈉水解陽性40)MR試驗陰性41)VP試驗陰性基于上述菌學性質，按照Presumptive Identification和Berger′s Manual of Systematic Bacteriology指導手冊來鑒別該菌株。鑒于鞭毛數目、于42℃下生長、水解明膠和TW-80、由海藻糖和甘露糖醇產酸等檢驗結果，將該菌株鑒定為臭味假單胞菌并命名為臭味假單胞菌IF-3。已按布達佩斯條約規定，將該菌株保藏在National Institute of Bioscience and Humantechnology，Agency of Industrial Science ＆ Technology，MITI，1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken 305，Japan，其保藏登記號為FERM BP-3824。
洋蔥假單胞菌BP-4282
a.形態學特征1)革蘭氏染色陰性2)細胞的形狀和大小短桿狀，約0.7-0.8×1.0-1.3μm3)運動性陽性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學性質1)O-F試驗(Hugh-Leifson法)需氧產酸2)對氧的反應嚴格好氧3)由糖產酸L-阿拉伯糖 +D-木糖 +D-葡萄糖 +D-甘露糖 +D-果糖 +D-半乳糖 +麥芽糖 +蔗糖 +乳糖 +海藻糖 +D-山梨糖醇 +D-甘露糖醇 +甘油 +
肌醇4)過氧化氫酶試驗弱陽性5)氧化酶試驗陽性6)檸檬酸利用(在Koser′s培養基和Christensen′s培養基中)陽性7)硝酸鹽還原陽性8)熱抗性(60℃×30分鐘)無抗性9)生長溫度于9-41℃生長10)明膠水解陰性11)石蕊汁反應陰性12)淀粉水解陰性13)賴氨酸脫羧陽性14)精氨酸二水解酶陰性15)鳥氨酸脫羧陰性16)酰胺酶陽性17)葡糖酸氧化陽性18)色素產生在King A培養基中陰性在King B培養基中陰性19)MR 試驗陰性20)VP 試驗陰性基于上述菌學性質，按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology的描述鑒別該菌株。鑒于其為革蘭氏陰性菌，桿狀，靠極性鞭毛有運動性、需氧性質、氧化酶陽性及可由葡萄糖產酸等檢驗結果，而將該菌株分類為假單胞菌屬的細菌。該菌株最初定名為假單胞菌SP.188-1，并已按布達佩斯條約規定保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Sciency ＆ Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號為FERM P-7073(FERM BP-4282)。
基于上述研究結果，又因其呈現陰性烏氨酸脫羧酶活性，陽性賴氨酸脫羧酶活性，陽性葡糖酸氧化酶活性，陽性酰胺酶活性，陰性精氨酸二水解酶活性及于41℃下生長等生理學性質，故將其鑒定為洋蔥假單胞菌種。
另外，本發明人已從臭味假單胞菌IF-3親代菌株得到了突變體臭味假單胞菌IF-3-9C-21。菌株IF-3-9C-21能夠組成型地將咖啡堿轉化成可可堿，但不能將可可堿轉化成7-甲基黃嘌呤。該菌株已按布達佩斯條約規定保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology，Agence of Industrial Science ＆ Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號為FERM BP-3825。
據認為，由假單胞菌屬細菌完成的咖啡堿代謝是按下述步驟進行的(見Hoope-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，Vol.358，pp.807-817(1987))
咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤)↓步驟1可可堿(3，7-二甲基黃嘌呤)↓步驟27-甲基黃嘌呤↓步驟3黃嘌呤步驟1，2和3中，據認為酶可分別特異地釋放1，3或7位上的甲基基團。但在尚不了解這些酶的分子量、等電點、氨基酸序列、氨基酸組成等蛋白質學性質的情況下，尚不能從蛋白質學上證實其存在。
為了提高上述微生物中咖啡堿脫甲基酶的活性，本發明人成功地進行了克隆咖啡堿脫甲基酶基因的嘗試。
可基本上通過下述步驟得到本發明的DNA片段、重組DNA及轉化的微生物。
(1)制備用于咖啡堿脫甲基酶基因克隆的宿主。對能夠代謝咖啡堿的臭味假單胞菌IF-3-9C進行突變處理，并分離到能同化可可堿但不能同化咖啡堿的菌株(臭味假單胞菌IF-3-19)。
(2)從臭味假單胞菌IF-3(已按布達佩斯條約以保藏登記號FERM BP-3824保藏)中提取總DNA，并用適當的限制性酶(如Hind Ⅲ)進行部份裂解。
(3)在Hind Ⅲ識別位點處將(2)中得到的DNA片段插入并連接到pNI20C中，以提供重組DNA。
(4)用(3)中得到的重組DNA轉化(1)中得到的臭味假單胞菌IF-3-19，以提供恢復了咖啡堿同化能力的重組體菌株。
(5)再克隆重組DNA，并測定此DNA片段的堿基序列，以鑒定咖啡堿脫甲基酶的編碼區。
(6)將含有咖啡堿脫甲基酶之整個編碼區的適當大小的DNA片段(假定含有基因之啟動子、終止子等的片段)整合到載體(pHI 107一種已知具有轉化假單胞菌屬細菌之能力的載體)中，以得到重組DNA。
(7)使用(6)中得到的重組DNA轉化臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達佩斯條約作為FERM BP-3825保藏)。
