專利名稱：合成多聚免疫球蛋白受體，受體-抗體復合物，生產及應用的制作方法
技術領域：
本發明是部分地借助于美國政府的資金作出的，因而美國政府對本發明擁有某些權利。
本發明涉及被動粘膜免疫保護的一般領域，以及多聚免疫球蛋白免疫試劑及技術的一般領域。我們用多聚免疫球蛋白抗體-即IgA和IgM-的多聚物類。IgM抗體一般產生于免疫反應的早期，并在保護性粘膜免疫學中不是一個重要因素。因此，本發明一般指的是多聚免疫球蛋白抗體，對于本發明的各個方面來說普通的和優選的抗體是IgA類抗體，這種抗體一般以二聚物形式被分泌，并且很少有聚合度較高的IgA多聚物。
許多致病的細菌和病毒最初是通過穿過胃腸道、呼吸道或生殖道的細胞內壁(上皮細胞)得以進入人體的。一種分化的抗體，IgA抗體，保護這些表面。IgA抗體是由位于上皮細胞表面之下的組織產生的二聚體或多聚體分子。它們由上皮細胞進入粘膜分泌部分，在這里它們與尚未進入人體的病原體交聯或將其包覆，阻止這些病原體與上皮細胞接觸或粘附在上皮細胞之上。因此，IgA抗體是作用于人體外面的病原體，它們是通過阻止病原體通過上皮細胞進入人體這種方式起保護作用的。
天然出現的IgA反應是通過將抗原輸送到粘膜表面而觸發的。抗原通過指定取樣部位(稱為微褶(microfold)或M細胞)進入人體，該部位將影響轉上皮細胞抗原輸送到含有粘膜免疫系統的特殊的、組織細胞聚集體的粘膜內皮區。更具體說，如
圖1所示，在腔1中的抗原A(表示為實點)連接位置2處的M細胞的腔表面。該抗原在3處被內在化和通過細胞(transcytosed)，以便被釋放在含有淋巴細胞L(B細胞和T細胞)和抗原處理/提供(antigen-processing/presenting)細胞，例如巨噬細胞(M)的上皮細胞間腔4中。
一種天然免疫的宿主中的IgA抗體通過與遍及呼吸和消化系統生殖道和乳腺的上皮細胞和含腺細胞的基礎(里面的)表面上的一專門受體(叫作多聚免疫球蛋白受體)結合被輸進分泌物中。見Solari和Kraehenbuhl所著“Receptor-Mediated Transepithe-lial Transport of Polymeric Immunoglobulins”，pp.269-298 in The Mammary Gland，Nelville和Daniel編輯，Plenum Publishing，Cambridge(1987);Mestecky(1987)J Clin.Immunol.7265-276。受體-IgA復合物穿過這些細胞并在胞外分泌出進入腔(表面的)細胞表面，在這里該受體通過酶的促進裂開，將IgA釋放出，與被稱為分泌成分(SC)的受體碎片一道進入分泌物中。見Mostov et al.(1980)Proc.Nat′l Acad.Scl.U.S.A.777257-7261;Solari，R.and Kraehenbuhl，J.P.Cell 3661-71(1984);Kuhn and Kraehenbuhl，J.Biol.Chem.25612490-12495(1981)。據報導，分泌成分減少了IgA蛋白水解作用的降解。見Lindh，J.，J.Immunol.114284-286(1975);Brown et al.J.Clin.Invest.491374(1974)。
總的來說，涉及注入抗原的現有的免疫策略引起生成IgA類抗體，這些抗體有次序地循環并在它們進入人體后中和病原體。注入抗原一般不含引起實質性IgA反應。
致力利用在粘膜阻檔層上的IgA保護作用的優點包括口服免疫，利用免疫哺乳動物的粘膜分泌，或是為了對免疫哺乳動物進行主動保護，或是為了對其他哺乳動物進行被動保護。見Glass et al，NEW Eng.J.Med.，3081389-1392(1983);Fubara et al.，J.Immunol.，111(2)395-403(1973)。單克隆IgA抗體業已生產出來，并直接應用于呼吸粘膜表面，致力于保護，防止病原體的進入。見Mazanec et al.，J.Virol.，612624-2625(1987)。
我們已經發現了各種制造和穩定用于被動粘膜免疫保護的單克隆多聚免疫球蛋白抗體制劑的辦法。更具體地講，這些制劑是一些在專門用于一選定的抗原或抗原族的多聚-Ig和一種至少包括一個該多聚-Ig受體的多聚-Ig鍵合區域的穩定劑蛋白之間，得到充分分離的復合物。該多聚-Ig穩定劑實質上沒有任何C一端的轉移膜或細胞內多聚-Ig受體區域。所產生的復合物的特征在于與未復合的多聚-Ig相比較具有蛋白水解穩定性，并且該復合物具有該多聚-Ig的專門的鍵合特性和免疫保護交聯特性。在本發明的第一個方面，該穩定劑蛋白是重組蛋白。在本發明的第二個方面，該多聚-Ig抗體是一種單克隆抗體。
如以下所評述的那樣，該復合物的一種優選的形式的特征在于在該多聚-Ig和該穩定劑之間的共價(二硫化物)鍵。這樣的復合物可以用一種可以產生專門用于所選定的抗原或抗原族的所需要的多聚-Ig的細胞來制造設計的這種細胞以產生多聚-Ig穩定劑。這種復合物是利用這種細胞的培養物制取的，并且也是從這種細胞培養物中回收來的。
該多聚-Ig最好是單克隆IgA類抗體。也如以下所詳述的那樣，該優選的穩定劑的特征是關于天然出現的多聚-Ig受體區，并且該優選的穩定劑包括區域Ⅰ和至少區域Ⅳ或Ⅴ或兩者，因區域Ⅵ實質上被截去。區域Ⅰ最好是與區域Ⅴ隔開一個大約100-500個氨基酸的鏈區。
本發明的第三個方面的特征是包括多聚-Ig受體的多聚-Ig鏈合區，并且實質上沒有C一端轉移膜或細胞內多聚-Ig受體區的重組多聚-Ig穩定劑。優選的穩定劑是以上關于具有本發明第一部分二個方面特征的復合物所討論的那些。
