專利名稱：表達載體和它們在制備治療用的hiv-抗性人體細胞方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用特別合適的表達系統在轉染的造血細胞中目標性阻斷用于病毒復制(如HIV的復制)的病毒信使核糖核酸(mRNA)的遺傳信息，所述表達系統表達一種互補的“反義RNA”。
具體說，本發明涉及編碼反義RNA順序的表達載體，所述反義RNA順序與先有技術中描述的相反，在用基因技術改造后的人體細胞中產生對HIV-1復制的完全抑制和對HIV-2復制的明顯抑制。本文所描述的表達載體的遺傳單位特別適用于HIV/AIDS疾病的體細胞基因治療，因為它們保護造血細胞免受HIV誘導的細胞病理感染。因此，可避免HIV感染的人體中的免疫缺陷。
在感染的細胞中的病毒繁殖由病毒基因組的基因調節。在該過程中，用于構建病毒繁殖所需的感染病毒顆粒的調節基因產物和結構蛋白由這些病毒基因通過轉錄和轉譯而形成。該過程的主要中間體是信使核糖核酸(mRNA)，它傳遞形成所述調節和結構蛋白的信息。
以高度特異性的方式阻斷信使核糖核酸，完全取決于病毒mRNA分子結構的獨特性，即該分子的病毒特異性核苷酸-堿基順序，這種阻斷可通過一個互補堿基順序的核糖核酸完成通過順序特異的核苷酸-堿基配對，象已對脫氧核糖核酸以相似的方法描述過那樣，原來的單鏈mRNA在雙鏈RNA中復合，所述核苷酸-堿基順序的遺傳信息的一部分不能用于蛋白質的生物合成。基因表達的第二個部驟(即轉譯)因而受到抑制。所述的互補的核糖核酸命名為反義RNA。
通過反義RNA和目標mRNA之間的相互作用而抑制基因表達的機制是復雜的，在很大程度上不清楚。一種解釋是抑制了細胞核中的RNA剪接和RNA轉錄后加工;但是在這一點上的詳細情況并不清楚。在雙鏈RNA中腺苷→次黃苷的轉變的證據已有公開，對轉譯的抑制據說是這種轉變的結果。對RNA通過核周膜到蛋白質生物合成的場所的運輸的抑制和雙鏈RNA對核糖體/RNA相互作用的掩蔽可對反義RNA抑制基因表達提供進一步的貢獻。
反義RNA對代謝過程的抑制已在天然存在的生物體系例如細菌和一些真核多細胞生物中描述過〔K.M.Takayama and M.Inouye，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 25，155(1990)〕，也在通過基因轉移人工產生的轉移基因生物中描述過〔J.Mol等人，FEBS Letters 268，427(1990)〕。
還有報道試圖在植物〔M.Cuozzo等人，Biotechnology 6，549(1988)〕和動物細胞〔T.Ruden and E.Gilboa，J.Virol.63，677(1989)，EP 252940〕中在引入一個表達反義RNA的基因之后產生抗病毒生物。但是，正如作者自己在文章中聲明的，反義RNA表達和病毒抗性之間沒有有說服力的科學證實的聯系。具體說，在微量注射質粒中，用瞬間表達表達反義RNA，其抗病毒活性很弱，或產生無法結論性評價的抗病毒活性〔K.Rittner等人，Nucleic Acids Research 19，1421(1991)〕。還有報道是關于使用逆病毒載體表達反義RNA以產生抗病毒細胞(R.Y-L.To et al.inGene RegulationBiology of Antisense RNA and DNA ed.R.P.Erickson and J.G.Izant，Raven Press Ltd.，New York 1992〕。這些逆病毒載體帶有觸發惡性腫瘤生長的危險，因為它們含有類似致癌基因的基因順序，對于依賴逆轉錄病毒的腫瘤生成有許多證據。
與以前發表的關于控制病毒復制的反義RNA的文章相反，本發明中描述了表達構建體，它們的區別特征是其啟動子構建體在反向上與病毒DNA的特異性選擇區域結合中的特殊性質，從而提供了令人驚奇的有質有量的抗病毒作用，該作用是迄今為止所知道的最好的。表達載體組份5′-側DNA順序、啟動子、插入/反義DNA和3′-加工信號順序的結合在表達反義RNA的轉染細胞中首次就逆病毒感染導致了相當大量的明顯可證明的病毒抗性。相反，本領域中用其它載體系統進行的內源反義RNA表達和逆病毒抗性只導致弱的抗病毒作用，該作用僅是暫時的〔e.g.T.Ruden and E.Gilboa，J.Virol，63，677(1989)，EP 252 940，G.Sczakiel et al.，Biochem.Biophys.Res.Com.169，643(1990)O.I.Mirosknichenko et al.，Gene 84，83(1989)，(T.Shimada et al.，Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2，133(1991);G.Sczakiel et al.J.Virol.66，5576(1992)〕，或有上述提及的風險(逆病毒基因轉移)或由于需要微量注射而無法實施。
本發明涉及表達反義RNA的表達載體構建體，它含有雜交的啟動子基因順序并具有強的構建性啟動子活性或在病原體侵入時可誘導的啟動子活性。
例如，本發明提供了那些受表達反義RNA的啟動子控制的在3′→5′取向(+)-DNA鏈的反向)上含有致病病毒的亞基因組基因順序的表達載體構建體。
特別適合于本發明范圍的是那些在反向上含有來自逆病毒(如HIV-1和HIV-2)或致癌病毒(如HTLV-Ⅰ，HTLV-Ⅱ)或致癌基因(如abl，erbA，erbB，fms，fos，myb，myc，ras，sis和src)的前病毒亞基因組DNA的表達載體構建體。
優選的表達載體構建體是在核苷酸7514→474或5786→474或2096→474或3825→681或5786→4158或5746→4648或2369→1635或3226→3003或2099→678或3829→2099或4647→4157或4157→3820的反向上含有HIV-1前病毒DNA的表達載體構建體。
