專利名稱：：生產l-谷氨酸的方法
技術領域：
：本發明涉及發酵生產L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸可在食品、醫藥等廣泛領域用于多種目的。發酵生產L-谷氨酸時，L-谷氨酸生產菌的生長需要生物素，故其L-谷氨酸產率在很大程度上取決于培養基中的生物素濃度。可在生產菌生長所需之特定極限濃度的生物素中生產L-谷氨酸。另一方面，用來作為廉價培養基之粗原料的赤糖糊糖蜜(blackstrapmolasses)、淀粉水解物等都含有過量的生物素。在這種含有過量生物素的培養基中生產L-谷氨酸，需要進行添加抗生素(如青霉素)、表面活性劑，或在培養期間提高培養溫度等操作。為了實現在不進行上述操作的情況下在含過量生物素的培養基中經培養微生物生產L-谷氨酸，已知有利用溶菌酶敏感性菌株的方法(日本已公開之已審查專利申請NO.27798/87)、及利用對有維生素P活性之化合物有抗性的菌株的方法(日本已公開之未審查專利申請NO.164792/81)等。為了利用廉價粗原料工業化生產L-谷氨酸，一直期望發展一種在不進行添加青霉素、表面活性劑等，或提高培養溫度等操作的情況下，有效地生產L-谷氨酸的方法。根據本發明，可使用對青霉素有敏感性的棒狀谷氨酸生產菌以高產率生產L-谷氨酸。本發明中，只要是屬于所謂棒狀谷氨酸生產菌的微生物，如屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)等的微生物，且對青霉素有敏感性并只要不會因培養基中存在過量生物素而抑制用微生物生產L-谷氨酸，則任何上述各屬微生物均可使用。一般說來，這種對青霉素有敏感性的菌株是選自于經突變屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的、并能夠產生L-谷氨酸的親代菌株所得到的突變菌株。這里所說的青霉素是指包括青霉素G、F、K、O、V、X等及其鹽的青霉素類。可用常規突變方法，如用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍等處理來誘導產生用于本發明的青霉素敏感性菌株。為了從突變誘導的菌株中選擇適用于本發明的突變株，可選擇那些在其親代菌株能生長的青霉素濃度下，生長得不好或不能生長的菌株。本文所說的青霉素敏感性是指青霉素的最小生長抑制濃度小于親代菌株的最小生長抑制濃度。L-谷氨酸的生產沒有因培養基中存在過量生物素而受到抑制，意味著培養基中存在過量生物素對L-谷氨酸生產造成的抑制作用基本上可以忽略不計。更具體地說，可在不受過量生物素影響的情況下生產L-谷氨酸。對于棒狀谷氨酸生產菌，一般當培養基中存在10μg/L或更多生物素時即可抑制L-谷氨酸的生產。因此，過量生物素是指培養基中存在之生物素的量在1μg/L或更多。得到本發明之突變株的親代菌株可包括棒狀谷氨酸生產菌，如谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、嗜醋酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、利郎棒桿菌(C.lilium)ATCC15990、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)ATCC14067、乳酸發酵短桿菌(B.lactofermentum)ATCC13869、二岐短桿菌(B.divaricatum)ATCC14020等。另外，也可使用由上述野生菌株誘導產生的、改善了L-谷氨酸產率的各種突變菌株。在許多情況下，可以賦予本發明的突變株以通常已知適于增加其L-谷氨酸生產能力的特性，來進一步提高產率。下文具體描述獲得本發明突變株的特定方法，并將如此誘導產生之突變株的青霉素敏感性程度列示如下。按常規方法，以10g個細胞/ml的密度分別將谷氨酸棒桿菌ATCC13032和黃色短桿菌ATCC14067菌株的細胞懸浮于10mlTris-馬來酸鹽緩沖溶液(pH6.0)中，并向懸液內加入500μg/ml的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍。將混合物于30℃下放置30分鐘。收集細胞后，用Tris-馬來酸鹽緩沖液徹底洗滌細胞并涂布在培養基A(1%蛋白胨、0.5%肉汁、0.5%酵母浸膏、0.25%Nacl、2%瓊脂，pH7.2)上，然后于30℃下培養48小時。將如此得到的突變株重復接種于培養基A和向培養基中添加0.01U/ml青霉素G(鉀鹽)制得的培養基B中。30℃培養48小時后，收獲在添加了青霉素的培養基(培養基B)中生長差或不生長，但在未添加青霉素的培養基(培養基A)中生長良好的突變株、此即青霉素敏感性菌株。