本發明的第四個方面的特征在于測定活體內多聚-Ig單克隆抗體的保護能力的方法，這是通過將待測的單克隆多聚-Ig引入一哺乳動物的循環系統中并測定該哺乳動物的粘膜分泌物中多聚-Ig來實現的。然后，和病原體(或精子)使該哺乳動物免疫性試驗并測定抗該病原體或受精的保護作用。該單克隆多聚-Ig最好是采用注射或灌注的方式引入哺乳動物循環系統中。換句話說，一種腫瘤或形成腫瘤的細胞(例如雜交腫瘤(hy-bridoma))可以以皮下方式引入，作為一個連續的單克隆多聚-Ig源。
本發明的第五個方面的特征在于一個通過以下步驟來制造上述巰基交聯復合物的方法，所述步驟是提供設計的固著上皮細胞，用來產生多聚-Ig受體的;在某些條件下培養這些上皮細胞，條件是在一種多孔支撐物上形成這種細胞一個單層，這種支撐物被設置用來將該單層底側上的第一介質與該單層頂側的第二介質隔離。單克隆IgA被引入該單層的底側，并且當該抗體穿過單層傳遞時在該細胞中形成該復合物。該復合物從該單層的頂側上的介質中加以回收。所述第一介質最好是適用于保證上皮細胞生長的營養介質，而第二介質最好是在回收多聚-Ig復合物時實質上不受蛋白質的干擾。單克隆IgA可以通過在第一介質中共同培養的雜交腫瘤細胞來引入。換句話說，單克隆IgA是首先在雜交腫瘤培養物中產生，然后從培養物中分離出來，最后被引入第一介質。
本發明第一和第二方面的復合物可以直接引入哺乳動物的粘膜表面以保護不受病原體或不受受精作用的影響。該復合物最好是通過口、鼻、陰道、直腸、眼睛引入，或引入中耳。一種優選的給藥方法是在第一個哺乳動物的一種粘膜分泌物中提供該復合物，然后將該粘膜分泌物給與第二種動物。例如，可以將含有該復合物的取自第一個動物奶喂給第二個動物。為了產生這種分泌物，將多聚-Ig[例如由雜交瘤(hybridoma)培養物提純的]引入第一個哺乳動物的循環(例如通過灌注或注射)，并且從該哺乳動物身上收集奶或其他粘膜分泌物。
本發明提供了特別有效和安全的被動免疫，原因在于它是非系統化的。因而，動物(非人哺乳動物)免疫試劑在粘膜免疫保護作用中比對全身免疫接種作用是合法的更有希望被容許。新生兒感染，例如壞死性大小腸結腸炎和B組鏈球菌感染是特別重要的目標，已知是由于在這個階段缺乏天然粘膜免疫性。
本發明的第六個方面的特征在于產生一種生成多聚-Ig的雜交瘤(hybridoma)，所使用的方式是以一種抗原給一哺乳動物免疫性試驗，并從該哺乳動物的粘膜組織，例如Peyer斑或淋巴細胞豐富的其他粘膜組織中回收淋巴細胞。最好是選用Peyer斑，而其他適用的淋巴細胞豐富的粘膜組織包括扁桃體、腺樣組織增殖體、闌尾和直腸淋巴細胞。該淋巴細胞融合到骨髓瘤細胞中。該抗原最好是加到該哺乳動物的一種粘膜表面上。
本發明其他的特征和優點由以下對它的優選的實施例的說明將會更清楚。
最佳實施例圖的說明。
圖1是用圖解法表示抗原橫過M細胞的細胞轉移。
圖2是用圖解法表示形成產生多聚IgA的雜交腫瘤的步驟。
圖3是用圖解法表示用于評價由雜腫瘤所產生的多聚IgA的保護特性的方法。
圖4是用圖解法表示多聚IgA和改良的多聚-Ig受體之間的復合物的結構。
圖5是用圖解法表示多聚-Ig受體區域。
圖6A和6B顯示一個基因編碼多聚-Ig受體的核苷酸順序和推論的氨基酸順序。
圖7是由多聚-Ig受體的兩個兔子等位基因的無性繁殖cDNA推斷的氨基酸順序。
圖8A-8C顯示由圖7順序推論的cDNA圖9比較圖7的多聚-Ig受體等位基因的區域Ⅰ的順序。
圖10用圖表示各種表達傳病媒介。
圖11用圖表示兩種專門的表達傳病媒介PLK-neo6.8kb和PLM-neo6.8kb的結構。
圖12描述了將無性繁殖多聚-Ig受體基因插入圖11的傳病媒介的情況。
圖13描述了在多聚-Ig受體cDNA中的各種限制位置。
穩定劑蛋白質和多聚Ig復合物最佳的穩定劑蛋白質是由多聚-Ig受體，一種作為多聚-Ig轉移媒介的轉移膜分子衍生的。該受體包括圖4和5中所示的以下區域5個胞外區域;一個轉移膜觀測部分和一個C一端細胞內尾。該受體的蛋白分解裂紋產生了游離的五區域蛋白質“SC”或分泌成分。見Mostov et al.，Nature 30837-43(1984);Kuhu et al.，J.Biol.Chem.，2586653-6659(1983)。在多聚-Ig受體和IgA之間形成二硫化物橋通常如圖4所示。
該多聚-Ig受體一般保存于所有哺乳動物中，而我們使用的這一種包括所有這樣的受體，不考慮哺乳動物的來說，例如小鼠、鼠、兔、豚鼠、豬、羊、馬、母牛或人類。該領域中的技術人員將作出這樣的評價，即在這種應用中所提供的兔多聚-Ig受體順序可以用于標準雜交無性繁殖技術，以便將這種cDNA編碼多聚-Ig受體與其他哺乳動物區分開。
如以上所概括的那樣，該復合物的穩定劑蛋白質部分可以是至少按二種不同的方法產生的重組穩定劑蛋白。該多聚Ig受體可以進行無性繁殖并且在一個細胞中被表達，該細胞可以將它排出并使其分裂以產生重組穩定劑蛋白。換一句話說，該多聚-Ig受體基因可以按各種方式設計(特別是通過插入一個如下所述的中止密碼子)以產生一個直接用該穩定劑蛋白表示的結構。
如以上所指出的那樣，制取所述穩定劑蛋白質的兩種方法都從所述無性繁殖的多聚-Ig受體基因開始。Mostov et al.，在Nature 30837-43(1984)中報導了這種基因的無性繁殖和它的順序。圖6就取自那篇報導，這在下面要做更詳細的說明。
