專利名稱：活化蛋白c的方法
技術領域：
本發明提供一種新的活化蛋白C的方法。該方法提供一種簡便有效的手段，使蛋白C從酶原形式轉變成活化蛋白C。活化蛋白C的先有技術方法包括用在溶液中的高濃度凝血酶，或在一起的凝血酶和凝血調變蛋白(thrombomodulin)，或其他價格昂貴的用于活化作用的酶來處理蛋白C的無活性酶原形式。本發明提供一種用固定的凝定酶使蛋白C活化的方法，從而避免使用凝血調變蛋白，并產生易于從固定的凝血酶絡合物中純化的活化蛋白C分子。
蛋白C在調節血液凝固中所起的作用蛋白C是一種依賴于維生素K的血漿蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作為一個無活性分子被合成，此處稱之為“初生蛋白C”。初生蛋白C經復雜的加工，產生很多不同的無活性分子，如同下面所作出的更加充分的敘述。此處將蛋白C的無活性分泌形式稱作為“酶原蛋白C”。在血液中，通過涉及凝血調變蛋白一凝血酶絡合物的反應，發生蛋白C的活化作用。經活化的蛋白C及其輔助因子蛋白S一起，是一種具有重要生理學意義的抗凝劑。活化的蛋白C能防止血管內血栓癥，并控制原有血塊的擴大。活化形式蛋白C的作用機理以及無活性凝血酶轉變成活性蛋白酶的活化機理在近些年內已被闡明(文獻綜述見J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune andStratton，Inc，1983)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶，即凝血鏈鎖反應最終的絲氨酸蛋白酶，以及稱之為凝血調變蛋白的、與內皮細胞膜相聯的糖蛋白。凝血調變蛋白與凝血酶形成一個牢固緊密的化學計量絡合物。當凝血調變蛋白與凝血酶絡合時，完全改變了凝血酶的功能性質。在正常情況下，凝血酶將纖維蛋白原凝成塊，使血小極活化，并將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成它們的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢而且效能不高。反之，與凝血調變蛋白絡合的凝血酶并不使纖維蛋白原凝成塊，不使血小板活化，或不將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成它們的活化相應物Ⅴa和Ⅷa，但變為非常有效的蛋白活化劑。通過凝血調變蛋白-凝血酶，蛋白C的活化作用速率常數比單獨用凝血酶時高1000倍以上。
為了解活化蛋白C如何下調血液凝固，下面對凝固酶系統進行簡略的敘述。最好把凝固系統作為包括各酶原依次連續性活化成為各種活性的絲氨酸蛋白酶的鏈鎖反應來考察。該鏈鎖反應最終產生凝血酶，它經過有限的蛋白分解，將血漿纖維蛋白原轉變成不溶性的凝膠纖維蛋白。在凝固鏈鎖反應中，兩件關鍵的事情是一、通過凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ子轉變成Ⅹa;二、通過凝血因子Ⅹa，使凝血酶原轉變成凝血酶。這兩種反應在細胞表面發生，最顯著地在血小板表面，同時兩種反應均需輔助因子。主要的輔助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系統中作為相應的無活性前體流通，但當開頭幾個凝血酶分子形成時，凝血酶便返回來通過有限的蛋白分解使輔助因子活化。被活化的輔助因子Ⅴa和Ⅷa加速了高凝血酶原轉變成凝血酶，也加速了因子Ⅹ轉變成因子Ⅹa，速率大約提高5個數量級。活化蛋白C優先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破壞凝血因子Ⅴa和Ⅷa(無活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ對活化的蛋白C來說是非常差的底物。
