用作疫苗或用于治療肝臟疾患的缺陷性肝炎病毒的制作方法

專利名稱：用作疫苗或用于治療肝臟疾患的缺陷性肝炎病毒的制作方法
1.本發明所屬領域本發明涉及復制缺陷性肝炎病毒。具體地說，本發明是涉及自身不能復制的缺陷性肝炎病毒，但其前基因組RNA能夠在適當輔助病毒功能存在下被包裝并反轉錄成DNA。在特定實施方案中，這種病毒的基因組DNA可能有env、pol和/或core基因的缺失。本發明還涉及肝炎病毒包裝基因組，其編碼的前基因組RNA本身不能被包裝和/或反轉錄成雙股DNA基因組，但能夠反過來為包裝提供必要的病毒功能。可將本發明的表達免疫原性抗原決定基的缺陷性肝炎病毒配制成疫苗，作為免疫刺激用以產生抗肝炎病毒抗原的免疫反應。
本發明還涉及包含異源基因順序的缺陷性肝炎病毒。在本發明的一個實施方案中，可用這些重組病毒對肝臟酶的遺傳缺陷進行基因治療，或由肝臟產生來取代酶缺乏。在本發明的另一實施方案中，可將包含異源基因順序的重組肝炎病毒配制成疫苗，用以防止由病原微生物或該生物體的抗原引起的感染。
本發明還涉及永久性肝細胞系的產生和維持，這些細胞系已用本發明的缺陷性肝炎病毒進行了穩定轉染，并能產生傳染性缺陷性肝炎病毒顆粒。
也可將本發明的缺陷性肝炎病毒配制成治療用的干擾劑，用以阻止野生型病毒感染的擴散和維持。
2.本發明的背景2.1.肝炎病毒2.1.1.肝炎病毒的結構肝炎病毒包括人乙型肝炎病毒(HBV)(Barker et al.，1975，Am.J.Med.Sci.270189-196)，旱獺乙型肝炎病毒(WHBV)(Ogston et al.，1982，Cell 29385-94)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)(Summers and Nason，1982，Cell 29403-415)，及地松鼠乙型肝炎病毒(GSHBV)(Narion et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，772491-2495)，這類病毒有肝細胞趨向性，可導致持久性感染并具有共同結構。已在被感染生物體的血液中檢出高濃度的肝炎病毒。肝炎病毒顆粒由被膜和核蛋白殼組成，直徑約42nm(參見Ganem and Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56651-693;Tiollais et al.，1985，Nature(London)317489-495)。被膜含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及碳水化合物和脂質。核蛋白殼含有環形DNA(3.0-3.3kb)、DNA聚合酶、蛋白激酶活性和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)肝炎病毒基因組是一小的、環狀的、部分雙股的DNA分子(參見Ganem and Varmus，上述文獻;Tiollais et al.，上述文獻)。負股是有固定長度的線性DNA，長3-3.2kb。反之，正鏈則有可變的長度，范圍為負股的50-100%。
對肝炎病毒克隆基因組之核苷酸順序的分析結果表明，除DHBV外負股均含有四個主要開放讀碼(ORFs)，即S、C、P和X(參見Ganem and Varmus;Tiollais et al.，上述文獻)。DHBV含有S、C和P ORFs(見圖1)。編碼HBsAg的ORF S可分為S基因、前S1區和前S2區。相似地，編碼HBcAg的ORF C則分為C基因和前C區。ORF P編碼病毒聚合酶。ORF X可能編碼長154個氨基酸的多肽，有關ORF X的功能目前尚不明了。
肝炎病毒基因組的復制包括四個主要步驟(參見Ganem and Varmus，上述文獻;Mason at al.，1987，Adv.Virus Res.3235-96;Seeger et al.，1986，Nature(London)232477-484)。第一步是在被感染細胞的核內將病毒粒子中的不對稱DNA轉化為共價閉環DNA。然后由RNA聚合酶Ⅱ轉化共價閉環DNA，產生兩種RNA，即基因組和亞基因組RNA。基因組RNA(3.5kb)包含完整的病毒遺傳信息，故可用作復制模板和mRNA。亞基因組RNA長2.1和2.4kb，很可能是前S1(2.4kb轉錄本)和前S2及S蛋白(2.1kb轉錄本)的mRNA。
然后使用病毒聚合酶和蛋白質引物通過前基因組RNA的反向轉錄合成負股DNA。一般認為負股DNA合成的起始位點出現了短順即DRI(直接重復1)內。
最后一步是使用病毒相關聚合酶加寡核苷酸引物經拷貝負股模板而合成正股DNA。DR1和DR2在這一步驟中起著重要作用(詳見Ganem和Varmus，上述文獻;Seeger et al.，1986，Nature(London)232477-484;Mason et al.，1987，Adv.Virus Res.3235-96)。該步驟顯然要使用得自前基因組RNA之5′部分的RNA引物。該引物含有已被退火為負股中之DR2順序的DR1順序(Madson et al.，1987，Adv.Virus Res.3235-96)，從而得以引導正鏈合成。正鏈合成可進行不同的距離，并常常在完全拷貝負鏈之前終止。
已用重組DNA技術研究了乙型肝炎病毒基因組的結構和表達。英國專利GB2034323A號(1980年6月4日公開)已報導了在用克隆的HBV DNA和單純皰疹病毒胸苷激酶基因共轉化小鼠細胞后HBV表面抗原的表達和表面抗原顆粒的分泌。Moriarty等人(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，782606-2610)描述含編碼HBsAg之HBV DNA片段的重組猴腎病毒的構建和表達;已證明22nm表面抗原顆粒可被分泌到細胞培養基中。歐洲專利公開0020251號(1980年12月10日公開)描述了含有自Dane顆粒中分離的編碼有HBV抗原性之蛋白質的HBV DNA片段的重組DNA載體。
2.1.2.肝炎病毒感染的生物學已觀察到HBV感染具有高度多態性，可由不明顯的感染(即病人肝臟只受到輕微感染或沒有損傷)到急性乙型肝炎(為一種以肝細胞損傷和炎癥為特征的較為嚴重的疾病)，以致到嚴重的慢性肝病(參見Ganem and Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56651-693)。病毒本身似乎是無細胞毒性的。宿主對病毒感染之細胞的免疫反應變化，是決定病人肝損傷程度的一個主要因素。在急性和慢性HBV感染期間，可觀察到機體對HBcAg和HBsAg的體液和細胞免疫反應(參見Robinson，1986，In Fundamental Virology，Fields，B.N.and Knipe，D.M.(eds.)，Raven Press，N.Y.，pp.657-679)。已觀察到其他肝炎病毒也主要是趨向肝細胞的，并可導致持久性病毒感染。觀察到慢性活動性肝炎是由于HBV和WHBV感染的結果。
除感染肝細胞外，在非肝組織如腎、胰臟及皮膚中也已檢測出HBV DNA(Robinson，上述文獻)。在被感染之北京鴨的腎和胰臟中也檢測到游離的病毒DNA。也發現在外周血白細胞和骨髓細胞中存在HBV DNA，但其拷貝數比在肝細胞中低。
肝細胞中的肝炎病毒DNA可作為游離DNA或整合到宿主細胞染包體內的形式存在(Tiollais et al.，1985，Nature(London)317489-495)。在HBV感染的急性和某些慢性階段可檢測到游離HBV DNA，并通常代表了復制的中間體形式。與之相反，整合的順序則大多見于慢性病毒感染及肝細胞癌期間。
除引起急性和慢性肝病之外，流行病學和分子生物學研究的結果還證明了肝炎病毒感染與肝癌之間存在著一定的關聯(參見Ganem and Varmus，上述文獻;Machowiak，1987，Am.J.Med.8279-97;Tiollais et al.，1985，Nature(London)317489-495)。在東南亞和赤道非洲，慢性HBV感染的高發生率與肝癌的發病率之間存在著密切的相互關聯。另外，已發現肝癌病人的肝細胞含有HBV DNA和HBsAg。在具有肝炎病毒感染的動物體內也發現了肝癌。而且實驗證明，在出生時用WHBV接種旱獺也可誘發肝癌。
已用Southern印跡雜交法研究了存在于人(Dejean et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA815350-5354)、旱獺(Ogston et al.，1982，Cell 29403-415)、地松鼠(Marion et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA834543-4546)和鴨(Imazeki et al.，1988，J.Virol.62861-862)肝細胞癌中的肝炎病毒DNA順序的結構。一般認為，病毒DNA在1至12位被整合到宿主染色體DNA中。病毒一宿主染色體接合點通常位于DR1和DR2之間的粘性末端區域內。
2.1.3.HBV感染的免疫接種和治療用于治療HBV感染的現有方法可分為兩類，即使用抗病毒劑和免疫調節劑(參見Hoofnagle，Ann.Int.Med.107414-415)。阿糖腺苷(腺嘌呤阿糖苷)是已廣泛試驗的一種對皰疹病毒具有潛在活性的腺嘌呤類似物。雖然已發現該化合物對病毒復制的抑制作用對某些病人是接近完全并持久的，但在另一些病人身上則只部分或暫時起作用。這種藥物的一個缺點是極不易溶于水，故必須靜脈內給藥(持續靜脈輸注)。阿糖腺苷的一種-磷酸化衍生物，即磷酸阿糖腺苷可經快速靜脈內輸注或肌肉注射方法給藥。雖然磷酸阿糖腺苷治療可以清除血清乙型肝炎病毒DNA，但它不會持久地改善伴隨的肝臟疾病。已試驗過的其他用于治療HBV感染的抗病毒劑包括無環鳥苷和蘇拉明(Suramin)。
已對病人用淋巴樣母細胞或重組α干擾素進行了1-6個月的治療效果研究。發現只有25-40%的病人對這種治療方法起反應。已證明合并使磷酸阿糖腺苷和人白細胞干擾素有毒性。最近研究的其他療法包括使用白細胞介素2、γ干擾素及短療程皮質類固醇。
美國專利4，741，901號公開了一種含成熟乙肝表面抗原之22nm多肽顆粒的疫苗。
2.2.缺陷性病毒
2.2.1.缺陷性RNA病毒在大多數這類RNA病毒如皰疹性口炎病毒(VSV)、付流感病毒、流感病毒、α病毒和呼吸道腸道病毒制劑(參見Holland，1986，In Fundamental Virology，Fields，B.N.and Knipe，D.M.，eds.，Raven Press，NY，pp.77-99)中含有大量缺陷性干擾(DI)顆粒，其因基組中只含有一部分親本病毒的遺傳信息。DI顆粒不能在宿主細胞中自身復制，但當它們與提供丟失基因產物的同型感染性病毒(輔助病毒)一起感染細胞時卻能夠復制。因為DI顆粒需要有限量由感染性顆粒提供的RNA聚合酶，所以使輔助病毒的復制受到明顯的抑制(自動干擾)。
已發現DI顆粒可在急性和慢性感染中起作用。實驗表明VSV DI顆粒通過啟動VSV在體內生長的周期特征以調節在小鼠體內的毒力(Cave et al.，1985，J.Virol.55366-373)。另外，新生倉鼠腎細胞內持續性VSV感染的形成和維持也需要DI顆粒(Holland and Villareal，1974，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，712956-2960)。
DI顆粒可起源于異常復制過程(Lazzarini et al.，1981，Cell26145-154)。據推測，在其復制中聚合酶一新生鏈復合物脫離模板，并在另一模板上或同一模板的不同位置上完成復制過程。
2.2.2.缺陷性反轉錄病毒缺陷性反轉錄病毒與其他缺陷性RNA病毒的主要區別在于缺陷性反轉錄病毒一般不能調節全長反轉錄病毒顆粒的感染。缺陷性反轉錄病毒與其他缺陷性RNA病毒一樣，只能在輔助病毒的存在下才能復制。輔助病毒和缺陷性病毒需要的不是同一反轉錄病毒;例如，白血病病毒可作為缺陷性肉瘤病毒的輔助病毒。
非缺陷性反轉錄病毒在基因組的5′和3′末端含有一個長的末端重復(LTR)區，以及gag、pol和env基因(參見Watson et al.，1987，In Molecular Biology of the Gene.Vol.2，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Menlo Park，CA;Hanafusa，1977，In Comprehansive Virology，Fraenkel-Conrat，H.and Wagner.R.R.，eds.Plenum Publishing CO.，NY，pp.401-436)。但除Rous肉瘤病毒外，非缺陷性反轉錄病毒的分離物均不含有致癌基因。非缺陷性反轉錄病毒在經過相當長的潛伏期后一般可誘發白血病(如HTLVI，貓白血病病毒)。
缺陷性反轉錄病毒的天然分離物都含有因gag、pol和env基因缺乏而形成的致癌基因(參見Watson et al.，上述文獻;Hanafusa，上述文獻)。已知這些病毒可作為急性轉化病毒，并有經過短潛伏期后在體內誘發腫瘤的能力(如肉瘤病毒)。另外，已表明只要LTR是完整的，就能夠使前病毒DNA漸漸整合到宿主基因組內，轉錄成RNA并繼而轉化宿主細胞，但還不能產生感染性子代。然而，如果用非缺陷性病毒感染這些細胞，即可產生非感染性和感染性病毒的混合物。在這種情況下常常會產生假型，其中非缺陷性病毒形成的被膜糖蛋白可摻入到產生感染性顆粒的缺陷性病毒內。