另外的關于無性繁殖該基因的專門文件如下所述。見Schaerer et al.，J.Cell.Biol.110987-998(1990)。細胞質RNA是根據Suard et al.，Biochem.J.20181-90(1982)所述由正在哺乳的新西蘭兔的乳腺制備的;而多聚A+RNA是根據Schibler et al.，J.Mol.Biol.14293-116(1980)所述提純的。所述多聚A+RNA在受體中可翻譯活性通過以5-20%的線性蔗糖梯度的大小分級分離加以富集，用作cDNA合成的模板。第一個cDNA鏈是根據Wahli et al.，Dev.Biol.67371-383(1978)合成的，而第二個鏈是根據Gubler，Gene 25263-269(1983)所述的DNA多聚酶I-RNaseH法合成的。這種雙鏈絞合的、dc結尾的cDNA在一種1%的低溶點瓊脂糖膠上進行分級分離，而大小分布在1.5和7kb之間的cDNA被洗脫并被退火處理成為dc結尾的PBR322，正如Peacock et al.，Biochem Biochem Biophys.Acta 655243-250(1981)中所描述的那樣。DH1細胞用根據Hanahan et al.，J.Mol.Biol.166577-580(1983)所述的一般方法進行過退火處理的DNA來轉換。變態的細菌被溶解，而DNA被轉移到硝化纖維素過濾器上[Thomas，Methods Enzymol，100255-266，(1983)]并且用兩種合成低聚核苷酸加以探查。所使用的專用的探針是由Mostov et al.，Nature 30837-43(1984)中所公開的順序為186-206和2421-2437的核苷酸，并用T4多聚核苷酸激酶和αP32-ATP標記，如Gough，N，et al.，Nutute 309763-767(1984)中所述那樣。與兩個探針雜交cDNA無性繁殖系其進一步的特征在于雜交選擇性轉化(Riezman et al.，EMBO J.22161-2168，1983)。兩個得到的質粒是PSC-Ⅰ，它對應于缺少區域2和3的低MW形式的多聚-Ig受體(如Deitcher et al.，Mol.Cell Biol.62712-2745，1986中所述)和PSC-Ⅱ，它對應于高MW形式的多聚-Ig受體。
圖6A和6B顯示了多聚-Ig受體mRNA的順序和由它預測的氨基酸的順序，Mosfov等人曾報導過。圖6A和6B它們的特性如下。殘基，從5′到3′編號，從P21，53中的多聚(dG)尾之后的第一個核苷酸形狀。核苷酸號碼在右邊給出。該復合物的順序是3517個基長，并含有少見的多聚(A)附加順序AU-UAAA，從多聚(A)尾部的上游26個基開始，并且以每一個基下面的三角表示。予測出的氨基酸的順序被表示在該核苷酸的順序之上。信號肽從-18到-1編號。成熟的多聚-Ig受體(Gln)的第1氨基酸是1號。ASn-鍵接糖基化作用的二個可能的位置被跨過去。予測的膜觀測區用一條虛跨線表示。這五個區域的半胱氨酸時，還包括第六個區域的相應的第一個半胱氨酸，在每一個區的第一個半胱氨酸上面的用實圓圈表示，和在每一個區第二個半胱氨酸之上的虛圓圈來表示。
多聚-Ig受體基因進行了無性繁殖之后，就可以設計要求的穩定劑蛋白質的直接表達式。特別是含有某些SC多聚-Ig-鍵接區域的重組蛋白質會使多聚Ig穩定，防止蛋白質水解斷裂，對多聚IgA的專門鍵合以及保護功能實際上沒有不良影響。具體說，圖4和5的那些區域是初始多聚-Ig鍵合區域(Ⅰ)、二個間隔初始區域(Ⅱ)和(Ⅲ)、C一端區域(Ⅳ)和(Ⅴ)，它們都有助于多聚-Ig的穩定。
所述多聚Ig受體在C-末端被削短以除去該蛋白質的轉移膜和細胞內部分，這些部分對于穩定和保護并非是必不可少的。因此，在本發明中很有用的所述被削短的多聚-Ig受體包括(最少)N-末端多聚-Ig鍵合區域Ⅰ。
提供以下關于特殊的被削短的多聚-Ig受體的討論是為了說明本發明，而不是限制它。該領域的技術人員將會很容易地懂得以下所提供的特殊的蛋白質順序，可以通過保守性的代換和刪減得以改善，而又保持本發明的功能和精神。
圖7描述了由該多聚-Ig受體的二個兔子等位基因的無性繁殖的cDNA(推斷的氨基酸順序。一個等位基因記為“1號”，對應于圖6A和6B所示的在Mostov et al.，Nature 30837-43(1984)中所報導的cDNA，其他的等位基因在申請人Kraehen-buhl的實驗室中按以上所報導的技術進行無性繁殖，那種等位基因的順序記為圖7中“2號”。在圖7中，一個冒號(“”)用來表示相同的殘基;一個句號(“.”)用來表示類似的殘基-即A，S，T;D，E;N，Q;R，K;I，L，M，V;F，V。
圖8A-8C描繪那些無性繁殖系cDNA順序。還有，冒號表示相同的基。“N”表示一未知的基。
在多聚-Ig受體順序之中的七個區域如下(號碼參看圖6)區域 部分Ⅰ 10-118Ⅱ 119-223Ⅲ 224-332Ⅳ 333-441Ⅴ 442-552Ⅵ 553-652
Ⅶ 653-755區域Ⅰ是一個多聚-Ig鍵合區，它保持在本發明削短的多聚-Ig受體中。
關于兩個等位基因(包括氨基酸1-9，它對于多聚-Ig鍵合來說并非是必不可少的，并因此也并不是關鍵性的)。區域1的特殊的順序表示在圖9中。
所述多聚-Ig受體順序可以用保守的氨基酸取代、刪除部分和附加部分來改變，而這些部分并不改變多聚-Ig的鍵合。確實，如圖9所示，比較兩個區域1順序只顯示出在位置38、70和76的三個氨基酸變動。在本發明(Ⅱ-Ⅴ)結果的其他區域的每一個中，在2和6個氨基酸之間變化，在殘基337和358處區域Ⅳ有變化，在殘基448、460和513處區域Ⅴ有變化。
簡言之，在氨基酸水平有80%以上同源好的，而其順序在全部五個區域內都可以利用氨基酸取代或利用區域刪除部分來改變。
尤其是對于多聚-Ig締合來說，應該在區域Ⅰ保持充分的同源性，在區域1和Ⅴ之間應該保持適當的間隔(即100-500個氨基酸)，并且區域Ⅴ應該適于保持共價二硫化物的穩定性。因此，在區域Ⅱ-Ⅳ可以容許非常充分的改變。
特別理想的是被截短的多聚-Ig受體還包括區域Ⅴ，該區域借助了一個巰基鍵，對于該復合物的共價穩定性負責。一般可見Eiffert et al.，Hoppe Seyler′s Z.phys.Chem.3651489-1495(1984)，鑒別在形成二硫化物橋時所涉及的多聚-IgA(人類)的半胱氨酸殘基。此外，重要的是包括對應于區域Ⅱ-Ⅴ的一個間隔，確定如圖5所示二硫化物橋形成的區域Ⅴ的位置，以及增強抗蛋白水解的保護作用。