活化蛋白C的一個重要輔助因子是蛋白S，它是另一種依賴維生素K的血漿蛋白。蛋白S使活化蛋白C介導的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C作為治療劑蛋白C被公認為一個有價值的治療劑(見歐洲專利公開No.0215548和美國專利No.4，775，624，此處作為參考文獻)。經活化的蛋白C是一種常用的抗凝劑(如肝素及口服羥基香豆精抗凝劑)具有更大治療指數的新抗血栓劑，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C者均無效，因為將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;這兩種輔助因子的活化形式對活化蛋白C來說是較好的底物。活化酶原蛋白C時也需要凝血酶，因為沒有凝血調變蛋-凝血酶絡合物，蛋白C酶原是不能被轉變成其活性相應物的。
活化蛋白C是一種按照要求的抗凝劑，因為活化蛋白C是使輔助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因為因子Ⅴ及Ⅷ轉變成它們的活化的相應物Ⅴa和Ⅷa時需要凝血酶，蛋白C僅僅在凝血酶再生之后才起到抗凝劑作用。與活化蛋白C相反，常用的抗凝劑只需給予病人，在整個循環中維持恒定的抗凝狀態，因此，大大增加了并發出血癥的危險，這種危險性超過了蛋白C或活化蛋白C所引起的。所以，活化蛋白C是一種按照要求的、在臨床上廣泛作為肝素和羥基香豆精的代用品使用的抗凝劑。
在某些疾病狀態中(例如遺傳性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治療重要性。在先天性純合子(homozygous)蛋白C缺乏情況下，患者個人早在童年時代就因暴發性紫癜而死亡，這是一種彌散性血管內凝血異常常見的致死形式。在雜合子(heterozygous)蛋白C缺乏情況下，患者個人忍受厲害的周期性的血栓塞發作。臨床上充分證實設計用來治療血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血漿蛋白濃縮物(含蛋白C作為雜質)，對預防和治療雜合蛋白C缺乏情況下的血管內凝塊有效。在血栓狀態下(如彌散性血管內凝固)以及在易發生血栓的疾病狀態下(如嚴重創作，大外科手術和癌癥)，也已被注意到蛋白C的濃度出現反常的偏低。
雖然蛋白C酶原形式對治療目的是十分有用的，將蛋白C的活化形式給予病人，某些疾病狀態能得到更有效的治療。在下列疾病狀態下，例如，心肌梗塞或深度靜脈血栓形式(特別發生在下肢外科手術之后)，病人有正常深度水平的蛋白C酶原，尚無足夠的活化蛋白C來制止血栓生成或支持除去原有的血栓。之所以不能使活化蛋白C的生成達到足夠的量是由于凝血調變蛋白不充分所造成。但是，不管什么原因，對這些疾病狀態的有效治療所需要的是活化蛋白C，并不是酶原。本發明提供了一種使蛋白C活化的新方法，訪法采用的是固相的凝血酶，而不是凝血酶/凝血調變蛋白的絡合物。
人蛋白C的合成和活化作用初生蛋白C能用下列圖解描繪
pre-pro-初生人蛋白C的氨基酸殘基1-42為人蛋白C的信號肽及前肽，對指導蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。
LC -初生蛋白C的氨基酸殘基43-197，一旦經轉譯后修飾，就組成雙鏈酶原(自單鏈酶原除去KR二肽而成，如下所討論)和蛋白C的活化形式的輕鏈(LC)。
KR -初生人蛋白C的氨基酸殘基198-199;這些殘基確信要被除去(基于與牛蛋白C的同源性)，可能通過包括最初的裂解(在殘基197-198之間或在199-200之間)隨后通過羥肽酶或氨酞酶作用，形成雙鏈蛋白C的兩步程序。
AP -初生蛋白C的氨基酸殘基200-211組成起活化作用的肽，它從蛋白C的酶原形試中除，去得到活化蛋白C。
AHC -初生蛋白C的氨基酸殘基212-461，一旦經轉譯后修飾，組成活化蛋白C的活化重鏈(AHC)。