缺陷性反轉錄病毒也已用于基因轉導過程，其中缺陷性病毒可攜帶外來DNA順序。例如，據報導可使用在組成上表達高水平β半乳糖苷酶的復制缺陷性反轉錄病毒來轉導成年大鼠肝細胞的初級培養物(Wilson et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853014-3018)。
2.2.3.缺陷性DNA病毒已發現DI顆粒是通過異常病毒復制過程或同源重組過程(參見Holland，上述文獻)由乳多空病毒、皰疹病毒、腺病毒、細小病毒等DNA病毒產生的。如RNA病毒一樣，DNA病毒的這些DI顆粒可在用野生型病毒經高滴度感染后產生。如RNA病毒一樣，許多不同結構的DI顆粒也可由包含缺失、取代和重復之野生型基因組的DNA病毒產生。
還觀察到可減輕乳多空病毒(Brochman，1977，Proc.Med.Virol.2369-95)和腺病毒(Larsen，1982，Virology，116573-580)中的急性病毒感染。但也如RNA病毒一樣，一般認為DNA病毒的DI顆粒與持續感染有關。例如，DI基因組可在BK病毒(一種人乳多空病毒)轉化的細胞內自動復制(Yoga et al.，1980，Virology 103241-244)。
2.3.疫苗
2.3.1.失活和減毒的病原體制備疫苗的傳統方法包括使用失活的或減毒的病毒。病毒失活后使之無害，可用作生物學制劑，但又不致于破壞其免疫性。將這些“被殺死的”病毒顆粒注入宿主體內即可誘發能中和肝臟病毒進一步感染的免疫反應。但使用死疫苗(即失活的病毒)的一個主要問題是不能滅活所有的病毒顆粒。即使作到這一步，由于被殺死的病毒不能在其宿主中增殖，故常常縮短免疫力期限并須作附加免疫接種。最后，失活過程可改變病毒蛋白而使之減小作為免疫原的效力。
減毒可看作是產生基本上失去其致病能力之病毒株的過程。一種方法是使病毒生長于異常條件下和/或在細胞培養物中多次傳代。然后選擇已失去毒力但仍能夠引發免疫反應的病毒突變體。經減毒的病毒只能夠在宿主細胞內復制并誘發長期免疫力，故可用作良好的免疫原。然而，如果減毒不徹底，則會造成一系列問題。
2.3.2.亞單位疫苗可代替上述方法的是使用亞單位疫苗(如參見Blumberg和Millman的美國專利3636191號)，這包括只用含有相關免疫學材料的蛋白質進行免疫接種。亞單位疫苗的一個優點是去掉了無關的病毒材料。對許多被膜包裹的病毒來說，病毒編碼的糖蛋白含有能引起中和抗體作用的抗原決定基。HBV亞單位疫苗含有由慢性感染攜帶者血液中純化的乙型肝炎表面抗原(Krugman，1982，J.A.M.A.2472012-2015)。已證明這種疫苗對高危險成年人群如吸毒者、同性戀者及新生兒是有效且安全的。但由于血清來源有限、純化與滅活過程復雜，以及在其生產和審批中須在黑猩猩身上作致死性安全試驗等，所以其價格十分昂貴。
還可使用代表表面抗原上免疫學引入區的合成肽來制備亞單位疫苗。已經使用許多病毒如口蹄疫病毒(Bittle et al.，1982，Nature(London)29830-33)、流感A病毒(Muller et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78569-573)、脊髓灰質炎病毒(Emini et al.，1983，Nature(London)304699-703)和HBV(Itoh et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.839174-9178)嘗試了這一方法。將肽偶聯到載體(如血蘭蛋白、聚DL-丙氨酸)上并與一種佐劑一起使用。但該方法也存在某些缺點。如這些肽的抗原性較差，所以一般需要使用弗氏佐劑(一種致癌物)以增強產生免疫反應的能力。
使用重組DNA技術生產亞單位疫苗包括在適當載體內分子克隆和表達編碼這些蛋白質的病毒遺傳信息，以在宿主動物體內引發中和反應。
就HBV和其他病毒而言，已發展了許多在真核細胞內產生病毒表面抗原的方法。其中之一是用一種重組體轉染酵母細胞，在所說的重組體中，已將HBsAg基因在可誘導啟動子的下游插入到酵母表達載體內(參見Valenzuela et al.，1988，美國專利4722841號)。但該方法中必須破碎酵母細胞才能釋放出HBsAg，然后再用等密度及區帶離心法結合免疫親合層析法純化之。
已使用重組病毒在哺乳動物細胞內試驗了一些相似方法。一般是將用作載體以表達外來基因的病毒插入其基因組中。導入宿主動物體內后，重組病毒即可表達被插入的外來基因并因而可引發抗這些基因產物的宿主免疫反應。已使用重組牛痘病毒(Smith et al.，1983，Nature(London)302490-495)、具有復制起點缺陷的SV40重組病毒(Burnette et al.，1984，InModern Approaches to Vaccines，Lerner，R.A.and Chanock，R.M.(eds.)Cold Spring Harbor，NY，pp.245-250)、腺病毒(Morin et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 844626-4630)和牛乳頭狀瘤病毒(Statowa et al.，上述文獻，pp.239-243)產生了HBsAg及其他表面抗原。另外，已構建了一種用HBsAg取代其中之SV40VP1蛋白編碼區的SV40重組體(Levinson et al.，1988，美國專利4741901號)。
2.4.基因治療基因治療是指為治療疾病或功能失調而向細胞內轉移并穩定地插入新的遺傳信息。通常是將外來基因轉移到能夠增殖并將新的基因擴散到整個群體的細胞內。因此通常用于細胞或原始細胞作為基因轉移的靶細胞，因為它們是能產生各種強有力地表達外來基因之子代連鎖的增殖性細胞。
有關基因治療的研究大多集中在使用造血干細胞上。已研究了用于造血原始細胞轉化的高效率基因轉移系統(Morrow，1976，Ann.N.Y.Acad.Sci.26513;Salzar et al.，1981，In Organization and Expression of Globin Genes，A.R.Liss，Inc.，New York，p.313;Bernstein，1985，In.GeneticEngineeringPrinciples and Methods，Plenum Press，New York，p.235;Dick et al.，1986，Trends in Genetics 2165)。關于開發病毒載體系統的報導指出，該系統較DNA介導的基因轉移方法(如磷酸鈣沉淀和DEAE葡聚糖)有更高的效率，而且能夠在多種類型的細胞中穩定地整合被轉移的基因。重組反轉錄病毒載體在實驗中已廣泛地用于轉導造血干細胞和原始細胞。在用反轉錄病毒載體轉移后，在小鼠體內成功地表達的基因包括人次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Miller et al.，1984，Science 255630)和人β珠蛋白(Dzierzak，E.A.et al.，1988，Nature(London)33135-41基因。也已作為將細胞抗藥基因轉化到實驗模型內的形式，將細菌基因轉移到了哺乳動物細胞內。已使用以重組反轉錄病毒為基礎的載體系統，用真核細胞病毒載體將造血原始細胞轉化為藥物抗性細胞(Hock and Miller，1986，Nature(London)320275-277;Joyner et al.，1983，Nature(London)305556-558;Williams et al.，1984，Nature(London)310476-480;Dick et al.，1985，Cell 4271-79;Keller et al.，1985，Nature(London)318149-154;Eglitis et al.，1985，Science 2301395-1398)。已成功地用腺相關病毒載體轉導哺乳動物細胞系使之成為新霉素抗性細胞(Hormonat and Muzyczka，1984，上述文獻;Tratschin etal.，1985，Mol.cell Biol.53251)。已研究過的、用于基因轉移的其他病毒載體系統包括乳多空病毒和牛痘病毒(見Cline.1985，Pharmac.Ther.2969-92)。
基因轉移的其他方法包括微量注射、電穿孔、脂質體和染色體轉移以及轉染技術(Cline，1985，上述文獻)。Salser等人使用磷酸鈣沉淀轉染法將氨甲嘌呤抗性二氫葉酸還原酶(DHFR)或單純皰疹病毒胸苷激酶基因，以及人珠蛋白基因轉移到小鼠造血干細胞內。已證明DHFR和胸苷激酶基因可以在干細胞子代細胞內表達(Salser et al.，1981，In Orgamzation and Expresion of Globin Genes，Alan R.Liss，Inc.，New York，pp.313-334)。
也已在小鼠模型中研究了有關酶取代治療的基因治療方法，為此，用得自供體小鼠的正常干細胞重新構建無β半乳糖苷酶的小鼠造血細胞系統(Yatziv et al.，1982，J.Lab.Clin.Med.90792-797)。因為提供了天然基因，故不必再使用重組干細胞(或基因轉移技術)。
3.本發明的技術概要本發明涉及復制缺陷性肝炎病毒，特別是涉及兩種類型的缺陷性肝炎病毒DNA及其核酸順序。其中第一種類型(本文中稱之為“顆粒缺陷性”肝炎病毒基因組)不能提供復制所需的所有肝炎病毒功能，但能夠產生具有適當順式作用(cis acting)信號的前基因組RNA，這些信號是為將RNA包含于病毒顆粒中(包裝)和反轉錄成DNA所必需的。在一特定實施方案中，含有這類顆粒缺陷性基因組的肝炎病毒可能在核心抗原(HBcAg)、病毒聚合酶和/或表面抗原(HBsAg)的產生中是有缺陷的。本發明的第二種類型缺陷性肝炎病毒基因組(本文稱之為“包裝基因組”)是能夠轉錄成前基因組RNA的基因組，所說的RNA不能(ⅰ)反轉錄成雙鏈基因組DNA，和/或(ⅱ)自身包裝;但該基因組能被轉錄成編碼蛋白質的mRNA，所說的蛋白質反過來可為將第二種RNA包裝到病毒顆粒中或將第二種RNA轉錄成病毒顆粒DNA提供必要的病毒功能。在本發明的特定實施方案中，這種包裝基因組包括但不只限于在直接重復(DR)區即DR1內有缺失的基因組DNA。
可通過共表達顆粒缺陷性基因組和“輔助”肝炎病毒包裝基因組來產生含有顆粒缺陷性基因組的肝炎病毒顆粒。也可以通過共表達顆粒缺陷性基因組和編碼肝炎病毒包裝功能(如反轉錄酶、核心、被膜)的核酸載體(如質粒)來產生這種病毒顆粒。然后可用所得到的含有顆粒缺陷性基因組(“已包裝的顆粒缺陷性基因組”)的肝炎病毒感染肝細胞，顆粒缺陷性DNA被運到細胞內并在其中表達。但因為該病毒DNA的缺陷，故不能引起再次肝炎病毒感染。因此，在不存在進一步的肝炎病毒增殖及所導致的疾病時，被感染的肝細胞即可表達該顆粒缺陷性肝炎病毒基因組。
本發明還涉及包裝的顆粒缺陷性基因組和包裝基因組產物的治療應用。可將表達免疫原性抗原決定基(如HBsAg)的被包裝的顆粒缺陷性基因組和肝炎病毒包裝基因組產物配制成疫苗，用于防止肝炎病毒感染或用作免疫治療劑。在一個實施方案中，可將這種疫苗用作治療肝炎病毒感染或其后遺癥的免疫刺激劑。
本發明還涉及含有異源基因順序的包裝的重組顆粒缺陷性基因組以及這類病毒在治療中的應用。在本發明的一個實施方案中，可以使用當引入已知生物體時能夠在病毒或其他調節順序控制下表達的異源基因順序取代肝炎病毒基因組的各個區域，這些區域包括但不僅限于編碼能反過來由包裝基因組補充之病毒功能的順序。可用這類重組病毒對那些能通過肝臟酶的產生得以治療的酶缺乏癥(如凝血因子)進行基因治療。在本發明的另一實施方案中，可將含有異源基因的重組肝炎病毒配制成疫苗，用于防止病原微生物的感染或因存在其抗原而引起的病理狀態或失調。
在本發明的再一個實施方案中，可使用包裝的顆粒缺陷性基因組干擾野生型病毒感染的傳播或維持，和/或減輕與消除野生型病毒感染。
本發明的進一步的實施方案涉及用缺陷性肝炎病毒穩定轉染的永性性肝細胞系。穩定摻入有一個或多個缺陷性肝炎病毒基因組的細胞系能夠提供缺陷性肝炎病毒基因組的必需功能，并能夠產生傳染性缺陷性顆粒。在一個具體的實施方案中，用肝炎病毒的包裝基因組穩定地轉染永久性細胞系，從而使這些細胞系能夠永久性表達對第二種缺陷性基因組進行反式包裝和逆轉錄所需的產物(本文稱為“包裝細胞系”)。在包裝細胞系中導入顆粒缺陷性基因組，則可回收到包裝有顆粒缺陷性基因的后代。
3.1.定義本文中所使用的有關術語的含義如下dp＝堿基對DHBV＝鴨乙型肝炎病毒
DR＝肝炎病毒基因組的直接重復區，即DR1或DR2FBS＝胎牛血清GSHBV＝地松鼠乙型肝炎病毒HBV＝乙型肝炎病毒(人)HBcAg＝DHBV、GSHBV、HBV或WHBV的表面抗原kb＝千堿基Kd＝千道爾頓NTP＝三磷酸核苷WHBV＝旱獺乙型肝炎病毒△DR1＝為-DHBV包裝基因組，缺失為完全合成雙鏈病毒DNA分子所必需之12bp直接重復順序的DR1，顆粒缺陷性＝為一并不編碼所有包裝功能的缺陷性肝炎病毒基肝炎病毒基 因組DNA，但能夠轉錄成帶有適當順式作用信因組 號的前基因組RNA，所說的信號是為將RNA包涵于病毒顆粒中(包裝)并反轉錄成DNA所必需的肝炎病毒包＝為一可轉錄成前基因組RNA的缺陷性肝炎病毒裝基因組 基因組DNA，所說的前基因組RNA不能(a)被包裝和/或(b)反轉錄成雙鏈DNA基因組，但它們所編碼的信使RNA可編碼一種或多種蛋白質，以便為將合適的第二種前基因組RNA包裝到病毒顆粒中并將第二種RNA轉錄成病毒顆粒DNA提供必要的病毒功能包裝細胞系＝穩定摻入有至少一個肝炎病毒包裝基因組的永久性細胞系，該細胞系能夠表達這樣的病毒產物，這些產物是反式包裝合適的第二前基因組RNA至病毒粒子中和逆轉錄第二RNA至病毒DNA所必需的。
生產細胞系＝一種永久性細胞系，含有基本上持續生產含有缺陷性肝炎病毒基因組的傳染性肝炎病毒顆粒所必需的遺傳信息。
4.