對于較短的反義-RNA轉錄本的表達，也可采用在3′→5′取向上含有亞基因前病毒基因順序或致癌基因順序的表達載體構建體。
這里所述及的這類表達載體構建體是那些含有來自HIV-1核苷酸605→455或670→440或825→535或6070→5800或5640→5020或5600→5040或8690→8300或9160→8800的前病毒基因順序的表達載體構建體。
優選的是含有來自一種病毒或多種病毒的兩種、三種或更多的亞基因組基因順序的表達載體構建體。
本發明還涉及含有上述表達載體構建體的轉染細胞。
所述表達載體構建體在制備藥物方面的應用也在本發明的范圍內，所述藥物含有一種或多種所述的表達載體構建體，該藥物也在本發明范圍內。
使用本發明所述的表達載體構建體，對HIV復制的抗病毒作用已在相關的人體宿主細胞中證明，它在人體細胞中提供針對HIV-1復制的完全保護長達60天。還產生對HIV-2的明顯抑制。
在本發明中，描述了在轉染細胞中表達信使核糖核酸轉錄本的表達載體構建體的構建和組成，所述轉錄本與不想要的病毒基因的mRNA順序是互補的，作為實例，使用的是人體免疫缺陷病毒HIV-1的基因GAG、POL、VIF、REV、TAT和VPU〔W.A.Haseltine等人，Scientific American USA，1988，34-42〕。此外，所述的反義RNA順序與HIV-2在基因GAG、POL和VIF的區域上足夠同源，所以也可獲得對HIV-2分離體的抗病毒效應(如分離體HIV-2 D194，inHuman Retroviruses and AIDS，eds.Myers等人Los Alamos National Lab.，1992，and EMBL accession No.X52223)。所述表達載體構建體的區別特征是所選擇的啟動子順序和雜交啟動子順序(例如CMV-IE/金屬巰基組氨酸三甲基內鹽I)的排列的特殊性質，所述順序在反向(3′→5′)上帶有亞基因組HIV-1 DNA片段，它們導致一些反義RNA轉錄本以構建性或可誘導的方式通過RNA剪接而轉錄。由該方法形成的反義RNA轉錄本對人體細胞(例如HUT 78，U937)中的HIV-1復制表現出令人驚奇的強烈的或完全的抑制。也觀察到對HIV-2復制的明顯抑制。HIV-2說明在本發明所述的表達載體中足夠的RNA順序同源，從而確保反義RNA抑制病毒復制。因此，本發明包括一種抑制逆病毒(例如HIV-1和HIV-2)復制的方法，該方法適用于通過特定方式的有抗病毒活性的反義RNA的表達來保護造血細胞，因而也是保護對人體細胞介導的免疫響應是重要的細胞(例如T-細胞、單核細胞)，免受使細胞損壞和細胞瓦解的病毒繁殖。
為了通過抗病毒的反義RNA的表達而使免疫系統的細胞抵抗逆病毒繁殖引起的細胞損壞作用，如已知的HIV-1和HIV-2感染，實驗方法如下。
啟動子構建含有啟動子的表達載體，所述啟動子應該在造血細胞中構建性地和強烈地表達，例如巨大細胞病毒IE啟動子(CMV-IE)。進一步，通過融合核酸順序構建啟動子，該啟動子應該在病毒侵染的情況下額外地誘導擴增性表達。具體說，這些雜交啟動子的組份是CMV-IE金屬巰基組氨酸三甲基內鹽啟動子片段和核苷酸289至474或289至532(核苷酸編碼UWGCG GENEMBL DATA BANK FileHIVHXB2CG.VIRAL.1987年9月25日)的HIV-1 LTR核酸片段，它提供了放大的可任意轉活化的補充的啟動子活性。
反義核酸片段所述載體構建體在反向上還含有亞基因組的前病毒DNA片段、即DNA的(+)鏈在所述啟動子的控制下在3′→5′方向上轉錄。
為了安全起見，不使用逆病毒的完整的前病毒基因組DNA片段。但是，主要使用較長的亞基因組前病毒DNA片段，而不是短的亞基因前病毒DNA片段，因為在較長的RNA轉錄本上更可能發生RNA剪接，這樣，按照本發明，從前病毒DNA片段上預期可得到更多的反義RNA轉錄本，在后面的實施例中發現也確實如此。(期望用于反向HIV順序的完全加工的反義mRNA轉錄本的類型和數量是不可預測的，因為沒有足夠準確的進行mRNA剪接的同義順序以允許結論性的預測)。
隨著反義RNA轉錄本數目的增加，由于其內在性質，如從核中輸出或在細胞質中的穩定性，產生具有強有力的抗病毒活性的反義RNA轉錄本的可能性也增加。
本發明還涉及含有融合基因片段的表達載體構建體，所述融合基因片段用于在一種強啟動子的控制下轉錄反義RNA。所述融合基因片段由來自兩種或幾種不同病源體病毒(例如HIV-1和HIV-2)的基因組DNA片段組成。所述融合基因片段編碼含有相接的幾個反義-RNA順序區域的RNA轉錄本，所述反義RNA順序區域互補于來自不同病毒的mRNA-順序區域，使用這樣的融合基因片段，可以構建具有較寬抗病毒作用的表達載體。
該原則的有效性可通過實施例1、4、5、10和12證實。例如，表達載體構建體KTX11，pSXK1和pSXK2含有來自HIV-1 LAV/BRU的反義DNA片段，這些反義DNA本身含有較短的也互補于來自HIV-2 D194的mRNA(例如核苷酸620-660或837-899或4868-5044)的區段。
這樣，得自KTX11、pSXK1和pSXK2的反義RNA對HIV-2也有病毒抗性。
這些載體的反義RNA編碼順序還可以在反向與來自其它病毒(例如HIV-2分離體，其它HIV-1分離體)的反義前病毒DNA片段融合，這樣，由于反義RNA和其它病毒的順序的片段最佳互補性，用一個表達載體構建體同時可獲得對不同病毒的改進的和完全的抑制。
為了產生高度穩定的mRNA，用多聚腺苷酸化信號(例如來自SV40或牛生長激素)終止反義RNA轉錄本。此外，所述載體含有表達一種適當選擇性標記的完整操縱子。在本發明實施例中，為了能夠選擇轉錄后含有表達反義-RNA的遺傳性構建體的細胞，用了一種抗生素抗性TNR 5neo(新霉素、遺傳素(geneticin)、G418、卡娜霉素)。