ⅡC -蛋白C酶原的二鏈形式的重鏈，一旦經轉譯后修飾，組成氨基酸殘基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的絲氨酸蛋白酶前體，并存在于血液中，為表達完整的生物學活性，蛋白C需要進行轉譯后的修飾，此修飾過程需要維生素K。該成熟的、雙鏈的、由二硫鍵連接的蛋白C酶原，由一個單鏈前體通過限制性蛋白水解作用而產生。這種限制性蛋白水解作用被確信包括pre-pro肽的裂解和除去，該肽由在細胞內加工過程中生成的氨基酸殘基1-42所組成;從細胞中分泌初生多肽;以及除去氨基酸殘基198和199以形成在酶原中觀察到的雙鏈。酶原活化成活性絲氨酸蛋白酶的過程涉及ARG-LEU肽鍵(殘基211和212)的蛋白水解。后者裂解釋放出構成雙鏈酶原分子較大鏈(重鏈)氨基末端的十二肽(殘基200-211)。蛋白C受到明顯地糖基化作用，成熟的酶含約23%碳水合物。蛋白C也含有若干不平常的氨基酸，包括r-羧基谷氨酸和β羥基天冬氨酸(赤-L-β羥基天冬氨酸)。r-羧基谷氨酸(gla)由谷氨酸殘基經r-谷氨酰基羧化反應而成，該反應借助于需要維生素K作為輔助因子的肝微粒體羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用圖解表示并說明如下。本領域專業人員應該明白，圖解中所示的步驟順序不一定反映體內的途徑。
本發明提供一種采用固相凝血酶使蛋白C酶原活化的新方法。
為了本發明的目的，在此處所公開的說明書和權利要求書中，下列術語定義如下。
本發明所描述的蛋白質或肽鏈中的氨基酸殘基的縮寫如下三字母縮寫 氨基酸殘基 一字母縮寫PHE 苯丙氨酸 FLEU 亮氨酸 LILE 異亮氨酸 IMET 蛋氨酸 MVAL 纈氨酸 VSER 絲氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 蘇氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 組氨酸 HGLN 谷氨酰胺 QASN 天冬氨酰胺 NLYS 賴氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 谷氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色胺酸 WTRG 精氨酸 R
GLY 甘氨酸 GEnh或增強子-BK病毒增強子。
r-羧基化反應-在谷氨酸r碳原子上加上一個羧基的反應。
r-羧化蛋白-蛋白內某些谷氨酸殘基已經過羧基化的蛋白。
初生蛋白-mRNA轉錄本剛轉譯過來的未經任何轉譯后修飾的多肽。然后諸如谷氨酸殘基的r-羧基化以及天冬氨酸殘基羥基化這樣的轉譯后修飾可以在蛋白從mRNA轉錄本全部被轉譯之前發生。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性質蛋白水解，酰胺解，酯解以及生物學(抗凝固或纖維蛋白溶解)等活性。測定蛋白抗凝活性的方法在本領域是眾所周知的，參見文獻(Grinnell等，1987，Biotechnology51189)。
酶原-蛋白水解酶的無酶催化活性的前體。此處所用蛋白C酶原指的是蛋白C的分泌的、無活性形式，無論是單鏈還是雙鏈。
本發明提供使蛋白C活化的新方法，該方法包括下列步驟a)使無活性蛋白C與固相的凝血酶相接觸，以及b)從固相凝血酶和其他的污染物中純化活化的蛋白C。
雖然幾種產生無活性人蛋白C酶原和無活性的初生人蛋白C的方法已經被敘述(見歐洲專利公開215548和美國專利4，775，624，以此處將其方法指導通過參考文獻編入)，但公開材料并沒有提供采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法。取而代之，到目前為止所產生的蛋白C酶原已被下列物質處理過，例如溶解狀態的α-凝血酶、胰蛋白酶、Russell氏蝰蛇毒因子X的活化劑，或凝血酶和血栓緩和素的混合物，以便得到活化蛋白C。所有這些活化方法使得重組生產活化的人蛋白C效率低，有污染的危險以及成本較高。某些活化反應一定要嚴密的加以監控，以使蛋白分解在起活化作用的肽被裂解之后停止-，否則的話，所產生的活化蛋白C被裂解并變的無活性。此外，維持在溶解狀態的α-凝血酶有自身消化的趨勢，所以需要向反應混合物中連續添加α-凝血酶。本發明采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法消除了凝血酶自身消化的問題，以及對凝血調變蛋白的需要。本發明的方法不僅能用于活化由DNA重組技術形成的人蛋白C酶原，而且能用于天然存在的，從血漿中分離的人蛋白C的活化。Kisiel，W.(1979，J.Clin.Invest.64761-769)公開了這樣一種從血漿中分離蛋白C的方法，本文將該方法編入參考文獻。此外，本發明的方法也可用于活化蛋白C的衍生物，如Bang等人的敘述(見歐洲專利公開No.EP-0-323 149)。包括新的糖基化作用型式的人蛋白C重組分子也可采用本發明的新的固相凝血酶方法進行活化。