(8)進一步證實(7)中得到的轉化體轉化1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤成為3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力。
可按照基因工程領域中使用的已知的常規方法，如Maniatis等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory(1989))所述的方法，很容易地完成上述重組DNA實驗。可從商業途徑得到用于該實驗的所有的酶和試劑。除特別指出者外，只要使用為制備特定產品所規定的條件即可完全實現預期的實驗目的。
例如，用于上述(2)中的DNA來源包括臭味假單胞菌IF-3(已按布達佩斯條約規定，作為FERM BP-3824保藏)和亮黃假單胞菌(Pseudomonas flavida IF-4)(已按布達佩斯條約規定作為FERMP-10865，FERM BP-4281保藏)。
亮黃假單胞菌的菌學性質如下所述。這些菌學性質是按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of the Identification of Medical Bacteria(MIMB)，Ideantification of Microorganisms.和Academic Society Press Center，Japan出版的Classification and Identification of Microorganisms，Vol.Ⅱ檢驗的。
亮黃假單胞菌IF-4a.形態學特征1)革蘭氏染色陰性2)細胞的形狀和大小短桿狀，約0.7-1.1×1.1-2.5μm3)運動性陽性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學性質1)O-F試驗(Hugh-Leifson法)需氧產酸2)對氧的反應好氧3)由糖產酸D-葡萄糖 +D-木糖 +甘露糖醇 -乳糖 -蔗糖 -麥芽糖 -海藻糖 -
D-果糖 +4)過氧化氫酶試驗陽性5)細胞色素氧化酶試驗陰性6)在Mac Conkeys培養基上生長陽性7)在SS瓊脂培養基上生長陽性8)檸檬酸利用陽性9)脲分解陰性10)硝酸鹽還原陰性11)脫氮反應陰性12)長生溫度5℃生長41℃不生長13)明膠水解陽性14)石蕊汁反應堿性15)淀粉水解陰性16)酪蛋白水解陰性17)凝集素酶反應陰性18)賴氨酸脫羧陰性19)精氨酸二水解酶陽性20)鳥氨酸脫羧陰性21)七葉苷水解陰性22)NaCl抗性對6%NaCl有抗性23)酰胺酶陰性
24)葡糖酸氧化陽性25)DNA酶陰性26)色素產生在Trypto Soy-瓊脂培養基中陽性在King B培養基中陽性27)TW-80水解陰性28)在NAC培養基中生長陽性29)瓊脂水解陰性30)從蔗糖產生果聚糖陰性31)苯丙氨酸脫氨基陰性32)來自TSI的酸陰性/陰性33)MR試驗陰性34)VP試驗陰性按照Presumptive Identification和Bergey′s Manual of Systematic Bacterioloy中提供的分類原則，基于上述菌學性質確定菌株的類型。根據這一分析，該菌株顯然屬于假單胞菌屬。但根據菌種鑒定情況，判定該菌株并不屬于任何已知的菌種，因為在所有常規鑒定手冊中都沒有涉及這一菌株的性質，而且它還具有新的質粒pNI 10和pNI 20。基于其表面光澤而且呈黃顏色而將該菌株定名為亮黃假單胞菌(Pseudomonas flavida)IF-4。該菌株已保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science ＆ Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號為FERM P-10865(已按布達佩斯條約規定，所給保藏號為FERMBP-4281)。
可按Saito氏方法(參見Biochem.Biophys.Acta.，Vol.72，PP.619-629(1963))從細菌中提取總DNA。
可按常規雙脫氧方法(參見Proc.Nati.Acad.Sci.，USA，Vol.73，PP.5463(1977)測定(5)中所得DNA的序列。
可用來轉化(3)和(6)中所得臭味假單胞菌的載體包括質粒pNI 107和pNI20C參見JP-A-3-67590，JP-A-3-67591，以及Journal of Biochemistry，Vol.110 pp.614-621(1991)。
可按照Bagdasarian等人(參見Gene，Vol.16，pp.237(1981))所述方法轉化臭味假單胞菌(步驟(7))。
可使用適當載體，以臭味假單胞菌以外的其他微生物作為宿主。例如，可使用J.Biochem.Vol 110，PP.614-621(1991)中所述的假單胞菌屬的其他種微生物。
在根據本發明生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤的過程中，最好使用上述微生物及其轉化體。具體地說，最好使用臭味假單胞菌IF-3的突變體，特別是臭味假單胞菌IF-3-9C-21及其轉化體。