該選擇性標記對人造血細胞的價值已證實。也可以選擇其它選擇性標記，例如與二氫葉酸還原酶的基因轉染結合的嘌呤霉素或潮霉素或氨甲蝶呤。
特別適合作為反義核苷酸順序的是那些來自HIV核苷酸2100-5800的POL/VIF基因區域的順序。具體說，核苷酸5786→4158的反義核苷酸順序表現出不尋常的抗病毒活性。也可以使用該基因區域的其它片段，例如，5746→4648或4647→4157或5880→3880或5850→4158或5150→3200。
為了證明反義RNA對例如HIV-1的抗病毒效應，用上述表達載體構建體轉染易受HIV-1感染的人細胞系。目的是證明在一系列細胞類型的人造血細胞中，內源性反義RNA表達導致了細胞中病毒復制的抑制，所述細胞具體參與細胞間的免疫響應。在AIDS病末期，免疫系統細胞的破壞與機會性感染頻率的增加有關，然后經常是致命的結果。為此，用造血細胞和本文開始時用惡性腫瘤細胞系例如HUT78，MOLT4，U937，Jurkat，CEM-CM3(all American Type Culture Collection ATCC Batherda，Maryland，USA)研究的目的是，在載體轉染后，將細胞系和遺傳特性克隆，以確定這些轉染的細胞系在用合適的HIV-1和HIV-2分離體的感染實驗中的病毒抗性。
在本發明中，對抗病毒活性的反義RNA在這些細胞中的表達的說明應該表明了表達載體在造血細胞中的有用性和它們最終在用于治療目的的造血骨髓組織細胞的轉化上的用途。為治療目的而將基因整合到外周血淋巴細胞和骨髓細胞中已在文獻(R.W.Culver等人，Transplant Proc.23 170-177，1991)中描述過，原則上可用于本發明所述的反義RNA表達構建體。
實施例實施例1表達載體構建體KTX11(在下文中，除非另有說明，所有核苷酸編碼都是關于1型人體免疫缺陷病毒(HXB2)順序，UWGCG，GENEMBL DATA BANK，File1987年9月25日的HIVHXB2CG.VIRAL)。
為了在HIV-1易感染細胞的轉染之后內源性表達抗病毒活性的反義RNA，構建了下述表達載體在Bgl Ⅱ-XhoⅠ接合體結合，對Bgl Ⅱ，XhoⅠ和SalⅠ裂解位點修飾后，使鼠的金屬巰基組氨酸三甲內鹽Ⅰ啟動子〔1600堿基對EcoRⅠ-BglⅡ片段(N.Glanville等人，Nature 292，267-269(1982)〕與來自前病毒HIV-1 DNA順序3′區的SalⅠ裂解位點(核苷酸5786)結合。
將來自前病毒HIV-1 DNA5′區的BglⅡ裂解位點(核苷酸474)與BamHⅠ裂解位點結合，BamHⅠ連著SV40多腺苷酸化信號的順序(核苷酸2564至4713，來自UWGCG GenEMBL File SV40XX的缺失順序)。該同一SV40的多腺苷酸化順序在3′→5′取向上用于TRN5NEO〔選擇標記新霉素(磷酸轉乙酰酶)，核苷酸1-1286TRN5NEO BACTERIA，UWGCG GenENBL〕終止。該新霉素基因表達由SV40早期啟動因子(核苷酸5171-371，UWGCG GenEMBL SV40XX)啟動。另外，該載體還含有帶有細菌起點和芐氨青霉素抗性基因的pBR 322 DNA(核苷酸2067-4363，UWGCG GenEMBL File PBR322)以便可用作大腸桿菌和動物細胞的穿梭載體。
圖1給出了這種載體KTX11的基因圖譜。
實施例2表達載體構建體KTX12HIV-1反義RNA表達載體KTX12以與載體KTX11相同的方法(實施例1)構建。但是，它含有可誘導的雜交啟動子，HIV-1模板DNA鏈在該來自核苷酸7514→474的雜交啟動子后沿3′→5′方向延伸。
為了獲得所述雜交啟動子，將HIV-1 LTR啟動子片段核苷酸289至532融合到金屬巰基組氨酸三甲內鹽啟動子的核苷酸368(UWGCG File MUSMETI.RO)上。圖2給出了該載體KTX12的限制圖譜。
實施例3表達載體構建體KTX15按照與載體KTX12相同的方法(實施例2)構建HIV-1反義RNA表達載體KTX15。但是，HIV-1模板鏈的DNA片段(在3′→5′取向上)大大縮短了，它從核苷酸2096延伸到核苷酸474，因此包含了GAG順序、先導順序、U5順序和一部分R順序。載體KTX15的另一個重要性質是伴隨在HIV-LTR雜交啟動子中缺失核苷酸474-532的TAR順序的缺失。其結果，雖然在HIV感染時它應該仍然能夠活化雜交啟動子，但是應該防止在沒有HIV-1 TAT蛋白存在下TAR編碼的轉錄終止〔S.Y.Kao等，Nature 330，489(1987)〕。因此，這種雜交啟動子通過在HIV-1 LTR啟動子順序控制下的特別高的構建性轉錄來識別。圖3中給出了載體KTX15的限制圖譜。
實施例4表達載體構建體pSXK1為了說明在另一種強的構建性的表達啟動子控制下的反義RNA的表達，已經制備了HIV-1反義RNA表達載體pSXK1，這里的實例是巨大細胞病毒啟動子。將HIV-1基因片段核苷酸681-3825在3′→5′取向上插入到在核苷酸891位的HindⅢ限制位點中(載體pRc/CMV，目錄號V750-20，Invitrogen，San Diego，CA92121，USA)。多腺苷酸化信號來自牛生長激素(BGH)基因。
另外，該載體以與載體KTX11相同的方法(實施例1)構建成帶有大腸桿菌中復制和選擇用的新霉素選擇性標記和pBR322 DNA片段的穿梭載體。圖4中給出了載體pSXK1的限制圖譜。
