專利名稱：利用昆蟲細胞高效表達人尿激酶原及其它有用蛋白質的方法
利用昆蟲細胞高效表達人尿激酶原及其它有用蛋白質的方法屬于生物基因工程領域，本發明涉及生產人尿激酶原及其它有用蛋白質的方法。現在心腦血管血栓并發癥嚴重影響臨床患者心肌梗塞、腦血栓的預后從而造成高死亡率。因此，國內外近年來嘗試用溶栓療法溶解血栓，防治心腦血管血栓并發癥的臨床報導越來越多。特別是進入八九十年代后，溶栓療法成為急性心肌梗塞的常規療法。溶栓療法所用的溶栓藥物為纖溶酶原激活物(plasminogenactivator，簡寫為PA)。單鏈尿激酶型PA即人尿激酶原(prourokinase，簡寫為pro-UK)是一種新型溶栓劑，優于尿激酶(urokinase，簡寫為UK)，具有血纖維蛋白(血栓)作用特異性。但是，pro-UK不象UK那樣易于制備獲得，只有基因工程生產才能解決這一難題。
大腸桿菌、酵母等微生物系統已用于表達外原基因進行生產，并形成了一些基因工程產品。但由于大腸桿菌的表達產物形成一種不溶解的包涵體需通過變性劑溶解和復性以恢復天然結構，使pro-UK一類具有多對二硫鍵的蛋白質表達產物的生物活性大受影響。哺乳動物細胞的表達產物保持天然的三維結構，能將蛋白質側鏈糖基化，翻譯后修飾加工與分泌，但是哺乳動物細胞培養價格昂貴，設備技術條件要求嚴格而且表達效率不高。近年來人們試圖用昆蟲細胞作為外源基因的表達系統，其特點是既可以單層貼壁生長又可以大量懸浮培養，培養基中不含胎牛血清細胞仍生長良好，具有表達產物側鏈糖基化、后加工修飾與分泌功能。已經應用此系統表達的有幾十種外源基因，多為病毒外殼蛋白，例如1.戴維·H·L·畢曉普，康賜永發明申請號CN87106266A，發明名稱重組體桿狀病毒載體中乙型肝炎病毒抗原的表達，1987年9月8日。該發明是用昆蟲表達系統表達人體乙型肝炎病毒抗原及與乙型肝炎表面抗原有關的pre-S2蛋白。類似的發明譬如表達rota病毒及其疫苗、日本腦炎病毒、狗細小病毒疫苗、愛滋病病毒，見于歐洲專利、日本專利等。
2.Summers，M，DetalUnitedStatesPatent5023328，TitleLepidopteranAKHsignalsequence，Jun.11，1991。該發明是將鱗翅目昆蟲的脂肪動用激素分泌肽DNA編碼序列插到轉移載體質粒多角體蛋白啟動子下游，使不帶分泌肽編碼序列的外源基因在昆蟲表達系統表達并分泌成為可能。
3.Wang，N.P.etalCell Growfh & Differentiation，1990，1429-437，文中所述，采用昆蟲表達系統表達網織細胞瘤表達產物pp110RB蛋白質，約為10mg/liter培養基上清。類似的表達產物有集落刺激因子、α-半孔糖甘酶A、人神經生長因子等，見于世界專利、歐洲專利等。但是，其共性是表達產量不夠高。即表達產物具備天然性質與活性，但表達效率不夠高，不利于形成基因工程產品。表達效率高否最關鍵的是用于構建重組病毒、供外源基因插入的轉移載體質粒的結構，轉移載體質粒中多角體蛋白啟動子基因愈完整，表達效率愈高。
本發明的目的是通過構建更好的(1)轉移載體質粒，得到一種(2)高效表達人尿激酶原蛋白質及其它有用蛋白質的基因工程方法。人尿激酶原為一種新型溶栓劑，但從自然界很難獲得，只有基因工程生產才能解決這一難題。本發明表達效率遠高于哺乳細胞培養上清的表達量，并優于大腸桿菌生產表達產物(變性復性大大降低了回收人尿激酶原的生物活性)，具有廣泛的應用前景。
本發明的內容及方案構建高效表達的轉移載體質粒pAcYT，克隆人尿激酶原cDNA到轉移載體質粒上。將帶有人尿激酶原基因(含分泌肽編碼序列)的轉移載體質粒與野生型核多粒包埋型多角體病毒DNA共轉染昆蟲Sf細胞。空斑法篩選純化重組病毒。用重組病毒感染昆蟲Sf細胞收獲分泌表達的人尿激酶原蛋白質。本方法適合于利用同樣方法表達其它有用蛋白質。