為了確定恰當的截尾位置，在該完善受體的區域Ⅴ1中的膜觀測部分可以認為是無電荷占優勢的疏水殘基(例如圖6中的630-652)的延伸，而該疏水基在其前面接有帶電殘基(例如Lys629)，并且在其后接有一個極端基的順序(例如在圖6中的Arg-ALa-Arg-His-Arg)。這種膜觀察部分，也包括該分子的C-末端細胞質尾，都通過截尾加以刪除。
在一個特殊的實施例中，截尾是通過合成一種16鏈節寡聚核苷酸來實現的，該寡聚核苷酸為在三個閱讀基因內部具終止編碼TAG的ACTAGTCTAGACTAG。該寡聚核苷酸是一種旋轉對稱并且自體雜交。所生成的雙顯性組合被嵌入上述多聚-Ig cDNA(DNA位置1834，氨基酸554)。
更具體講，通過這種寡聚物編碼的這四個氨基酸(T-S-L-D)被加到區域Ⅴ的C-末端，結果截尾準確地出現在區域Ⅴ和Ⅴ1之間的過渡部位。為寡聚物嵌入而選擇的限定核酸內切酶位置是Sall位置，該位置是唯一的，并且靠近假設的自然斷裂位置(氨基酸563，597和605)。在區域Ⅴ中其他一些合適嵌入位置是在ASP(1827);KpnI(1831);AccI(1835)。在區域Ⅴ1中沒有合適的唯一位置。見圖13。
以上所述無性繁殖的多聚-Ig受體cDNA或所設計的(例如截尾的)多聚-Ig受體cDNA一般可以以本領域技術人員所熟知的各種各樣的表達系統中的任意一種來表達。例如，理想的表達系統是專門的分泌細胞(即天然分泌大量蛋白質的細胞)，例如成纖維細胞，包括中國田鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)表達系統。可以應用內分泌腫瘤細胞表達系統，例如ATt20細胞(ATCC CRL89和CRL1759)或PC-12細胞。Madin-Darby Ca-nine Kidney(MDCK)細胞也是一種理想的宿主細胞。是以上所引用的Mostov等人1984的著作。表達媒介物的選擇將取決于已選定的宿主細胞。
在一個實施例中，被截尾的多聚-Ig受體可以用永久不死的生成IgA的細胞，例如淋巴細胞-骨髓瘤融合物來表達。在這種情況，最佳的表達媒介物是這樣一種，即包括一種強的或可引發的啟動基因、增強病毒成分(即一種B-淋巴細胞專用的增強病毒例如μ-增強病毒或一種病毒或一種病毒原增強病毒)，一種被引入多聚-IgR-cDNA的所設計的中止編碼，這種引入是為了避免區域1-Ⅴ(SC)由細胞膜碇系(區域Ⅴ1-Ⅴ11)的蛋白水解分離的需要。專門的表達系統在下面加以敘述。
一般如圖10所述，表達媒介物可以是以下一些例子說明過的傳病媒介，這些例子是具有糖皮質激素響應成分的PLK-neo或hygro或PLM-neo或hygro，或是在其中糖皮質激素響應成分被除去的或已被以下成分所取代的同樣的傳病媒介，這些成分是μ-增強病毒成分，PAKR-μ-neo和PSV40-μ-neo。傳病媒介可以包括以下成分。
1)一種用于開始該cDNA轉錄的合適的啟動基因。由反轉病毒(retroviruses)制取的LTR′S是適用的，包括由腎腺瘤分離出的LTR，如williger等人在J.Virol.601-11(1986)所述。該腎LTR共享具有以乳房腫瘤分離出的LTR的同系物，該同系物在U3區有某些差別。兩個LTRs具有一個糖皮質激素響應成分，該成分提供了轉錄的激素刺激作用。例如，糖皮質激素(地塞米松，Sigma公司，St.Louis，Mo)使被截尾的多聚Ig受體的轉錄作用增加了10-50倍。由一種無性繁殖傳病媒介(PLK或PLM，由瑞士癌癥研究院的HeidiDiggelmann博士提供，在該院的一個組制成了這種質粒，見前面引用的Williger等人著述)借助于順序的PStl，S1和BamH的菌致分解物回收的腎的或乳房的LTR被嵌入一個PSV2neo傳病媒介(可通過Biolabs買到)，該傳病媒體利用EcoRI，SI和BamHI菌致分解物進行上述的順序的菌致分解(除去SV40啟動基因并用LTR啟動基因取代它)。(圖6B)。通過在新霉素抗病性基因(IB)的位置引入濕霉素抗病性基因構成PLK-hygro或PLM-hygro傳病媒介。我們已經存放質粒PLK-neoPIR11，它帶有ATCC，Rockville，Maryland，在登記號ATCC40787之下。那種質粒是圖10所示的PLKneo質粒，它帶有嵌入在該質粒的BamHI位置的被截尾的多聚免疫球蛋白受體編碼的DNA(圖8)。
2)增強轉錄作用增強病毒成分，并因此增強被截尾的多聚-Ig-受體的生成。這些成分包括病毒成分(SV40，MMTV的糖皮質激素響應成分)或哺乳動物組織專用的增強病毒，例如可以對B細胞中的Ig的高表達式響應的μ增強病毒。由包圍μ重鏈基因座的一種鼠染色體組織無性繁殖系回收的μ增強病毒(Mercola，M，Wang，X.F.，Olsen，Y，and Calame，K.1983，Science221663-665)可以嵌入各種啟動基因的位置之前。
3)一個傳病媒介主鏈大分子，包括可選擇的標記(例如一個新霉素或濕霉素抗病性基因)，一個在一個帶有一個抗體性基因E.Coli中的起源。
4)多聚-Ig-受體-編碼cDNA。
5)一個在每一個閱讀基因中都含有中止編碼，例如AC-TAGTCTAGACTAGT的合成寡聚物。
在圖11中提供了關于這種傳病媒介結構的更多的細節。PSC-1的cDNA被引入Southern和Berg在J.Mol.Appl.Gen.1327-341(1982)中所描述的表達式傳病媒介PSV-2中。該結構被稱PSV2-SCl。
所得到的傳病媒介被轉染進入骨髓瘤細胞中并將這些細胞分離以顯示被截尾的多聚-Ig受體的有效的表達式。標準的電多孔(eletroporation)技術被用來影響這種轉染。
尤其是細胞從生長介質(每個樣品2×106)中采取并使之離心沉積(5×1000rpm)。這些細胞出自處于30-70%融合性的狀態的培養液，并且該介質應該在前24小時加以改變。在冷芷溫度下(冰浴)，用電多孔介質(RPMI2mM谷氨酰胺和帶有penstrp
