糖化物及其合成方法和設備的制作方法

專利名稱：糖化物及其合成方法和設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及諸如低聚糖、多糖、糖脂及糖蛋白之類的糖化物，更具體而言，本發明涉及利用酶催化工藝制備上述各種糖化物的方法。
“碳水化合物”一詞包括通式(CH2O)n的各種化合物，例如單糖、雙糖、低聚糖以及多糖。低聚糖其鏈由糖化物單元，亦稱糖基組成。這些糖基單元可以以任意順序排列，且兩個糖基單元間的連接鏈可以是大約十種不同方式中的任一種。由此，可能存在的立體異構低聚糖鏈的數量是非常多的。
在所有生物聚合物族中，人們對低聚糖和多糖的研究最少，這在很大程度上是由于這些復雜的糖鏈其排列與合成均十分困難所致。盡管低聚核苷酸和多肽的合成已獲成功，但目前仍無法應用于合成低聚糖的合成工藝。
許多古老的碳水化合物合成工藝已得到發展，但這些工藝面臨著要求選擇性保護和脫保護的困難。另外，許多糖苷鍵的不穩定性，實現區域選擇配糖體時的困難以及合成產率低這些因素阻礙了低聚糖的有機合成。這些困難再加上分離提純碳水化合物以及分析其結構上的困難，使得對這個化學領域有了十分強烈的要求。
人們對碳水化合物以及各種含碳水化合物片段的分子，如糖脂和糖蛋白已經作了很多研究工作，并且對于后者的研究興趣很高，因為已經知道蛋白質與碳水化合物之間的相互作用涉及到一系列的生物識別過程，包括受精、靶分子、細胞間的識別以及病毒、細菌和真菌的致病緣由。現已普通注意到了糖蛋白和糖脂中的低聚糖部份是細胞與細胞間、細胞與配位體之間、細胞與細外基質之間以及細胞與病原體之間的識別媒介。
這些識別現象很有可能受到具有同樣糖基序列的低聚糖以及與細胞識別有關的糖蛋白和糖脂中的活性部份的立體化學的抑制。據認為低聚糖與糖蛋白和糖脂競爭受體蛋白質上的接合點。例如，雙糖半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖是與肝細胞原生質膜中受體產生相互作用的糖蛋白的組份之一。因此，可以推斷它們能與潛在的有害組份競爭細胞接合點。低聚糖及其它糖化物能為藥物學、疾病診斷及治療學開拓新的前景。
對以低聚糖作為人類及動物疾病的治療藥劑已經作了一些努力償試，但它們的合成方法如上所述仍不可行。雖然按傳統的有機化學方法可以合成有限的幾種小分子低聚糖，但合成這些化合物的成本一般卻相當高。另外，合成立體定向低聚糖十分困難，而對某些糖，如唾液酸和巖藻糖來說由于它們的鍵極不穩定，即使合成了也毫無意義。要生產大量的各種用于藥物及治療目的低聚糖就要求有一些改進的能普通應用的低聚糖合成方法。
在一些實踐中，酶已被用于有機合成來替代較為傳統的工藝，如，酶被用作有機合成的催化劑。在這些領域中酶催合成反應的價值因反應加速且具有立體選擇性而得到確認。此外，現在有些工藝可以以較低的成本來生產某些酶并能改變它們的性能。
已有人提出用酶作為催化劑來合成碳水化合物，但迄今為止尚未發現以酶為基礎的工藝被用來合成一定規模量的低聚糖和其它復雜的碳水化合物。現已公認用酶作為催化劑來合成碳水化合物的主要限制因素是完成這些化合物合成所需的酶的能利用的范圍很窄，請參見Toone等人的“四面體報告”(Tetrahedron Reports)(1990)(45)175365-5422。
在哺乳動物體內，單磷酸及二磷酸核苷糖中的八種活性單糖組份給大多數低聚糖造成了合成障礙UDP-Glc、UDP-GlcUA、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、GGP-Man、GDP-Fuc和CMP-NeuAc。它們是Leloir途徑的中間體。絕大多數糖(如木糖、阿拉伯糖)和低聚糖是存在于微生物和植物中的。
有兩組酶與體內低聚糖的合成有關，Leloir途徑中的酶是最大的一組，這些酶將活性組份糖以磷酸核苷糖轉移至生長的低聚糖鏈上。而非Leloir途徑中的酶把活性碳水化合物單元以磷酸糖而不是磷酸核苷糖的形式來轉移。
對于體外酶催合成低聚糖已有兩種提議。(參見Toone等人的上述報告)，第一種建議方法是利用糖苷轉移酶，第二種是用糖苷酶或糖苷水解酶。
糖苷轉移酶催化使活性糖逐漸加到正在增長的低聚糖中的蛋白質或脂上，或者加到非還原端上。看來合成碳水化合物必須有大量的糖苷轉移酶。每種NDP-糖殘基都需要一種不同糖苷轉移酶，而迄今已證實的一百多種這類轉移酶的每一種只能催化形成一種縮水甘油鍵。到目前為止，人們還不知道糖苷轉移酶的更詳細的特征，例如什么樣的碳水化合物順序能被大多數這類酶識別尚不清楚。
Leloir途徑中的酶已開始應用于低聚糖的合成，這一方法要獲成功需兩個要素，即磷酸核苷糖的實際成本必須是可行的，糖苷轉移酶必須是能得到的。對于比較普通的NDP-糖，包括在哺乳動物體內生物合成中那些重要的NDP-糖來說，第一個問題已解決，但該技術卻受約于第二問題。至今只有非常少數的糖苷轉移酶是可得到的。因此，這些種類酶的獲取已是這類碳水化合物合成的唯一限制因素了。
已有報導說大多數糖苷轉移酶很難分離，特別是與哺乳動物源分離。這是因為這些蛋白質存在的濃度很低，并且是與生物膜結合在一起的。另外，盡管有少數幾種糖苷轉移酶被固定化，但已報導說這些酶不穩定。目前只有非常少數的糖苷轉移酶是可商購的，但這些材料是很昂貴的。
因此，人們迫切希望能進一步發展酶的基因工程(即克隆)，特別是自從已經克隆了幾種糖苷轉移酶，包括半乳糖糖苷和巖藻糖苷轉移酶以及唾液酸轉移酶后。人們還進一步希望克隆技術能加快其它糖苷轉移酶的克隆，并能提高它們的穩定性。
