專利名稱：農業園藝用殺菌劑新抗生素rs-28a及其制備方法
技術領域：
本發明是關于新抗生素和其制備方法，以及一種以該抗生素為有效成分的農業園藝用殺菌劑。
以往，農業園藝用殺菌劑一直是使用如銅、汞、砷之類重金屬化合物制劑和有機氮、有機磷藥劑。但是這些藥劑對動物和人體都有害，對土壤有污染作用，并且殘留在自然界中的有害物質又長期地作用于動、植物。這樣造成的環境污染已成了當今重大的社會問題，從而導致了目前這種被禁止或限制使用的局面。此外，隨著選擇性藥劑的減少及抗藥菌的出現，各種植物病害-尤其是水稻的主要病害有明顯加重的趨勢。為此，人們迫切希望能開發出一些既有強選擇性效果，又有高度安全性的新型農藥。
本發明的目的在于提供一種對各種植物病害均有效的新抗生素及其制備方法。而且本發明的目的還在于提供一種以上述抗生素為有效成分的農業園藝用殺菌劑。
本發明所述的抗生素RS-28A具有下述的理化性質。
融點126～128℃元素分析碳59.01%、氫8.67%比旋度[α]20D＝+35.4°(C＝0.5%CH3OH)紫外吸收光譜λMeOHmax＝212nm(E1%1cm＝98)紅外吸收光譜3375、2920、1730、1630、1595、1455、1368、1280、1180、1065、967、900、875、575cm-1溶解性易溶于甲醇、乙醇、丁醇;難溶于水;不溶于丙酮、乙腈氰甲烷、氯仿、醋酸乙酯、苯。
分子量1554(HRFABMS質譜)(分子式C78H138O30)呈色反應與高錳酸鉀、碘蒸氣、茴香醛-硫酸呈陽性反應;與茚三酮、來登·史密斯試劑呈陰性反應。
物質的顏色白色粉末該抗生素RS-28A可通過培養“RS-28”菌株而制得。上述“RS-28菌株”是從中國福建省的土壤中分離而得，其屬于一種鏈霉菌屬的微生物，并具有下述菌學性質。
1、形態特征在含有1%葡萄糖、1%酵母浸膏的菌體分析用培養基上培養本“RS-28菌株”，再用6N鹽酸在110℃、加熱水解18小時。水解物經薄層分析、可檢出出L、L-二氨基庚二酸，但未發現有M-二氨基庚二酸。
此外，用電子顯微鏡可觀察到在瓊脂平板上成長的氣生菌絲呈螺旋狀，孢子表面平滑、呈卵型，孢子鎖在氣生菌絲的前端形成眾多的鏈狀。
2、在各種培養基上的成長狀態[于27℃培養20天、顏色按照“色彩協調便覽”第4版(Colourharmonymanual)(container社)]。
(1)淀粉·酵母瓊脂培養基生長普通氣生菌絲部分形成氣生菌絲色調a(白)基內色調2na(亮黃)可溶性色調無(2)酵母膏·麥芽浸汁瓊脂培養基生長良好氣生菌絲普通氣生菌絲色調2ba(灰白)基內色調2pe(芥黃)可溶性色素無(3)麥片瓊脂培養基生長良好氣生菌絲多氣生菌絲色調5ba(貝殼紅)基內色調2ga(牡蠣灰白)可溶性色素無(4)淀粉·無機鹽瓊脂培養基生長良好氣生菌絲多氣生菌絲色調7ba(粉紅)基內色調3ea(亮棕黃)可溶性色素無
(5)酪氨酸瓊脂培養基生長良好氣生菌絲普通氣生菌絲色調2ba(灰白)基內色調3pe(琥珀)可溶性色素3pn(暗棕)(6)蔗糖硝酸鹽瓊脂培養基生長不良氣生菌絲無基內色調2ba(灰白)可溶性色素無(7)葡萄糖·天冬酰胺瓊脂培養基生長良好氣生菌絲普通氣生菌絲色調5ba(貝殼紅)基內色調2ga(牡蠣灰白)可溶性色素無(8)甘油·天冬酰胺瓊脂培養基生長普通氣生菌絲少量氣生菌絲色調a(白)基內色調3pn(暗棕)可溶性色素3nl(琥珀棕)