的0.5%胎兒小牛血清)洗滌該細胞。將該細胞加以計數并在2×106/0.75ml的電多孔介質中重新使之懸浮。將大約45-50μl的線性化的DNA(10μg線性化和重新懸浮在45μl磷酸鹽緩沖鹽水中)加入到在一個電多孔小杯中的一份(0.75ml)該細胞的懸浮物中。將該小杯在冰上存放15分鐘，并將該混合物加以攪動。然后，將這些細胞放入經過調節的RPM1或Eagle介質中并加以選擇。
所述受轉染的骨髓瘤細胞表達并分泌所述被截尾的多聚-Ig受體。在對照中骨髓瘤細胞不能分裂和分泌這種完整的受體。該被截尾的多聚-Ig受體從該骨髓瘤培養液懸浮在上層的物質中通過硫酸銨沉降和膠體過濾加以分離和提純。
在下面要作盡詳細地敘述的一個特別好的實施例中，該被截尾的多聚-Ig受體是在一種雜交腫瘤中產生的，該雜交腫瘤被選中是因為它能產生一種理想的多聚-IgA。
在這樣一個系統中，在該活的細胞中形成將該被截尾的受體與該多聚-Ig連接起來的共價二硫鍵，并且所產生的穩定的分泌物Ig復合物被分泌出來。這種系統可以按以下方式之一構成或者通過使骨髓瘤細胞轉染，這種細胞將用作融合配偶以使產生多聚-Ig-產生B細胞永遠繁衍;或者通過使雜交腫瘤轉染，這種雜交腫瘤已制造出來并且為了產生理想的多聚-Ig進行了篩選。在這兩種情況中的任一處情況下，都產生了所要生成的共價二硫化物鍵。
SP-20或P3×63/Ag8V.1骨髓瘤細胞(ATCC CRL1581，CRL8287，CRL1597)的轉染是利用PLK表達式傳病媒介來進行的，在該傳病媒介中所述多聚-Ig受體的cDNA轉錄作用是處于控制腎MMTV LTR啟動基因的條件。見williger et al.J.Virol-ogy 601-11(1986)。充分的轉錄是通過用10-6M地塞米松對轉染的細胞進行不少于12個小時刺激獲得的。
用于產生穩定劑蛋白質的另一種系統涉及使一個用于表達所述完整的多聚-Ig受體的表達式傳病媒介轉染到一個哺乳動物上皮細胞的碇系依賴細胞(anchorage-depenclent cell)線中，該細胞線在一種多孔基底上形成一個單層。一種特殊的這類細胞線是用一個表達如上所述的多聚-Ig受體的傳病媒介轉化了的MDCK細胞線。尤其是含有糖皮質激素LTRk的PLK-neo-ScII傳病媒介可以使用。也可以使用其他適合的形成單層上皮宿主細胞。潮霉素抗病性基因是可以買到的，如Bloechliner和Diggel-mann在Mol.Cell.Biol.42929-2931(1984)中所述。
一般說來，被轉染的細胞線在一多孔基底，例如涂有骨膠原的過濾器(即通過性能良好過濾器，0.45μm，4.7cm2)上生長成為一個單層。見Steele et al.，Am.J.physiol.251C136-C139(1986)。這些細胞將成為帶有底部和頂部膜的不對稱細胞。布置有膜和單層是為了將一個容器分成底部介質和頂部介質。由于這些細胞趨向于從底部介質中滋養，該介質應該具有保持細胞生長所必須的營養物質。在該頂部介質中對營養物的較少需要。
有利的是這些細胞將利用重組多聚-Ig受體，以便從底部介質中取出多聚-Ig并把它轉移到頂部膜中，在膜中該受體被酶促分裂，產生與該穩定劑蛋白質共價結合的穩定的多聚-IgA。通過在那種介質中培養產生IgA的雜交腫瘤的方式將多聚-IgA補充到所述底層介質中。換句話說，從一種單獨的雜交腫瘤培養液中回收(例如親合力提純)的多聚-Ig可以加到該介質中。
穩定的多聚-IgA可以再一次通過親合力提純或其他標準抗體分離方法從該上層介質中加以回收。該上層介質可以保持與蛋白質雜質完全分離以簡化提純。
產生IgA的雜交腫瘤的構成和篩選本發明的另一方面是容易形成多聚-Ig抗體和對多聚-Ig(特別是IgA)抗體篩選的能力，該抗體經受得住選擇的感染，特別是由能通過粘膜表面進入人體的病毒和細菌病原體的感染。本發明的這個方面還包括形成抗精子表面成分的多聚-Ig抗體和對能提供避孕保護的抗體篩選的能力。它還進一步包括形成和篩選抗食物和空氣中傳播的過敏原的多聚Ig抗體。
在本發明的這一方面，將一個受控制的多聚Ig抗體源提供給一個宿主動物，例如，將分泌多聚-Ig的雜交腫瘤細胞植入一個宿主動物，在動物身上它們發育成為腫瘤。由這腫瘤所產生和釋放的多聚-Ig進入到動物循環系統中，循環的二聚單克隆IgA從有漏隙的毛細管出來進入粘膜組織，在那里它們被上皮細胞受體識別并被連接，被轉移到帶有內分泌成分的分泌物中。雜交腫瘤細胞的腹膜(腹水)腫瘤(這是已知的)可能引起腸內不希望有的病理變化和在浸泡所述腸的腹膜液中引起特別大量的非分泌IgA。因此，分泌IgA的雜交腫瘤的最佳位置是皮下的，例如在上背部。
產生IgA的雜交腫瘤是使一種抗原敏感B淋巴細胞持續繁衍產生的，即從口或粘膜免疫后的Peyer斑(PP)中收集的。見Weltzin et al.J.Cell.Biol.1081673-1685(1989)。用于使產生IgA的細胞持續繁衍的骨髓瘤細胞各處都可以買到。可以利用標準的溶合約定。
特別是為了指定的IgA的生產，根據以下專門的例子來產生和試驗雜交腫瘤。
各種標準的方法可以用于免疫試驗動物以生產抗原敏感雜交腫瘤結構的B細胞。見以前所引用的Wiltzin等人的著作。一種特殊的方法涉及應用羥磷灰石(HA)微粒作為口服引入機體的抗原的載體。在由Amerongen、Nautra，weltzin和Kraehenbuhl與本申請同時提出的共同擁有的題目為《羥磷灰石-抗原共軛體和用于產生一種多聚-Ig免疫反應的方法》的專利申請中公開了關于制備適用于粘膜免疫的抗原-HA配合的過程的細節。因而，該申請被引用作為參考文獻。