實施例1.構建高效表達的轉移載體質粒pAcYT用限制性內切酶酶切去除質粒pAc373啟動子基因的XhoI-BamHI片段(2.1Kb)，得到不含啟動子的pAc373′DNAXhoI-BamHI大片段(7.7Kb)。將3′-下游修飾過的克隆野生型AcMNPVDNA多角體蛋白啟動子基因片段(XhoI-BamHI片段，2.1Kb)與7.7Kb的pAc373′DNAXhoI-BamHI大片段連接。再去除一段多角體蛋白結構基因下游的DNA片段(BamHI-KpnI片段)，得到一個新的具有添加的啟動子下游DNA片段-7TATAAAT-1并缺失多角體蛋白結構基因下游BamHI-KpnI片段的高效表達轉移載體pAcYT。DNA序列測定表明pAcYT啟動子基因比pAc373多一段TATAAAT序列。即本發明所構建的高效表達轉移載體pAcYT啟動子部分結構比pAc373更完整，使外源基因在完整多角體蛋白啟動子控制下被表達。
2.克隆人尿激酶原cDNA到轉移載體pAcYT上經二次分別分段重組人尿激酶原cDNA到質粒Bluescript和pUC19上以得到BamHI、KpnI末端，然后平頭正向插入到轉移載體質粒pAcYT的BamHI位點上(見圖1)，將pAcYT/UK質粒擴增后，用氯化銫密度梯度離心或PEG8000沉淀等常規DNA純化方法進行純化。
3.病毒和細胞及病毒DNA制備昆蟲細胞株Sf9細胞在TMN-FH或IPL41培養基中培養;昆蟲細胞株Sf21細胞在TC-100培養基中培養;用核多粒包埋型多角體病毒感染Sf細胞以增殖病毒。高速離心(4℃，30000轉/分)沉淀培養基上清中的病毒粒子，低濃度Na2CO3裂解多角體，蛋白酶K水解病毒蛋白質，酚氯仿抽提一次，乙醇沉淀病毒DNA。
4.昆蟲細胞內同源重組病毒的篩選將帶有人尿激酶原cDNA(含分泌肽編碼序列)的pAcYT/UKDNA1-5微克與野生型AcMNPVDNA2-10微克懸浮于30微升蒸餾水中，與30-50微克脂質體混合后共轉染單層貼壁Sf細胞，25℃-28℃溫育2-4小時。吸棄轉染液，換新鮮培養基，25℃-28℃培養4-7天，直至病毒多角體形成。根據重組病毒無多角體(Occ-)這一形態學特征，用空斑法篩選純化，重復三次。獲得重組病毒。
5.帶有人尿激酶原基因的重組病毒感染Sf9細胞每毫升Sf9細胞用103PFU(空斑形成單位)的重組病毒感染，4-7天后收集培養基上清(含有表達產物人尿激酶原)，并以野生病毒為對照。
6.純化與回收表達產物人尿激酶原蛋白質將溴化氰活化的Sepharose4B凝膠與抗人尿激酶單克隆抗體(4D1E8)偶聯后裝柱，柱床體積2.5毫升。每次上樣體積30-60毫升。用2mol/LKSCN洗脫，收集人尿激酶原洗脫峰流出液，在Aprotinin(Sigma)存在下透折，低溫真空干燥。ELISA法確定人尿激酶原濃度，標準品人尿激酶原為GmbH產品，濃度經氨基酸成分分析準確定量。纖維蛋白原平板法測定人尿激酶原纖溶生物活性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot鑒定純化的人尿激酶原表達產物。重組病毒感染Sf細胞5-7天后，上清液中人尿激酶原為96mg/liter(TMN-FH培養基)，60mg/liter(Sf900無血清培養基)，16mg/liter(IPL41培養基)，依培養基不同而表達量亦不同，溶纖活性為800000IU～1600000IU/liter。單克隆抗體親和層析一步法純化表達產物，回收率達70%以上，比活約為60000IU/mg;純化的人尿激酶原蛋白質，無論非還原還是還原處理，其SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜均為相同的單用條帶，分子量約為50000;其West-ernblot結果為單一條帶，與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜吻合。
圖1轉移載體質粒pAcYT多角體蛋白啟動子基因3′-端DNA序列測定圖譜
權利要求