(9)營養瓊脂培養基生長普通氣生菌絲無基內色調2ea(亮白)可溶性色素無(10)蛋白胨·酵母膏·鐵瓊脂培養基生長普通氣生菌絲無基內色調2ea(亮白)可溶性色素無3、糖的利用D-葡萄糖成長良好++D-果糖成長良好++鼠李糖不成長-棉子糖不成長-D-木糖成長良好++L-阿拉伯糖成長良好++蔗糖不成長-肌醇成長良好++D-甘露醇成長良好++D-乳糖成長良好++從上可知RS-28菌株屬于鏈霉菌屬，該菌株已于92年2月26日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(保藏號為CGMCC-0171)。
此外，上述RS-28菌株的自然及人工變異菌株均屬鏈霉菌屬，具有生產抗生素RS-28A的能力，都可使用本發明所述的方法。
由此可以判明，本菌株屬于鏈霉菌屬，并命名為StreptomycesspRS-28。
培養方法及精制方法本發明所述的抗生素RS-28A可采用常規的方法，通過培養上述鏈霉菌屬的生產菌而制得。培養方法既可為液體培養、也可為固體培養。但為了有利于工業性生產，宜將上述生產菌的孢子懸浮液或培養液接種到培養基上，并通過通氣攪拌來加以培養。
培養基中的營養源并無特殊的規定，可采用常用的碳源、氮源及其它營養源。其中，碳源可為淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、乳糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、米糠、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，以及其它有機或無機含氮化合物。至于其它營養源，可適當添加一些無機鹽類，例如食鹽、磷酸鹽類及鉀、鈣、鋅、錳、鐵之類的金屬鹽，必要時也可添加些動、植、礦物油作為消泡劑。
對培養的溫度、時間等條件并無嚴格的限制，以適于使用菌的成長為準，并選擇RS-28A產量最高的條件為好。例如，培養基的PH范圍可為4～9，而以接近中性更好;培養溫度宜在25～35℃之間。當然，培養溫度、攪拌條件等均應根據所使用菌株的外部條件而進行適當的調節，以獲得最好的效果。
由上述所得的培養物出發，通過一些適當的方法就能制得RS-28A。這是些常用于提取代謝產物的常規方法。例如，可利用RS-28A與不純物在溶解度、離子結合力、吸附親和力及分子量等方面的差別，進行單獨、組合或反復提取。具體地講，RS-28A大部分存在于培養濾液之中，該培養濾液通過各種離子交換層析、凝膠層析、吸附層析、液相層析、纖維素層析等組合精制后，即可獲得含有RS-28A及其它活性成分的組份。該組份經冷凍干燥，所得粉末再通過高速液相色譜(例好High-carbonODS、以乙腈氰甲烷-甲醇-水-0.15%甲酸為展開劑)進一步精制，即可得到白色粉末狀的RS-28A精制品。
薄層分析美國Merck公司制造的0.25mm硅膠薄層板溶劑氯仿∶甲醇＝2∶1Rf值0.23溶劑氯仿∶甲醇＝1∶1Rf值0.36溶劑丁醇∶甲醇∶水＝4∶1∶2Rf值0.61抗生素RS-28A對各種微生物的最低生長抑制濃度。
被測菌株MIC(Rg/ml)黃瓜灰霉病菌30(Botrytis cinerea)
黃瓜炭疽病2(Colletotrichum lagenarium)水稻稻瘟病30(Pyricularia oryzae)小球藻1(Chlorera Vulgaris)大腸埃希氏菌>200(Escherichia coli)金色葡萄球菌>200(Staphylococcus aureus)白色念珠菌2(Candida albicans)與其它物質的比較在紫外光譜中，對顯示出末端吸收的分子量在1500～1600之間的已知抗生素進行了電子計算機檢索，沒有發現與本發明所述的RS-28A相當的物質，同時也沒有發現分子式為C78H138O30的物質，故而可以推定RS-28A為一種新抗生素。