如此看來，由于低聚糖的潛在用途以及很難大量或不可能大量得到它們，因此，長期以來人們一直希望有生產低聚糖、多糖、糖蛋白、糖脂及類似物的通用合成方法，并且這些方法應是有效的、價格合理的、能立體定向的并能通用的。
本發明的一個目的就是提供糖化物，尤其是低聚糖、多糖以及含低聚糖單元的化學物質。
本發明的另一目的是提供廣泛的各種各樣的糖化物包括那些在自然界中尚未發現的。
本發明還有一個目的是提供能用來治療人及動物疾病的糖化物。
本發明再一個目的就是提供改進的制備糖化物的方法。
本發明的進一步目的是提供用于制備糖化物的酶促方法。
本發明還有一個目的是提供可獲得適用于合成糖化物的酶的方法。
本發明的另外一個目的是提供按本發明合成糖化物時所用的設備。
本發明的上述種種目的可以通過利用酶促方法生產低聚糖、多糖、糖脂、糖蛋白及其它糖化物得以實現。這些方法包括使預選糖基單元由給體向受體的酶促轉移。具有多個糖基單元的糖化物最好是通過逐步向受體部分附加糖基單元而制得，其中受體部分本身亦是按本發明方法制得的糖化物。
因此，所提供的制備糖化物的方法包括提供一受體部分，并使該受體部分與一種糖苷轉移酶接觸。制備糖苷轉移酶使之對受體部分具有專一性，并且能夠將糖基單元轉移至受體部分。本發明的這一方法要重復進行多次，因此，第一次重復的產物成為第二次重復的受體部分，如此類推。


圖1、2和3給出了按本發明方法用糖苷轉移酶催化合成糖化物所適用的設備。
在本文中，術語“糖化物”(Saccharide composition)是指在其結構中含糖基單元的任何化學物質。糖、碳水化合物、糖化物、單糖、低聚糖、多糖、糖蛋白及糖脂均屬糖化物之列，含有上述物質的混合物和溶液也屬于糖化物。
根據本發明，通過糖基單元由給體部分向受體部分的酶促轉移即可制得糖化物。應該注意到這種轉移是依受體和給體與糖苷轉移酶的接觸而發生的，并且典型的是導致受體與糖基單元立體選擇性共價結合，也就是只有一種異構體形式。
按本發明制備的糖化物能廣泛地應用于疾病診斷、治療及藥物中。用常規方法一旦確定了所要求標準的糖化物的糖排列順序后，一般即可做反向合成分析來確定適宜該糖化物的合成方案。這一合成方案最好與具體的給體、受體及產生要求的糖化物所必須的糖苷轉移酶一致。
本發明無需依賴基因工程的進一步發展來提供碳水化合物合成時所需的大量糖苷轉移酶。本發明靠的是如下的非同尋常的方法。在按照本發明的糖化物的合成方法中，預選擇的糖基單元首先在酶催化作用下連接到初始受體上，即蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂或碳水化合物原料上。隨后再通過酶催化作用使預選擇的糖基單元連接到如此逐步得到的產物上，從而形成了糖化物。
隨著每一預選擇糖基單元的連接，就獲得一種中間產物。本發明是基于發明人的如下發現而產生的在目的糖化物的合成過程中，合成的原料(即蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂或碳水化合物)和在合成過程中形成的每一中間產物能有助于獲得(對每一相應的合成步驟而言)一種專門催化下一中間產物連接的糖苷轉移酶。
因此，按照本發明，將任一給定步驟所需的糖苷轉移酶與中間產物(受體部分)分離，并將其用于將構成目標碳水化合物分子所必需的下一糖基單元連接到受體部分上。按照本發明，重復該過程，隨著每次重復，產生了下一糖基單元連接到被分離的正在增長的分子上時所需的專門糖苷轉移酶，直到獲得目標碳水化合物分子。
本發明還提供了可以使糖基單元與受體確能有效形成共價結合的反應條件及共試劑。
在優選實施方案中，受體可以是一種蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂或碳水化合物，如單糖、雙糖、低聚糖或多糖。在另一優選方案中，糖苷轉移酶負載于一固體載體上。
本發明的方法能夠立體定向地將糖基單元連接到受體部分上。一般說來，較好的是以核苷酸糖作為給體。因此給體最好包括以欲被供給的糖基單元為終端的磷酸尿苷、磷酸鳥苷以及磷酸胞苷材料。
因此，本發明還提供了制備對一具體受體專一并能轉移一預選糖基單元至該受體上的糖苷轉移酶的方法。這些方法包括將受體物質與認為可能含有一定量糖苷轉移酶的混合物接觸，同時使之處于能有效地使受體與對該受體專一的糖苷轉移酶結合的條件下。繼而分離出結合的糖苷轉移酶。最好通過基因工程技術排列糖苷轉移酶順序并使之產量得以提高。
被認為可能含某一所需糖苷轉移酶的混合物可按如下方法進行證實，對于最普通的糖苷鍵來說，糖苷轉移酶的活性已在公開出版物上作了描述。對于象乳低聚糖或典型的(亦即一般的)糖蛋白和糖脂中的碳水化合物組分確實如此。對于還未很好描述的那些鍵，首先可以注意組織、器官、食物有機體，從中找到有關鍵。通常，如果在一特殊物源上發現了鍵，那么作用于該鍵的酶也必定存在于該物源上。
如果僅有一種糖化物結構，而不是一種物源，可以采用最靈敏的篩選分析來試驗幾例很可能含該種糖化物結構的生物體。例如，如果化合物含艾杜糖醛酸、N-乙酰氨基半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖，可以試驗一下脊柱動物的有關組織。如果目的化合物含阿比可糖，可以試驗一下細菌和植物以便發現適當的糖苷轉移酶的存在。