適用于通過上皮(例如一般小于0.1μm)傳遞的HA微晶體被涂復用抗原的浸透，并在一個用于粘膜給藥的適合的載體(例如一鹽溶液)中化合。對于25g小鼠的口服免疫，將在200μlPBS中的小量(eNgN，30μg)蛋白質同適量(例如每30μg蛋白質1mgHA)的經過予先的超聲處理的和洗滌的HA相混合。該混合物在4℃下攪動一小時，然后將HA通過在一個微型離心機(mi-crofuge)中以10000rpm轉速旋轉2分鐘來將HA弄成小球。該小球加以洗滌和旋轉或超聲處理，以使之重新懸浮在200μl含有0.1M(更少)NaHCO3(碳酸氫鈉，用于中和胃酸)的水中。用于口服免疫的給藥溶液可以調整以避免高鹽情況，該情況有助于從HA中釋放該蛋白質。
其他適用于對動物進行免疫試驗以提高粘膜免疫反應的方法對本領域技術人員來說是已知的，并且這些公知方法也適用于在本發明中使用。
在一個特殊的用以產生分泌IgA的雜交腫瘤的方法中，從進行免疫試驗的動物身上分離出PP單核細胞。特別是8-10PPS的粘膜或粘膜下層被除去，并在含有0.1%膠原酶的完全的RMPI介質中在37℃下培養1小時。組織在二個無菌的冷凍端顯微鏡導軌端部之間被粉碎，所釋放出的細胞在完全的RPMI中洗滌兩次，從一個小鼠中大約可收集2-3×107個能存活的PP單核白細胞。
骨髓瘤細胞和小鼠單細胞用無血清的RMPI洗滌兩遍，并融合于37%聚乙二醇4000(E.Merck，Darmstadt，FRG)中，白血細胞與骨髓瘤細胞之比為5∶1。在融合后，這些細胞在完全的RPMI中被稀釋為1×106細胞個數/ml，并放入96個穴的組織培養液盤中，該營養液盤在24小時之前每穴用2×104個被紫外線照射(800rads)的小鼠腹膜滲出液細胞接種過。雜交腫瘤是用標準方法在次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷中選擇出的。
產生定向針對所希望的抗原或細胞的IgA抗體的雜交腫瘤是用標準的篩選方法來鑒別的。
所生成的雜交腫瘤細胞例如在RMP11640被壓成小粒的培養液介質中培養，使之重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中并加以計數。細胞密度被調整為每0.5ml為106個細胞。將懸浮細胞(在0.1至0.5ml中有106個)通過皮下注射于BALB-C小鼠上背部。硬瘤在注射后1至3周之間出現。當該瘤達到3-5mm予計的直徑時通過尾部放血采集血清樣品。ELISA被用來測定血清IgA。具有與植入雜交腫瘤相同特性的分泌物IgA在腸內洗滌物和在奶中加以測量，還是使用ELISA。其他粘膜分泌物(例如從口腔/鼻腔的上皮和腺中，從呼吸系統和生殖系統中分泌出的分泌物)也可能含有這種特殊的分泌物IgA。
然后這些產生腫塊的小鼠就被用于“免疫性”試驗，在該試驗中流出的病毒或細菌病原體通過口腔或其他粘膜表面引入，或者在該試驗中將精液或精子從陰道中引入。分泌有用IgA的雜交腫瘤被從顯示抵抗這種免疫試驗的保護作用的小鼠身上被鑒定出來。這些試驗可以用來專門鑒別最適合于被動免疫保護或人或其他動物避孕的分泌物IgA(見下面)。例如，在鑒別適用的分泌抗-V.Cholerae雜交腫瘤時，在出生的那天就給新生的小鼠接種，以便在這些新生小鼠自動產生抗霍亂抗病性之前進行篩選。
以上試驗可以用于新生期保護試驗，在該試驗中雜交腫瘤在三周妊娠期的第一或第二周被植入懷孕的BALB/C小鼠身體內。在懷孕期間腫瘤長起來，循環的產自腫瘤的二聚物IgA充分地被乳腺上皮細胞輸出并作為分泌物IgA被排放到初乳和以后的乳液里。新生的小鼠從出生就吸收SIgA。在需要持續不斷地供給這種IgA的場合，可以利用多個哺乳雌鼠。
一旦利用以上所述的活體內的檢測方法鑒別出IgA單克隆抗體是保護性抗體，就要在直接或被動應用于粘膜表面之后就它們的保護能力對它們進行試驗。在這些試驗中，帶有或不帶穩定劑蛋白質的多聚-IgA可以在培養液中產生(如前所述)，并且被加到以前所列的那些器官系統的粘膜表面。
本發明這一方面的一個特別重要的特征就是在接受者體外，在粘膜表面上IgA作用。因此，該IgA不需要是與接受者的系統免疫相容的;它只需到達接受者的粘膜表面并且充分地阻止病原體進入。
本發明特別有用的是提供保護抵抗Pseudomonas aeruginosa，Hemophilus influcnzae，Vibril cholerae，Bordetella Pertussis，Corynebacterium diphtheriae，Escherichia Coli，Salmonella typhi以及typhimurium，clostridium perfringens和其他腸的clostridiae，Shigella dysenteriae，Shigella flexmerii，Neisseria gonorrheae，Tri-chomonas，Entameba histolytica，Giardia lamblia，Streptococcus，呼吸多核體病毒，旋轉病毒(rotavirus)，呼吸道腸道病毒，人類(Human)免疫缺乏病毒，人類(Human)T-細胞親淋巴性病毒，Ⅰ型和Ⅱ型，脊髓灰質炎病毒，鼻病毒，流感病毒，皰疹病毒，人類乳頭狀瘤病毒;AIDS2·病原體，例如Pneumocystis，以及酵母，例如串珠菌屬。本發明對于提供保護抵抗接觸呼吸或消化粘膜表面的變應原也是很有用的。它還對于提供保護避免因為陰道里的交聯精子而懷孕以及防止精子通過子宮頸和子宮的運動是很用的。
在每一種情況，一種合適的已知的抗原，例如整個病原體或特殊的從外部給予的抗原-例如病毒外殼蛋白，或細菌細胞表面蛋白，菌毛蛋白，脂多糖，病毒衣殼或包膜蛋白，原生動物原生質膜表面成分，精子表面蛋白，或呼吸變應原都可以使用。也可以使用類毒素，例如CRM-197，以及Uchida et al.在J.Biol.Chem.2483838-3844(1973)中所報導的鈍化的diphtheria毒素。根據以上的方法來使用該抗原，以產生分泌所要求的保護性抗體的雜交腫瘤。就象剛才那幾個例子一樣，WO88/08437(在這里被引用作為參考文獻)公開了適于形成抗-V.Cholerae單克隆多聚-Ig抗體的一種tcPA菌毛蛋白。美國專利4725669公開了適用于形成抗-HIV多聚-Ig單克隆抗體的HIV(HTLV-Ⅲ)被膜糖蛋白。以下專利和專利申請公開了關于具有抵抗鏈球菌感染，特別是B組Streptococcus的感染的保護作用的抗原的制備方法。這些專利和專利申請包括U.S.pat.4367221，4367222，4367223，4356263，4207414(RE31672)，以及WO87/06267。
