專利名稱：：用固定化細胞催化氧化低碳烴的過程的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用微生物催化氧化揮發性強的或氣態有機化合物的過程。隨著生物催化的發展，發現了許多以烴類為唯一碳源和能源的具有活化分子氧能力的微生物，例如可使丙烯直接氧化成環氧丙烷的甲烷菌類微生物就是這一類微生物的突出代表。Colby，Dolton等發現甲烷菌之所以具有這一種功能是由于含有甲烷單加氧酶(MMO)，正是由于MMO的存在才能使丙烯直接被分子氧氧化成環氧丙烷。C.T.Hou等發現，單獨的MMO不能催化這一反應，必須在反應體系中添加MAOH作為輔酶。輔酶主要起電子給體作用，在反應中是逐漸消耗的，目前還找不到有效的方法進行再生。為此C.T.Hou(US4348476)將甲烷菌細胞分別吸附在多孔玻璃球、活性碳、陶瓷、砂子等載體上制備成固定化細胞，作為活化分子氧使氣態有機化合物發生催化氧化的催化劑，該類生物催化劑特別適用于丙烯環氧化制環氧丙烷和能被甲烷單加氧酶催化的類似反應，但是操作6小時后催化劑即失活，將失活的細胞用甲醇再生一次催化劑活性下降60%，經三次再生后催化劑已基本失活，很難做到催化劑的連續應用。US4368267中記載了一種低碳α-烯烴、二烯烴或乙烯基芳香化合物環氧化的生物催化過程，在微生物或微生物中提取的酶存在下將上述化合物進行環氧化反應，所用微生物是甲基營養菌，尤其是在好氧條件下以甲烷為營養的微生物。本發明在包埋活細胞制得的固定化細胞作用下，氧化揮發性強的或氣態有機化合物，并用可給固定化細胞提供能量的相應低碳烷烴或烯烴與空氣的混合氣對其固定化細胞進行處理，以達到提供能量，帶走有毒產物，增加還原當量，使一次投入的催化劑多次再生而不失活的目的。本發明的目的可由如下措施實現。將以氣態低碳烷烴或烯烴作為唯一碳源和能源，輔以無機無碳培養基生長的好氧細菌、酵母、真菌，在可給上述微生物提供能量的相應的碳源氣和空氣的混合氣中用無機無碳培養基于20-60℃培養48hr-144hr，然后用海藻酸鈉溶液包埋微生物細胞，海藻酸鈉溶液的溶劑為含金屬離子的無菌蒸餾水或無機無碳培養基，這樣有利于細胞包埋后的生存，再將含有菌體的海藻酸鈉滴加到0.1MCaCl2溶液中，制成2mm小球，放入4℃的冰箱中增加催化劑的強度，最后洗去催化劑上的CaCl2加入培養基，充入可給微生物提供能量的相應低碳烷烴或烯烴碳源氣與空氣的混合氣，其中碳源氣的范圍為1-99%，在搖床上培養48hr-120hr備用。本發明制固定化細胞所采用的微生物可以是甲烷營養菌甲基囊菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基無芽胞桿菌屬乙烷營養菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬、短桿菌屬、分枝桿菌屬丁烷營養菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬乙烯營養菌分枝桿菌屬丙烯營養菌諾卡氏菌、假單胞菌屬鋼綠色極毛桿菌。取一定量濕重的催化劑小球放入填充式反應器中，空氣和下述一種的氣態或揮發性強的C1-C4烷烴、C2-C4烯烴或二烯烴、乙烯基芳香化合物、甲基環己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl等，分別經過增濕器后進入反應器，氣體的總流量1-10ml/min，pH為3-10，反應溫度20-80℃，反應6小時后，停止供應原料氣，將反應器的溫度調至所用菌體的最適培養溫度，即20-60℃，通入(上述所提及)可給微生物提供能量的相應的低碳烷烴或烯烴碳源氣和空氣的混合氣，其中碳源氣占1-99%，以提供能量，帶走有毒產物，增加還原當量，這一再生過程和反應過程交替進行。