按照本發明可以采用的各種探測糖轉移酶的分析方法已經公開，具體說明如下Furukawa等人在“生物化學雜志”(1985，227573-582)上描述了一種由發明人開發的用硼酸鹽浸漬的紙電泳分析及熒光分析法(圖6)。Roth等人在“Exp′l Cell Research“(1983，143217-225)上公開了應用硼酸鹽分析經色譜分析后的葡糖醛酸基轉移酶。Benau等人在“J.Histochem.Cytochem.”(1990，38(1)23-30)上披露了一種基于重氮鹽被NADH還原的組織化學分析方法。
含所要糖苷轉移酶的物源一經發現，即可均質該物源。利用親合色譜，以受體物質作為親合配位體從均漿中提純出酶。也就是說，讓均漿通過固定化的固體基質，而其中受體物質處于能使糖苷轉移酶結合在其上的條件下。然后，洗滌結合有糖苷轉移酶的固體載體基質。隨后，通過洗脫，將糖苷轉移酶由固體載體基質中解吸出來并收集之。正如所知的那樣，吸收的糖苷轉移酶可被洗脫，如使用鹽(如NaCl)水溶液通過固體載體基質。
在本發明的實際實施中，通過親合色譜從均漿中提純的，并用于使預選糖基單元結合到受體上的“酶”是一種包含各種糖苷轉移酶的混合物，所說的各種糖苷轉移酶已經從均漿中存在的其它含可能干擾所要求的提純后的糖苷轉移酶活性的酶的生物材料中分離提純出來。因此，用于本發明的糖苷轉移酶通常是各種“糖苷轉移酶”的混合物。如果需要，上述材料可以進一步分離提純為純的單一的糖苷轉移酶來用于本發明，但通常進一步提純是不必要的。
根據本發明，提供的受體能與預選的糖基單元形成共價結合，有代表性的受體物質包括蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂和碳水化合物。應該注意到受體物質最好以所要糖化物的結構組份存在。例如，在制備N-乙酰神經氨酰α2-3半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖這樣的糖化物時，優選的受體應該是N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖。此外，還應注意末端為糖基單元的受體，繼后的糖基單元一般將以共價健結合到末端糖基的非還原端。
被轉移至受體物質上的糖基單元是由給體物質提供糖基單元的。本發明的給體物質包括待轉移的糖基單元，并且當與受體和適當糖苷轉移酶接觸時能向受體提供糖基單元。優選的給體物質有核苷酸糖，如末端糖基化的磷酸尿苷、末端糖基化的磷酸鳥苷以及末端糖基化的磷酸胞苷。
應該知道，優選的給體物質應當與受體和糖苷轉移酶接觸時能很容易地向受體提供它們的糖基單元成份。例如，向N-乙酰氨基葡萄糖轉移半乳糖，二磷酸尿苷半乳糖是優選的，而向半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖轉移N-乙酰神經氨酸、唾液酸，單磷酸胞苷N-乙酰神經氨酸才是較佳的。
受體與給體相一致對制備糖化物來說是必要的，應該為每一受體/給體對制備一種糖苷轉移酶。本領域的技術人員應知道糖苷轉移酶可以廣義地定義為能促使糖基單元由一化學物質(在此稱為給體)向另一化學物質(在此稱為受體)轉移的酶，它是根據糖基單元轉移這一現象而命名的。所以說，半乳糖苷轉移酶轉移的是半乳糖，而巖藻糖苷轉移酶轉移的是巖藻糖。
根據本發明，糖苷轉移酶是那些能有效將預定的糖基單元轉移至受體物質上的酶。糖苷轉移酶最好是對受體專一的，或至少是有效的、有活性的、或有暴露部分。糖苷轉移酶的專一性可通過以下方法證明當發生接觸或類似這種情況時，具有與受體上一特定順序片段發生結合的傾向并能轉移一特定糖基單元至受體上，即證明了專一性。
目前，糖苷轉移酶只能由天然來源中獲得，因此，其數量是比較有限的。已知的具有高度專一性的糖苷轉移酶轉移糖基單元的化學識別和繼后對受體的連接的立體化學兩方面來有效地轉移糖基單元。例如，已知一種N-乙酰神經氨酰轉移酶能夠將N-乙酰神經氨酸轉移至僅帶有一個半乳糖基的受體上產生在N-乙酰神經氨酸基和半乳糖基間為α2-3鍵合的糖化物。
因此，本發明允許的是在自然界中已發現的糖鍵結構。例如，半乳糖與N-乙酰神經氨酸間的α1-2鍵在自然界中尚未發現，目前可能是無用的。所以，本文中所描述的方法是利用可以獲得的任何種類的糖苷轉移酶。
雖然，很多糖苷轉移酶的作用是已知的，但多數目前尚未完成定性。然而通過本發明提供的方法，所有能夠實施的糖苷轉移酶都可以被驗證和制備。現已發現，受體物質能夠作為親合色譜介質來分離那些能夠轉移特定糖基單元的酶，由此合成其它糖苷。
在一優選實施方案中，受體物質被固定化，如固定在一固體載體上。請注意術語“固體載體”還包括半固體載體。一經固定化后，受體即與被認可可能含糖苷轉移酶的混合物，如含自然存在的細胞均漿接觸。由于固定化的受體將與對其專一的酶結合，那么可以監測該系統中的結合受體的酶。
對結合受體的酶的監測可以按下述方法進行讓細胞均漿通過固定化的受體。該步驟可以這樣完成，如使細胞均漿通過一載有固定化受體的柱子，然后洗滌柱子，測定通過載有固定化受體柱子的蛋白質的量，當再也測不出蛋白質的時候，讓鹽水洗脫液流過柱子以便洗脫出酶來。然后分析獲得的洗脫液確定糖苷轉移酶的存在。可以采用的分析方法在上面已提到，也就是Furukawa等人、Roth等人和Benau等人所給出的方法。