圖1圖解顯示了DHBV DNA及主要轉錄本的結構和功能特征(a);顆粒缺陷性DHBV基因組的結構(b);△DR1包裝基因組的結構(c);及-DHBV重組基因組的結構(d)。
圖2顯示用顆粒缺陷性DHBV DNA轉染的HuH7細胞的免疫熒光染色結果。其中細胞分別用下列DNA轉染RV-718(pol-)、RV-2650(core-)、Kpn-(pol-env-)或Kpn-Spn-(pol-env-core-)，并于5天保溫后著染核心(a-c)或表面(a-s)抗原。放大40倍。
圖3顯示用Southern印跡雜交法檢測由pol-env-和pol-env-core-病毒突變體及-DHBV重組體的DNA轉染的HuH7細胞中出現的病毒復制DNA。其中各平皿(60mm)的HuH7細胞(2-3×10個細胞/皿)分別是用野生型DHBV(泳道1，3)、野生型+Kpn-Sph-(pol-env-core-)(泳道2，4)、△DR1(泳道5)、△DR1+Kpn-+1000(泳道7)、△DR1+Kpn-+180(泳道8)、△DR1+Kpn-Sph-(pol-env-core-)(泳道9)的DNA轉染的。Southern雜交分析是按下文6.4.2.節中所述方法，用一個正極的DHBV RNA探針進行的。泳道10為含有1微微克已克隆之DHBV DNA的雜交標準品。泳道11含有-HindⅢ分子大小標志物。曝光時間為4小時(泳道1和2)或48小時(泳道3-11)。圖左側標示了松弛環(RC)和單股(SS)形式之細胞內病毒DNA的位置。
圖4顯示用包裝基因組△DR1轉染之HuH7細胞的免疫熒光染色結果。其中染色顯示了用野生型DHBN(WT)或△DR1 DNA(△DR1)轉染的細胞的核心(a-c)或表面(a-s)抗原。PC相差圖。放大40倍。
圖5顯示用包裝基因組和顆粒缺陷性DHBV基因組轉染后HuH7細胞內的病毒復制形式。按圖3所述方法檢測病毒DNA。分別用野生型DHBV(泳道1)、△DR1(泳道2)、△DR1+Kpn-(pol-env-)(泳道3)、△DR1+RV-718(pol-)(泳道4)、△DR1+RV-2650(core-)(泳道5)、RV-2650(core-)(泳道6)、RV-2650(core-)+Kpn-(pol-env-)(泳道7)、RV-718(pol-)(泳道8)、RV-2650(core-)+RV-718(pol-)(泳道9)的DNA轉染細胞。圖中左側標示了細胞內松弛環(RC)和單鏈(SS)形式病毒DNA的位置。
圖6顯示檢測感染后HuH7細胞培養物上清中感染性病毒的結果。自1.5、3和6μg野生型DHBV DNA(泳道1、2、3)或3μg △DR1 DNA(泳道4、5)、Kpn-(pol-env-)(泳道6、7)或Kpn-Spn-(pol-env-core-)(泳道8、9)DNA轉染的HuH7細胞培養物各分離2ml上清液，并與初級鴨肝細胞的培養物保溫過夜。將感染的肝細胞保溫12天，提取總DNA并用如圖3中所述的Southern印跡雜交法分析病毒復制DNA的存在形式。泳道10含有λ-HindⅢ分子大小標志物。圖中左側標示了松環(RC)和單鏈(SS)DNA的位置。
圖7顯示DHBV突變DNA在共轉染HuH7細胞中對感染性病毒的抑制作用。以圖6所述的Southern印跡雜交法分析用病毒DNA感染的HuH7細胞上清液的感染性。分別用野生型DHBV(泳道1、2)、野生型+Kpn-(pol-env-)(泳道3、4)、野生型+Kpn-Spn-(pol-env-core-)(泳道5、6)、野生型+△DR1(泳道7、8)或野生型+pSP65(泳道9、10)的DNA轉染HuH7細胞，分離培養液并與肝細胞一起保溫以感染肝細胞，然后從感染的肝細胞中提取病毒DNA。
圖8(a)在1326位與1350位之間的野生型DHBV基因組的核苷酸順序，和顆粒缺陷性基因組lS的相應順序，在下文6.7節中有述。
(b)病毒復制型，在泳道1和2中，HuH7細胞用二聚體形式的顆粒缺陷性基因組lS轉染后進行Southern印跡雜交測定。用二聚突變lS基因組轉染的HuH7細胞的上清液(泳道5)或用lS二聚體加上△DRl二聚體轉染的HuH7細胞的上清液(泳道7)被用來感染初級鴨肝細胞，然后測定細胞中的病毒DNA。
Southern印跡雜交測定如圖3所述進行。泳道3，4，6和8分別代表對照泳道3-用來自患有活性DHBV肝炎的鴨的血清感染的鴨肝細胞;泳道4-用來自WT轉染的HuH7細胞的液體感染的鴨肝細胞;泳道6-用來自WT+△DRl轉染的HuH7細胞的上清液感染的鴨肝細胞;泳道8-未轉染的鴨肝細胞。
圖9.初級鴨肝細胞在用野生型DHBV感染(第1列)，和用從與缺陷性基因組△DRl和lS共轉染的HuH7細胞回收的上清液感染(第2列)后的免疫熒光染色，核心抗原被染色。放大率40倍。
圖10.質粒pHBV△DRl Neo，示出了方向和二聚體△DRl順序，可選擇標記物，和某些限制性位點的相對位置。R＝ECoRl，B＝BamHI，SV＝SV40調節DNA。
圖11.制備質粒pHBV△DRlNeo的構建步驟流程圖解。AmpR＝氨芐青霉素抗性基因;CAMR＝氯霉素抗性基因;R＝EcoRI;限制性位點如圖所示。
圖12.用透射式電子顯微鏡檢查HepB1-2細胞薄切片。放大率125，000倍。
圖13.推斷的△DRl DNA順序圖解，△DRl DNA衍生于質粒pHBV△DRlNeo，其在HepB1-2細胞中整合到宿主細胞DNA中。R＝EcoRI;B＝BamHI;pBR＝pBR322順序;鋸齒狀線＝細胞順序。
圖14.利用缺口轉移HBV探針，對分離自HepB1-2細胞培養物上清液的不同密度梯度部分的核酸進行Southern印跡雜交分析。通過在氯化銫中離心分離上清部分，然后從上清部分中分離出核酸，在下文8.2節中有述。梯度范圍值以g/ml計。
圖15.分離自用顆粒缺陷性基因組(X-)轉染的HepB1-2細胞上清液的核酸的Southern印跡雜交分析。用5mg(泳道1-3)和1mg(泳道4-6)的X-質粒DNA進行轉染。分級分離上清液，然后從各級分中分離核酸，在下文8.2節中有述。
5.本發明的詳細描述本發明涉及復制缺陷性肝炎病毒，特別是涉及兩種類型的缺陷性肝炎病毒基因組及其核酸順序。第一種類型(本文稱之為“顆粒缺陷性”基因組)不能自身提供復制所需的所有肝炎病毒功能，但能夠產生帶有適當順式作用信號的前基因組RNA，所說的信號是使RNA包含于病毒顆粒內(包裝)并反轉錄成DNA所必需的。在特定實施方案中，含有這種顆粒缺陷性基因組的肝炎病毒可能在核心抗原(HBcAg)、病毒聚合酶和/或表面抗原(HBsAg)的合成上是有缺陷的。根據本發明的第二種類型的缺陷性肝炎病毒基因組(本文稱之為“包裝基因組”)是能夠轉化成前基因組RNA的基因組，所說的前基因組RNA不能反轉錄成雙鏈DNA基因組和/或自身包裝，但該基因組能轉錄成編碼一種或多種蛋白質的信使RNA，所說的蛋白質能夠為將第二種前基因組RNA包裝到病毒顆粒中或將第二種RNA轉錄成病毒顆粒DNA提供必要的病毒功能。因此，包裝基因組能為包裝顆粒缺陷性基因組提供“輔助功能”。包裝基因組包括但不只限于在直接重復(DR)區即DR1和/或DR2中有缺失的肝炎病毒基因組。
可通過表達反向包裝所需要的肝炎病毒蛋白質(如核心、反轉錄酶、被膜)來包裝本發明含有異源基因順序的顆粒缺陷性肝炎病毒基因組，因為該顆粒缺陷性基因組本身不能以功能化形式提供上述蛋白質。這一表達過程導致了含顆粒缺陷性基因組之肝炎病毒顆粒(本文稱之為“已包裝的顆粒缺陷性基因組”或“顆粒缺陷性病毒”)的產生。在一個實施方案中，可通過一種或多種編碼提供這些功能的核酸載體(如質粒)的表達來提供反向包裝功能。在另一實施方案，通過表達一個或多個肝炎病毒包裝基因組來包裝顆粒缺陷性基因組。在一特定實施方案中，當使用基因轉移技術在體外將包裝基因組和顆粒缺陷性基因組一起導入適當細胞內時，包裝基因組的表達便提供了為將顆粒缺陷性基因組包涵于繼后由細胞內釋放之病毒顆粒內所需要的功能。在另一特定實施方案中，可通過將顆粒缺陷性基因組導入其中已穩定地摻入并表達了“輔助”包裝基因組的細胞系內來完成顆粒缺陷性基因組的包裝。
然后可用已產生的含顆粒缺陷性DNA的病毒顆粒(“顆粒缺陷性病毒”)于體外或體內感染肝細胞或其他敏感細胞，顆粒缺陷性DNA被輸入細胞并可在其中表達，但該病毒DNA因自身的缺陷而不能引起再次肝炎病毒感染。因此，可在沒有進一步的肝炎病毒增殖及所產生之疾病的情況下，由感染的肝細胞表達顆粒缺陷性肝炎病毒。
在一特定的實施方案中，可通過給予一種條件復制缺陷性肝炎病毒(如在可誘導的啟動子控制下的輔助病毒基因組，其只能在某些條件下起“輔助”病毒的作用)，在摻入顆粒缺陷性基因組的宿主細胞中誘導有限周期的肝炎病毒增殖。這種有限的病毒增殖可使顆粒缺陷性病毒DNA向宿主細胞作進一步但有限的非致病性擴散。在本發明的一個實例中，可使用重組顆粒缺陷性病毒DNA進行基因治療，這種條件病毒增殖作用可能是優選的。
在本發明的特定實施方案中，可將缺陷性肝炎病毒作為抗病毒劑用于治療肝炎病毒感染。可將這種病毒配制成抑制野生型病毒增殖和生存的干擾劑。
在另一實施方案中，可將表達免疫原性抗原決定基(如HBsAg)的包裝的顆粒缺陷性病毒或肝炎病毒包裝基因組產物配制成防止肝炎病毒感染的疫苗，或用作免疫刺激劑。
本發明還涉及包含異源基因順序的顆粒缺陷性重組肝炎病毒基因組、含有該基因組的病毒及這類病毒在治療上的應用。可用異源基因順序取代肝炎病毒基因組的各個區域，這些區域包括但不只限于編碼能反過來由包裝基因組彌補之病毒功能的區域。這樣，當異源順序被導入適當細胞內時即可在肝炎病毒或異源調節順序的控制下表達。在一個實施方案中，對于因異源DNA順序編碼的酶的缺乏而引起的疾病或紊亂，可使用含有這些重組基因組的病毒通過誘導肝臟酶的產生來進行基因治療。在本發明的另一實施方案中，可將含有編碼免疫原性抗原決定基之異源基因順序的重組肝炎病毒配制成疫苗，用以防止異種生物體的感染，或防止因存在抗原而引起的病理狀態或功能紊亂。5.1.缺陷性肝炎病毒基因組的產生和應用本發明涉及復制缺陷型肝炎病毒基因組，后者包括但不只限于可由包裝基因組反過來提供的功能包裝的顆粒缺陷性基因組，以及能夠反過來提供包裝功能的包裝基因組。本發明還涉及編碼顆粒缺陷性基因組或包裝基因組順序的核酸順序。
被包裝的顆粒缺陷性肝炎病毒基因組包括但不只限于有合成核心抗原(HBcAg)、病毒聚合酶和/或表面抗原(HBsAg)之缺陷的肝炎病毒基因組。在一特定實施方案中，這種合成上的缺陷可能是由于缺失給定蛋白質的部分或全部編碼區。在本發明的特定實施方案中，已包裝的顆粒缺陷性基因組不能編碼產生一種、二種或三種上述肝炎病毒蛋白質。
本發明的肝炎病毒包裝基因組包括但不只限于在順式病毒DNA合成所需的區域中或在前基因組RNA的順式識別與包裝所需的區域中有突變或缺失的基因組。在一個實例中，這種包裝基因組可在DR1(直接重復1)或DR2區域中有缺失。在另一實例中，肝炎病毒基因組在DR1區域中有缺失。還有一個實例中，包裝基因組在DR1和DR2區域均有缺失。已證明DR1和DR2區域參予病毒DNA合成的起始。
5.1.1.缺陷性病毒基因組的產生可使用重組DNA技術制得本發明的缺陷性肝炎病毒基因組。可使用的缺陷性肝炎病毒包括但不僅限于對人和高等靈長類有致病性的乙型肝炎病毒(HBV)、地松鼠乙型肝炎病毒(GSHBV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)和旱獺乙型肝炎病毒(WHBV)。
為便于敘述起見，可將制備本發明缺陷性肝炎病毒基因組DNA的方法分為下列幾個步驟。第一步包括分離野生型肝炎病毒DNA。可使用已知技術(參見Maniatis et al.，1982，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)，由肝炎病毒感染的肝細胞或克隆的DNA中得到肝炎病毒DNA。第二步是處理已分離的肝炎病毒DNA，使之產生可導致病毒復制缺陷的突變。必要時可在重新連接病毒基因組并感染或轉化敏感細胞之后，根據(a)核酸雜交，(b)是否存在“標志”基因功能，或(c)缺陷性肝炎病毒基因的表達來鑒定該缺陷性病毒。