有效成分為RS-28A的農業園藝用殺菌劑本發明所述的有效成分用作農業園藝用殺菌劑時，可同樣使用該技術領域中已知農藥所通用的固相載體、液相載體及乳化分散劑等制劑。并能配制成顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑等任意的劑型。這些載體中固相載體可以是粘土、高嶺土、皂土、酸性白土、硅藻土、碳酸鈣、硝化纖維素、淀粉、阿拉伯膠等;液相載體可以是甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、乙二醇等。同時，在制劑中一般可適當添加些輔助劑，如高級醇的硫酸酯、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基乙二醇醚、烷基烯丙基無水山梨糖醇月桂酸酯、烷基烯丙基磺酸鹽、季胺鹽、聚烯化氧等。
一般而言，各制劑中有效成分的配比，在乳劑及可濕性粉劑中為10～90%;在粉劑及油劑中為0.1～10%。當然，也可根據不同的使用目的而適當增減。
此外，本發明的制劑還可與其它殺菌劑、除草劑、殺蟲劑、肥料物質、土壤改良劑等配合使用。
以下，就本發明的制造、實施、試驗事例作具體的說明，但這并不意味著對本發明有所限定。
其中[%]、[比]分別表示重量%、重量比。
實施例1以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食鹽0.2%、磷酸二氫鉀0.005%的配比制成70ml的培養基，將上述“RS-28菌株”接種于該培養基中，并置于100瓶K1長頸瓶中，在27℃振動培養48小時。取其培養液離心分離成菌體和培養濾液。分別以丁醇萃取，合并丁醇層進行濃縮，將濃縮液加入迪阿翁離子交換樹脂的上部，以50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇的順序沖洗。對在100%甲醇沖洗區分中存在的活性物質加以濃縮、干燥，得519mg該活性物質。將該活性物質置于MCI膠凝柱(2.1×81cm)的上部，以80%甲醇、90%甲醇的順序沖洗。區分溶出液，收集活性區分，經濃縮、干燥得108mg，然后以高速液相色譜進行精制。柱NucleosilHigh-CarbonODS(直徑20mm，長25cm);溶劑78%(乙腈氰甲烷∶甲醇＝5∶3)，22%水，0.15%甲酸;流速85ml/min;展開時間60～63分鐘。活性區經反復分離后，濃縮、冷凍干燥即可得10mg純粹的白色粉末。
實施例2可濕性粉劑將10份RS-28A與5份十二烷基磺酸鈉、2份二苯甲烷-二磺酸鈉-甲醛聚合物及83份陶土混合、粉碎，即得100份制劑。
實施例3乳劑將8份RS-28A與10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份烷基-二甲基芐基氯化銨及52份甲醇混合、溶解，即得100份乳劑。
實施例4粉劑將0.2份RS-28A與0.5份硬脂酸鈣、50份滑石粉及49.3份陶土混合、粉碎，即得100份粉劑。
實施例5顆粒劑將10份RS-28A與15份淀粉、72份皂土粉及3份十二烷基硫酸鈉混合、粉碎，即得100份制劑。