如果酶與受體物質沒有發生結合(即洗脫分析未顯示出糖苷轉移酶的存在)，那么，可以下結論說該混合物內不含對這一特定受體專一的酶。然后再讓其它混合物，如動物和/或植物細胞均漿的混合物與受體物質接觸，直到觀察出有結合的酶。
當受體物質與酶結合時，分離出這一品種，作進一步研究。在一優選實施方案中，讓受體與侯選的酶再次接觸，但這次是在有給體存在的情況下接觸，所說的給體含有要求被轉移至受體的糖基單元。如果上述接觸導致了糖基單元向受體轉移，那么，該酶即是能用來實施本發明的糖苷轉移酶。
一旦確定了糖苷轉移酶，就可以按本領域技術人員已知的技術來確定它的排列順序和/或復制它。例如，通過重組技術可以完成復制，所說的重組技術包括分離糖苷轉移酶的基因密碼材料，并制備能生成糖苷轉移酶的永遠細胞線(immortal cell line)。復制技術將證明工業規模生產本發明的糖化物的希望。
在糖苷轉移酶確定之后，使之在確能發生轉移，而且在糖基單元與受體間能形成共價結合的條件下使受體和給體接觸。所述的條件，如轉移一特定糖基單元適宜以及最佳的時間、溫度和pH值可以由本領域中技術人員按常規實驗來確定。一些共試劑也被證明能用于該轉移。例如，較好的是在二價陽離子存在下，尤其在錳離子(可由Mncl2提供)存在下讓受體和給體與糖苷轉移酶發生接觸。
在優選實施方案中，將糖苷轉移酶附加到固體載體上使之固定化，再將待與之接觸的受體和給體加入到其上。正如上面所討論的，本發明所用的糖苷轉移酶通常是含至少一種具有規定活性的糖苷轉移酶的混合物，但是純的單一的糖苷轉移酶也可以用于本發明。在該優選方案中，糖苷轉移酶混合物或純的單一糖苷轉移酶都可以被固定化。另外，糖苷轉移酶、給體和受體每種都可以溶液的形式提供，并以溶質形式相接觸。
一種優選的固定糖苷轉移酶的方法(如果必要，也可固定受體)是以在含一種水溶性預聚物如聚乙酰胺-共-N-乙酰羥丁二酰亞胺(PAN)、一種交聯二胺如三亞乙基四胺和糖苷轉移酶的中性緩沖液中的共聚物化為基礎的，如Pollack等人在“J.Am.Chem.Soc.”(1980，1026324-36)所描述的。酶在PAN上的固定化是有用的，因為可以使用少量的酶而獲得酶活性的高產率，并使酶與聚合物間的鍵穩定。
最佳的固定化方法包括把糖苷轉移酶中的氨基固定到固體載體中的環氧乙烷基上(如參見“Enzyme Eng.”Chum等，1980，5457-460)或者固定到“SEPHADEX”或“SEPHAROSE”的活性溴化氰上(“Nature”Axen等，1967，2141302-1304)。
在一優選實施方案中，用適度提純的含糖苷轉移酶的組合物固定糖苷轉移酶。極純的酶制劑(即比活度為lnMols/轉移每μg蛋白質/每分鐘培養)以共價鏈固定到固體載體上的效果不好，與純度低10倍或100倍的制劑相比，衍生百分率較低。
應該避免因固定化作用而使糖苷轉移酶的活性點減少。發明人發現與在固定化過程中受到特別保護的糖苷轉移酶的活性相比，在固定化過程中受到污染的酶的活性有消失的趨勢。因此，在固定化過程中，可以用酶所需要的陽離子，被酶識別的核酸以及被酶識別的受體來保護糖苷轉移酶。例如，不管采用什么固定化方法，在固定化過程中，都可以用Mn2+、N-乙酰氨基葡萄糖和UDP來保護半乳糖苷轉移酶，這樣，在固定化過程中，污染的蛋白酶未受到任何保護。
因為在固定化過程中僅僅保護了要求的糖苷轉移酶，所以干擾目的糖化物合成的酶受到損失。干擾酶的例子有蛋白酶，它們可以其它方式反作用于要求的糖苷轉移酶，還有糖苷酶，它們可以其它方式反作用于糖化物。
如上指出的，根據本發明，由一受體與給體和糖苷轉移酶接觸后制備的糖化物能返回來作為進一步分離酶的受體和下一個糖基單元轉移至其上的受體。通過所述的接觸使糖基單元加到糖化物上這種制備方法優選用來合成碳水化合物和具有三個糖基單元以上的糖鏈。
例如，在制備三糖N-乙酰神經氨酰α2-3半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖時，先按照本發明制備雙糖半乳糖苷β1-4N-乙酰氨基葡萄糖，然后再以其為受體加上下一個基因。本發明領域技術人員會知道連接到本發明糖化物上的糖基單元可以是相同的，也可以是不同的。
本發明的糖化物具有非常廣泛的各種用途，可以按與已知物源得到的糖化物相同的方式使用。但這些糖化物最好用于哺乳動物的疾病治療和防治。
在治療許多病毒、細菌或真菌源疾病方面，如肺炎、念珠菌病、泌尿道感染、牙周病和腹瀉，本發明的糖化物能作為阻滯劑作用于細胞表面受體。例如，按本發明方法制備的低聚糖可以抑制病原體如引起肺炎的細菌結合到哺乳動物生物膜分子上。可以用經色譜法或電泳法分離出來的細胞糖蛋白和糖脂來培養所述病原體。在測定固有特性曲線(specific adherence patterns)后，分析目的化合物并制備糖化物抑制劑。如果互補分子中的一個通過其糖組份而起作用，那么專門的糖化物應該會抑制結合。
按本發明制備的糖化物可以有下列用途1.營養增補劑嬰孩配方老年人配方專用配方2.抗菌藥
腹瀉
外科手術(醫院的)感染與導管有關的感染3.抗腫瘤藥固體移動腫瘤(solid tumor metastases)
4.消炎藥嗜中性白細胞-血小板互相作用WBC-內皮互相作用5.Naval drag reductionship hulls6.避孕藥
泡沫和凝膠組份7.抗病毒藥皰疹流行性感冒HIV8.抗真菌和酵母菌藥口腔及陰道念珠菌病(如葡甘露聚糖配合物、在α-D-MAN(1-6)n上α(1-2)帶支鏈L-RHAM、D-Gal、D-Glc、