只要微生物能在其中生長，可用任何一種營養培養基來培養該菌株。培養基可以是含有常規成份，如除1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤以外的各種碳源、氮源、無機鹽以及必要時還含有其他營養素和輔助成分(如pH調節劑、乳化劑、消泡劑等)的天然或合成培養基。除1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤以外的適當碳源包括糖如葡萄糖、木糖及阿糖;糖醇如甘油和山梨糖醇;以及有機酸如檸檬酸和延胡索酸。適當的氮源包括無機氮源如銨鹽和硝酸鹽，以及有機氮源如肉羹、酵母浸膏、胰蛋白胨和caltivator。適當的無機鹽包括磷酸鉀，氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉及硫酸亞鐵。
對培養基中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的濃度沒有特殊限制，并可根據預期之3-甲基-7-烷基黃嘌呤產率和培養條件及經濟效益來確定。濃度范圍一般為0.1-10%，且較好是0.5-5.0%。培養可在10至40℃且pH約4.5至9.0，較好在20至30℃且pH約6.5至7.5條件下進行約5至72小時。連續提供含例如葡萄糖和木糖的碳源，以及如肉羹、酵母浸膏和谷氨酸鈉的氮源的培養基，同時控制培養基中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的濃度，以連續發生1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤向相應3-甲基-7-烷基黃嘌呤的轉化(分批進料培養)。其中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤可作為固體物或水溶液加入。
必要時可加入用于加速培養物中3-甲基-7-烷基黃嘌呤積聚的反應加速劑。這類反應加速劑的適當例子包括單甲基黃嘌呤，金屬離子(如鎳離子或鋅離子)，咖啡堿及可可堿，但可根據培養物中所用菌株的不同而選用不同類型的加速劑。
在實施本發明中，產物可以得自如上述培養所得到的培養物本身及培養物產物，如微生物細胞、培養物濾液、破碎的細胞、凍干的細胞、用乙醇、甲苯或乙酸乙酯等溶劑提取的細胞提取物，以及固定化細胞。
當1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤與培養物或含水介質中的培養物產物接觸時即可轉化為相應的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。在反應系統中，即在濃度超過其溶解度時，1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤可以懸浮狀態存在。可在分批進料系統或在使用柱子的連續進料系統中使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤與培養物或培養物產物接觸。
在上述條件下用通氣方法攪拌培養物或培養物產物與1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的混合物5至80小時，以在通氣條件下連續發生轉化反應。可以常規方法從反應混合物中回收如此產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。即必要時于離心分離后，用堿處理反應混合物，用有機溶劑除去雜質，然后調pH以得到3-甲基-7-烷基黃嘌呤沉淀物。
現借助參考實施例和實施例更詳細地闡述本發明，但應明確的是這些實施例并不構成對本發明的限制。
參考實施例11，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的合成將600g茶堿(1，3-二甲基黃嘌呤)(Katayama Kagaku Kogyo K.K.的產品)溶解在1800ml含有263.4g氫氧化鉀的水溶液中，并于減壓條件下將溶液蒸發至干以制得茶堿的鉀鹽。將所得鹽懸浮于3600ml二甲基甲酰胺中，向其中加入436.5ml丙基溴，然后于攪拌同時90℃加熱8小時。減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺，并向殘留物中加入1800ml二氯甲烷。用300ml部分的1N氫氧化鉀水溶液將混合物洗三次，再用300ml水洗一次并在54g無水硫酸鎂上干燥之。過濾除去干燥劑，于減壓下然后于真空下干燥母液(85℃，5小時)，得到657g(產率88.8%)1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤。
參考實施例2臭味假單胞菌IF-3-9C-21的制備將臭味假單胞菌IF-3(FERM BP-3824)培養在TY培養基(Difco Co.產品;含有1.0% Bacto-胰化胨和0.5% Bacto-酵母浸膏)中達到對數生長期，離心收集微生物細胞，洗滌后懸浮于5ml50mM Tris-馬來酸鹽緩沖液(pH＝6.0)中。
向細胞懸浮液內加入NTG至濃度為100μg/ml，并將懸浮液于30℃下放置30分鐘。經NTG處理后，用0.9%氯化鈉水溶液將細胞洗兩次，懸將于TY培養基中，然后于30℃振蕩培養過夜。離心收集細胞，用0.9%氯化鈉水溶液洗兩次，并于30℃下在5ml咖啡堿基本培養基(0.3%硫酸銨，0.5%二代磷酸鉀，0.1%氯化鈉，0.2%七水合硫酸鎂和0.1%咖啡堿;pH＝7.0)中繼續培養6小時。稀釋所得培養物并平鋪于咖啡堿基本瓊脂培養基(0.3%硫酸銨，0.5%二代磷酸鉀，0.1%氯化鈉，0.2%七水合硫酸鎂，0.1%咖啡堿和1.5%瓊脂;pH＝7.0)。于30℃培養2天后，篩選呈現極好生長狀態之菌株的菌落。