實施例5表達載體構建體pSXK2HIV-1反義RNA表達載體pSXK2與載體pSXK1(實施例4)的區別在于，它具有融合的啟動子順序，其中含有與金屬巰基組氨酸三甲內鹽啟動子(UWGCG GenEMBL File MUSMETI.RO)的核苷酸150-369融合的CMV啟動子的核苷酸209-865(見實施例4)，因此也代表一種雜交啟動子。此外，將核苷酸4158-5786的前病毒DNA順序沿3′→5′取向插入，作為在CMV/金屬巰基組氨酸三甲內鹽雜種啟動因子的控制下的反義RNA表達的模板。載體pSXK2的限制圖譜復制在圖5中。
實施例6表達載體構建體pHTT 1、4、6、9、10、12和15HIV-1反義RNA表達載體構建體pHTT 1、4、6、9、10、12和15按照與載體pSXK1(實施例4，圖4)相似的方法制備。所有插入到pHTT載體中的HIV-1基因片段都在構建性表達巨大細胞病毒啟動子的控制下沿3′→5′取向克隆到載體pRc/CMV中(Invitrogen，San Diego，CA92121，目錄編號V750-20，1991)。
pHTT載體具體說明如下(a)pHTT 1將HIV-1基因片段(核苷酸4648-5746)參入pRc/CWV載體的NotⅠ裂解位點(核苷酸966)。
(b)pHTT 4將HIV-1基因片段(核苷酸1635-2639)參入pRc/CMV載體的XbaⅠ裂解位點(核苷酸985)。
(c)pHTT 6將HIV-1基因片段(核苷酸3003-3227)參入(b)中所述的XbaⅠ裂解位點。
(d)pHTT 9將HIV-1基因片段(核苷酸678-2099)參入(b)中所述的XbaⅠ裂解位點。
(e)pHTT 10將HIV-1基因片段(核苷酸2099-3829)參入(b)中所述的XbaⅠ裂解位點。
(f)pHTT 12將HIV-1基因片段(核苷酸4157-4647)參入(b)中所述的XbaⅠ裂解位點。
(g)pHTT 15將HIV-1基因片段(核苷酸3830-4157)參入(b)中所述的XbaⅠ裂解位點。
在實施例1-6的載體中在反向(3′→5′)上所含的HIV-1基因片段的總圖復制在圖6中。
實施例7用反義RNA表達載體轉染和克降人體淋巴細胞選擇非粘著生長的單核細胞樣細胞系U937和非粘著生長的T-淋巴細胞細胞系HUT78作為轉染的人體造血細胞系的實例，由于內源性表達的反義RNA抗HIV的結果，它們具有抗病毒性。兩個細胞系均得自American Type Culture collection(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852-1776，USA。
在ATCC推薦的培養基中對所述細胞系進行培養。通過各種方法進行載體轉染，其中電泳法證明是最成功的1.磷酸鈣方法該方法是Wigler等人，1977，Cell，11，223中的方法的一種變化形式。
用DNA的Ca沉淀物進行轉染。將0.05～20μg不同量的DNA溶解于0.25ml 250mM CaCl2中，用吸量管緩慢地轉移到0.25ml的兩份HEBS緩沖液中。將整個沉淀物混合物加到10ml細胞培養物中完成轉染。15小時后，吸濾除去介質。然后用DMSO使細胞休克。
對10ml培養物，加入3ml 25% DMSO的無菌PBS溶液。4分鐘后，吸濾除去液體，用5ml PBS洗細胞。然后，將細胞加到10ml DMEM培養基中。
2.DEAE-葡聚糖在轉染前一天，將細胞再次培養至每毫升培養基中含3-4×105個細胞的密度。轉染前2-4小時，將細胞離心，轉移到新鮮培養基中。將0.5-20μg DNA與1070μl PBS混合后，向其中加入120μl 10mg/ml DEAE-葡聚糖溶液(轉染溶液)。轉染前，將40ml細胞離心，轉移到10ml PBS中，并再次離心。
將細胞沉降物懸浮在1.2ml PBS-DEAE-葡聚糖溶液中，培養30分鐘，然后加入0.8ml冷的DMSO溶液(25%，在TBS中)使細胞休克。3分鐘后，加入10ml TBS，離心混合物。在RPMI生長培養基中洗細胞，并將細胞轉移到40ml該培養基中。
3.融合(Sanari-Goldin方法)將對數生長期的細胞(1×107細胞/ml)離心，用RPMI培養基洗一次，向細胞沉降物中加入2ml大腸桿菌的原生質體懸浮液(2×103細胞/ml，在10%蔗糖和10mM MgCl2中)。按Sanari-Goldin等人的方法制備帶有轉染質粒的原生質體。培養8分鐘后，離心，然后在2分鐘內小心地加入PEG溶液(聚乙二醇400;45%的RPMI溶液)。培養1分鐘后，在7分鐘內加入不含FCS的10ml RPMI培養基。將細胞離心，在RPMI培養基中洗，置于10ml中。
4.電泳用基因脈沖裝置和電容擴充器(自Bio Rad得到)進行電泳。將對數生長后的細胞調整至1×107細胞/ml，在PBS中洗一次，然后用10mM葡萄糖和0.1mM二硫蘇糖醇重新懸浮在無FCS的RPMI培養基中。
將0.4ml細胞懸浮液置于EP小池中，加入10-20μg DNA。DNA按1μg DNA/μl TE的比例溶解。
電泳條件變化如下電容260-960μF;電壓150-300V;電極距離0.2/0.4cm;阻抗100-∞ohm。
在電泳前后，將細胞在室溫下培養10分鐘，然后在10ml生長培養基+10%FCS中再次培養。
轉染體的選擇在每種情況下都是在對G418的抗性基礎上選擇轉染體的。
1.在粘性培養基中的選擇首先，在含G-418的生長介質中對轉染的細胞進行予培養，直至不再能觀察到生長。然后，把它們散布在粘性培養基中。用瓊脂(Gibco)或甲基纖維素使培養基固化。將予選的細胞散布到組織培養皿(10cm)上，向其中加入10ml選擇培養基(RPMI+1mg/ml G418)和2ml 2%的液化瓊脂溶液。瓊脂冷卻后，將平皿在37℃的恒溫箱中培養。在該實驗的一種變化形式中，用甲基纖維素代替瓊脂。
2.用隨后在Transwell細胞培養箱(Transwell TM，得自Costar)中克隆進行選擇。
轉染后48小時，將細胞以每0.2ml孔1×105個細胞的密度散布在96孔微量滴定板上。對U937加入濃度為0.7mg/ml的G418，而對HUT78加入1.0mg/ml的G418。培養基一耗盡，就向每孔中加入1/2孔體積的新鮮培養基;然后僅在U937情況下，再加入0.5mg/ml G418。