±
糖)放線菌類9.食品添加劑
乳化劑增稠劑
10.獸醫抗細菌抗病毒抗真菌消炎因此，本發明還提供了含有按本發明方法制備的糖化物的藥物組合物和其它組合物，如食品組合物。在按本發明提供的藥物和食品兩種組合物中，本發明的糖化物的含量可以為10-3μg/ml-100mg/ml。
在任意給定的具體藥物或食品組合物中的糖化物的濃度將根據所用糖化物的活性而變化。對于藥物組合物來說，組合物中本發明的糖化物濃度取決于在體外測出的具體化合物的活性。而對于食品組合物而言，本發明的糖化物的濃度可以根據測定要添加的化合物的活性來確定。
例如，上面提到的母乳中含的糖化物可以用于嬰兒配方和作為抵抗泌尿道感染的抗細菌藥。因此，本發明通過向嬰兒食品配方中添加上述糖化物使商購嬰兒食品的配方得到了改進。上述特定糖化物在商購嬰兒食品的配方中用量可以是0.1μg/ml-1000μg/ml。它在母乳中的存在量約為10μg/ml。
藥物組合物應該無發熱原。本發明的藥物組合物可以按本領域已知的方法制成以適用于口服、靜脈注射、肌肉、直腸、皮下及鼻內(如鼻內噴射)給藥。以霜劑、軟膏、懸浮劑等的形式局部給藥也是優選的。
上面已經提到，有些糖化物作為食品、紡織和石油工業的化學品以及主要用作醫藥領域的專用化學物質這兩方面都是非常重要的。迄今為止，還沒有一種有效的生產糖化物的方法能獲得含有活性組份糖化物的商品組合物。
本發明是第一次使糖化物有可能容易地大量獲得。在此以前僅能非常少量地得到的糖化物以及根本不能得到的糖化物采用本發明的方法已能數以克、公斤計地獲得。按照本發明提供的糖化物其純度高于95(Wt)%的糖化物。對于某些要求高純度的應用領域，用本發明的方法能夠獲得純度為98(Wt)%至基本上100(Wt)%的糖化物。
因此，現在本發明第一次提供了含有有效量糖化物的藥物組合物和其它組合物。本發明提供的組合物中含有按本發明方法獲得的糖化物的量至少為100mg，最好是至少500mg，以及直到占組合物的95(Wt)%。
在另一實施方案中，本發明提供了適用于按本發明方法進行糖苷轉移酶催化合成糖化物的設備，圖1、2和3給出了這些設備的示意圖。
本發明設備的最基本形式包括一個反應室，所有糖苷轉移酶、預選糖基單元和初始受體在其中進行混合。由于糖苷轉移酶的專一性，給定足夠的時間，該混合物會生成本發明的糖化物。
圖1、2和3給出了能用于本發明的設計更好的設備。圖中所示設備包括一個設有進口和出口的反應器，這是它們的基本部件。該反應器適用于在眾多對每一共價鍵專一的相應糖苷轉移酶的催化作用下進行大量預選糖基單元對受體的有序共價結合。其內至少裝有三種、優選四種，最好是四種以上，如五、六、七或更多種不同的優選固定化的糖苷轉移酶。
進口裝置適用于引進受體和大量預選糖基單元進入反應器，以便能夠合成糖化物。較好的是進口裝置還能適于引入本身已被優選地固定化了的糖苷轉移酶進入反應器。出口裝置要能使糖化物從反應器排出。
圖1畫出了裝有固體載體基質的柱式反應器，該方法所用的各種糖苷轉移酶(酶1、2、3)可以自由分布在整個固體載體基質上，也可以如圖1所示那樣排列成區域。將初始受體(圖中以A表示)和預選糖基單元(圖中以B、C和D表示)通過進口裝置裝入反應器，再通過固體載體基質，在此由于專有糖苷轉移酶的作用產生了糖化物，再通過出口裝置回收，其分子為A-B-C-D。
在圖2所示的方案中，初始受體物質和待結合到初始受體上的預選糖基單元由固體載體基質的頂部裝入，而相對于每種所加入的預選糖基單元的糖苷轉移酶沿反應混合物的流動方向設置在相應的區內。然后，在沿反應混合物流向的適當位置上(如圖所示)分別添加不同種預選糖基單元。
在圖3所示的另一優選方案中，反應器包括串聯連接的(n)個反應區，反應區間以連續的流體通道聯系起來，其中(n)數值不大于被反應結合的糖基單元數。每一反應區裝有至少一種能專一催化一特定預選糖基單元結合到在前一反應區所生成的中間產物上的糖苷轉移酶。
按照這種實施方案，讓初始受體(A)和待結合到該受體上的第一個預選糖基單元(B)通過第一個反應區，該反應區內含有能專門催化第一個糖基單元鍵合到初始受體上的糖苷轉移酶，由此產生了第一個中間產物。然后，讓第一個中間產物進入第二個反應區(n-1)，該區裝有第二個預選糖基單元(Xn)和能夠專門催化使第二個預選糖基單元與形成的第一個中間產物鍵合的糖苷轉移酶(E1+n)，按相應的反應區數重復該過程直到獲得以A-B-(X)n-E表示的由本發明提供的糖化物，其中每個X基是獨立選擇的，n是1至500或500以上的整數。
在另一優選方案中(也如圖3所示)，提純裝置4設在流體輸送管中并位于每兩個反應區之間，這些裝置能提純從任一反應區流出的由反應混合物生成的每一中間產物。可這些裝置裝有如離子交換樹脂的以除去反應混合物中存在的對下一個預選糖基單元結合到形成的中間產物上有抑制作用的雜質。
本發明的其它目的、優點和新的特征通過下面的實施例，對本領域技術人員來說將是顯而易見的，但這些實施例不是對本發明的限制。
實施例1三糖N-乙酰神經氨酰α2-3半乳糖β1-4N-乙酰氨基葡萄糖的制備向5個試管中分別加入10μlpH7.4的磷酸鉀緩沖液、10μl 5MM MnCl2、17，000CPM單磷酸胞苷-(14C)-N-乙酰神經氨酸、25μl半乳糖苷轉移酶和25μlN-乙酰神經氨酰轉移酶。糖苷轉移酶是用Sephadex G-100凝膠色譜法從中初乳中提純出來的。