可由肝炎病毒如HBV、DHBV、GSHBV及WHBV中制得野生型肝炎病毒基因組DNA。已克隆了這些基因組DNA并測定了它們的核苷酸順序(Seeger et al.，1984，J.Virol.51367-375;Mandart et al.，1984，J.Virol.49782-792;Galibert et al.，1982，4151-65;Valenzuela et al.，1980，InAnimal Virus Genetios，Field，B.N.，Jaenisch，R.and Fox，C.F.，eds.，Academic Press，NY，pp.57-70)。如果不容易從市場上買到已克隆的肝炎病毒DNA，則可以由肝炎病毒感染的肝細胞中制得肝炎病毒DNA(如參見Tuttleman et al.，1986，J.Virol.5817-25)。另外，可使用本領域內已知的方法由純化的病毒制得HBV、GSHBV、DHBV或WHBV DNA(如參見Mason et al.，1980，J.Virol.36829-836)。然后可按本領域已知的標準方法克隆肝炎病毒DNA(如參見Maniatis，T.et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
可使用本領域內已知的多種不同的方法分析克隆基因的核苷酸順序，如Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)，Sanger的雙脫氧方法(Sanger，F.et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463)，或使用自動DNA順序分析儀(如Applied Biosystems，Foster City，CA)。
可使用多種已知的戰略構建顆粒缺陷性基因組和肝炎病毒包裝基因組。在制備顆粒缺陷性基因組時，可用酶學或化學方法處理病毒DNA以使之產生有復制缺陷的突變，但仍保留順式包裝所需要的信號。在一優選實施方案中，用一種或多種限制性酶處理病毒DNA，以在特定位點上切斷并重新連接之。如果經限制性核酸內切酶消化后產生了有粘性DNA末端的適當缺失，便不必在連接之前進一步修飾DNA。但如果限制性酶消化后未產生粘性末端，或期望缺失另外的順序，則可在經過限制性酶切后用核酸酶如核酸酶Bal 31、核酸外切酶Ⅲ、λ核酸外切酶、綠豆核酸酶或T4DNA聚合酶的核酸外切酶活性消化之，以除去部分DNA順序。可用多種已知方法修飾經過酶處理的DNA末端，以利于病毒DNA的連接。例如可在限制性切割后，先經回頭消化或充填單股DNA末端等修飾過程產生平頭，然后再進行連接。可將編碼一個或多個限制性酶切點的寡核苷酸順序(接頭)連接到已切斷的病毒DNA末端上。然后在體外使肝炎病毒DNA順序相互連接，或連接到適當的表達載體順序上。
在一優選的實施方案中，顆粒缺陷性肝炎病毒的制備包括刪除編碼表面抗原、核心抗原和/或聚合酶/表面抗原的基因。編碼聚合酶的部分區域也編碼表面抗原。在造成缺失時可使用一種以上的限制酶。在本發明的一個實施方案中，經限制酶消化除去編碼兩種病毒蛋白的肝炎病毒DNA。在另一實施方案中，經限制酶消化除去編碼所有三種蛋白質的DNA。另外，也可以只經限制性酶消化除去一部分編碼HBsAg、HBcAg或聚合酶蛋白的肝炎病毒DNA，致使所得突變體只能表達無功能產物，或不能表達由減毒基因編碼的蛋白質。還可在一個、兩個或三個上述肝炎病毒基因上造成缺失。
在本發明的一個可代用的方法中，可經體外或體內突變制得顆粒缺陷性肝炎病毒基因組。其中的一個例子是，這種顆粒缺陷性基因組可能因轉錄(如啟動子)或轉譯的缺陷而不能表達病毒蛋白質。在另一實例中，肝炎病毒可能因病毒蛋白質的突變(如點突變或移碼)，阻止了蛋白質發揮正常功能而成為顆粒缺陷性的。如產生一種不能裝配的核心蛋白。可使用本領域內任何已知的誘變技術，如體外定點誘變(Hutchinson，C.，et al.，1978，J.Biol.Chem.2536551)，及使用TAB 接頭(Pharmacia)等。
可通過在DR1區中造成突變來制備肝炎病毒包裝基因組(見6.3節)。還可預期通過刪除DR2區來制得這種突變體。可使用上文公開的制備顆粒缺陷性基因組的技術制得肝炎病毒包裝基因組。在一優選方案中，可經限制性酶消化刪除DR1區域或其部分。可使用已知技術如限制性酶切圖和/或順序分析法來確定是否產生了適當的基因突變。
必要時可將顆粒缺陷性基因組及包裝基因組插入各種核酸載體內。在本發明的一個優選實施方案中，顆粒缺陷性基因組或肝炎病毒包裝基因組被插入到用于轉化適當宿主細胞的質粒克隆載體中，以復制DNA并產生許多所需肝炎病毒順序的拷貝。這可通過將肝炎病毒順序連接到具有互補粘性末端的克隆載體內來完成。但如果經限制性酶消化不能得到粘性末端，或優先產生了其他不同的位點，則可使用本領域內已知的多種技術在所需位點上連接缺陷性肝炎病毒DNA。例如，如上所述，可在用限制性酶切割之后進行修飾，即通過進一步消化或充填將單鏈DNA末端修成平頭，然后再進行連接。另外，可使用核酸酶“回頭嚼斷”已切斷的缺陷性肝炎病毒DNA的末端，以除去部分順序。可通過連接到DNA末端上將編碼一個或多個限制性切點的寡核苷酸順序(接頭)插入肝炎病毒DNA的某區域中。也可使用接頭(Linker)在肝炎病毒順序中產生適當的限制性切點。另外，可在體外或體內造成肝炎病毒順序的突變，形成新的限制性酶切點或破壞已有的酶切點，以便進行體外連接。
在本發明的一個特定實施方案中，可使用已知方法(參見Maniatis，T.，et al.，1982，Molecular CloningA Laborafory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)使缺陷性肝炎病毒的基因組二聚化。例如，可在連接反應中使用相對于載體DNA大大過量的缺陷性肝炎病毒DNA。
用摻入了肝炎病毒DNA順序的重組DNA分子轉化宿主細胞即可產生多個肝炎病毒DNA拷貝。從而可經培養轉化體、由轉化體中分離重組DNA分子，及必要時由分離的重組DNA中回放插入的基因而大量獲得肝炎病毒DNA。
一旦分離出制備肝炎病毒顆粒缺陷性基因組或包裝基因組所需的順序，即可將其插入適當表達載體即含有轉錄和轉譯蛋白編碼順序所需之必要構件的載體內。可利用多種宿主載體系統來表達蛋白編碼順序，其包括但不只限于病毒(如牛痘病毒、腺病毒、反轉錄病毒、SV40等)感染的哺乳動物細胞系統;病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統;微生物如含有酵母載體的酵母;或由噬菌體DNA、質粒DNA可裝配型質粒DNA轉化的細菌。這些載體的表達元件依據其強度和特異性而異。根據使用的宿主-載體系統不同，可使用任何一種適宜的轉錄和轉譯元件。例如，當在哺乳動物細胞系統內克隆時，可使用自哺乳動物細胞基因組分離的啟動子(如小鼠金屬硫因啟動子)，或自生長于這些細胞內的病毒分離的啟動子(如牛痘病毒7.5kb啟動子)。也可使用以重組DNA或合成技術制得的啟動子來轉錄被插入的順序。
為有效地轉譯已插入的蛋白編碼順序，還需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和其相鄰順序。起始密碼子必須與蛋白編碼順序的讀碼同步協調，以確保整個插入段的轉譯。這些外源性轉譯控制信號和起始密碼子可以是各種不同來源的，即天然與合成的。
可使用不同的方法將缺陷性肝炎病毒DNA插入載體內，對于質粒和噬菌體等表達載體可使用體外重組DNA與合成技術;對于病毒表達載體如牛痘病毒和腺病毒可使用體內重組(即基因重組)方法。
如果最終目的是將肝炎病毒順序插入病毒表達載體如牛痘病毒、腺病毒或反轉錄病毒中、則可修飾摻入顆粒缺陷性肝炎病毒或肝炎病毒包裝基因組的重組DNA分子，使基因側接于可在病毒表達載體感染的細胞內進行基因重組的病毒順序上，從而將肝炎病毒DNA插入其他病毒基因組中。
可用下列三種通用方法鑒定含有顆粒缺陷性肝炎病毒基因組或肝炎病毒包裝基因組順序的載體(a)核酸雜交，(b)是否存在“標志”基因功能，及(c)被插入順序的表達。第一種方法中，使用與肝炎病毒有同源順序的探針以核酸雜交法檢測是否存在已插入表達載體內的修飾的肝炎病毒基因組。在第二種方法中，可基于是否存在某些因在載體內插入了外來基因而產生的“標志”基因功能(如胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉化表型、桿狀病毒中閉合體形成等)來鑒定和選擇重組載體/宿主系統。例如，如果將修飾的肝炎病毒DNA順序插入在載體的標志基因順序內，可根據標志基因功能的存在來鑒定含有經過修飾之肝炎病毒基因組的重組體。在第三種方法中，可通過檢測由重組體表達的外來基因產物來鑒定重組表達載體。所用的檢測法可以是基于基因產物之物理學、免疫學、或功能特征的。例如，可用ELiSA法檢測是否存在與抗HBsAg、HBcAg或肝炎病毒聚合酶蛋白抗體反應的抗原決定基。
一旦鑒定了肝炎病毒順序，即可將含有肝炎病毒順序的表達載體轉移到適當宿主內。所用的方法包括但不只限于轉化(如當載體是質粒時)、噬菌體轉導、磷酸鈣介導的轉染(如使用哺乳動物細胞病毒載體時)或微量注射等。可選擇一種宿主細胞株，借以調節插入順序的表達，或以特定方式修飾與加工嵌合基因產物。存在某些誘導劑(如用于誘導金屬硫因啟動子的鋅和鈣)時可以提高某些啟動子啟動表達的能力。另外，修飾(如糖基化)和加工(如切割)蛋白質產物對于被編碼之蛋白質的功能是很重要的。不同的宿主細胞具有轉譯后加工與修飾蛋白質的不同特性和機制。可選擇適當的細胞系或宿主系統以確保對已表達的外來蛋白質進行必要的修飾與加工。
5.1.2.顆粒缺陷性基因組的包裝可通過提供反向包裝所需要的肝炎病毒基因產物將顆粒缺陷性肝炎病毒基因組包裝到肝炎病毒顆粒(本文稱之為“包裝的顆粒缺陷性基因組”)中。為此，可使用表達這些肝炎病毒基因產物的核酸載體(表達載體)反過來提供包裝功能。在另一實施方案中，可使用包裝基因編碼的產物包裝顆粒缺陷性基因組。可通過將包裝基因組與顆粒缺陷性基因組共轉染到敏感細胞(如肝細胞、白細胞)中，或將顆粒缺陷性基因組輸送(如通過轉染)到其中已穩定地摻入并表達了包裝基因組的包裝細胞系中來提供這些包裝基因組產物。然后可分離出代表已包裝之顆粒缺陷性基因組的病毒顆粒。可使用本領域內已知的方法(如參見Tuttleman et al.，1986，J.Virol.5817-25)純化病毒顆粒。另外，盡管已克隆到給定的載體內，仍可將肝炎病毒DNA用于治療等目的。
5.1.3.缺陷性肝炎病毒基因組和包裝的顆粒缺陷性基因組的應用可使用顆粒缺陷性肝炎病毒基因組、肝炎病毒包裝基因組及其基因產物預防和/或治療因肝炎病毒引起的疾病或紊亂。在本發明的一個實施方案中，可用表達肝炎病毒免疫原性抗原決定基的包裝的顆粒缺陷性基因組(如借助包裝基因組表達而包裝的)或缺失核酸的肝炎病毒顆粒(由包裝基因組表達而產生的)配制疫苗。可使用的病毒包括但不只限于HBV、DHBV、GHBV和WHBV。
在本發明的另一實施方案中，可用含有異源基因順序的缺陷性肝炎病毒顆粒配制疫苗，用以對抗異源病原體或進行基因治療。
在本發明的再一個實施方案中，可用包裝的顆粒缺陷性基因組作為治療劑，以治療因肝炎病毒感染引起急、慢性肝炎。該實施方案中，這些缺陷性病毒的作用在于干擾野生型肝炎病毒的復制(參見下文6.7.節)。
5.1.3.1.用于預防感染的肝炎病毒疫苗可根據本發明，由表達免疫原性抗原決定基(如核心抗原和/或表面抗原的一個或多個抗原決定基)的缺陷性肝炎病毒配制用于防止肝炎病毒感染的疫苗，為宿主提供保護性免疫力。如在一優選實例中，使用疫苗后表達了表面抗原的抗原決定基。
在本發明的一個實施方案中，可用肝炎病毒包裝基因組表達的蛋白質產物配制疫苗。例如可使用“空”病毒顆粒(即由于包裝基因組不能包裝其自身的前基因組RNA和/或合成其自身的基因組DNA而形成的缺少基因組DNA的病毒顆粒)制備疫苗。其中一個例子是由包裝基因組DNA轉染的細胞上清液中收獲這種空病毒顆粒。