繼續培養，直到抗性細胞在各孔中開始生長。將這些混合的克隆擴充到較大體積，再進行克隆。為此，使用一種特殊的生長箱(得自Costar，Transwell TM，目錄號3425，205 Broadway，Cambridge，MA02139，USA)。
將細胞以低細胞密度(50-200個細胞/6ml)散布在含G418的軟瓊脂中(見粘性培養基中的選擇)，并向中心區(上區)中加入6ml。將該區用得自U937或HUT78的非常稠密生長的液體滋養培養物(200，000個細胞/ml)的膜分開(下區)。耗盡后，部分更換液體培養基以使細胞繼續生長。一旦G418抗性集落在軟瓊脂上出現，就用巴斯德吸量管分離它們并擴充。
為了說明反義RNA表達和HIV-1抗性，按照該方法，將10個獨立的轉染細胞系克隆并進行了進一步處理，所述10個轉染細胞系為用載體KTX11、KTX12、KTX15、pSXK1和pSXK2中的每一個對U937和HUT78轉染得到的。此外，用載體pHTT1、pHTT4、pHTT9和pHTT10產生HUT78細胞系并在HIV感染試驗中進行檢驗。
實施例8用表達載體KTX15轉化骨髓細胞作為實例，下面給出說明在小鼠樣品中初級骨髓細胞轉化的基本步驟從6-10周齡的C57小鼠的股骨分離初級骨髓細胞。將該細胞置于McCoy培養基(得自Flow)中，并與2.5μg/ml的interleukin-3、2.5μg/ml的GM-CSF(粒性白細胞-單核細胞集落刺激因子;得自Genzyme)和瓊脂(Bacto agar，得自Difco;終濃度0.3%)混合，在有或沒有毒性抗生素G418(新霉素)存在下以1×105個細胞/ml濃度散布在陪替氏培養皿中。在散布到瓊脂中之前除去骨髓細胞，之后直接進行轉染。然后將細胞在恒溫箱中于37℃和7.5%CO2條件下培養數天。多次間隔之后，在顯微鏡下記錄每種情況下轉化的集落(至少50個細胞)或簇(10-50個細胞)的數目。在給定的實驗條件下，大多數集落與粒性白細胞/單核細胞或粒性白細胞集落混合;偶爾可觀察到紅色釋放(erythroid bursts)，就象偶爾觀察到巨核細胞一樣。通過May-Grunewald染色法鑒定集落中細胞類型。
將轉染條件最佳化。在下述條件下成功地進行了初級骨髓細胞的轉染800μl骨髓細胞懸浮液(5×106個細胞，在實施例7中所述的電泳介質中)，5μg KTX15，在300V、100Ω、250μFD、6ms下進行電泳。
電泳(基因脈沖裝置和電容擴充器得自Bio Rad)后，在500μg/mlG418(新霉素)存在下的上述培養基中選擇細胞。對G-418的抗性表明成功地進行了可繁殖的初級骨髓細胞的轉染。
實施例9完整的表達載體構建體的整合的證明和反義RNA表達的證明在轉染的U937和HUT78細胞系破裂后，用氯化銫密度梯度離心通過標準方法分離來自這些細胞系的DNA和RNA〔L.G.Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York(1986)〕。表達反應RNA的完整的載體構建體的整合用寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應來證明〔PCR Technology Principles and Application for DNA Amplification，Ed.Henry A.Erlich，M.Stockton Press，New York(1989)〕，寡核苷酸引物擴增啟動子順序、插入順序和終止順序的重疊DNA片段。擴增后的DNA用DNA插入基因探針通過Southern印跡分析(Davis等人，見上)鑒定。圖7、8和9中給出了分析結果的實例。例如，將側翼引物，來自啟動子順序的5′-CAA ACC CTT TGC GCC CG-3′-或5′-ACT CGT CCA ACG ACT AT-3′及來自用于多腺苷酸化順序的5′-TTT TTT CAC TGC ATT CTA CTT-3′，用于載體KTX11、KTX12和KTX15。在帶pRc-CMV載體的表達載體的情況下，例如，將側翼引物5′-CTT TCC AAA ATG TCG TAA CAA CTCC-3′和5′-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT-3′分別用于啟動子順序和終止順序。在插入子(HIV順序)中，選擇可產生約500堿基對至2100堿基對的PCR產物的引物順序，其中的堿基對取決于引物對的選擇。
反義RNA的表達通過對得自克隆的轉染細胞系的RNA進行Northern印跡分析(Davis等人，見上)來說明。圖10給出了用來說明轉染的U937細胞系中HIV-1反義RNA的分析結果的一個實例。
實施例10轉染的克隆的造血細胞系的病毒抗性的說明用起始細胞系HUT78和U937作為對照，在用HIV-1(L.Ratner等人，Nature 313，277(1985)〕或HIV-2 D194(H.Kuhnel等人，Nucleic Acids Research(1990)18，6142)的比較感染研究中觀察克隆的反義RNA表達細胞系的病毒抗性的表達，所述細胞系根據實施例7和9獲得并鑒定。
1.用HIV-1感染HUT78和U7937細胞(對照)步驟在每種情況下，用不同稀釋度的HUT78/HIV-1培養物上清液(約104SFU/ml，在PBL培養物中，冷凍原液的RT活性為650，000cpm/ml)處理10ml細胞懸浮液60分鐘。然后將細胞離心，洗三次，以除去未結合的病毒顆粒和病毒蛋白。最后，在每種情況下，將細胞重新懸浮在10ml培養基中，在恒溫箱中培養。
每隔3-4天，用200μl無細胞的培養物上清液檢查是否存在HIV抗原。用Organon Technika的抗原捕獲檢驗法。