試驗例1對黃瓜炭疽病的防治試驗將按實施例2所制成的可濕性粉劑稀釋到所定的濃度，然后噴到播種后成長15天的黃瓜(品種∶相模半白)幼苗上，并進行風干。將黃瓜炭疽病菌(Colletotricvm.legenarirm)置于土豆、葡萄糖瓊脂培養基上培養，將所得的孢子懸浮于蒸餾水中。藥液干燥后，將黃瓜移至接種箱，用噴霧器將上述懸浮液進行噴霧接種，每4棵黃瓜幼苗約噴藥4ml。接種后的黃瓜幼苗置于恒溫多濕的地方，24小時后移至人工光照下，4天后檢查發病的情況。其結果如表1所示表1試驗化合物噴灑濃度(PPM)防治效果(%)藥害RS-28A100100無5099.4無2594.4無百菌清*1750 97.5＊1百菌清四氯間苯二腈對黃瓜菌核病的防治試驗將按實施例2所制成的可濕性粉劑稀釋到所定的濃度，然后噴到播種后成長15天的黃瓜(品種∶相模半白)幼苗上，并進行風干。將黃瓜菌核病菌(Scerotiniascerotiorum)置于土豆、葡萄糖瓊脂培養基上培養，然后接種到黃瓜幼苗的葉片上，每一葉片接種二處。接種后的黃瓜幼苗置于恒溫多濕的地方，24小時后移至人工光照下，4天后檢查發病情況，其結果如表2所示，并按式1求出防除效果。
表2試驗化合物噴灑濃度(PPM)防治效果(%)藥害RS-28A100100無5077.5無2536.5無撲海因*2250 100＊2撲海因3-(3，5-二氯苯基)-N-異丙基-2，4-二氧代咪唑烷-1-羧酰胺式1防除效果(%)＝(1- (處理區的發病指數之和)/(無處理區的發病指數之和) )×100
根據以上試驗的結果可以證明，本發明所述的RS-28A提供了一種新的農業園藝用殺菌劑。這種殺菌劑在低濃度下對植物病害也具有極高的防治效果。而且具有高度的安全性，并無任何藥害。
附圖和簡單說明
圖1為本發明所述的抗生素RS-28A在甲醇中的紫外吸收光譜圖;圖2為RS-28A在溴化鉀片劑中的紅外吸收光譜圖;圖3為RS-28A在CD3OD中的質子NMR圖譜;圖4為RS-28A在0～110ppmCD3OD中的13NMR圖譜;圖5為RS-28A在110-220ppmCD30D中的13NMR圖譜。
權利要求
1.一種農業園藝用殺菌劑，本發明的特征在于所述的殺菌劑是一個新抗生素RS-28A，其具有下述理化性質。融點126～128℃元素分析碳59.01%、氫8.67%比旋度[α]20D=+35.4°(C=0.5%CH3OH)紫外吸收光譜λMeOHmax=212nm(E1%1cm=98)紅外吸收光譜3375、2920、1730、1630、1595、1455、1368、1280、1180、1065、967、900、875、575cm-1溶解性易溶于甲醇、乙醇、丁醇；難溶于水；不溶于丙酮、乙腈氰甲烷、氯仿、醋酸乙酯、苯。分子量1554(HRFABMS質譜)(分子式C78H138O30)呈色反應與高錳酸鉀、碘蒸氣、茴香醛-硫酸呈陽性反應；與茚三酮、來登·史密斯試劑呈陰性反應。物質的顏色白色粉末
2.按權利要求1所述的新抗生素RS-28A的制備方法，其特征在于先培養鏈霉菌屬的RS-28菌株(該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會的編號為CGMCC NO.0171)，再從這些培養物中分離提取出新抗生素RS-28A。
全文摘要
本發明提供了一種新抗生素RS-28A及其制備方法，還提供了一種有效成分為RS-28A的農業園藝用殺菌劑。它對防治黃瓜炭疽病、菌核病等具有卓效，既有強選擇性，又有高度安全性，對施用人員毫無影響，又無任何藥害。本抗生素可通過培養鏈霉菌Sp.RS-28(strcptomyccs sp.RS-28)而制得。
文檔編號C12N1/20GK1075752SQ92108338
公開日1993年9月1日 申請日期1992年2月28日 優先權日1992年2月28日
發明者倪長春, 高偉明, 王知惠, 張云樺, 沈寅初, 郭慶銘, 磯野清, 木原剛, 長田裕之, 山口勇, 有江力, 清水俊行 申請人:上海市農藥研究所, 日本國理化學研究所