上述所提及的可給微生物提供能量的相應碳源氣可以是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯，實驗證明，用包埋法制備的固定化催化劑經上述方法再生，催化劑至少可再生8次而活性仍不下降。本發明與已有技術相比具有如下優點，1、用海藻酸鈣包埋法制備生物催化劑，不僅方法簡便，有利于大規模生產，而且，固定化生物催化劑經多次再生，催化劑活性不降。2、用填充式反應器，可直接通入碳源氣和空氣，而不必把催化劑從反應器中取出，即可進行再生。現進一步通過最佳實施例來闡述發明的實現方式實施例[1]本發明將成都微生物研究所提供的甲基單胞菌屬(Methylononas)成都761(Appl.EnvironMicrobiol.，1984，Vol.48，No.4，PP.807～812)，用無機無碳培養基，在甲烷∶空氣＝1∶1的氣氛中，溫度為30℃下培養，培養周期為4天。將靜止培養好的菌液用接種環取上層菌體放入2.7%的海藻酸鈉溶液中(溶劑為培養基，這有利于細胞被包埋后的生存)。用10ml的注射器，5號針頭將含有菌體的海藻酸鈉溶液滴入0.1M的CaCl2溶液中，制成直徑約2mm的小球。并在4℃的冰箱中放置5小時，用滅菌蒸餾水洗去催化劑上的CaCl2，最后用培養基洗一次。將洗好的催化劑小球放入250ml的三角瓶中加入適量培養基，充入1∶1的甲烷空氣混合氣在搖床(32℃，220rpm)上培養85小時備用。實施例[2]取包埋培養好的固定化細胞8.91g(每克固定化細胞中含有細胞5.9mg)，裝入φ1×20cm的填充式反應器中，反應器裝有夾層，用循環水控制反應溫度，40℃下反應。空氣和丙烯分別經過增濕器，然后以1∶1的比例進入反應器，氣體的總流量為2ml/min，由于環氧丙烷的沸點為34.2℃，生成的環氧丙烷隨氣體從反應器中流出被吸收在由冰水冷卻的裝有1ml水的吸收器中。反應6小時后共生成1.6μmol的環氧丙烷，這時催化劑已失活。將反應器的溫度改為32℃，通入1∶1的甲烷空氣混和氣，流速為2ml/min，進行輔酶再生，再生時間為16小時。再生完畢后。將反應器溫度調成40℃，通入反應氣(1∶1的空氣丙烯混合氣)進行同樣條件下的反應。催化劑失活后再進行同樣條件的再生。發現經8次再生，催化劑活性不降。將一次投入的催化劑每次再生后所達到的活性列入表Ⅰ。</tables>實施例[3]取包埋培養好的固定化細胞16.4g(每克固定化細胞含有6.8mg細胞)放入250ml的三角瓶中，加入30ml培養基作反應液，將其中的空氣盡可能抽盡，加入60ml丙烯，其余用氧氣充滿，在32℃、220rpm的搖床上反應。反應6小時后催化劑失活，共生成11.1μmol的環氧丙烷，用蒸餾水把催化劑洗凈，最后用培養基洗一次。加入40ml培養基，充入1∶1的空氣甲烷混合氣，在32℃，220rpm搖床上再生16小時。洗凈，做同樣條件下的環氧化反應，催化劑失活后進行同樣條件下的再生。將催化劑再生次數與活性關系列入表Ⅱ。</tables>權利要求1.一種在微生物催化劑存在下，氧化揮發性強的或氣態有機化合物的過程，其特征在于上述化合物和空氣在通過包埋活細胞制得的固定化細胞作用下反應，其中包埋活細胞微生物是指以氣態的低碳烷烴或烯烴作為唯一碳源和能源，輔以無機無碳培養基生長的好氧的細菌、酵母、真菌，反應完畢后，用可給微生物提供能量的相應碳源氣與空氣的混合氣，在再生條件下，對其固定化細胞進行再生。2.如權利要求1所述的氧化過程，其特征在于有機化合物和空氣分別通過增濕器后，進入裝有固定化細胞的填充式反應器，總流速1-10ml/min，pH為3-10，反應溫度20-80℃，反應畢后，將反應器溫度調至20-60℃，用可給微生物提供能量的相應碳源氣與空氣的混合氣對固定化細胞再生，其中碳源氣占1-99%，反應與再生兩過程交替進行。