在本發明的另一實施方案中，可由已包裝的顆粒缺陷性基因組配制疫苗。該方案中，抗抗原決定基的免疫反應是在已包裝基因組被導入敏感細胞并在其中表達之后產生的。顆粒缺陷性基因組一旦被導入這類細胞，即可在其中得以表達，但因其自身的缺陷而不會引發再次感染。一個例子是用于配制疫苗的已包裝的顆粒缺陷性基因組中編碼核心抗原的基因有缺失。另一個例子是編碼病毒聚合酶蛋白之基因的5′區域有缺失，從而可抑制這種蛋白質的表達，但不影響表面抗原的表達。還有一個實例是用于配制疫苗的已包裝的顆粒缺陷性DNA的核心抗原編碼區及聚合酶基因5′末端均有缺失。
5.1.3.1.1.基于缺陷性肝炎病毒表達的抗原決定基之免疫能力的測定可在用包裝的顆粒缺陷性基因組或肝炎病毒包裝基因組顆粒作免疫接種后，通過監測試驗動物的免疫反應來確定由疫苗制劑中含有已包裝之顆粒缺陷性基因組的病毒顆粒或“空”(即缺少基因組核酸)病毒顆粒(通過表達肝炎病毒包裝基因組產生的)表達的抗原決定基的免疫能力。試驗動物可包括黑猩猩和其他靈長類動物以及人(接種HBV)。引入免疫原的方法包括口服、皮內注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、鼻內給藥及其他常規免疫接種途徑。
可用各種方法分析試驗對象的免疫反應，如(a)使用酶聯免疫吸附法(ELiSA)、免疫印跡法、放射免疫沉淀法等已知技術檢測所得免疫血清對肝炎病毒抗原或其含有肝炎病毒抗原決定基的片段或分離的天然肝炎病毒的反應活性;(b)使用胚變反應檢測法、細胞毒性檢測法及遲發性超敏反應性等已知技術檢測由被免疫對象體內分離的淋巴細胞對肝炎病毒抗原或其片段、或病毒的反應活性;(c)免疫血清體外中和肝炎病毒感染性的能力，以及(d)被免疫動物的抗病能力及感染癥狀的減輕情況。
5.1.3.1.2.疫苗的配制本發明中這一實施方案的目的是配制一種疫苗，其中免疫原包含給定之肝炎病毒的抗原決定基，從而可引發抗肝炎病毒抗原決定基的免疫(體液和/或細胞介導的)反應，以防止肝炎病毒感染或由肝炎病毒引起的疾病或失調。這樣一種疫苗可以是單價或多價的。
可由表達一個或多個肝炎病毒抗原決定基的一種或少數幾種肝炎病毒顆粒制備多價疫苗。此外，當將缺陷性肝炎病毒基因組克隆到哺乳動物或昆蟲細胞病毒載體中時，可配制多價疫苗，以得到肝炎病毒基因產物和/或重組病毒。
本發明的疫苗制劑中使用的兩種主要類型的免疫原是(ⅰ)肝炎病毒顆粒，或(ⅱ)分離的肝炎病毒蛋白(用于亞單位疫苗)。在一個實施方案中，肝炎病毒顆粒可含有已包裝的顆粒缺陷性基因組，而得到只能對其自身造成一次感染的病毒顆粒。在該實施方案中，免疫原性抗原決定基是基于導入感受態細胞后表達已被包裝的肝炎病毒基因組而產生的。在另一實施方案中，用作免疫原的肝炎病毒顆粒可包含沒有病毒DNA的“空殼”(經導入細胞并在其中表達肝炎病毒包裝的基因組而產生的)。與已包裝的顆粒缺陷性基因組不同，這種空的病毒顆粒將不會在導入宿主細胞后合成肝炎病毒蛋白。
可用許多方法引入本發明的疫苗制劑;這些方法包括但不僅限于口服、皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、透皮和鼻腔內途徑，還包括親本野生型肝炎病毒的自然感染途徑。
5.1.3.1.3.抗缺陷性肝炎病毒抗體的使用用本發明的缺陷性肝炎病毒顆粒或其蛋白質進行免疫接種所產生的抗肝炎病毒抗體也可用于免疫診斷、被動性免疫治療及產生抗個體基因型抗體。
可用本領域內已知的標準技術(如免疫親合層析法、離心法、沉淀法等)分離所產生的抗體并用于診斷性免疫分析。也可使用抗體監測治療和/或疾病進程。本領域內已知的任何免疫檢測系統(如上文中列出的)均可用于這一目的，它們包括但不僅限于使用放射免疫法、ELiSA法(酶聯免疫吸附法)、夾心免疫檢測法、沉淀素反應法、凝膠擴散沉淀素反應法、免疫擴散法、凝集法、補體結合法、免疫放射測定法、熒光免疫法、蛋白A免疫測定法及免疫電泳法等的競爭性和非競爭性檢測系統。
本發明的疫苗制劑也可用于產生進行被動免疫治療的抗體，其對宿主的短期保護作用是經給予預先生成的抗異種生物體的抗體而達到的。
本發明的疫苗制劑產生的抗體也可用于制備抗個體基因型抗體。抗個體基因型抗體本身又可用于免疫接種，以產生與病原微生物之起始抗原結合的抗體亞群(Jerne，1974，Ann.Immunol.(Paris)125c373;Jerne.et al.，1982，EMBO J.1234)。
5.1.3.2.用作免疫治療劑在本發明的這一實施方案中，有效量的本發明之肝炎病毒顆粒(如5.1.2.1.2節中所述)，或由缺陷性肝炎病毒基因組編碼的蛋白質(其含有一免疫原性抗原決定基)均可用于免疫治療。在一個實施方案中，免疫原性抗原決定基可以是核心抗原的抗原決定基。在一優選實施方案中，抗原決定基可以是表面抗原的抗原決定基。
因肝炎病毒顆粒或肝炎病毒蛋白能夠刺激抗肝炎病毒的免疫反應，故在預防肝細胞瘤中是有效的。實驗結果表明，肝炎病毒感染和肝細胞瘤的發生之間在流行病學和分子水平上具有一定的關聯。可以單獨使用該免疫原，也可以結合使用其他療法(如化學療法、放射療法等)。
在本發明的一個特定實施方案中，可將缺陷性肝炎病毒顆粒或含有免疫原性抗原決定基的蛋白質用作免疫刺激劑，以刺激宿主的免疫系統，增強細胞介導的免疫力并有利于清除特定的感染因子(為甲型肝炎病毒、細胞肥大病毒)。在一優選實施方案中，因為肝炎病毒大多以高濃度見于被感染個體的肝細胞、血和骨髓內，所以可單獨使用包裝的顆粒缺陷性基因組或與其他療法結合治療那些感染上述類型細胞的疾病(如由甲型肝炎病毒、瘧疾寄生蟲、細胞肥大病毒、EB病毒等引起的疾病)。
5.1.3.3.治療肝炎病毒感染因于包裝的顆粒缺陷性肝炎病毒基因組能夠干擾野生型肝炎病毒的復制，故可作為抗病毒劑用于治療急性或慢性肝炎病毒感染。本發明的一個實施方案包括可產生缺陷性表面抗原、核心抗原或病毒聚合酶蛋白的肝炎病毒。在本發明的一優選實施方案中，顆粒缺陷性肝炎病毒不能合成病毒聚合酶蛋白，并可編碼剪切的表面抗原蛋白和剪切的核心抗原蛋白。該種顆粒缺陷性肝炎病毒可以單獨使用，也可以與其他抗病毒劑如α-干擾素和Vidarabine Phosphate等一起使用。
5.2.含有異源順序之包裝重組體顆粒缺陷性基因組的產生和應用本發明還涉及含異源基因順序之包裝顆粒缺陷性基因組。在本發明的一個實施方案中，可用異源克隆的基因取代肝炎病毒基因組的各種區域(它們包括但不僅限于可通過包裝基因組而反過來補充編碼病毒功能的區域)，這樣，當導入某生物體內時，異源基因將在病毒或其他調節順序的控制下得以表達。在本發明的一個實施方案中，異源DNA順序被插入肝炎病毒的表面抗原編碼區。在本發明的另一實施方案中，異源DNA順序則被插入肝炎病毒的核心抗原編碼區。這樣異源基因即可在肝炎病毒啟動子控制下得以表達。在另一可供選擇的實施方案中，可通過構建適當的重組DNA得以使用異源轉錄調節區。
這些重組肝炎病毒在治療上有許多方面的應用。在本發明的一個實施方案中，可使用這些重組肝炎病毒對影響肝臟的疾病或紊亂以及可通過肝臟內酶的產生得以治療的疾病進行基因治療(見下文5.2.2.1節)。例如用于治療因遺傳上肝臟酶缺乏、凝血因子缺乏或病原微生物感染引起的疾病。在本發明的另一實施方案中，異源基因可編碼肝臟酶或某種對病原因子有毒性的產物。
5.2.1.含異源順序之重組肝炎病毒基因組的產生可使用本領域內已知的重組DNA技術產生重組肝炎病毒基因組。可使用的肝炎病毒基因組包括但不僅限于乙型肝炎病毒(HBV)(其可感染人及高等靈長類動物)、地松鼠乙型肝炎病毒(GBHBV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)和旱獺乙型肝炎病毒(WHBV)。
為便于描述起見可將重組肝炎病毒基因組的產生方法分為下列三個步驟1)異源順序的分離;2)重組肝炎病毒DNA的構建;及3)重組肝炎病毒基因組的表達。
5.2.1.1.異源順序的分離可分離、使用任何編碼蛋白質產物并能在肝細胞內表達的異源DNA順序。本發明與治療酶缺乏有關的一個實施方案中(5.2.2.1節)，可分離使用任何編碼功能性酶(其缺乏構成了機能失調的基礎)的異源DNA順序(這些酶的非限制性舉例參見下文5.2.2.1節表Ⅱ)。在本發明的另一個特定實施方案中，使用可編碼凝血因子的DNA順序對遺傳性凝血功能紊亂進行基因治療，因為肝臟恰是生物合成這類因子的正常場所。分離的DNA順序可編碼給定酶的整個蛋白質順序或代表活性部位之順序的功能性部分。
異源DNA順序可編碼用于緩解疾病的基因產物。在一個涉及治序因感染病原微生物而引起的肝炎病變的實施方案中，異源基因順序可編碼對病原體有毒性但對宿主無明顯損害的產物，而在另一實施方案中，異源DNA順序則編碼可干擾病原體生活史的蛋白質產物。這類DNA順序可編碼某種病原體之改變了的基因產物或“反義”順序(即可與病原體的功能性核酸雜交的順序)。
本發明與疫苗的應用有關的另一個實施方案(見下文5.2.2.2節)包括分離一編碼異源生物抗原決定基的DNA順序，當將其引入適當宿主內時，可產生對抗該生物體或由其抗原引起之病理狀態的保護性免疫力。在本發明的這一實施方案中，可將包含異源基因順序的包裝重組顆粒缺陷性基因組制成疫苗，用以預防因含有異源基因順序之病原生物體引起的疾病。這些病原生物體的例子如表1所示。
表1可由重組肝炎病毒編碼抗原決定基的病原生物體E-B病毒甲型肝炎病毒非甲非乙型肝炎病毒細胞肥大病毒瘧原蟲(Plasmodium Spp.，瘧疾寄生蟲)在一優選方案中，重組肝炎病毒的異源順序編碼親肝細胞病原微生物的抗原決定基。
在一特定實施方案中，可分離出編碼瘧原蟲屬瘧疾寄生蟲抗原決定基(其對脊椎動物有免疫原性)的DNA順序，并可按本發明的方法使用之。可用作DNA來源的瘧原蟲屬寄生蟲包括但不僅限于人瘧原蟲P.falciparum，P.malariae、P.ovale、P.vivax，及動物瘧原蟲P.berghei、P.yoelii、P.knowlesi和P.cynomolgi。可由重組肝炎病毒表達的抗原或其片段是由瘧疾寄生蟲在其生活史的任何階段表達的抗原決定基。在一特定實施方案中，將被表達的異源抗原決定基是瘧原蟲的環形子孢子(CS)蛋白的抗原決定基(如參見Dame et al.，1984，Science 225593;Arnot et al.，1985，Science 230815;Weber et al.，1987，Exp.Parasitol.63295)。
其他可由重組肝炎病毒表達的抗原決定基包括但不僅限于A型肝炎病毒抗原的抗原決定基(von der Helm et al.，1981，J.Virol.Methods 337-43);CMV之64-66衣殼糖蛋白上的中和抗原決定基(Plotkin，1985，In The Herpesviruses，Roizman，B.and Lopez，C.，Plenum Press，N.Y.，pp.297-312);以及EBV膜抗原蛋白(gp340)上的中和抗原決定基(North et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797504-7508)。
可按已知技術分離依據本發明表達之編碼異源抗原決定基的基因順序，這些技術包括但不僅限于由微生物的基因組DNA中純化、由微生物的RNA進行cDNA合成、重組DNA方法(Maniatis T.et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)或化學合成。
5.2.1.2.重組肝炎病毒基因組的構建根據本發明的這一實施方案，重組肝炎病毒基因組的構建包括用編碼異源生物體之一個或多個抗原決定基的順序取代肝炎病毒基因組內的順序。在本發明的一個實施方案中，異源基因順序取代了編碼表面抗原和病毒聚合酶蛋白的基因。在本發明的另一實施方案中，異源基因順序取代了編碼表面抗原的基因。該方案中的重組肝炎病毒DNA可保留前S順序，順序中含有啟動表面抗原表達的啟動子。本發明的再一個實施方案中，異源基因取代了編碼核心抗原的基因。該方案的重組肝炎病毒DNA也可包含啟動核心抗原表達的前C順序。