再向試管1中加入10μl 40mm二磷酸尿苷半乳糖和10μl40mM的N-乙酰氨基葡萄糖。將試管1在冰中保溫1小時。
向試管2中加入10μl40mM二磷酸尿苷半乳糖，試管2在37℃下保溫1小時。
向試管3中加入10μl40mMN-乙酰氨基乳糖，把它放在37℃下保溫1小時。
向試管4和5中加入10μl40mM二磷酸尿苷半乳糖和10μl40mMN-乙酰氨基葡萄糖，將試管4和5置于37℃下保溫1小時。
保溫培養后，將每個試管內的混合物在用四硼酸鈉浸飽過的紙上做高壓電泳分析。由遷移率能證明同位素標記的三糖產物。結果表明試管3中形成了產物。
試管 三糖(CPM)1 02 03 33754 6705 950由此可以看出，試管4和5中存在的適當受體、給體和糖苷轉移酶使單糖原料生成了預期的三糖產物。通常，唾液酸N-乙酰神經氨酸在有機化學合成中試圖使之結合到糖化物上是有一定困難的，因為它的糖苷鍵具有酸不穩定性。用單磷酸胞苷N-乙酰神經氨酸在酶催化作用下合成三糖能解決與在強酸下去除保護基有關的合成問題。
據信，一種受體(N-乙酰氨基葡萄糖)首先與一種給體(二磷酸尿苷半乳糖)和一種糖苷轉移酶(半乳糖苷轉移酶)接觸生成了一種糖化物(半乳糖苷β1-4 N-乙酰氨基葡萄糖)，該糖化物然后作為受體再與第二個給體(單磷酸胞苷N-乙酰神經氨酸)和第二個糖苷轉移酶(N-乙酰神經氨酰轉移酶)接觸。
通過與試管3的產物比較，證明試管4和5中由單糖原料合成出了三糖產物，在試管3中，是雙糖受體(N-乙酰氨基乳糖)與單磷酸胞苷N-乙酰神經氨酸和N-乙酰神經氨酰轉移酶接觸產生了三糖。
試管2中沒有三糖說明適宜的受體對于三糖的形成是必要的，而試管1中沒有三糖說明三糖的合成確實取決于酶(糖苷轉移酶)的作用，而任何酶在低溫下都是沒有活性的。
按照本發明可以期望制備出低聚糖N-乙酰氨基半乳糖α1-3(巖藻糖α1-2)半乳糖β1-4 N-乙酰氨基葡萄糖β1-3半乳糖(引起腹瀉細菌的標的物)和N-乙酰氨基半乳糖β1-4半乳β1-4葡萄糖(引起肺炎細菌的標的物)。
實施例2四糖生物合成方法(protocol)酶N-乙酰氨基葡萄糖苷轉移酶將人初乳在70，000XG下離心1小時，由25%飽和硫酸銨提取形成的上清液被滲析除去硫酸銨。將滯留物加到Sephadex G-200柱中(2.5×83cm)，用分光光度計在280nm測定蛋白質的分布情況。然后對含有活性轉移酶的餾分進行放射性分析。收集具有單峰的酶餾分，通過Amicon過濾濃縮十倍。再次分析收集的酶制劑，用Biorad分析儀測定蛋白質濃度。該制劑的比活度為5.3PMoles/ug蛋白質-分鐘。
半乳糖苷轉移酶將人初乳在8700XG下離心15分鐘，將上清液倒入通過干酪包布，并取10ml加到Sephasex G-100(2.5×90cm)柱中。用分光光度計在280nm下確定蛋白質分布情況，然后對含有酶活性的餾分進行放射性分析，將具有最高活性的餾分收集起來并通過Amicon過濾濃縮十倍，再次分析收集的酶制劑，并如前所述測定蛋白質濃度。該制劑的比活度為15.4pMoles/ug蛋白質-分鐘。
酶的固定化N-乙酰氨基葡萄糖苷轉移酶將300mgEupergit顆粒(1.2ml)用去離子水洗滌三次，再用無菌Hepes-緩沖水洗三次，取1ml酶制劑和UDP、乳糖、Mncl2(最終濃度分別為10、25和10mM)及和含一滴氯仿的Hepes-緩沖溶液一起在無菌條件下與上述顆粒混合。在4℃下輕緩攪拌顆粒2天半。分成等份，定期進行分析，用無菌緩沖液洗滌顆粒三次以終止衍生作用，并將顆粒保存在緩沖液中，置于冷處，顆粒帶有UDP、乳糖、Mncl2和氯仿。
半乳糖苷轉移酶用去離子水洗滌3.75g顆粒三次，再用無菌Hepes-緩沖水洗滌三次，將顆粒與UDP、GlcNAc、Mncl2(最終濃度均為10mM)和含一滴氯仿的Hepes-緩沖溶液一起加入到3ml的酶制劑中(在兩種情況下，最佳衍生作用在大約1mg蛋白質/200mg顆粒下發生)。衍生作用和保存如上所述，本例只是用GlcNac和半乳糖苷轉移酶代替了乳糖，它相應于N-乙酰氨基葡萄糖苷轉移酶的受體。
四糖的生產將衍生的N-乙酰氨基葡萄糖苷轉移酶(0.5ml顆粒)與乳糖(25mM)、UDPGlcNAc(80um)和Mncl2一起恒速攪拌培養21小時。再如此制備一份培養物，其中一份的上清液用來測定產生的三糖量(14μg)，將另一份的上清液加到0.5ml的由半乳糖苷轉移酶衍生的顆粒中。因此，半乳糖苷轉移酶培養物內含有14μg三糖、25μmUDPgal和10mM Mncl2。在室溫下24小時后，第二種酶制劑產生了大約1.6μg的四糖，31小時后，產生了2.2μg的四糖。
實施例3下面的路徑用以合成3個比較復雜的低聚糖A-和B-型乳低聚糖(Ⅰ和Ⅱ)以及黃耆膠(Ⅲ)，一種作為食品添加劑而大量使用的植物低聚糖。
(Ⅰ)galNACα1→(fucα1，2)galβ1，3→(fucα1，4→)GlcNAcβ1，3→galβ1，4→glc首先，將葡萄糖的已醇胺葡萄糖苷(glc-O-(CH2)6-NH2)通過已醇胺上的氨基加到活性CNBr載體上，如Sepharose而合成。然后，用該親合配糖體從人乳或人初乳中提純出識別葡萄糖的半乳糖苷轉移酶，經部分提純的酶被用于半乳糖苷葡萄糖，制造乳糖。
另外，可合成乳糖的已醇胺葡萄糖苷，它價廉且是易于獲得的二糖。將如上獲得的乳糖結合到Sepharose上，并作為親合配糖體從人初乳或從人血漿中提純出一部分N-乙酰氨基葡萄糖苷轉移酶。