將如此得到的各突變菌株按種于LKC培養基(1.0% Bacto-胰化胨，0.5% Bacto-酵母浸膏，0.5%氯化鈉，0.5%二代磷酸鉀和0.1%咖啡堿;pH＝7.0)中。30℃培養8小時后測定培養基中的咖啡堿濃度。分離與親代菌株相比顯示出使咖啡堿有較大程度減少的菌株，即為咖啡堿代謝中的組成型突變菌株，將其稱為菌株9C。
以上述同樣方法用NTG處理菌株9C。在含有0.3%可可堿、如上述咖啡堿基本培養基中相同之無機鹽及300μg/ml羧芐青霉素的可可堿基本培養基中將收集并洗過的微生物細胞于30℃振蕩培養過夜。用0.9%氯化鈉水溶液將細胞洗兩次，稀釋并平鋪于LT-瓊脂培養基(1.0% Bacto-胰化胨，0.5% Bacto-酵母浸膏，0.3%可可堿和1.5%瓊脂;pH＝6.8)中，然后于30℃下培養2天以形成菌落。得到25個并不分解菌落周圍之可可堿的菌落。
檢驗已分離之菌株同化咖啡堿、可可堿和7-甲基黃嘌呤的性質，分離只同化7-甲基黃嘌呤的菌株并定名為臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達佩斯條約規定以FERM BP-3825保藏登記號保藏)。臭味假單胞菌IF-3-9C-21菌株是組成性地同化咖啡堿但不能將可可堿轉化成7-甲基黃嘌令的雙突變菌株。
實施例1將臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達佩斯條約規定以FERM BP-3825保藏登記號保藏)接種到75ml含如參考實施例1中制備的1.0%1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤、1.0% Bacto-胰化胨、0.5% Bacto-酵母浸膏和1.0%二代磷酸鉀(pH＝6.7)的培養基(在500ml Sakaguchi培養瓶中)內。30℃預培養過夜后，將1%等份的培養液分別接種到加在Sakaguchi培養瓶內的75ml上述的同樣培養基中。在120rpm攪拌下于30℃培養18小時。
將檢測的1700ml合并的培養物以10，000rpm離心15分鐘。用鹽酸將上清液調到pH6.0，于減壓下濃縮，并于5℃下放置過夜。將沉淀的結晶體懸浮在450ml純化水中，向其中加入25.2g氫氧化鉀，再加入約600ml二氯甲烷，并分離出約400ml含水層。向含水層中加入鹽酸以沉淀出結晶物，然后離心(12，000rpm×15分鐘)回收固體物。將固體物懸浮在約100ml水中并再次離心。將回收的固體物與大約80ml乙醇混合，然后于50℃減壓干燥，以得到重1.18g的制劑。
按下述方法分析一等份制劑以確定結構。
(a)制劑的乙基化將0.2g等份的制劑溶解在1.7ml 1N氫氧化鉀水溶液中，然后于減壓下蒸發至干。將殘留物懸浮在1.5ml二甲基甲酰胺中，并邊攪拌邊向其中加入0.22ml乙基溴。于90℃將混合物加熱5小時，同時進行攪拌。
減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺。將殘留物溶解在30ml二氯甲烷中，用每份20ml 1N氫氧化鉀水溶液洗兩次并用20ml水洗一次，通過無水硫酸鎂干燥，再于減壓下干燥以除去二氯甲烷，最后在真空中干燥得到0.2g(產率88.1%)乙基化的制劑。
(b)1-乙基-3，7-二甲基黃嘌呤的制備將0.9克可可堿(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.的產品)溶解于7.5ml 1N氫氧化鉀水溶液中，然后于減壓下干燥。將殘留物懸浮在6ml二甲基甲酰胺中，并邊攪拌邊向其中加入0.6ml乙基溴，然后在攪拌的同時于90℃加熱8小時。
減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺，將殘留物溶解在50ml二氯甲烷中，用1N氫氧化鉀水溶液洗兩次(每次30ml)，再用水(30ml)洗一次，在無水硫酸鎂上干燥，再于減壓下干燥以除去二氯甲烷，最后真空干燥得到0.86克(產率83%)的1-乙基-3，7-二甲基黃嘌呤。
將(a)中制得的乙基化制劑(下文中用(4)代表)的N-取代基的13C-NMR圖譜與咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤(下文中用(1)代表)，以及(b)中制得的1-乙基-3，7-二甲基黃嘌呤(下文中用(2)代表)和參考實施例1中制得的1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤(下文中用(3)代表)的相應圖譜相比較。即比較(1)、(2)和(3)之N-甲基基團的13C＝NMR圖譜后，確定1-、3-和7-位上之N-甲基基團(下文中分別稱為N1-甲基、N3-甲基和N7-甲基)的化學轉變(ppm)如下所示N1-甲基27.72ppmN3-甲基29.37-29.54ppmN7-甲基33.35-33.40ppm然后，將(3)之N1-甲基和N3-甲基的化學轉變(分別為27.72ppm和29.48ppm)與(4)之N-甲基基團的化學轉變(29.43ppm)相比較，證明該制劑的化合物是通過微生物轉化釋放N1-甲基基團后由(3)衍生的化合物，即3-甲基-7-烷基黃嘌呤。如上確定的化學轉變的結果示于下表1中。