本領域內已知的許多戰略均可用于構建重組肝炎病毒基因。例如可用已知技術，用限制性核酸內切酶在適當位點切斷肝炎病毒基因組或異源DNA的相關順序，然后分離并于細胞外連接之。如果限制性消化后產生了粘性末端，即不必作進一步修飾即可連接。但如果限制性消化后沒有產生可利用的粘性末端，或產生優選的方便位點以外的其他位點，則可采用現有技術中的任何一種方法，在如上所述的預期位點(見5.1.1.節)來完成異源DNA的連接。
構建基因融合體的具體戰略將取決于被取代或向其中插入異源順序的特定肝炎病毒順序，以及欲插入的異源順序。
5.2.1.3.重組肝炎病毒基因組的表達用三種通用方法鑒定含有異源基因插入段的肝炎病毒基因組(a)核酸雜交，(b)有無“標志”基因功能，以及(c)插入序列的表達。第一種方法中，可使用含有與外源插入基因有同源順序的探針，通過核酸雜交法來檢測在肝炎病毒載體中插入的外來基因。第二種方法中，可基于有無因在肝炎病毒載體中插入外來基因而產生的“標志”基因功能來鑒定并選擇重組載體/宿主系統。例如，如果外源基因插入到了肝炎病毒的聚合酶基因順序中，即可根據沒有聚合酶活性鑒定含有異源插入段的重組體。第三種方法中，可通過檢測由重組體表達的外來基因產物來鑒定重組肝炎病毒。這些檢測法可以是基于基因產物的物理學、免疫學或功能特性而建立的。
在下文實施例中詳述的本發明特定實施方案中，描述了取代肝炎病毒聚合酶和表面抗原基因之含異源基因順序重組肝炎病毒基因組的構建、表達和包裝。這種包裝的重組顆粒缺陷性基因組要求在其增殖的同時將一“輔助”肝炎病毒包裝基因組引入給定的細胞系內。6.3節中詳細描述了構建這種包裝基因組的一個實例，其可為將適當的前基因組RNA包裝到病毒粒子中并將RNA轉錄成病毒粒子DNA提供必要的病毒功能。
一旦鑒定了表達異源基因的肝炎病毒重組體，即可分析基因產物。可使用本領域內基于產物之物理學、免疫學或功能性質的方法進行上述分析。可使用包括層析(如離子交換層析、親合層析及分子篩柱層析)、離心、差分溶解度及純化蛋白質的其他常規方法分離并純化之。
5.2.2.含異源順序之重組肝炎病毒的應用5.2.2.1.基因治療含有異源基因順序的重組顆粒缺陷性基因組及其重組體肝炎病毒(即包裝的重組顆粒缺陷性基因組)可具有治療價值。將含有能由宿主細胞表達之異源基因順序的重組肝炎病毒穩定地摻入宿主細胞(如肝細胞)，可能在治療疾病和功能紊亂上具有很大價值。
為達到基因治療的目的，可使用許多已知技術將缺陷性重組肝炎病毒DNA導入細胞(如肝細胞)中。使用的技術應能將肝炎病毒順序穩定地轉移到宿主細胞(其包括但不僅限于肝細胞、淋巴細胞和白細胞)內，以使重組肝炎病毒順序在上述細胞內得以表達。且不致于破壞受體細胞所必備的發育和生理功能。在一優選實施方案中，將重組顆粒缺陷性肝炎病毒DNA包裝在病毒顆粒中(如通過使用輔助包裝基因組表達來實現)，然后這種病毒顆粒即可通過正常肝炎病毒感染途徑將其所包含的重組DNA穩定地轉移到宿主細胞內。病毒顆粒的使用途徑包括但不僅限于肝內、口服、靜脈內、皮下、腹腔內、肌肉內、真皮內及鼻腔內等。
在本發明的具體實施方案中，可使用重組肝炎病毒治療肝功能代謝失調性疾病。其中一個實施方案中，可用這些重組肝炎病毒治療因遺傳性肝臟酶缺乏引起的肝臟疾病。這些遺傳性病征包括但不僅限于表Ⅱ中所列出者(有關對這些病征的詳細討論詳見Sharp，1985，In Gastroenterology，Berk，J.E.，ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.3236-3258)。
表Ⅱ可通過含異源基因順序之顆粒缺陷性基因組的表達治療的疾病或功能紊亂1.肝臟酶的遺傳性缺乏A.血氨過多1.遺傳性尿素循環酶缺乏癥a.N-乙酰谷氨酸(AGA)合成酶缺乏癥b.氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)缺乏癥c.鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OCT)缺乏癥d.瓜氨酸血癥e.精氨琥珀酸尿癥2.來自分支鏈氨基酸、奇數鏈脂肪酸和膽甾醇側鏈分解代謝的遺傳性有機酸血癥a.丙酸血癥b.甲基丙二酸血癥c.異戊酸血癥B.嬰幼兒膽汁郁積
1.半乳糖血癥2.α-抗胰蛋白酶缺乏癥3.三羧基糞甾烷酸血癥C.Hematomegaly(肝腫大)1.糖原貯藏性疾病根據酶缺乏情況分為4個類型2.果糖不耐受性疾病3.酪氨酸血癥4.酸性脂肪酶缺乏癥D.少年期后肝臟疾病1.血色素沉著癥2.威爾遜氏病Ⅱ.遺傳性凝血機制紊亂A.血友病A-因子Ⅷ缺乏癥B.血友病B-因子Ⅸ缺乏癥C.罕見的遺傳性凝血機制紊亂(如血纖維蛋白原缺陷、因子Ⅴ缺陷，因子Ⅺ缺陷等)可由重組肝炎病毒基因組編碼的其他蛋白質包括但不只限于補體成分、中等鏈酰基輔酶A脫氫酶、低密度脂蛋白受體、胰島素、消化酶等。
在本發明的另一實施方案中，可使用編碼凝血因子之重組肝炎病毒基因的表達來治療遺傳性凝血機制障礙(其例子如表Ⅱ所示，有關這些疾病或紊亂的詳細描述可參見Jandl J.H.，1987，In Blood，Textbook of Hematology，LittleBrown and Co.，Boston，MA，pp.1095-1140)。目前的治療方法是從具有正常因子水平者的血漿內分離特定因子進行取代治療。但這樣接受取代治療的病人便有可能同時感染供體攜帶的血源病毒。使用本發明的療法則可消除這種危險。肝臟是生物合成各種凝血因子如因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和ⅩⅢ，以及纖維蛋白溶酶原的場所。在一特定實施方案中，重組肝炎病毒顆粒缺陷性基因組的表達可提供一種或多種這類因子。
在本發明涉及治療酒精中毒性肝臟疾病的特定實施方案中，可使用表達對乙醇有較低km值之突變型醇脫氫酶的重組肝炎病毒，以加速乙醛的生成，因乙醛可使飲酒者惡心嘔吐，從而抑制其嗜酒習性。
本發明的另一實施方案涉及用重組肝炎病毒治療因感染病毒微生物而引起的肝臟疾患。這種重組肝炎病毒可包含表達利于疾病緩解之產物的異源基因，所說的產物對病原體有毒性但對宿主則無明顯的不良影響，或者可干擾病原體的生命周期等。根據本發明的這一實施方案，可用重組肝炎病毒治療之疾病的病原體包括但不只限于表1中所示者。異源基因可編碼病原微生物的改變了的基因產物。另外有可能構建表達肝細胞病原體核酸之“反義”順序的重組肝炎病毒。這種與病原體的RNA或DNA互補的順序可與病原體RNA或DNA雜交并使之失活，從而抑制病原體核酸的功能或表達，并干擾其生命周期。
為了進行基因治療，可由本發明的重組顆粒缺陷性DNA表達許多其他異源順序。例如，為了治療某種因特定產物過多引起的疾病，可以表達該產物的抑制劑或降解酶，或其合成抑制物。為阻斷特定基因的轉錄過程，可用重組肝炎病毒DNA表達反義寡核苷酸。
5.2.2.2.疫苗應用根據本發明的這一實施方案，將包含異種生物體之免疫原性抗原決定基的重組肝炎病毒顆粒或蛋白質制成疫苗使用。可使用這類疫苗對抗異種病原微生物的感染(如包括但不僅限于上文表Ⅰ中所示者)，或對抗由微生物抗原引起的病理狀態或紊亂。這類疫苗可包括活的顆粒缺陷性肝炎病毒疫苗或亞單位疫苗制劑。可使用適當的肝炎病毒包裝基因組或其他來源的肝炎病毒蛋白包裝肝炎病毒重組體，并將所得病毒顆粒制成疫苗，或者可純化已表達的含異源抗原決定基的蛋白質用作亞單位疫苗。本發明的疫苗制劑可用于動物和/或人體。
5.2.2.2.1.重組肝炎病毒表達之異源抗原決定基的免疫效能檢測可在用重組肝炎病毒免疫接種后測試驗動物的免疫反應，以檢測活疫苗制劑中重組肝炎病毒表達之異源抗原決定基的免疫效能。亞單位疫苗中可用適當佐劑配制以提高免疫反應能力，并可在用分離的重組肝炎病毒的異源產物免疫動物后檢測被試動物的免疫反應情況。適用的佐劑包括但不只限于礦物膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂、普盧蘭尼多元醇、聚陰離子、油乳劑、肽類及可用于人體的佐劑如BCG(卡介苗)和微小棒狀桿菌(Corynebacterium Parvum)。試驗動物包括黑猩猩及其他靈長類，如果肝炎病毒是HBV則可以是人類受試者。也可將經基因重組構建的含有異種生物抗原決定基的其他肝炎病毒如DHBV、GSHBV和WHBV用于疫苗制劑中，分別免疫鴨、地松鼠或旱獺，以對抗異種生物體的感染。引入免疫原的方法包括但不只限于口服、皮內注射、肌肉注射、腹腔內注射、靜脈注射、皮下注射、滴鼻及其他常規免疫接種法。
可用各種方法分析受試者的免疫反應，如(a)用已知技術，如酶聯免疫吸附法(ELiSA)、免疫印跡法、放射免疫沉淀法等分析所得免疫血清對含有異源抗原決定基的天然抗原或其片段、或天然存在之異種生物體的反應活性;(b)用已知技術，如胚變反應測定法、細胞毒性檢測法、遲發型超敏感性檢測法等分析自免疫受體內分離之淋巴細胞對天然抗原或其片段、或異種生物體的反應活性;(c)免疫血清體外中和生物體感染性或天然抗原生物學活性的能力，以及(d)免疫接種動物對抗疾病的能力和/或感染癥狀緩解情況。
5.2.2.2.2.疫苗的配制在本發明的一個實施方案中，將表達異種生物體抗原決定基的重組肝炎病毒配制成活疫苗使用。在另一實施方案中，則可將這種重組體病毒的蛋白質產物配制成亞單位疫苗。活疫苗或亞單位疫苗可以是多價或單價的。本發明的疫苗制劑可用于人和/或動物。
5.2.2.2.2.1.活疫苗制劑該實施方案的目的是配制一種疫苗，其中的免疫原是一種包裝的重組顆粒缺陷性基因組，其包含編碼異種生物體之抗原決定基的順序并能在體內表達，從而引發對異源抗原決定基的免疫反應(體液免疫和/或細胞免疫)，以對抗該生物體的感染或由該生物體之抗原引起的疾患。這種活疫苗將使顆粒缺陷性基因組導入敏感細胞并在其中表達，但不會發生再次感染。
活疫苗制劑可以是單價或多價的。可由單個或少數幾個編碼一個或多個異源抗原決定基的包裝的重組顆粒缺陷性基因組(其可以是不同生物體的)制備多價疫苗。單個重組肝炎病毒基因組可編碼同一或不同抗原的一個以上的抗原決定基。
可用許多方法引入本發明的活疫苗，這些方法包括但不只限于口服、皮內注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、皮下植入、經鼻腔途徑以及親本野生型肝炎病毒的自然感染途徑。
5.2.2.2.2.2.亞單位疫苗制劑作為配制活疫苗的另一方法，可使用異源肽或蛋白質作為亞單位疫苗制劑(其可以是多價的)中的免疫原。如前所述，亞單位疫苗只含有免疫宿主所必需的相關免疫原性材料。因此可使用現有技術中的已知方法，由表達異種抗原決定基的重組肝炎病毒中純化這些可以是重組融合蛋白的異種蛋白質。
將純化的蛋白質調到適當濃度，加入適當的疫苗佐劑配制并包裝備用。適用的佐劑包括但不僅限于上文5.2.2.2.1.節所述者。疫苗制劑中的免疫原也可以與脂質體、或與多糖和/或其他聚合物合并使用。
可用許多方法引入上述疫苗制劑，這些方法包括但不只限于口服、皮內注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下及鼻腔內途徑等。
5.3.重組肝炎病毒抗體的使用也可將用本發明的重組肝炎病毒進行免疫接種而產生的抗異種生物體抗體用于免疫診斷、被動免疫治療、及產生抗個體基因型抗體。
可使用現有技術中的標準方法(如免疫親合層析法、離心法、沉淀法等)分離所產生的抗體，并用于診斷性免疫檢測法中以檢測存在于人或動物組織、血液、血清內具有醫學或獸學重要性的病毒顆粒、細菌或寄生蟲。也可用所得抗體監測治療和/或疾病的進程。為此目的而使用的已知免疫檢測系統包括但不僅限于使用放射免疫法、ELlSA(酶聯免疫吸附法)、“夾心”免疫檢測法、沉淀素反應法、凝集法、凝膠擴散沉淀素反應法、免疫擴散法、補體結合法、免疫放射測定法、熒光免疫法、蛋白A免疫檢測法及免疫電泳法等的競爭性和非競爭性檢測系統。
本發明的疫苗制劑還可用于產生進行被動免疫治療的抗原，其中對宿主的短期保護是通過給予抗異種生物體的預制抗體達到的。
由本發明的疫苗制劑產生的抗體也可用于生產抗個體基因型抗體。然后可反過來再用抗個體基因型抗體免疫接種，以產生與病原微生物之起始抗原結合的抗體亞群(Jerne，1974，Ann.Immunol.(Paris)125c373;Jerne.et al.，1982，EMBO J.1234)。