親代菌株在各培養基均生長良好。分別在培養基A和培養基B中將本發明收獲的突變菌株和其親代菌株培養48小時，以比較各菌株的生長程度。結果示于表1中。表1</tables>卄生長良好;一不生長上述青霉素敏感性菌株已于1990年7月12日分別以下列登記號保藏在FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTechnology，Japan谷氨酸棒桿菌H-7684(FERMBP-3004)和黃色短桿菌H-7685(FERMBP-3005)。為了培養用于本發明的微生物，一般可使用適于發酵生產氨基酸的培養基。即可使用含有能被微生物同化之碳源、氮源、無機鹽、生長因子等的合成培養基或天然培養基。作為碳源可使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖蜜、淀粉、淀粉水解物等;且可使用乙酸、富馬酸、檸檬酸等各種有機酸;乙醇、甲醇、甘油等醇類物質。最好是選用赤糖糊糖蜜。作為氮源，可使用氨，氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等各種無機酸鹽，富馬酸銨等有機酸銨鹽，乙胺等胺，尿素等含氮化合物，蛋白胨、肉汁、酵母浸膏、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆餅或其水解物，用于氨基酸和核酸發酵的各種微生物細胞及其消化產物等。作為無機礦物質，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。作為生長因子，可使用生物素、硫胺素、煙酸、β-丙氨酸等維生素以及谷氨酸等氨基酸。可在通氣條件下進行培養，如振蕩培養，攪拌深層培養等。培養溫度為20至40℃，較好是25至38℃。培養基的pH為5至9，且較好保持在中性pH左右。可用尿素、碳酸鈣、無機或有機酸、堿溶液、氨水、pH緩沖溶液等調整pH。一般在1至7天完成培養過程，從而產生并在培養液中積聚L-谷氨酸。培養完成后，由培養液中除去細胞等沉淀物。單獨或聯合使用離子交換處理、濃縮、鹽析、等電沉積等方法從培養液中回收L-谷氨酸。下面以實施例進一步闡述本發明。實施例1首先，在2升錐形瓶內制備250ml由50g/L赤糖糊糖蜜(按葡萄糖量計算)、10g/L硫酸銨、2g/L尿素、0.5g/LKH2PO4、0.5g/LMgSO4·2H2O和30g/LCaCO3組成的生產培養基(pH7.2)。在由20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L酵母浸膏和5g/LNacl組成的種子培養基(pH7.2)中將谷氨酸棒桿菌ATCC13032或H-7684菌株于30℃下培養24小時。然后將20ml種子培養液接種到上述250ml生產培養基中。在ATCC13032菌株的培養液中未見有L-谷氨酸積聚，而在H-7684菌株的培養液中產生并積聚了25.0mg/ml的L-谷氨酸。從H-7684菌株的培養液中離心得到1升上清液，并通過裝有強酸性陽離子交換樹脂〔Dowex50×8(Na型)，DowChemical有限公司生產〕的柱。用氨水洗脫L-谷氨酸、分離、純化、濃縮并結晶，得到20.0gL-谷氨酸結晶。實施例2按實施例1所述的相似方法培養黃色短桿菌ATCC14067或H-7685菌株。結果如表2所示。表2</tables>權利要求1.生產L-谷氨酸的方法，其包括在培養基中培養中對青霉素有敏感性的棒狀谷氨酸生產菌直到培養中積聚L-谷氨酸，并由其回收L-谷氨酸。2.根據權利要求1的方法，其中細菌是屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的微生物。3.根據權利要求2的方法，其中微生物屬于谷氨酸棒桿菌或黃色短桿菌菌種。4.根據權利要求3的方法，其中微生物是谷氨酸棒桿菌H-7684(FERMBP-3004)或黃色短桿菌H-7685(FERMBP-3005)。5.根據權利要求1的方法，其中培養是在20至40℃下進行1至7天。6.微生物谷氨酸棒桿菌H-7684(FERMBP-3004)或黃色短桿菌H-7685(FERMBP-3005)的生物學純的培養物。全文摘要本發明公開了生產L-谷氨酸的方法，其包括在培養基中培養對青霉素有敏感性的棒狀谷氨酸生產菌直到培養基中積聚L-谷氨酸，然后由其中回收L-谷氨酸。可在不進行添加抗生素等操作，并且不會因培養基中存在過量生物素而抑制L-谷氨酸產率的情況下，有效地產生用作藥物和食品添加劑的L-谷氨酸。文檔編號C12P13/14GK1058615SQ91105208公開日1992年2月12日申請日期1991年7月30日優先權日1990年7月30日發明者東明樹,倉都祥行申請人:協和發酵工業株式會社