為了維持細胞，在每種情況下取出5ml細胞懸浮液，并用5ml培養基代替。
2.用HIV-1感染表達反義RNA的HUT78細胞和U937細胞步驟在每種情況中，用得自HUT78/HIV-1的稀釋過的培養物上清液(約104SFU/ml，在PBL培養物中，冷凍原液的RT活性為650，000cpm/ml)處理10ml細胞懸浮液(約4×105細胞/ml)60分鐘。原種病毒溶液的最終稀釋度對HUT78細胞為1∶1000，對U937細胞為1∶50。然后將細胞離心，小心地洗四次以除去未結合的病毒顆粒和病毒蛋白。最后，在每種情況下都將細胞重新懸浮于10ml培養基(RPMI1640+16%FCS)中，在恒溫箱中培養60天。
每隔3-4天，用160μl的無細胞培養物上清液檢查是否存在HIV抗原。同時使用Organon Technika的抗原捕獲檢驗法和微量滴定板光度計。
為了維持細胞，在每種情況下，每隔3-4天，取出5ml細胞懸浮液，用5ml新鮮培養基代替。
作為對于其它HIV反義RNA表達細胞系的有代表性的結果，可提及的是用三種HUT78轉染體(HUTK14-KTX11、SSHUTK16/2-SXK1、SSHUTK1/1-SXK2)(見圖11)和三種U937轉染體(ssUK20/4-KTX11a、ssUK3/1-SXK2和ssUK20/15-KTB11b)(圖12)的兩個系列實驗，這些試驗表明，在那些帶有表達載體pSXK1和pSXK2的反義RNA表達細胞系中，在感染后培養長達60天期間，在這些細胞培養物中對反轉錄酶活性(RT活性)和HIV抗原進行了測定，都沒有HIV增殖的跡象。相反，在對照細胞系中，可明顯地測到HIV增殖。此外，在較弱地表達表達載體KTX11的轉染體中可以觀察到病毒復制的延遲增加。圖11和12給出了結果。
為了檢驗在培養60天后檢測不到HIV-1抗原或RT活性的細胞系SSUK3/1-SXK2、SSHUT K16/2-SXK-1和SSHUT K1/1-SXK2中HIV-1感染的情況，通過例如在已培養60天的SSHUT K16/2-SXK1和SSHUT K1/1-SXK2的細胞(圖13)中的HIV-1 TAT基因順序和核膜基因順序的PCR檢測來說明陽性鑒定。為此，用PCR引物5′-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3′和5′-TCT ACC ATG TCAT-3′來產生690堿基對長的PCR片段。表達載體pSXK1和pSXK2不含有這些順序，因此不能產生任何假陽性的PCR產物。
實施例11對照實驗在沒有沿反向插入得自HIV-1的前病毒DNA的情況下轉染實施例1-6的載體，在細胞系U937和HUT78中不會導致病毒復制被抑制。但是，沒有進行其中正義方向插入前病毒HIV-1 DNA片段的實施例1-6的載體的對照實驗，因為相應的正義轉錄可以結合規則的HIV復體蛋白如TAT和REV，因此競爭抑制病毒復制〔G.J.Graham等人，PNAS 87，5817(1990)〕，所以作為對照實驗是不合適的。
實施例12用HIV-2感染反義RNA表達HUT78和U937細胞系用分離體HIV-2 D194(H.Kuhnel等人，Nucleic Acids Res.18，(1990)6142)進行感染實驗。將RT活性為2.14×105cpm/ml、抗原濃度(1∶1000稀釋度)為0.249 OD450nm(160μl樣品)的病毒株懸浮液儲存在-80℃。在4ml培養基中用50μl該病毒株懸浮液感染2×106HUT78細胞，培養3小時。對于U937細胞，在4ml培養基中用100μl病毒株懸浮液感染2×106細胞，培養24小時。然后，通過洗滌從細胞培養物中除去未結合的病毒顆粒。
以3-4天的間隔，維持細胞培養物，取出細胞培養物上清液，用Organon Technika的抗原捕獲檢驗法和伴隨的微量滴定板光度計定量測定HIV抗原。在不含有反義RNA表達載體的HUT78對照細胞系和U937對照細胞系中HIV-2 D194復制的過程與在轉染的細胞系中的過程對比在圖14和15中。
結果用表達載體KTX11、KTX12、KTX15、pSXK1、pSXK2、pHTT1、pHTT4、pHTT6、pHTT9、pHTT10、pHTT12和pHTT15(實施例1-6)，在基因轉染和轉染的細胞系克隆(實施例7)后，在人體血細胞系中內源性形成了抗HIV-1的反義RNA，證實了其抗病毒作用(實施例10、12)。
令人驚奇的是，在轉染的細胞系中證實了逆病毒復制的明顯表達抑制。反義RNA表達細胞的病毒抗性也可以相似的方式用特別適合于轉染細胞系的HIV-1病毒說明(圖11、12)。也觀察到了反義RNA對HIV-2的顯著的抗病毒性質(圖14、15)。
作為實例，這些結果表明，合適的表達反義RNA分子的啟動子，及反義RNA順序的性質，在遺傳改變的細胞中導致產生對逆轉病毒侵染的抗性。實施例9中表明，由于先前未知的，前病毒HIV-1 DNA的(+)-鏈的HIV-1 RNA轉錄本的沿3′-5′方向的RNA剪接，產生了幾種mRNA分子，這導致了抗病毒作用。
實施例1-12中所述的實驗表明，用合適的帶有得自逆轉病毒的反義RNA的編碼DNA片段的表達載體構建體，可在細胞中產生抗逆轉病毒性質，這些性質保護細胞不被逆轉病毒襲擊。
從圖11-13可以看出，細胞系SSHUT K16/2-SXK1和SSHUT K1/1-SXK2在HIV感染后60天用PCR分析檢測前病毒HIV DNA，結果是陽性的，但對HIV抗原的檢驗結果是陰性的。由此結果可以得出結論，即在細胞被HIV-1感染后，在HIV復制循環的第一步在轉染的HUT78細胞系中確實仍然形成了前病毒DNA，但是反義RNA阻止了前病毒DNA的轉錄/轉譯，沒有形成可檢測量的供病毒復制的HIV蛋白。