6.缺陷性肝炎病毒的產生在本文詳述實施例中，使用鴨模型系統，通過構建兩種類型的缺陷性鴨乙型肝炎病毒基因組進一步闡明了本發明。第一種類型的顆粒缺陷性DHBV基因組缺失編碼聚合酶蛋白、核心抗原和/或表面抗原的基因(見圖1)。這些基因組不能自身復制，但在各種情況下均可產生具有適當順式功能信號的前基因組RNA，以適應在病毒顆粒中包涵RNA并反向轉錄為DNA的需要。第二種類型的缺陷性DHBV基因組即包裝基因組，其缺失DHBV基因組的DR1區域。這些突變體基因組反過來可為病毒提供將適當前基因組RNA包裝到病毒顆粒內及將RNA轉錄成病毒粒子DNA所必需的所有功能。但突變的基因組本身并不能反向轉錄成基因組DNA。
6.1.通用方法6.1.1.細胞由C.Koiki愽士(Department of GeneResearch，Cancer Institute，Tokyo，Japan)處得到人肝腫瘤細胞系HuH7(Nakabayaski et al.，1982，Cancer Res.423858-3863)并在Dulbecco 氏改良的Eagle培養基(DMEM)加有10%胎牛血清的F12(FBS)(G1BCO，Grand Island，NY)中擴增。用膠原酶灌注法(Tuttleman et al.，1986，J.Vorol.5817-25)從2周令北京鴨(得自W.Mason愽士，Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，PA)的肝臟中分離用于建立初級鴨肝細胞培養物的肝細胞。在加有10mM碳酸氫鈉、1.5%(V/V)二甲亞砜(DMSO)、5%FBS及前述添加物(Tuttleman et al.上述文獻)的無血清L15培養基(G1BCO，Grand Island，NY)中增殖初級鴨肝細胞。然后在含5%CO2(V/V)的孵箱內于37℃下保溫。
6.1.2.質粒由在EcoRⅠ位點，p5.2Gal×1處克隆到質粒pSP65載體中的DHBV基因組DNA得到用于構建缺陷性DHBV基因組的DHBV順序，該順序衍生于Mandart等人用來測定DHBV DNA核苷酸順序的病毒顆粒DNA克隆(Mandart et al.，1984，J.Virol.49782-792)。
6.1.3.DNA的制備、限制性消化和修飾限制性酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶及大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段均購自New England Biolabs(Beverly，MA)。除特別指出外，酶反應均按提供者建議的條件完成。
限制性酶消化后分離DNA片段，并在TBE緩沖液(0.01MTris-硼酸鹽、PH8.2，1mMEDTA)中使用5%聚丙烯酰胺凝膠，或在Tris-醋酸鹽緩沖液(0.02M Tris-醋酸鹽、0.05M醋酸鹽、1mM EDTA、PH7.4)中使用0.8%或1.5%瓊脂糖凝膠經凝膠電泳純化之。可在紫外光下觀察于PEI(聚乙烯亞胺)薄層層析板上顯現的DNA片段負性陰影、亦可用溴化乙錠染色直接觀察DNA片段。可在TBE緩沖液中以200V室溫下電洗脫2小時，或者用苯酚提取液化的凝膠，由低熔點瓊脂糖凝膠中回收DNA片段。
采用β-氰乙基氨基磷酸酯化學法(Sinha et al.，1984，Nucl.Acids Res.124539-4544)，在Applied Biosystems公司生產的380B型合成儀中基于0.2微摩爾規模合成寡核苷酸。在TBE緩沖液中使用聚丙烯酰胺/8M尿素凝膠經凝膠電泳分離并純化寡核苷酸，然后在紫外光照射下在PEI薄層層析板上顯示出寡核苷酸的負性陰影。在TBE緩沖液中以200V室溫電洗脫2小時以回收寡核苷酸。
6.2顆粒缺陷性DHBV基因組的構建用Kpn I消化野生型基因組，在四種dNTP存在下用T4聚合酶處理，再用T4DNA連接酶閉合質粒環(見圖1b)以產生缺失聚合酶和表面抗原(即被膜)基因(pol-，env-)區的顆粒缺陷性DHBV基因組。先用Kpn′I消化DHBV基因組、導致KpnI限制性切點丟失并產生Kpn-基因組，得到缺失所有三個病毒基因編碼區的pol-env-core-突變DNA(稱為Kpn-Sph-)(圖1b)。再用SpnI消化Kpn-基因組，并在四種dNTP存在下用T4聚合酶處理之。然后用T4 DNA連接酶閉合質粒環。
用EcoRV部分消化野生型基因組以產生pol-突變基因組(稱為RV-718)或core-突變基因組(稱為RV-2650)(圖1b)。為此目的，于37℃下用2單位EcoRV將5μg野生型DHBV DNA消化15分鐘。然后在dGTP存在下于T4 DNA聚合酶反應混合物中保溫此部分消化產物。
可采用下列戰略使所有顆粒缺陷性DHBV基因組二聚化。第一是使用部分EcoRI消化，其中于37℃下用2單位EcoRI消化5μg DHBV DNA，從而在側接基因組的兩個EcoRI位點之一處切斷質粒。在1%瓊脂糖中經溴化乙淀熒光染色法鑒定線性化的DNA，并在TBE緩沖液中室溫下以150V電洗脫2小時回收之。然后用細菌堿性磷酸酶處理分離出的線性質粒并與在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上純化的相應EcoRI酶切的單體基因組相連接。二聚化的第二種戰略是使3至10倍過量的EcoRI酶切并經電泳純化的單體與EcoRI-細菌堿性磷酸酶處理的pSP65DNA相連接。
經轉化到大腸桿菌HB101細胞內以擴增克隆到pSP65中的缺陷性DHBV基因組。然后對質粒DNA進行限制性酶切分析以鑒定二聚體克隆。
6.3.DHBV包裝基因組的構建首先將包含在野生型基因組BamHI位點(在1658位核苷酸處)和EcoRI位點(在3021位核苷酸處)之間的遠端部分插入到沒有AccI限制性位點的pBR322衍生物中，以產生在稱為△DR1基因組的DR1中有缺失的(見圖1c)DHBV基因組。此可通過AccI消化、用Klenow酶充填并使用T4連接酶連接而完成，如此刪除pBR322核苷酸651和2246之間的順序。然后用Af1Ⅱ和AccⅠ自重組質粒上切下(分別在核苷酸2526和2577處切斷質粒DNA)含DR1區域(核苷酸2535-2546)的野生型DHBV基因組部分，并用準確缺少DR1之12個堿基對的雙鏈合成DNA片段取代之。最后，將DHBV基因組含上游端連接質粒順序的近端部分作為BamHI片段插入唯一BamHI位點。
同減毒的DHBV基因組一樣，也可采用6.2.節中所述的任一種戰略使△DR1基因組二聚化。通過轉化到大腸桿菌HB101細胞內來擴增已克隆到pSP65中的△DR1基因組。可根據DR1缺失位置上是否存在新的HinfI位點來鑒定二聚體克隆。
6.4.缺陷性DHBV基因組的表達用鈣沉淀法(Graham and van der Eb，1973，Virology 52456-467)將顆粒缺陷性和包裝基因組DHBV DNA(3μg)轉移到HuH7細胞上。五天后，根據HBcAg和/或HBsAg的存在監測顆粒缺陷性和包裝基因組DHBVDNA的表達情況。在95%(V/V)乙醇5%(V/V)冰醋酸中于-20℃下固定細胞。使用兔抗HBcAg或HBsAg抗血清(由W.Mason愽士提供，Fox Chase Cancer Center Philadelphia，PA)和若丹明結合的羊抗兔IgG(Tuttleman et al.，1986，J.Virol.5817-25)，以間接免疫熒光法檢測HBcAg和/或HBsAg。
6.4.1.顆粒缺陷性DHBV基因組的表達用免疫熒光素染色法進一步證明了缺失核心抗原編碼區(圖2，RV-2650)的顆粒缺陷性DHBV DNA不能產生核心抗原(參見圖2)。還使用免疫熒光素染色法進一步證實了缺失表面抗原和聚合酶蛋白編碼區(Kpn-DNA)以及缺失核心抗原、表面抗原和聚合酶蛋白編碼區(Kpn-Spn-DNA)的顆粒缺陷性DHBV DNA不能產生表面抗原。RV-2650突變DNA能產生表面抗原，而缺失聚合酶蛋白編碼區(RV-718)和Kpn-基因組的顆粒缺陷性DHBV能產生預期的核酸衣殼(核心)蛋白。Kpn-Sph-編碼剪切的表面抗原和剪切的核心抗原，但并不能用免疫熒光法檢測出來。
6.4.2.包裝基因組的表達如上所述，包裝基因組缺失了一特定的病毒順序即稱為DR1的12堿基對直接重復順序，而該順序是全合成雙鏈病毒DNA所必需的。用磷酸鈣沉淀法(Graham and van der Eb，1973，Virology 52456-467)將包裝基因組轉染到HuH7細胞內。五天后用HBS(12mM Hepes、0.15M NaCl、PH7.45)洗細胞，并向細胞內直接加入1ml溶解緩沖液(10mM Tris-HCl(PH7.9)、1mMEDTA、0.1%(W/V)NP-40、50mM NaCl、8%(W/V)蔗糖)。于37℃保溫10分鐘后除去溶胞產物，并在Beckman B型微量離心機中以13，000rpm離心2分鐘沉淀核及其他不溶性材料。然后用下述方法分離出含有DHBV DNA合成中所有中間體的病毒核心顆粒。除去上清液并加入醋酸鎂(MgAc2)至終濃度為6mM。在100μl含50mM Tris-HCl(PH7.9)6mM MgAc2的溶液內加入脫氧核酸酶I(DNase Ⅰ-Sigma Ⅱ型)至濃度為100μg/ml。懸浮液于37℃消化10分鐘后加入8%聚乙二醇-8000和0.5M NaCl沉淀病毒核心。在微型離心機中4℃離心收集沉淀物并溶解于含50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、0.1M NaCl和100μg/ml DNase I的0.3ml緩沖液中。37℃保溫30分鐘后，將反應混合物調整為含15mM EDTA、0.5%SDS和500μg/ml鏈霉蛋白酶(pronase)。37℃保溫30分鐘后，用等體積苯酚提取樣品。用乙醇從水相中沉淀核酸，溶解于10mM Tris-HCl(PH7.5)、1mM EDTA中，并使用Tuttleman等人(1986，J.Virol.5817-25)所述的條件在1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠中電泳。電泳后，將凝膠在0.5N NaOH、1.5M NaCl中浸泡30分鐘并使用Southern吸印轉移法(Southern，1975，J.Mol Biol.98503-517)將其轉移到0.2M Tris-HCl(PH4.0)、1.5M NaCl中的尼龍薄膜(Hybond N，Amersham)上。轉移后用2×SSC簡單沖洗濾膜，然后風干并暴露于紫外光源(240-390nm)下5分鐘，以使DNA共價交聯到濾膜上。于50℃使濾膜與加有鏈極性的32P標記的DHBV核苷酸探針雜交。于-80℃下使用柯達X-OMAT膠片和增光屏進行放射自顯影。
圖3泳道5所顯示的結果表明，盡管形成了一些單股負鏈DNA(SS)，但該突變DNA并不產生完整的松環DNA(RC)。泳道3的比較實驗顯示，用同等量野生型病毒DNA轉染細胞后產生了復制性中間體。
用固定細胞的間接免疫熒光素染色法檢測病毒衣殼和殼包核酸蛋白的產生，以分析這些轉染后的細胞(圖4)。似乎△DR1轉染的細胞產生的核心(C)和表面(S)抗原量與野生型細胞產生者相當。
6.5.△DB1對DNA合成所需病毒功能的補償在共轉染實驗中，試驗了△DR1補充病毒DNA合成功能的能力。將在核心抗原(RV-2650)、病毒聚合酶(RV-718)、病毒RNA聚合酶和表面抗原合成(Kpn-)中有缺陷的簡單移碼突變DNA及不足以合成所有這三種已知病毒蛋白(Kpn-Sph-)的突變DNA(見圖1b)連同包裝基因一起共轉染到HuH7細胞中。所有這些情況下，△DR1均能彌償這些缺陷性基因組，以產生完整的松環病毒DNA(見圖3和5)。
另外還顯示，這些顆粒缺陷性DHBV基因組也可以相互補償。例如，當core-突變DNA與pol-突變或Kpn-突變DNA共轉染時，它能夠補償這些DNA的缺陷，以產生病毒DNA(圖5，泳道7和9)。