表11,3,7-三 1-乙基-3,7- 1,3-二甲基-7 乙基化測定 甲基黃嘌呤 二甲基黃嘌呤 丙基黃嘌呤 的制劑CH3CH2CH2(N7) 10.62 10.62CH3CH2(N1) 13.16 13.06CH3CH2CH2(N7) 23.97 23.97CH3(N1) 27.72 27.72CH3(N3) 29.54 29.37 29.48 29.43CH3(N7) 33.40 33.35CH3CH2(N1) 36.19 36.30CH3CH2CH2(N7) 48.57 48.57在下述條件下進行13C-NMR圖譜檢測樣品溶液將70mg(1)或100mg(2)、(3)或(4)加在0.5mlCDCl3中儀器Japan Electron Optics Lab.Co.，Ltd.制造的JNMFX60Q型核磁共振儀標準CDCl3的化學轉變，77.1ppm實施例2將洋蔥假單胞菌FERM BP-4282接種到與實施例1中所用的有相同成分并且還含有0.01%7-甲基黃嘌呤或0.1%可可堿的培養基中。30℃預保溫過夜后，將1%等份的培養液分別接種到加在Sakaguchi培養瓶內的75ml相同培養基中。于30℃用120rpm攪拌培養18小時。
使用Toso Co.，Ltd.制造的層析儀以高效液相層析法(HPLC)分析結合的培養物。結果，進一步證明同樣滯留時間的峰即為用實施例1中得到的3-甲基-7-丙基黃嘌呤(制劑)所觀察到的峰，此表明培養物中有3-甲基-7-丙基黃嘌呤積聚。在下述條件下進行HPLC柱ODS-80TM(Toso Co.，Ltd.制造)流動相含有17%乙腈和0.1%三氟乙酸的水溶液流速1ml/分鐘實施例3按實施例2所述的同樣方法，將溴味假單胞菌IF-3(已按布達佩斯條約規定以登記號FERM BP-3824保藏)于30℃預培養過夜，并將1%等份的培養液分別接種到75ml同樣培養基(加在Sakaguchi培養瓶內)中。于30℃培養18小時，同時以120rpm攪拌。
在實施例2的同樣條件下對合并的培養物進行HPLC分析的結果，進一步證實3-甲基-7-丙基黃嘌呤的生成。
實施例4
以實施例1所述的同樣方法培養臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達佩斯條約規定以登記號FERM BP-3825保藏)，但不同的是培養基成分中去掉了1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤。將所得培養液與1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤混合，并在實施例2所述的同樣條件下用HPLC法分析混合物。結果進一步證實了3-甲基-7-丙基黃嘌呤的產生。
實施例5分離來源于咖啡堿代謝菌的咖啡堿脫甲基酶基因(1)咖啡堿脫甲基酶缺陷突變體的制備在TY培養基(1.0% Bacto-胰化胨和0.5% Bacto-酵母浸膏)中培養具有組成性地同化咖啡堿能力并得自親代菌株IF-3(已按布達佩斯條約規定作為FERM BP-3824號菌株保藏)的臭味假單胞菌突變菌株IF-3-9C，使之生長到對期生長期。離心收集微生物細胞，洗滌，并懸浮在5ml 50mM Tris-馬來酸鹽緩沖液(pH-6.0)中。
向細胞懸將液中加入NTG至終濃度為100μg/ml，并將懸浮液在30℃放置30分鐘。經NTG處理后，用0.9%氯化鈉水溶液洗細胞兩次，然后在已加入了終濃度為500μg/ml的羧芐青霉素的咖啡堿基本培養基(0.3%咖啡堿，0.3%硫酸銨，0.5%二代磷酸鉀，0.1%氯化鈉和0.2%七水合硫酸鎂;pH＝7.0)中30℃振蕩培養過夜。用0.9%氯化鈉水溶液將收集的細胞洗兩次。
將洗過的細胞懸浮在1ml 0.9%氯化鈉水溶液中，適當稀釋并平鋪在LT-瓊脂培養基(1% Bacto-胰化胨和0.5% Bacto-酵母浸膏)上。在LT-瓊脂培養基30℃培養1天后，將菌落影印在咖啡堿基本培養基上。30℃培養2天后，檢查在咖啡堿基本培養基上生長狀態不好之菌株同化咖啡堿、可可堿及7-甲基黃嘌呤的能力，并得到可同化可可堿和7-甲基黃嘌呤但不同化咖啡堿的突變菌株IF-3-19。
臭味假單胞菌IF-3-19是不能將咖啡堿轉化成可可堿的突變菌株，即咖啡堿脫甲基酶缺陷型突變株。
(2)克隆咖啡堿脫甲基酶基因按Saito和Miura所述方法(參見Biochem.Biophys.Acta，Vol.72，PP.619-629(1963))制備臭味假單胞菌IF-3(已按布達佩斯條約規定作為FERM BP-3824號菌株保藏)或亮黃假單胞菌IF-4(已按布達佩斯條約規定作為FERM P-10865，FERM BP-4281號菌株保藏)的總DNA。用Hind Ⅲ切割所得總DNA得到DNA片段(約1μg)。使用T4 DNA連接酶將已切割的片段連接到已用Hind Ⅲ消化并已去磷酸化的克隆載體pNI20C(約2μg)上。
用所得重組質粒DNA轉化咖啡堿脫甲基酶缺陷型臭味假單胞菌IF-3-19，并將其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的咖啡堿基本瓊脂培養基上。
30℃培養2天后，得到4個含有源于臭味假單胞菌IF-3之基因的轉化體菌株和3個含有源于亮黃假單胞菌IF-4之基因的轉化體菌株。
從各轉化體菌株制備質粒并用Hind Ⅲ消化，經瓊脂糖凍凝膠電泳進一步證實酶裂解圖形。表明所有這些菌株都共同具有如圖1中所示的用Hind Ⅲ切割的來自2.4kb和4.3kb DNA片段的DNA片段。
(3)再克隆咖啡堿脫甲基酶基因并確定其位置將(2)中制得的質粒之一定名為pTF1。用不同的限制性酶切割pTF1并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，以制得包括圖1所示的被插入的6.7Kb DNA片段的限制性核酸內切酶酶切圖。為了確定存在于該片段中的咖啡堿脫甲基酶編碼區，然后將用限制性酶消化的各不同的DNA片段插入并連接到pNI 107中以制備重組DNA，并用該重組DNA轉化臭味假單胞菌IF-3-19。結果得到用AccⅠ和NdeⅠ切下的并使IF-3-19恢復了咖啡堿同化性質的約1.7Kb DNA片段。將攜帶該DNA片段的質粒稱為pCA32A。