通常，本發明的方法可通過將凝血酶固定于任何支持樹脂上得以實施。所用凝血酶的類型取決于若干因素，特別是費用和安全性。盡管人、馬、大鼠或小鼠的凝血酶在市場上都能買到，但牛凝血酶通常是優選的，因為它不大可能被人體內病毒污染。有幾類凝血酶，例如α-凝血酶，β-凝血酶和δ-凝血酶也能買到，并在本發明中是有用的，但α凝血酶是優選的。
許多不同類型的固體支持物都可用來固定凝血酶(用于活化蛋白C)，但瓊脂糖凝膠(Sepharose)和瓊脂糖(agarose)是優選的。一種帶有N-羥基琥柏酰亞胺(NHS)酯類作為交聯試劑的瓊脂糖親和性支持物是最優選的。凝血酶含有賴氨酸殘基，其ε-氨基在非氨基緩沖液如HEPES中被連接到柱子上，調節HEPES緩沖液的PH到大約7.6，以便維持凝血酶的穩定性，而且使賴氨酸變得足以去質子化。在酯內的碳原子通過去質子化的賴氨酸進行親核性攻擊，從而讓凝血酶結構上的賴氨酸殘基取代酯基。該反應是很溫和的，凝血酶能保持穩定。
一旦凝血酶結合到支持物上，固相的凝血酶就能用適宜的緩沖液平衡，而且為了活化作用，可加入蛋白C。在批量反應中，固相的凝血酶能和蛋白C相接觸，或者讓蛋白C通過含有固相凝血酶的柱子。蛋白C可通過一長柱子處理或用一短柱子循環處理，并在反應過程中任何給定的點上檢定其活化程度。固相凝血酶的方法比先前的可溶性凝血酶方法更有效，因為固相凝血酶不象溶解狀態的凝血酶那么容易降解。固相凝血酶的柱子是可以重復利用的，通常多達15次。固相凝血酶的方法比先前的固相凝血酶/凝血調變蛋白方法更有效，因為在凝血酶/凝血調變蛋白方法中所用的凝血調變蛋白不是以共介鍵結合到固相支持物上，可能會污染活化蛋白C的最后洗脫液。當單獨使用經固相的凝血酶時，這種交叉污染是不明顯的(＜1ppm)。
活化蛋白C的活性能通過各種各樣的方法加以監控，盡管最普通的是“Xa因子-步凝集測試法”或“活化部分促凝血酶原激酶的時間(APTT)的凝集測試法”。兩種測試在文獻中都有敘述(Grinnell等，1987.Biotechnology 51189-1192)，該方法全部被列為本發明參考文獻。Bang還公開了一些活化方法(美國專利No.4，775，624，審定日期1988年10月4日)，該方法全部被列為本發明參考文獻。
本發明方法的第一步是將大約50mg牛α-凝血酶溶解于約25ml50mMHEPES緩沖液(pH7.6)中。然后用大約500ml非常冷的高純度水洗滌25ml瓶裝的Affi-GelTM-10微球，在從微球內排出過量水份之后，將濕的微球加到凝血凝酶溶液中，并在4℃下于旋轉混合器中緩和地混合1-2小時。將100ul1M甘氨酸(pH8.0)加到溶液中，于4℃下繼續旋轉1-16小時，以封閉Affi-GelTM10樹脂上未反應的位點。
凝血酶微球(T-微球)被分裝到二支消過毒的50ml聚苯乙烯管內，并在半速或更慢速度下離心30-60秒鐘。將管子放在冰上，讓T-微球沉降1-2分鐘，然后移出上清液并棄去。每個管里留下大約1.25mlT-微球。
向每個試管中加入約35ml由20mM Tris-HCl(pH.4)和200mM NaCl組成的洗滌緩沖液，然后將其倒置，直到所有T-微球重新懸浮。如前面那樣將管子離心，然后放在冰上使之完全沉淀，取出上清液并棄去。將該洗滌步驟重復10-15次，然后檢驗最后的上清液中酰胺分解活性，以檢出未結合的或被沖洗掉的凝血酶。如果在405nm下光密度變化少于0.002/min，T-微球即可備用。如果光密度太高，應重復洗滌步驟，直至達到適當的水平。
一旦上清液顯示出適當的純度，就可制備25%的T-微球懸浮液，即每毫升經過離心的T-微球加入3ml由20mM Tris-HCl(pH7.4)，和200mM NaCl洗滌緩沖液，如果在洗滌緩沖液中于4℃保持消毒狀態，T-微球能貯存較長一段的時間。