一個抗V.Cholerae脂多糖的適用的IgA單克隆抗體是由雜交腫瘤2D6產生的，存放ATCC，Rockville，MD，登記號為ATCCHB10420。
另一些適用的抗原在以下文件中被公開，該文件是Bacte-rial Vaccines and Local Immunity Proceedings of the Sclavo Interna-tional Conf.，Siena，Italy 17-19November 1986。適用于HIV抗原的特殊的試劑在下述文件中被公開，該文件是AIDS Research and Reference Reagent Program，National Institute of Health，June1989。例如，gP120是Micro Genesys，Inc.出售的。精子細胞表面抗原，例如LDH-C4，也是公知的。例如見Shaha et al.and Tal-war et al.Vaccine 797-100(1988);以及Shaha et al.Int.J.An-drol.11479(1988)。
為實施本發明在選擇抗原中特殊含義在于粘膜保護涉及到交聯以防止進入人體，并且這種機理不需要所述多聚物抗體殺死或“中和”所述病原體。相反，系統的(IgG)保護涉及鍵合，這種鍵合為了更有效一般必須中和所述病原體。因此，沒有任何與所述病原體鍵合的IgG抗體是保護性的，如同用以下這樣單克隆抗體的例子所說明的那樣，這種單克隆抗體專門與Vibrio cholerae鍵合，但是沒有中和這種病原體，中和的意義指的是防止它移植、生長和在它的宿主中出現臨床癥狀。因而，為提高保護性IgA抗體的可得到的抗原和決定體的全領域被有效地增加了。
被動免疫保護用以上方法鑒別為分泌保護性多聚-Ig的單克隆抗體的雜交腫瘤是用已知的技術培養的，而該抗體利用特殊的免疫吸收法分離并加以收集。
被截尾的Ig受體復合物是通過以下兩種方式之一提供的，或是如上所述通過用一種表達傳病媒介轉化所述雜交腫瘤，或是通過單獨表達所述Ig受體并利用以上所述的單層培養技術將它加到所述單克隆抗體中。
所生成的穩定的單克隆抗體被配成為一種“被動”疫苗，這種疫苗被直接給予預計要用流出的病原體進行免疫試驗的粘膜表面。
專門的載體和該復合物的給藥途徑將依據病原體而變化。口腔給藥一般是利用緩沖鹽溶液來完成，或者在需要時為了保護該復合物抵抗胃和胰的蛋白酶而用膠束。鼻腔給藥是利用氣溶膠來完成的，眼睛給藥是用鹽溶液來完成。生殖器或直腸給藥是用凝膠、泡沫或栓劑來實現的。
本領域熟練的技術人員將會明白如何用已有技術來配制這些載體。
活性接種羥磷灰石配合抗原，例如以上所述用作雜交腫瘤融合配偶細胞的免疫試驗供體的那些抗原也可以用于活性接種。具體說，配合抗原被直接加到粘膜組織上，或者通過口腔(用膠束或其他傳遞載體)，鼻(用氣溶膠)或者通過直腸或陰道(用栓劑或其他載體)。
保存物申請人的代理人，哈佛大學的校長及其同事，指出以上所列舉的保存物，ATCC40787和HB10420是根據布達佩斯條約的條款同American Type Culture Colleetion(ATCC)in Rockville，Maryland一起進行的。他們還進一步指出ATCC是一個提供永久性保存的保管機構，如果一個專利被批準，公眾很容易與之接洽。一旦一個專利被批準，對公眾獲得所保存材料的一切限制不可變更地都將取消。對于接受過根據37C.F.R1.15和35U.S.C.122規定，被授權的官員確定的審查人員，在該專利申請審查過程中這種材料也將可以得到。保存的材料在最近提出配制要保存的微生物樣品的要求之后至少保存五年，并且，在任何情況下，關于在保存日之后至少30年的期限或關于該專利的可實施期限，無論哪一個期限，取較長一個。申請人的代理人宣告它的職責是在該保管機構由于保存條件的原因不能提供樣品時更換保存物。
其他的體現在以下的權利要求書中。
權利要求
1.一種被充分分離的復合物，包括a)專門針對一選定的抗原或抗原族的多聚一lg；以及b)一種包括多聚一lg受體的多聚一lg鍵合區域的重組穩定劑蛋白，所述穩定劑蛋白實質上沒有任何C一末端轉移膜和細胞內多聚一lg受體區域；所述復合物的特征在于同未復合的多聚一lg相比較具有蛋白水解穩定性，所述復合物進一步的特征還在于該多聚一lg的專門的鍵合性能和免疫保護性交聯性能。
2.一種被充分分離的復合物，包括a)一種專門針對一選定的抗原或抗原族的單克隆多聚-Ig，以及b)一種包括一個多聚-Ig受體的多聚-Ig鍵合區域的穩定劑蛋白，所述穩定劑蛋白實質上沒有任何C-末端轉移膜和細胞內多聚-Ig受體區域;所述復合物的特征在于同未復合的多聚-Ig相比較具有蛋白水解穩定性，所述復合物的進一步的特征還在于該多聚-Ig的專門鍵合性能和免疫保護性交聯性能。
3.根據權利要求2所述的被充分分離的復合物，其特征在于所述穩定劑蛋白是一種重組蛋白。
4.根據權利要求1或2或3所述的被充分分離的復合物，其特征在于所述的多聚-Ig和所述的穩定劑蛋白是通過二硫鍵共價結合的。
5.根據權利要求1或2所述的被充分分離的復合物，其特征在于所述多聚-Ig是多聚-IgA類抗體。
6.根據權利要求1或2所述的被充分分離的復合物，其特征在于所述穩定劑蛋白包括多聚-Ig受體的區域Ⅰ和區域Ⅳ和Ⅴ中的至少一個，并且所述多聚-Ig穩定劑被截短，實質上失去了區域Ⅵ。