1.一種利用昆蟲高效表達人尿激酶原及其他有用蛋白質的方法，其特征在于用重組體桿狀病毒感染的昆蟲細胞高效表達人尿激酶原及其他有用蛋白質，所述方法包括(1)構建高效表達的轉移載體質粒pAcYT用限制性內切酶酶切去除質粒pAc373啟動子基因的XhoI-BamHI片段(2.1Kb)，得到不含啟動子的pAc373′DNAXhoI-BamHI大片段(7.7Kb)，將3′-下游修飾過的克隆野生型AcMNPVDNA多角體蛋白啟動子基因片段(XhoI-BamHI片段，2.1Kb)與7.7Kb的pAc373′DNAXhoI-BamHI大片段連接，再去除一段多角體蛋白結構基因下游的DNA片段(BamHI-KpnI片段)，得到一個新的具有添加的啟動子下游DNA片段TATAAAT并缺失多角體蛋白結構基因下游BamHI-KpnI片段的高效表達轉移載體pAcYT，DNA序列測定表明pAcYT啟動子基因比pAc373多一段TATAAAT序列，即本發明所構建的高效表達轉移載體pAcYT啟動子部分結構比pAc373更完整，使外源基因在完整多角體蛋白啟動子控制下被表達；(2)克隆人尿激酶原cDNA到轉移載體pAcYT上經二次分別分段重組人尿激酶原cDNA到質粒Blue-script和pUC19上以得到BamHI、KpnI末端，然后平頭正向插入到轉移載體質粒pAcYT的BamHI位點上(見圖1)，將pAcYT/UK質粒擴增后，用氯化銫密度梯度離心或PEG8000沉淀等常規DNA純化方法進行純化；(3)病毒和細胞及病毒DNA制備昆蟲細胞株Sfg細胞在TMN-FH或IPL41培養基中培養；昆蟲細胞株Sf21細胞在TC-100培養基中培養；用核多粒包埋型多角體病毒感染Sf細胞以增殖病毒，高速離心(4℃，30000轉/分)沉淀培養基上清中的病毒粒子，低濃度Na2CO3裂解多角體，蛋白酶K水解病毒蛋白質，酚氯仿抽提一次，乙醇沉淀病毒DNA；(4)昆蟲細胞內同源重組病毒的篩選將帶有人尿激酶原cDNA(含分泌肽編碼序列)的pAcYT/UKDNA1-5微克與野生型AcMNPVDNA2-10微克懸浮于30微升蒸餾水中，與30-50微克脂質體混合后共轉染單層貼壁Sf細胞，25℃-28℃溫育2-4小時，吸棄轉染液，換新鮮培養基，25℃-28℃培養4-7天，直至病毒多角體形成，根據重組病毒無多角體(Occ-)這一形態學特征，用空斑法篩選純化，重復三次，獲得重組病毒；(5)帶有人尿激酶原基因的重組病毒感染Sfg細胞；每毫升Sf9細胞用103PFU(空斑形成單位)的重組病毒感染，4-7天后收集培養基上清(含有表達產物人尿激酶原)，并以野生病毒為對照；(6)純化與回收表達產物人尿激酶原蛋白質；將溴化氰活化的Sepharose4B凝膠與抗人尿激酶單克隆抗體(4D1E8)偶聯后裝柱，柱床體積2.5毫升，每次上樣體積30-60毫升，用2mol/LKSCN洗脫，收集人尿激酶原洗脫峰流出液，在Aprotinin(Sigma)存在下透折，低溫真空干燥。
2.根據權利要求1(1)所述的病毒轉移載體質粒pAcYT其特征在于所說的病毒轉移載體質粒啟動子為核多角體病毒的多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter)。
3.根據權利要求1(3)所述的細胞其特征在于它是一種昆蟲細胞，即衍生目昆蟲草地貪夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda，簡寫為Sf細胞)。
4.根據權利要求1(3)所述的病毒其特征在于它是一種昆蟲病毒，即苜蓿尺蠖核多粒包埋型多角體病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus，簡寫為AcMNPV)。
5.根據權利要求1(5)所述的人尿激酶原基因其特征在于人尿激酶原包括人尿激酶原基因或其部分自144位氨基酸殘基的相應堿基起始的部分A鏈及B鏈基因或其他部分基因。
6.根據權利要求1的方法所述，用高效表達重組體桿狀病毒感染繞昆蟲細胞高效表達其它有用蛋白質是指各種有用的具有生物活性的蛋白質包括含糖蛋白質、含二硫鍵蛋白質及一些特殊蛋白質。
全文摘要
本發明通過基因工程技術，構建了新型高效表達的昆蟲核多粒包埋型多角病毒轉移載體。該質粒多角體蛋白啟動子基因結構完整，3′-端同源序列區小于普通轉移載體質粒，人尿激酶原基因被插入到該質粒中，得到了高效表達。通過在培養的昆蟲細胞中進行同源重組得到含人尿激酶原基因的重組昆蟲核多粒包埋型多角體病毒。由此感染的昆蟲細胞高活性高效表達人尿激酶原并直接分泌到培養基上清中。單克隆抗體親和層析一步法回收與純化表達的人尿激酶原蛋白質。
文檔編號C12P21/00GK1075165SQ9310211
公開日1993年8月11日 申請日期1993年3月4日 優先權日1993年3月4日
發明者徐揚, 胡美浩, 張洪濤 申請人:北京大學