在細胞系SSU K3/1-SXK2的DNA中，在任何一個試驗樣品中，在用HIV-1感染后60天，既沒有用抗原試驗檢測到HIV蛋白的形成，也沒有用PCR分析檢測到前病毒HIV DNA形成。該結果可被解釋為表明了，在細胞系SSU K3/1-SXK2中形成的反義RNA不僅抑制HIV復制循環的第二步(前病毒DNA的轉錄和轉譯)，而且也抑制復制循環的第一步反義RNA可明顯地阻止由逆轉錄過程從染色體(+)鏈RNA形成前病毒DNA。人們已從理論上推測到了反義RNA的這種作用，但以前沒有被具體證實(R.Y.L.To and P.E.Neiman in Gene RegulationBiology of Antisense RNA and DNA eds.R.P.Erickson and J.G.Izant，Raven Press Ltd.，New York 1992)，因為在此之前還沒有發現相應有功效的表達載體構建體。
圖1表達HIV-1反義RNA的表達載體KTX11。金屬巰基組氨酸三甲基內鹽啟動子(MTI啟動子)驅動反義RNA的轉錄，所述反義RNA來自前病毒HIV-1的DNA片段，核苷酸5786→474(編碼UWGCG GENEMBL DATA BANK File HIV HXB2CG.VIRAL)。所述反義RNA轉錄本由SV40多聚腺苷酸化順序終止。新霉素抗性基因TRN5neo由SV40早期啟動子轉錄。該穿梭載體還含有pBR322起點和氨芐青霉素基因(pBR322-amp)。進一步的詳細情況描述在實施例1中。
圖2在HIV-1 LTR金屬巰基組氨酸三甲基內鹽雜交啟動子的控制下表達HIV-1反義RNA的表達載體KTX12。該載體構建的具體步驟見實施例2。
圖3在HIV-1 LTR金屬巰基組氨酸三甲基內鹽雜交啟動子的控制下表達HIV-1反義RNA的表達載體KTX15，其中缺失了HIV-1 TAR順序以獲得在沒有轉激活劑蛋白TAT存在下的最大表達。該載體構建具體步驟見實施例3。
圖4在細胞肥大病毒啟動子(CMV)的控制下表達HIV-1反義RNA的表達載體pSXK1。該載體構建的具體步驟見實施例4。
圖5在細胞肥大病毒啟動子(CMV)的控制下表達HIV-1反義RNA的表達載體pSXK2。在該實施例中，得自HIV-1的中央基因組區域的前病毒HIV-1 DNA片段不象實施例1-4中那樣含在5′區的順序，而是代之以來自POL/VIF區域的順序。該載體構建的詳細情況見實施例5。
圖6制備HIV-1基因片段的基本圖，所述基因片段含在反義RNA表達載體的3′-5′反向上(箭頭方向)，定義在欄1中給出。各表達載體的啟動子在欄2中給出，根據UWGCG GENEMBL DATA BANK FileHIVHXB2CG.VIRAL的HIV順序的核苷酸編碼在欄3中給出。
圖7來自克隆的U937轉染體的染色體DNA經PCR放大后的Southern印跡分析，所述轉染體含有整合到染色體DNA上的表達載體pSXK1。啟動子/插入順序的整體性質通過PCR產物的片段大小和與HIV基因探針的雜交而說明，所述基因探針不含有PCR產物的引物順序。
1.對照樣品載體，5′-連結，887個堿基對片段2.對照樣品載體，3′-連結，775個堿基對片段3.染色體DNA，5′-連結，887個堿基對片段4.染色體DNA，3′-連結，775個堿基對片段進一步細節見實施例9。
圖8通過PCR放大檢測來自克隆的HUT78轉染體的染色體DNA中的HIV-1基因片段。PCR反應物在瓊脂糖-TAE凝膠上分離，溴乙錠染色后在紫外光下照像。PCR產物含有561bp，相當于HIV-1基因片段(核苷酸699-1305)。它也是pSXK1載體的一個組份。所述561bp長的PCR產物由箭頭指標。
M＝DNA長度標準，表明516bp和1018bp1＝負對照，PCR反應中不加入DNA2＝來自U937細胞(野生型)的染色體DNA3＝來自HUT78細胞(野生型)的染色體DNA4＝負對照，PCR反應中不加入DNA
5＝正對照，6＝來自HUT78轉化體(SSHUT6/1 107-9/1)的染色體DNA7＝來自HUT78轉化體(SSHUT6/1 107-9/1)的染色體DNA8＝來自HUT78轉化體(SSHUT6/1 107-9/1)的染色體DNA9＝來自HUT78轉化體(SSHUT6/1 107-9/1)的染色體DNA圖9通過PCR放大檢測來自U937單核細胞和HUT78 T-淋巴細胞的染色體DNA中的HIV-1基因片段(核苷酸4158-5792)。所述細胞已預先用pSXK2載體轉染。PCR反應物在瓊脂糖-TAE凝膠上分離，用溴乙錠染色后在紫外光下照像。PCR產物含有pSXK2中的全部HIV-1基因片段(核苷酸4158-5792)，長度為1811bp。該1811bp長的PCR產物由箭頭指示。
M＝DNA長度標準，表明1635bp和2036bp長度標準1＝負對照，PCR反應中沒加入DNA2＝來自U937細胞(野生型)的染色體DNA3＝來自HUT78細胞(野生型)的染色體DNA4＝來自HUT78轉化體(SSHUT2/1 107-12/1)的染色體DNA5＝來自U937轉化體(SSUK3/1 107-12/1)的染色體DNA圖10在轉染的克隆的U937細胞條中證明一些反義RNA轉錄本的Northern印跡分析，所述細胞系含有細胞系SSUK 20/15-KTX11b的表達載體KTX11。用一個相當于載體KTX11的HIV-1插入DNA的基因探針，在病毒抗性細胞系的RNA中(第1道)可以檢測到至少三個長度為800bp、1，200bp和3，200bp的反義RNA轉錄本。第2道含有來自非轉染細胞系U937的RNA(負對照)。第3道含有標準RNA分子量。
圖11用HIV-1 LAV/BRU分離體(在0天)感染HUT78細胞系后，在60天內HIV-1抗原形成的過程。對細胞培養上清液進行的HIV ELISA試驗所得的450nm下的光密度值(OD450nm)在縱坐標上給出。光密度＞2.0時，將培養物上清液稀釋，然后再計算出OD值。中斷值代表HIV抗原決定簇的檢測極限。