3.如權利要求1所述的氧化過程，其特征在于其中固定化細胞的制取方法包括(a)將微生物用無機無碳培養基，在低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣氣氛中培養，(b)取靜止培養好的菌液于2.7%的海藻酸鈉溶液中，(c)將含有菌體的海藻酸鈉溶液滴入0.1NCaCl2溶液中，放入4℃的冰箱中存放5小時，(d)用滅過菌的蒸餾水洗去固定化細胞上的CaCl2，然后再用培養基洗一次，(e)將洗好后的催化劑小球，加入適量的培養基，充入可給微生物提供能量的相應低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣于搖床上培養。4.如權利要求1或2或3所述的氧化過程，其特征在于微生物是各種甲基營養菌、乙烯營養菌、丙烯營養菌。5.如權利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于有機化合物是氣態或揮發性強的C1-C4烷烴、C2-C4烯烴或二烯烴、乙烯基芳香化合物、甲基環己烯、C＝C-C-C-Br、C＝C-C-C-Cl。6.如權利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于再生固定化細胞的混合氣是可給微生物提供能量的相應低碳烷烴或烯烴和空氣。7.如權利要求1所述的氧化過程，其特征在于微生物是甲烷營養菌甲基囊菌屬、甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基無芽胞桿菌屬，乙烷營養菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬、短桿菌屬、分枝桿菌屬，丁烷營養菌假單胞菌屬、土壤桿菌屬，乙烯營養菌分枝桿菌屬，丙烯營養菌諾卡氏菌、假單胞菌屬鋼綠色極毛桿菌。8.如權利要求3所述的氧化過程，其特征在于固定化細胞的直徑1-20mm。9.如權利要求3所述的氧化過程，其特征在于海藻酸鈉溶液可用含金屬離子的無菌蒸餾水配制。10.如權利要求3所述的氧化過程，其特征在于海藻酸鈉溶液可用無機無碳培養基配制。11.如權利要求3所述的氧化過程，其特征在于培養微生物的碳源氣是可給微生物提供能量的相應甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一種。12.如權利要求1或2所述的氧化過程，其特征在于丙烯和空氣分別通過增濕器進入填充式反應器中，在海藻酸鈣包埋甲基單胞菌屬成都761制得的固定化細胞存在下反應制得環氧丙烷，反應溫度為40℃。再將反應器溫度調至32℃，用1∶1的甲烷和空氣的混合氣對固定化細胞進行再生。13.如權利要求6所述的氧化過程，其特征在于再生固定化細胞的碳源氣是可給微生物提供能量的相應的甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯中的一種。全文摘要本發明涉及用微生物催化氧化揮發性強的或氣態的有機化合物過程。本過程在海藻酸鈣溶液包埋微生物細胞制得的固定化細胞存在下，使空氣和一種揮發性強的或氣態的有機化合物反應，反應完全后，用可給固定化細胞提供能量的相應低碳烷烴或烯烴和空氣的混合氣對其微生物催化劑進行再生，以提供能量，帶走有毒產物，增加還原當量，使一次投入的催化劑經多次再生而不失活。海藻酸鈣包埋法，方法簡便，有利于大規模生產。文檔編號C12P17/02GK1055201SQ9010457公開日1991年10月9日申請日期1990年7月7日優先權日1990年7月7日發明者李樹本,高燦柱申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所