通過在1.5ml聚丙烯微量離心管中37℃下進行試驗性活化2-3小時而測試T-微球懸浮液活化蛋白C的能力。通過Crinnell等人公開的S-2238酰胺分解步驟和抗凝活性步驟，均能測定蛋白C的功能活性，見文獻(1987，Biotechnology 51189-1192)。旋轉含有蛋白C、固相凝血酶的微量離心管，每次30-60分鐘，直到蛋白C的功能活性達到穩定狀態。
本發明通過以下范例作進一步闡明。
實例1牛α-凝血酶的固相化將一瓶大約5mg無熱原質的高純度牛凝血酶(得自Miles Laboratories，Inc.，1121 Myrtle，Box 2000，Elkhart，Indiana 46515或ICN Pharmaceuticals，Inc.，26201 Miles Road，Cleveland，Ohio，44128)溶解于25ml 50mM HEPES緩沖液(pH7.6)中。將25ml商標為Affi-GelTM10的瓶裝微球(Bio-Rad Laboratories，P.O.Box 708，220Maple Avenue，Rockville Centre，New York 11571)置于150ml多孔玻璃漏斗中，用大約300-500ml冷的高純度的水洗滌，在每次添加水后，將微球重新拌成漿狀并且勿讓其干燥。微球很脆，并且易被碎裂。
將凝血酶溶液轉移到一支消毒的50ml聚苯乙烯離心管中，加入洗滌過的微球，加蓋塞住，內容物于40℃在旋轉混合器中旋轉1-2小時，讓其緩和地混勻。其次，加入100μl 1M甘氨酸溶液(pH8.0)，封閉Affi-GelTM-10樹脂上未反應位點。重新將管子塞緊并于4℃旋轉1-16小時。凝血酶微球(T-微球)被分成2份，各置于50ml聚苯乙烯離心管中。放在冰浴內進一步冷卻。后置于階式頂型臨床離心機中(轉速約1000-2000rpm)，在半速或低于半速下離心60秒鐘。小心地將管子移入冰浴并讓其在1-2分鐘之后出現沉降。用消毒吸管將上清液從每個管子中移出。每管約有12.5ml T-微球留下來。
向每個管子內加入約35ml T-微球洗滌緩沖液[20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl]，塞緊，用手輕輕地倒轉過來，直到T-微球重新懸浮。在用消毒吸管吸出上清液之前，將管子在半速下離心60秒鐘，然后放入冰浴1-2分鐘。該洗滌步驟重復約10-15次，以除去污染的內毒素，甘氨酸和凝血酶。
然后用S-2238酰胺分解測定法檢驗上清液。將25mg瓶裝HelenaLaboratories出品的S-2238底物溶解在18ml 20mM Tris-HCl，150mMNaCl(pH7.4)中，該緩沖液經0.2mm Acrodisc過濾器消毒過濾。其次，配制“稀釋緩沖液”，由20mM Tris-HCl，(pH7.4)，150mM NaCl3mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)所組成。為檢驗瀝濾凝血酶的T-微球，可按以下原始記錄的操作步驟進行。在一次性使用的微量比色杯中，100μl T-微球上清液與600μl“稀釋緩沖液”和300μl S-2238底物的溶液相混合。比色杯用封口薄膜封住，然后倒轉混勻。在波長405nm下將光密度讀數4分鐘。如果每分鐘光密度值差(△O.D./min)為0.002或更小，則表明T-微球是足夠干凈的。如果其差大于0.002，則按原始記錄要求，一定要重復洗滌步驟，直到T-微球不含瀝濾了的凝血酶。
一旦T-微球顯得干凈，就在離心管邊上刻度，以計量T-微球的相對體積。然后加入三倍體積的T-微球洗滌緩沖液，以達到稀釋至25%(1→4)的目的。如果在消毒條件下保存，T-微球在此溶液中，于4℃下可長時間貯存。
為測驗T-微球對活化蛋白C的能力，將400μl重新懸浮的T-微球轉移到1.5ml聚丙烯微量離心管中，在半速下離心60秒鐘，然后小心地除去上清液。將500μl高質量的非活化的重組人蛋白C(1mg/ml)的樣品和10μl 0.2mM EDTA(pH7.4，用來除去鈣)一起加到T-微球中。將管子加蓋，緩和地倒轉數次，然后如前那樣進行離心。從上清液移出100μl樣品，并和900μl T-微球“稀釋緩沖液”混合，在波長280nm下進行光密度讀數，以確保樣品在重組人蛋白C(rHPC)中為1mg/ml。