7.根據權利要求6所述的被充分分離的復合物，其特征在于所述穩定劑蛋白的所述區域Ⅰ和所述區域Ⅳ或Ⅴ之間有一段相應于大約100-500個氨基酸順序的距離。
8.根據權利要求1或2所述的復合物，包括一個單克隆IgA抗體，該抗體專門針對一個選自以下一組抗原中一個抗原，這組抗原包括Pseudomonas aeruginosa，Hemophilus influenzae，Vibriocholerae，Bordetella pertussis，Corynebacterium diphtheriae，Es-cherichia coli，Salmonella typhi以及typhimurium，Clostridium per-fringens以及其他腸的clostridiae，Shigella dysenteriae，Shigella flexnerii、Neisseria gonorrheae，Trichomonas，Entameba histolytica，Giardia lamblia，Streptococcus，呼吸多核體病毒，旋轉病毒(ro-tavirus)，呼吸道腸道病毒，人體(Human)免疫缺乏病毒，人體(Human)T-細胞親淋巴性病毒，Ⅰ型和Ⅱ型，脊髓灰質炎病毒，鼻病毒，流感病毒，皰疹病毒，人類乳頭狀瘤病毒;Pneumocystis;酵母，以及精子抗原。
9.重組多聚-Ig穩定劑蛋白，包括多聚-Ig受體的一個多聚-Ig鍵合區，所述穩定劑蛋白實質上沒有任何C-末端轉移膜和細胞內多聚-Ig受體區，所述穩定劑蛋白具有與多聚-Ig形成復合物的特性，該復合物是蛋白水解作用穩定的并且具有該多聚-Ig的免疫保護性交聯性質。
10.一種用于制造權利要求4的復合物方法，包括以下步驟a)提供一種設計用來生產所述穩定劑蛋白質的細胞，所述細胞還能產生專門針對所述選定的抗原或抗原族的單克隆抗體;b)培養所述細胞以產生所述復合物;以及c)收集所述復合物。
11.一種用于制造權利要求2的復合物的方法，其特征在于所述多聚-Ig和所述穩定劑通過二硫鍵共價結合，包括以下步驟提供設計用于產生多聚-Ig受體的碇系依靠上皮細胞;在一多孔支承體上形成所述細胞的一個單層的條件培養所述上皮細胞，所述多孔支承體和形成的單層使在該單層底側的第一層介質與在該單層頂側的第二介質分隔開;將單克隆IgA引入該單層的底側;從所述單層的頂側收集所述復合物。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述第一介質是適于維持所述上皮細胞生長的營養介質。
13.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述第二介質實質上不含與收集所述復合物干擾的蛋白質。
14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述單克隆IgA是通過在所述第一介質中同時培養雜交腫瘤細胞來引入所述第一介質的。
15.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述單克隆IgA首先在雜交腫瘤培養液中產生，然后將其與所述培養液分離，再往后被引入所述第一介質。
16.一種用于檢測單克隆多聚-Ig以確定抵抗病原體或抵抗在體內懷孕的保護性的方法a)將所述單克隆-Ig引入對該病原體敏感的一種哺乳動物的循環系統中。b)檢測所述哺乳動物的粘膜分泌物中的多聚-Ig;c)用所述病原體或精子對所述哺乳動物的粘膜表面進行免疫性試驗。d)確定抗該病原體或精子免疫性試驗保護性。
17.根據權利要求16所述的方法，其特征在于所述單克隆多聚-Ig是通過向循環系統注射或灌注引入該哺乳動物的。
18.根據權利要求16所述的方法，其特征在于所述單克隆多聚-Ig是通過皮下植入產生該單克隆多聚-Ig的腫瘤或腫瘤細胞引入該哺乳動物的。
19.一種用于保護哺乳動物抵抗病原體或避孕的方法，包括將權利要求1-3中的任意一種復合物給藥所述哺乳動物的一種粘膜上。
20.權利要求19的方法，包括將該復合物通過口、鼻、陰道、直腸、眼睛，或通過中耳給藥。
21.權利要求19的方法，包括第一個哺乳動物的粘膜分泌物中產生所述復合物，并將所述粘膜分泌物給予第二個哺乳動物。
22.權利要求21所述的方法，包括通過口腔將含有所述復合物的來自第一個哺乳動物的奶供給第二個哺乳動物。
23.權利要求21或22的方法，包括提供一種產生多聚-Ig的傳諸永遠的免疫細胞，將所述多聚-Ig引入第一個哺乳動物的循環系統，并從第一個哺乳動物身上收集粘膜分泌物。
24.一種培育產生單克隆多聚-Ig抗體的雜交腫瘤的方法，包括用一種抗原對一種哺乳動物進行免疫試驗，從該哺乳動物Peyer斑粘膜或淋巴組織豐富的其他粘膜上收集淋巴細胞并將該淋巴細胞融合到骨髓細胞中以形成雜交腫瘤。
25.根據權利要求24所述的方法，其特征在于通過將所述抗原加到該哺乳動物的一種粘膜表面對該哺乳動物進行免疫試驗。
全文摘要
多聚-Ig抗體(特別是單克隆IgA抗體)同一種由該多聚-Ig受體衍生的穩定劑蛋白(特別是一種重組受體-衍生穩定劑蛋白)相復合，它包括至少該受體的一種多聚-Ig鍵合區，并且實質上沒有任何C-末端轉移膜或細胞內多聚-Ig受體區。該穩定的復合物可以用作被動疫苗給藥到粘膜表面。還公開了一些用于在活體中篩選單克隆多聚-Ig的方法。還公開了一些利用設計用來制造多聚受體的碇系，依靠上皮細胞單層產生該復合物的方法。通過從淋巴細胞豐富的粘膜組織(例如Peyer斑)收集淋巴細胞來制取用于產生單克隆IgA的雜交腫瘤。
文檔編號C12R1/91GK1057785SQ9110335
公開日1992年1月15日 申請日期1991年4月15日 優先權日1990年4月16日
發明者讓-皮埃爾·克雷亨布爾, 理查德·A·韋爾齊恩, 瑪麗安·R·紐特拉 申請人:哈佛大學校長及研究員協會, 瑞士癌病實驗研究院