在反義RNA-表達細胞系SSHUT K16/2-SXK1和SSHUT K1/1-SXK2中，HIV復制在60天的時間內得到完全抑制。
在細胞系HUT K14-KTX11中，HIV的復制與未轉染的野生型細胞系HUT78相比延遲了。
圖12用HIV-1 LAV/BRU分離體(在0天)感染U937細胞系后，在60天中HIV-1抗原形成的過程。對細胞培養物上清液進行的HIV ELISA試驗所得的450nm下的光密度值(OD450nm)在縱坐標上給出。光密度＞2.0時，將培養物上清液稀釋，然后再計算出OD值。中斷值代表HIV抗原決定簇的檢測極限。
在反義RNA-表達細胞系SSUK3/1-SXK2中，HIV復制在60天的時間內得到完全抑制。其它的轉染細胞系與野生型細胞系(U937)相比，表現出HIV復制的延遲。
圖13在含有反義RNA表達載體的細胞系中檢測HIV-1 DNA的PCR分析，該分析在HIV感染后60天進行。溴乙錠染色的瓊脂糖電泳凝膠顯示了來自如下指明的細胞系染色體DNA的PCR產物。
在HIV-感染的細胞系中，用引物對5′-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3′和5′-TCT GT TCT ACC ATG TCAT對來自TAT-ENV基因區域的702堿基對長的PCR片段進行放大。為了與PCR結果比較，在括號中給出了相應細胞培養物樣品的HIV抗原試驗的結果。
M道標準分子量，指出600bp1道陽性HUT K14-KTX11 702bp(抗原試驗陽性)2道陽性SSHUT K16/2-SXK1 702bp(抗原試驗陰性)3道來自與2道平行的感染試驗的PCR產物4道來自與2道平行的感染試驗的PCR產物
5道陽性SSHUT K1/1-SXK2 702bp(抗原試驗陰性)6道來自與5道平行的感染試驗的PCR產物7道與5道平行的感染試驗8道HUT78，陽性對照9-11道SSUK 3/1-SXK2培養物未檢測到702bp的PCR產物(抗原試驗陰性)。
圖14用HIV-2 D194分離體(在0天)感染HUT78細胞系后30天中HIV抗原形成的過程。對細胞培養物上清液進行的HIV ELISA試驗所得的450nm下的光密度值(OD450nm)在縱坐標上給出。光密度＞2.0時，將培養物上清液稀釋，然后再計算出OD值。中斷值代表HIV抗原決定簇的檢測極限。
在反義RNA-表達細胞系SSHUT K1/1-SXK2中，HIV復制在14天的時間內得到完全抑制。其它的轉染細胞系與野生型細胞系(HUT78)相比，表現出HIV復制的延遲。
圖15用HIV-2 D194分離體(在0天)感染U937細胞系后30天中HIV抗原形成的過程。對細胞培養物上清液進行的HIV ELISA試驗所得的450nm下的光密度值(OD450nm)在縱坐標上給出。光密度＞2.0時，將培養物上清液稀釋，然后再計算出OD值。中斷值代表HIV抗原決定簇的檢測極限。
在反義RNA-表達細胞系SSHUT K3/1-SXK2中，HIV復制在30天的時間內得到完全抑制。其它的轉染細胞系與野生型細胞系(U937)相比，表現出HIV復制的延遲。
權利要求
1.表達反義RNA的表達載體構建體，其特征在于，所述構建體含有雜交啟動子基因順序并具有強的構建性啟動子活性或在病源體侵入時可誘導的啟動子活性。
2.根據權利要求1的表達載體構建體，其特征在于，所述構建體在3′→5′方向(反向)上含有受表達反義RNA的啟動子控制的病源體病毒的亞基因組基因順序，所述反義RNA代表一個與病源體病毒的mRNA互補的核苷酸-堿基順序。
3.根據權利要求1和2的表達載體構建體，其特征在于，所述載體構建體在反向上含有前病毒的亞基因組DNA，所述前病毒的亞基因組DNA來自逆病毒例如HIV-1或HIV-2，或來自致癌病毒例如HTLV-Ⅰ或HTLV-Ⅱ，或來自致癌基因例如ab1、erbA、erbB、fms、fos、myb、myc、ras、sis或src。
4.表達反義RNA的表達載體構建體，其特征在于，在核苷酸的反向上含有啟動子或雜交啟動子的基因順序和HIV-1前病毒DNA，所述核苷酸為7514→474或5786→474或2096→474或3825→681或5786→4158或5746→4648或2369→1635或3227→3003或2099→678或3829→2099或4647→4157或4157→3830。
5.根據權利要求1-3的表達載體構建體，其特征在于，它們在3′-5′方向上含有表達較短的反義RNA轉錄本的亞基因前病毒基因順序或致癌基因順序。
6.根據權利要求4的表達載體構建體，含有來自HIV-1核苷酸605→455或670→440或825→535或6070→5800或5640→5020或5600→5040或8690→8300或9160→8800的前病毒基因順序。
7.根據權利要求1-6的表達載體構建體，其特征在于，它們含有來自一種病毒或多種病毒的兩種、三種或多種亞基因組基因順序。
8.含有權利要求1-7的表達載體構建體的轉染細胞。
9.權利要求1-7的表達載體構建體在藥物制備中的應用。
10.含有一種或多種權利要求1-7的表達載體構建體的藥物。
全文摘要
本發明涉及用特別合適的表達系統在轉染的造血細胞中目標性阻斷用于病毒復制(例如HIV的復制)的病毒信使核糖核酸(mRNA)的遺傳信息，所述表達系統表達一種互補的“反義RNA”。
文檔編號C12N15/33GK1089303SQ9310032
公開日1994年7月13日 申請日期1993年1月2日 優先權日1993年1月2日
發明者A·克雷施默, H·-P·安東尼切克, J·包加滕, A·勒伯丁, B·米爾克, W·施普林格, U·施特洛普, M·-M·施特魯克, L·B·埃舍塞默, H·呂沙門-懷曼, H·蘇哈通諾, T·-P·豪斯納 申請人:拜爾公司