反應管重新加蓋，在37℃下旋轉2-4小時。在30分鐘、1小時、2小時及4小時的時間點內，將管子離心并移出10μl樣品，稀釋該10μl樣品，使得終濃度為10μg/ml rHPC。將該稀釋的樣品50μl加到650μl“活性測定用稀釋緩沖液”和300μl S-2238底物中，然后緩和地倒轉將其混勻。在波長405nm下進行光密度讀數4分鐘。如果光密度的變化大于0.1/分鐘，表明rHPC是完全有活性的。
實例2γHPC的活化重組HPC的制備大體上按照以下方法指導進行，Bang等，美國專利4，775，624和Grlnnell等，1987，Biotechnology 51189-1194。100ml FFQ(Pharmacla Fast Flow Q)樹脂按制造商所推薦的方法嚴格地制備而得。然后將FFQ樹脂用含有20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA和2mM苯甲脒的緩沖液(pH7.4)平衡。將EDTA和苯甲脒加到細胞培養上清液中，終濃度分別為4mM和5mM。在線性流速為20cm·h時，將培養基通過FFQ柱(3×16cm)。將柱子首先用300ml(3個柱子體積)含20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA，2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗滌，然后用300ml(3個柱子體積)含有20mM Tris，0.15M NaCl，10mM CaCl和2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗滌。將此第二次洗脫液用經典的陰離子交換步驟濃縮。
將純化的含γHPC的溶液通過消毒的0.2μm Acrodisc過濾器過濾到聚丙烯容器內。γHPC的濃度在1-10mg/ml范圍內(在20mM Tris，pH7，4，0.15M NaCl中，不存在CaCl2的情下，即“活化前緩沖液”)。將實例1產生的T-微球用T-微球洗滌緩沖液洗滌，然后離心，棄去上清液。大約5-7ml T-微球已足夠活化多達45ml純凈的γHPC。
將在“活化前緩沖液”中的γHPC加到T-微球中去，然后加入EDTA到終濃度為0.5mM。將管加蓋，在37℃緩和地旋轉。定時移出等分試樣，按實例1的方法指導測定酰胺分解活性。經用此法處理過的蛋白C被發現在2小時內具有100%的活性。
本領域專業人員還會認識到許多與本發明所述的特定物質和方法等價的物質和方法(采用常規的實驗方法)。這樣的物質和方法也認為在本發明范圍之內，并包括在下列權利要求書中。
權利要求
1.一種使蛋白C活化的方法，該方法包括下列步驟a)使非活化蛋白C與固相的凝血酶接觸以及b)從固相的凝血酶和其他污染物中純化活化蛋白C。
2.權利要求1的方法，其中凝血酶選自由牛凝血酶，與凝血酶，人凝血酶，小鼠凝血酶和大鼠凝血酶組成的一組凝血酶。
3.權利要求1的方法，其中凝血酶選自由α-凝血酶，β-凝血酶和γ-凝血酶組成的一組凝血酶。
4.權利要求1的方法，其中凝血酶被固定在瓊脂糖上。
5.權利要求1的方法，其中凝血酶被固定在瓊脂糖凝膠上。
6.權利要求1的方法，其中蛋白C選自由牛蛋白C，人蛋白C和人蛋白C衍生物組成的一組蛋白C。
7.權利要求6的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
8.權利要求2的方法，其中凝血酶是牛α-凝血酶，
9.權利要求8的方法，其中牛α-凝血酶被固定在瓊脂糖上。
10.權利要求9的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
全文摘要
無論是衍生自血漿還是產生自DNA重組工程的蛋白C分子的活化，都能通過蛋白C分子與固相凝血酶相接觸而達到目的。本發明方法比采用凝血酶/凝血調變蛋白絡合物更為有效，并消除了凝血酶自身降解的問題。
文檔編號C12N9/64GK1050043SQ9010746
公開日1991年3月20日 申請日期1990年9月5日 優先權日1989年9月5日
發明者殷秀慈 申請人:伊萊利利公司