(4)進一步證實存在于pCA32A中的咖啡堿脫甲基酶基因為了證實上述直到(3)的步驟中制得的插入到pCA32A中的DNA片段編碼咖啡堿脫氫酶這一事實，將pCA32A引入沒有同化咖啡堿之性質的臭味假單胞菌ATCC 8209中，并檢驗所得重組體是否能將咖啡堿轉化成可可堿。具體方法如下所述。
將上述(3)中制得的pCA32A引入沒有咖啡堿同化作用即沒有能力同化咖啡堿、可可堿和7-甲基黃嘌呤中任何一種物質的臭味假單胞菌ATCC 8209中，得到轉化體8209/pCA32A。
將所得各轉化體菌株分別接種到5ml TYKG培養基(1.5% Bacto-胰化胨、0.75% Bacto-酵母浸膏、0.5%二代磷酸鉀、0.2%葡萄糖和25μg/ml卡那霉素;pH＝6.7)中并于30℃振蕩培養8小時。取0.5ml等分的培養液接種于分別加在10個500ml Sakaguchi培養瓶內的50ml TYKG培養基中，然后于30℃振蕩培養16小時。
合并所得培養物(500ml)并以7，000rpm離心10分鐘。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗滌如此收集的微生物細胞，并懸浮于30ml同樣緩沖液中。
向細胞懸浮液(0.5ml)內加入105μl 100mM咖啡堿水溶液，210μl 50mM NADH水溶液、50μl 0.8M磷酸鈉緩沖液和1135ml水，并使此系統于25℃反應16小時。將475μl等份的反應混合物加至25μl 50%三氯乙酸水溶液中以終止反應。離心該混合物，于下述條件下經HPLC測定上清液中的咖啡堿和可可堿含量，以估計咖啡堿脫甲基酶活性。所得結果示于表2中。
柱ODS-80TM，TOSO Co.，Ltd.制造流動相含17%乙腈和0.1%三氟乙酸的水溶液流速1ml/分鐘檢測272nm
表2反應時間0小時 17小時轉化體菌株 咖啡堿 可可堿 咖啡堿 可可堿(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)臭味假單胞菌 0.94 0 0.94 0ATCC 8209/pNI107臭味假單胞菌 0.938 0 0.763 0.160ATCC 8209/pCA32A如表2中所示，已被質粒載體pNI107轉化的菌株不產生可可堿，而帶有pCA32A的ATCC 8209的轉化體則可轉化18.6%的咖啡堿底物以產生0.16克/升可可堿。這些結果證明被插入的pCA32A的DNA片段含有咖啡堿脫甲基酶基因。
(5)測定咖啡堿脫甲基酶基因的序列按照Sanger方法測定已插入至pCA32A中之約1.7Kb的AccⅠ-NdeⅠ DNA片段的堿基序列。更具體地說，用Klenow片段將已用AccⅠ和NdeⅠ切割之DNA片段的末端修成平端并在SmaⅠ識別位點處插入pUC118中，以得到插入方向上有所不同的質粒118A和118B。
借助Takara Shuzo Co.，Ltd.生產的缺失藥盒從所得質粒中逐步缺失被插入的DNA，以制備不同質粒。借助Applied BiosystemsCo.生產的序列藥盒，使用各缺失質粒作模板合成互補DNA。用DNA序列儀讀出堿基序列。結果發現，在上述DNA片段中只有一個開放閱讀框架。
在SEQ ID NO1中，顯示了包含有咖啡堿脫甲基酶基因之DNA的AccⅠ和NdeⅠ間的DNA堿基序列(1686 bp)。在堿基各三聯子下方還示出了推測的咖啡堿脫甲基酶的氨基酸序列。
實施例6用pCA32A轉化體從1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤用pCA32A轉化臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達佩斯條約作為FERM BP-3825號樣品保藏)，以得到臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A。
將臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A接種到75ml含0.5%肉浸膏(由Kyokuto Seiyaku Kogyo Co.，Ltd.生產)，0.3% Meast PIG(由Asahi Breweries，Ltd.生產)和0.3%二代磷酸鉀的培養基中(在500ml Sakaguchi培養瓶內)，并于30℃下預培養16小時。在5升小罐內放入2升上述培養基，并向其中加入0.5% 1，3-二甲基-7-乙基黃嘌呤，1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤或1，3-二甲基-7-丁基黃嘌呤。將1%預培養液接種到已制備的培養基中并培養24-48小時，其中前7小時溫度控制在30℃，然后于25℃下以1V.V.m通氣量繼續培養，此期間借助帶有6個葉片的扁平型葉輪攪拌器以600rpm進行攪拌。從培養開始4小時后，將培養物的pH控制在6.6和6.8之間并開始供應有下列組成的培養基。
待進料的培養基組成葡萄糖 17%谷氨酸鈉 2%肉浸膏 4%Meast PIG 4%如下列表3所示，在各培養物中測得有相應1-脫甲基化合物的產生。