接下來，用上述第二種轉移酶使N-乙酰氨基葡萄糖結合到乳糖上，形成三糖。所說的三糖再被結合到Sepharose上。該結合的三糖被用來獲取β1，3半乳糖苷轉移酶(來自豬的頜下腺)，而此酶將被用來產生能提純下一個酶-α1，4巖藻糖苷轉移酶(從豬肝中)的物質。α1，2-巖藻糖苷轉移酶(來自豬的頜下腺)以及最后終止A-型乳低聚糖合成的α1，3N-乙酰氨基半乳糖苷轉移酶(來自豬的頜下腺)被逐步親合提純出來。如此獲得的轉移酶按幾種方法的任一種固定在固體基質上，而基質將倒入柱裝置中。
載有酶的柱子用來有序地，即按同樣順序先合成較小糖基數的衍生物，再合成高值可溶性低聚糖。
糖連接的順序很關鍵，在第二個巖藻糖(以α1，2鍵連接半乳糖)加入之前，最鄰近的巖藻糖(以α1，4鍵連接glcNAc)必須連接到了完成的核心四糖上。最后，加入末端galNAc(α1，3)完成七糖低聚糖。該順序是因糖苷轉移酶的專一性而必須的。
(Ⅱ)galα1，3→(fucα1，2→)galβ1，3→(fucα1，4→)glcNAcβ1，3→galβ1，4→glc已經合成了Ⅰ、Ⅱ將以完全相同的方式進行合成，不同的是首先用已糖來提純α1，3半乳糖苷轉移酶，該酶是用保護半乳糖苷轉移酶而非N-乙酰氨基半乳糖苷轉移酶的保護基衍生而來的。然后用該酶來合成B型低聚糖。
(Ⅲ)〔…(fucα1，3→xylβ1，3→)galAα1，4→(gal，β1，4→xylβ1，3→)galA…〕為了分離出一種合成黃耆膠主鏈α1，4-半乳糖醛酸的酶，該酶目前僅能從生長于中東地區的一種樹的皮中獲得，用果膠制備六吡喃半乳糖醛酸(hexagalacturonans)(桔皮中的一種普通成份)作為親合配糖體。
該親合配糖體還能用來從樹組織中分離出合成最鄰近的β1，3木糖苷所需要的木糖苷轉移酶。一旦生成木糖苷吡喃半乳糖醛酸，即可用于分離巖藻糖苷轉移酶和半乳糖苷轉移酶，這兩種酶能分別使木糖苷吡喃半乳糖醛酸巖藻糖苷化和半乳糖苷化。在該低聚糖的情況中，木糖苷化、巖藻糖苷化和半乳糖苷化的程度靠通過適當的載有酶的柱子的化合物數，憑經驗來控制。生成的重復糖基的數量取決于開始時使用的半乳糖醛酸殘基的數量;該值可以在4-20個單糖基中變化。
顯然，按照上述說明，本發明可以有許多改進和變化。因而，應該理解，除了本文的描述外，其它能夠實施本發明的都在本發明的權利要求范圍內。
權利要求
1.一種利用糖苷轉移酶催化使預選糖基單元有序地結合到受體物質上制備糖化物的方法，包括如下步驟(1)制備能夠將預選的糖基單元轉移至受體物質的糖苷轉移酶，即讓所說的受體物質與認為可能含有一定量糖苷轉移酶的混合物在能使所說的受體與所說的糖苷轉移酶結合的條件下接觸，并由此分離出所說的糖苷轉移酶，其中所說的受體物質選自于由蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂和碳水化合物組成的一組物質中；(2)提供反應條件和共試劑，使所說的預選糖基單元在所說的糖苷轉移酶的催化作用下確能結合到所說的受體上，從而獲得一產物；(3)將步驟(1)和(2)重復多次，即在一指定重復步驟(2)中獲得的產物被用作為下一重復步驟(1)中的受體物質，直到獲得所說的糖化物。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的碳水化合物選自于單糖、雙糖、低聚糖和多糖。
3.根據權利要求1的方法，其中步驟(2)中所用的糖苷轉移酶被固定在一固體載體上。
4.根據權利要求3的方法，其中在固定化過程中，通過保護所說糖苷轉移酶上的活性點而獲得結合在3固體載體上的糖苷轉移酶。
5.根據權利要求1的方法，其中所說的共試劑包括錳離子。
6.根據權利要求1的方法，其中所說的步驟(2)所用的糖是核苷酸糖。
7.根據權利要求6的方法，其中所說的核苷酸是磷酸尿苷、磷酸鳥苷和磷酸胞苷。
8.根據權利要求1的方法，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質選自于蛋白質、糖蛋白、類脂和糖脂。
9.根據權利要求1的方法，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質選自于單糖、雙糖、低聚糖和多糖。
10.根據權利要求1的方法，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是N-乙酰氨基葡萄糖。
11.根據權利要求1的方法，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是N-乙酰氨基葡萄糖，在所說的第一次重復中所用的糖苷轉移酶是半乳糖苷轉移酶，在所說的第二次重復中所用的糖苷轉移酶是N-乙酰神經氨酰轉移酶。
12.根據權利要求1的方法，其中在所說的第二次重復中所用的受體是半乳糖β1-4N-乙酰氨基葡萄糖。
13.根據權利要求1的方法，其中所用的給體物質中的至少一種為單磷酸胞苷N-乙酰神經氨酸。
14.根據權利要求1的方法，其中所說的被認為可能含有一定量糖苷轉移酶的混合物是細胞均質。
15.根據權利要求1的方法，其中所說的糖化物是下列表示式之一的化合物(4)