表3底物 底物濃度 培養時間 產物 產物濃度(mg/ml) (小時) (mg/ml)1,3-二甲基-7- 5.20 24 3-二甲基-7- 4.65乙基黃嘌呤 乙基黃嘌呤1,3-二甲基-7- 5.26 24 3-甲基-7- 4.98丙基黃嘌呤 丙基黃嘌呤1,3-二甲基-7- 4.20 48 3-甲基-7- 1.80丁基黃嘌呤 丁基黃嘌呤實施例7用臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A將咖啡堿轉化成可可堿并將1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤將臭味假單胞菌IF-3-9C-21和臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A分別在75ml含有0.5%肉浸膏、0.3% Meast PIG和0.3%二代磷酸鉀的培養基(pH6.7)(在500ml Sakaguchi培養瓶)中30℃振蕩培養過夜。其中用于轉化體菌株的培養基還另外含有25μg/ml卡那霉素。
將1%所得預培養物接種到3升含0.5%肉浸膏、0.1%葡萄糖和0.3% Meast PIG并且另外還含有0.5%咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的培養基中，并在控制的溫度下培養50小時，前7小時溫度控制在30℃，然后于25℃及1V.V.m通氣條件下培養，同時借助帶有6個葉片的扁平型葉輪攪拌器以600rpm攪拌之。從培養開始4小時后將培養物的pH控制在6.6和6.8之前，并從同一時間點以12ml/小時的速率開始供入含有25%葡萄糖、6%肉浸膏、6% Meast PlG、3%谷氨酸鈉和1.0%咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的培養基。
定時測定培養物中咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的濃度，并適當加入這些底物以便將各自的濃度控制在0.5和2.5mg/ml之間。
如此使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉化成相應的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。轉化反應的結果示于圖2中。可以看出，在使用名底物(咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤)的反應中，帶有pCA32A的轉化體菌株即臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A能夠以2至4倍于臭味假單胞菌IF-3-9C-21的產生量產生相應的轉化產物(分別為可可堿或3-甲基-7-丙基黃嘌呤)。
測定培養結束時底物和產物的量。結果可見，在使用臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A并以咖啡堿作底物的系統中，在長達50小時時間所加咖啡堿的積聚量為535克，而隨著產生414克可可堿所余咖啡堿的殘留量為90克，表明咖啡堿轉化為可可堿的轉化率為98.9%。而在使用同樣菌株并以1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤作為底物的系統中，在長達50小時時間里所加底物的積聚量為390克，而隨著產生262克3-甲基-7-丙基黃嘌呤，所余殘留底物的量為63克，此表明1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉化為3-甲基-7-丙基黃嘌呤的轉化率為97%。
根據本發明，可在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養培養基中培養能產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物或其突變體，以在培養物中產生并積聚3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從培養物中回收該產物，從而有效地并以低成本制得作為成藥之重要中間產物的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發明提供了含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段，基于該DNA片段有可能提供具有增加了在1位上催化咖啡堿脫甲基之咖啡堿脫甲基酶活性的新的臭味假單胞菌菌株。使用該新的臭味假單胞菌菌株即有可能以進一步提高的效率從相應的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
雖然本文已對本發明作了詳細描述并給出了特定實施例，但顯然本領域技術人員可在不背離本發明糖神和范圍的前提下對本發明作出各種改變和改動。
序列一覽表(1)一般資料:
(ⅰ)申請人:Yoshinao,KoideSeiji,NakaneYutaka,Imai(ⅱ)發明名稱:含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段和生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法(ⅲ)序列數:2(ⅳ)通信地址:
(A)地址:SUGHRUE,MION,ZTNN,MACPEAK & SEAS(B)街道:2100 Pennsylvania Avenue(C)城市:N.W.
(D)州:Washington,D.C.
(E)國家:U.S.A.
(F)郵編:20037-3202(ⅴ)計算機可讀形式:
(A)基質類型:Floppy 盤(B)計算機:IBM PC 相容性(C)操作系統:PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:Patent In Release #1.0,Version #1.25(vi)目前申請資料:
(A)申請號:
(B)申請日:
(C)分類號:
(vii)在先申請資料:
(A)申請號:JP 4-154380(B)申請日:20,5,1992(viii)在先申請資料:
(A)申請號:JP 4-312954(B)申請日:27,10,1992(xi)電信資料:
(A)電話:202-293-7060(B)傳真:202-293-7860(C)電傳:6491103(2)SEQ ID NO:1的資料:
(i)序列特征:
(A)長度:1686堿基對(B)類型:核酸(C)鏈型:雙股(D)結構:線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/鍵:CDS(B)定位:476..1528
權利要求
1.一種含有源于假單胞菌屬微生物中之咖啡堿脫甲基酶基因的分離并純化的DNA片段。
2.根據權利要求1的DNA片段，其中所說的DNA片段是由圖1所示的限制性核酸內切酶酶切圖譜限定的。
3.根據權利要求2的DNA片段，其中圖1所示的限制性核酸內切酶酶切圖譜中含有咖啡堿脫甲基酶基因的AccⅠ位點和NdeⅠ位點間的堿基序列是由SEQ ID NO1表示的。
4.含有編碼由SEQ ID NO2代表之氨基酸序列的堿基序列的分離并純化的DNA片段。
5.具有已整合到其載體內的含有源于假單胞菌屬微生物之咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段的重組DNA。
6.包括用重組DNA轉化的宿主的假單胞菌屬轉化體，其中所說的重組DNA具有已整合到其載體內的含源于假單胞菌屬微生物之咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段。
7.根據權利要求6的假單胞菌屬的轉化體，其中所說的宿主是臭味假單胞菌。
8.根據權利要求7的假單胞菌屬的轉化體，其中所說的宿主是臭味假單胞菌IF-3-9C-21(FERM BP-3825)。
9.生產由式(Ⅱ)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法，-其中R代表直鏈或分支鏈烷基基團-
該方法包括在含有由式(Ⅰ)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤
-其中R定義同上-的營養培養基中培養權利要求6的轉化體，以在培養物中產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤并從培養物中回收所產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
10.生產由式(Ⅱ)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法
-其中R代表直鏈或分支鏈烷基基團-，該方法包括使由式(Ⅰ)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤
-其中R的定義同上-與權利要求之轉化體的培養物、微生物細胞或其經處理的產物接觸，以產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從反應混合物中回收所產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
11.根據權利要求9或10的方法，其中R是C1-C4烷基基團。
12.生產由式(Ⅱ)代表的3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法，
該方法包括在含有由式(Ⅰ)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤
的營養培養基中培養能夠將1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬的微生物或其突變體，以在培養物中產生式(Ⅱ)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤并從培養物中回收所產生的式(Ⅱ)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
13.生產由式(Ⅱ)代表的3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法，
該方法包括在含有由式(Ⅰ)代表的1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤
與能夠將1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬微生物的培養物、微生物細胞式其經處理的產物接觸，以產生式(Ⅱ)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤，并從反應混合物中回收所產生的式(Ⅱ)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
14.根據權利要求12或13的方法，其中所說的微生物是臭味假單胞菌。
15.根據權利要求14的方法，其中所說的微生物是臭味假單胞菌IF-3-9C-21(FERM BP-3825)。
全文摘要
公開了含有由屬于假單胞菌屬并能同化咖啡堿的微生物產生的咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段以及生產3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法。所說的方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營養培養基中培養用其中已整合了上述DNA片段的重組DNA轉化的假單胞菌屬的新細菌菌株，以在培養物中產生3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從培養物中回收所產生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。本文還公開了生產3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法。
文檔編號C12N15/60GK1088259SQ9310759
公開日1994年6月22日 申請日期1993年5月20日 優先權日1992年5月20日
發明者小出芳直, 今井豐, 中根誠治 申請人:天野制藥株式會社