16.一種藥物組合物，包括藥物可接受的賦形劑或載體和用糖苷轉移酶催化使預選的糖基單元有序地結合到受體物質上的方法而制備的糖化物而非肝素，其中所說的方法包括如下步驟(1)制備能夠將預選的糖基單元轉移至受體物質的糖苷轉移酶，即讓所說的受體物質與認為可能含有所說糖基轉移酶的混合物在能使所說的受體與所說的糖苷轉移酶結合的條件下接觸，并由此分離出所說的糖苷轉移酶，其中所說的受體物質選自于由蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂和碳水化合物組成的一組物質中;(2)提供反應條件和共試劑，使所說的預選糖基單元在所說的糖苷轉移酶的催化作用下確能結合到所說的受體上，由此獲得一產物;(3)將步驟(1)和(2)重復多次，即在一指定重復步驟(2)中獲得的產物被作為下一重復步驟(1)的受體物質。
17.根據權利要求16的藥物組合物，其中含有至少100mg所說的糖化物。
18.根據權利要求16的藥物組合物，其中含有至少1g所說的糖化物。
19.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是蛋白質。
20.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是糖蛋白。
21.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是類脂。
22.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是糖脂。
23.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是碳水化合物。
24.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是單糖。
25.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是雙糖。
26.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是低聚糖。
27.根據權利要求16的藥物組合物，其中在所說的第一次重復中所用的受體物質是多糖。
28.一種能用于治療肺炎的藥物組合物，其中包括有效劑量的如下式所示的化合物以及藥物可接受的載體或賦形劑。
29.一種能用于治療牙周病的藥物組合物，其中包括有效劑量的如下式所示的化合物以及藥物可接受的載體或賦形劑。
30.一種能用于治療固體腫瘤的藥物組合物，其中包括有效劑量的如下式所示的化合物
以及藥物可接受的載體或賦形劑。
31.一種適用于避孕的藥物組合物，其中包括有效劑量的如下式所示的化合物以及藥物可接受的載體和賦形劑。
32.一種食品，含有用糖苷轉移酶催化使預選的糖基單元有序地結合到受體物質上的方法而制備的糖化物，并非黃耆膠和鹿角藻膠(族)，其中所說的方法包括如下步驟(1)制備能夠將預選的糖基單元轉移至受體物質的糖苷轉移酶，即讓所說的受體物質與認為可能含有一定量糖苷轉移酶的混合物在能使所說的受體與所說的糖苷轉移酶結合的條件下接觸，并由此分離出所說的糖苷轉移酶，其中所說的受體物質選自于由蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂和碳水化合物組成的一組物質中;(2)提供反應條件和共試劑，使所說的預選糖基單元在所說的糖苷轉移酶的催化作用下確能結合到所說的受體上，由此獲得一產物;(3)將步驟(1)和(2)重復多次，即在一指定重復步驟(2)中獲得的產物被作為下一重復步驟(1)的受體物質。
33.改進的嬰兒食品，包括表達式如下的化合物其用量為0.1μg/ml-1000μg/ml。
34.一種用于糖苷轉移酶催化合成糖化物的設備，所說的設備包括一個反應器;在所說的反應器中有至少四種不同的糖苷轉移酶;能將一種受體物質和多種預選糖基單元引入所說反應器以使糖化物得以合成的進口裝置;能將所說糖化物從所說反應器排出的出口裝置;其中所說的受體物質選自于由蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂和碳水化合物組成的一組物質中。
35.根據權利要求34的設備，其中所說的反應器包括多個串聯連接的反應區，彼此間以有序的流體通道為聯系，其中每一反應區裝有能專一催化一預選糖基單元結合至前一反應區形成的中間產物上的糖苷轉移酶。
36.根據權利要求34的設備，其中在流體通道上和每兩個所說的反應區之間設置用于把每一所說的反應區中所形成的中間產物從剩余的反應混合物中提純出來的裝置。
37.根據權利要求34的設備，其中所說的糖苷轉移酶是固定在固體載體上的。
38.根據權利要求37的設備，其中固定在所說固體載體上的糖苷轉移酶上的活性點在固定化過程中受到了保護。
全文摘要
本發明公開了一種制備糖化物的方法，該方法是重復進行的，包括如下三個步驟(i)使受體與認為可能含糖苷轉移酶的混合物在能使受體與糖苷轉移酶結合的條件下接觸，從而分離出能將預選糖基單元轉移至受體上的糖苷轉移酶，受體是蛋白質、糖蛋白、類脂、糖脂或碳水化合物。(ii)然后用分離出的糖苷轉移酶催化受體與預選糖基單元之間的鍵合。(iii)用在本方法的第一次重復中獲得的中間產物作為第二步重復的受體如此重復步驟(i)和(ii)多次。
文檔編號C12P19/26GK1056530SQ9110323
公開日1991年11月27日 申請日期1991年4月16日 優先權日1990年4月16日
發明者斯蒂芬·羅斯 申請人:賓夕法尼亞州大學理事會