6.6.由轉染的HuH7細胞及缺乏感染性的△DR1、Kpn-和Kpn-Spn-上清液轉染的細胞產生感染性病毒顆粒培養的HuH7人肝細胞瘤細胞可產生能夠感染初級鴨肝細胞的病毒顆粒。用大約5×106個HuH7細胞接種100mm平皿，24小時后用1.5、3和6μg克隆的野生型二聚DHBV DNA轉染之。轉染后48小時換培養基(DMEMF12+10%FBS)(G1BCO，Grand Island，NY)，繼續培養3天后除去培養基，等量分配到含初級鴨肝細胞(48小時前制備的)的3×60mm平皿上。于37℃用HuH7培養基感染肝細胞20小時。感染后第12天用Tuttleman等人(1986，J.Virol.5817-25)所述的方法收獲細胞，用Southern印跡雜交法(見6.4.2節)根據DHBV DNA復制中間體的存在分析總細胞內DNA。圖6顯示培養物中出現了病毒DNA，表明HuH7培養物上清中已存在感染性病毒。單用△DR1 DNA，或用Kpn-或單用Kpn-Sph-突變DNA轉染，沒有顯示存在復制性中間體(圖6)。因此，HuH7細胞能夠由野生型克隆的DHBV DNA產生感染性DHBV，且如所期望的，這些細胞沒有由△DR1、Kpn-或Kpn-Spn-突變DNA產生感染性病毒，因為前者是有復制缺陷的。
6.7.細胞與△DR1基因組和顆粒缺陷性基因組共轉染之后感染性病毒的產生為了檢測由與包裝基因組和顆粒缺陷性基因組共轉染的細胞感染性病毒的產生，構建了另一個顆粒缺陷性基因組，命名為S1。基因組S1被專門設計為被膜產生缺陷性，而DNA合成完全勝任性的(例如，env-pol+)。在S1突變型中保持了聚合酶功能，從而使病毒DNA的復制和病毒基因產物的產生比被膜和聚合酶功能均缺失的顆粒缺陷性基因組(例如，Kph-)有所提高。
S1顆粒缺陷性基因組是由野生型DHBV基因組DNA(見上文，6.1.2節)通過用相應大小的合成連接子取代位于野生型順序的1290位和1358位之間的核苷酸來制備的，合成連接子在1326與1350位之間含有特異的核苷酸取代，如圖8(a)所示。對野生型順序進行了特殊的突變以生成S1，見圖8(a)，突變后在被膜開放讀碼內產生了終止密碼子，而未改變重疊聚合酶開放讀碼的氨基酸編碼，用6.2節所述的方法，通過使1S基因組在pSP65載體內形成二聚體構建了質粒形式的1S顆粒缺陷性基因組，命名為pSPDHBV.1S。
含有質粒pSPDHBV.1S的二聚體在HuH7細胞中通過鈣沉淀轉染(上文，6.1.1.節)。用6.4.2節所述的方法，通過Southerm印跡雜交測定轉染的細胞中的病毒復制型，結果示于圖8(b)，泳道1和2。如圖8(b)，泳道1和2所示，用1S缺陷性基因組轉染的HuH7細胞基本上含有野生型水平的松環(RC)和單股(SS)復制型病毒DNA。轉染的HuH7細胞的免疫染色分析(未示出)呈現了核心抗原的累積和可檢測表面抗原的缺乏。
由于在1S轉染的HuH7細胞中缺乏可檢測水平的表面抗原，所以轉染子不能產生感染性病毒顆粒。通過從培養的轉染子中回收上清液和用它感染初級鴨肝細胞的培養物(見上文，6.1.1節)證實了感染性顆粒在1S轉染的HuH7細胞中的缺失。用Southern印跡雜交法測定感染的鴨肝細胞培養物中的病毒復制型，未測出病毒DNA，圖8(b)，泳道5。
為了估價1S缺陷性基因組被包裝基因組△DR1的互補，△DR1質粒二聚體(見上文，6.3.節)與質粒pSPDHBV.1S一起共轉染到HuH7細胞中。三天以后，回收培養基上清液并用于感染初級鴨肝細胞培養物。在感染后第12天，收集感染的鴨肝細胞并通過Southern印跡雜交(6.4.2節)測定總胞內DNA中DHBV復制中間體的存在。如圖8(b)，泳道7所示，在感染的鴨肝細胞中能檢測到新合成的病毒DNA以松環和單股兩種形式并存。有核心抗原存在的感染的鴨肝細胞層的免疫染色(圖9)呈現了可檢測的核心抗原水平等于或大于在用野生型DHBV感染的對照細胞中觀察到的水平。具有抗被膜抗血清的同樣細胞群體的免疫染色未呈現任何可檢測的表面抗原，其與1S基因組的env-基因型一致。結果表明△DR1可反過來提供顆粒缺陷性1S基因組所缺少的被膜功能，并且HuH7細胞能夠在與顆粒缺陷性基因組和包裝基因組共轉染之后產生感染性顆粒。產生的感染性顆粒可感染初級鴨肝細胞以在鴨肝細胞內產生病毒復制型。
6.8.干擾野生型病毒的產生為了將重組DHBV基因組用作轉導異源DNA的載體，在缺陷性轉導基因組中必須存在前基因組轉錄、包裝和反向轉錄所不可少的DHBV順序。因為可通過△DR1的DNA合成反過來補償突變基因組pol-env-(Kpn-)、pol-env-core-(Kpn-Sph-)、pol-和core-等缺陷，所以它們須包含這些必要的順序。然而，其中某些依賴于病毒開放讀碼的突變似乎以一種優勢方式干擾由野生型病毒合成DNA和感染性顆粒。圖3中(泳道1、2或3、4)顯示了這種干擾的一個例子。當使用6.6節中所述方法將Kpn-Sph-突變DNA與野生型DNA一起共轉染到HuH7細胞內時，病毒DNA合成被抑制約20倍。我們還觀察到(如用免疫熒光素染色法檢測到的)核心抗原的產生也受到抑制。當根據初級鴨肝細胞的感染性分析這種共轉染得到的培養液時，我們發現與野生型轉染的細胞相比，由Kpn-Sph-+野生型共轉染的細胞釋放的感染性病毒的效價明顯降低(圖7，與泳道5和6相比較的泳道1和2)。用Kpn-突變基因組則可見到相似但較弱的效果(圖7，泳道1和2與泳道3和4比較)。某些突變DNA干擾野生型病毒復制可以解釋為什么我們觀察到各種突變體能以不同的效率相互補償。
7.λ-DHBV重組體的產生在這些實施例中我們描述了含異源λ基因序列之重組DHBV基因組的產生、表達和包裝。在DHBV基因組編碼表面抗原和病毒聚合酶蛋白的區域中造成缺失，然后將不同大小的噬菌體λ基因組DNA的片段插入該區域內。
7.1.一般方法7.1.1.細胞由Koiki愽士(Department of Gene Research，Cancer Institute，Tokyo，Japan)處得到人肝細胞瘤細胞系HuH7(Nakabayashi et al.，1982，Cancer Res.423858-3863)，并在加有10%FBS的DMEMF12(1∶1，V/V)(G1BCO，Grand Island，NY)中增殖之。
7.1.2.DNA制備、限制性酶切與修飾由在EcoRI位點克隆到質粒pSP65載體中的DHBV基因組DNA得到用于構建重組體的DHBV順序。λ基因組DNA、限制性酶、T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段均購自New England Biolabs(Beverly，MA)。除特別指出者外，酶反應均在提供者指定的條件下進行。
經限制性酶消化后，在TBE緩沖液(0.01M Tris-硼酸鹽(PH8.2)、1mM EDTA)中用5%聚丙烯酰胺凝膠以凝膠電泳法分離并純化DNA片段。可在紫外光下通過PEI(聚乙烯亞胺)薄層層析板肉眼觀察DNA片段所顯示的負性陰影。室溫下在TBE緩沖液中以200V電洗脫2小時以回收DNA片段。
7.2.λ-DHBV重組體的構建經用Kpn I消化野生型DHBV基因組刪除編碼聚合酶蛋白和表面抗原的順序，以產生λ-DHBV重組體。用大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段填補線性化的質粒。然后用T4DNA連接酶將噬菌體λ的片段連接到該質粒(在核苷酸1290處)中。含有180bp HaeⅢλ片段或1000bp HaeⅢλ片段的λ-DHBV重組體分別被定名為Kpn-+180和Kpn-+1000。
同顆粒缺陷性DHBV基因組和△DR1突變體一樣，也使用6.2節簡述的兩種戰略之一使λ-DHBV重組體二聚化。通過轉化到大腸桿菌HB101細胞內擴增已克隆到SP65中的λ-DHBV重組體。然后用質粒DNA的限制性酶切分析法鑒定二聚體克隆。
7.3.重組體λ-DHBV基因組的表達使用磷酸鈣沉淀法(Graham and van der Ed，1973，Virology 52456-467)將λ-DHBV基因組與包裝基因組共轉染到HuH7細胞中，以表達重組的λ-DHBV基因組。使用6.4.2節中描述的方法經Southern吸印雜交監測λ-DHBV重組體的表達。如圖3泳道8所示，含有λ(Kpn-+180)之180bp HaeⅢ的λ-DHBV重組體被包裝在病毒顆粒中，但其包裝能力約低于Kpn-突變體達50倍。含有λ(Kpn-+1000)之1000bpHaeⅢ片段的λ-DHBV重組體則未被包裝(見圖3泳道7)。這些結果表明對包裝基因組有一個大小約束，而且就這個系統來說，對包裝約3000bp之基因組的最大長度有著嚴格的限制。為了插入較大的異源片段，應刪除較大的DHBV片段和/或將DHBV DNA克隆到可能對大小限制較小的其他載體中。
8.0能夠生產缺陷性肝炎病毒的穩定細胞系的產生暫時表達系統有一些固有的缺陷，主要是轉染效率太低。因此，希望將本發明的一個或多個缺陷性肝炎病毒基因組摻入永久性的穩定轉染細胞系中。含有正確的遺傳信息的穩定轉染的永久性細胞系可以基本上持續的方式生產病毒顆粒。
本發明的范圍包括用肝炎病毒包裝基因組穩定轉染的永久性細胞系，從而產生“包裝細胞系”。包裝細胞系穩定地轉染了對病毒功能提供反式互補作用的遺傳信息，這些功能是轉染至包裝細胞系中的第二缺陷性肝炎病毒基因組所必需的。更具體地說，將顆粒缺陷性基因組轉染至包裝細胞系中，能夠通過“包裝的”基因組提供所需的反式輔助功能，使得輸入的基因組被包裝和反轉錄，以產生攜有顆粒缺陷性基因組的傳染性缺陷性病毒顆粒。存在于包裝細胞系中的包裝基因組本身不能以傳染性顆粒的形式回收，因為包裝基因組缺乏順式作用的順序，而不能自我復制成雙鏈DNA。
與此相似，攜有異源基因順序的顆粒缺陷性肝炎病毒基因組(5.2節，見上)，在基因組導入包裝細胞系及互補了顆粒缺陷性基因組所需的功能后，能夠以傳染性病毒顆粒的形式增值和回收。
本發明進一步涉及永久性細胞系的產生和使用，它穩定地含有一個以上的缺陷性肝炎病毒基因組，以及使用這種細胞系作為“生產”細胞系以產生缺陷性肝炎病毒顆粒。具體地說，生產細胞系可含有穩定地摻入其中的包裝基因組的顆粒缺陷性基因組。生產細胞系能以基本上連續的方式包裝和產生包裝的顆粒缺陷性基因組，而不需要進行重復轉染。
在所有細胞系都能夠包裝和產生傳染性缺陷性基因組顆粒的情況下，用已知方法可從轉染細胞的培養上清中回收顆粒。
8.1方法8.1.1.細胞HepG2細胞系是可得自許多實驗室的人肝癌細胞系。
HepG2細胞保留了許多初級肝細胞的形態特征。以前已經證實，HepG2系用二聚體形式的野生型HBV DNA轉染后能夠產生野生型病毒。例如參見Sells等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 841005，1987。迄今為止已經確定，HepG2細胞系的細胞不含有內源HBV DNA順序。
8.1.2.含有包裝基因組二聚體和選擇標記的質粒載體的制備為了用包裝基因組△DR1轉染HepG2細胞系，首先構建稱為pHBV △DR1 Neo(圖10)的質粒載體。載體pHBV△DR1 Neo含有二聚體形式的人HBV△DR1包裝基因組，并進一步含有在SV40啟動子調控下的抗生素(新霉素)抗性基因。
圖11和下面的描述說明了利用已知的實驗程序構建pHBVDR1Neo的可重復的方法。由大腸桿菌質粒pSP65上切下攜有氨芐青霉素抗性的479bpXmnI-BglI片段，質粒骨架用DNA聚合酶I的Klenow片段填平，使平頭末端與來自pBR328并攜有氯霉素抗性的2057bpClaI-XmI片段連接。用得到的質粒構建體轉化大腸桿菌HB101，使之變為氯霉素抗性。構建體pSPCAM沒有限制性酶FspI的限制位點，但攜有一個來自pSP65的多人工接頭區。
然后，用一個266bp的片段取代pSPCAM多人工接頭區域中的Hinc-XbaI片段，該266bp片段相應于野生型HBV基因組的1726-1992位，它是由野生型HBV二聚體質粒中作為DraI-XbaI片段得到的。用得到的CAMR構建體轉化大腸桿菌HB101，使之成為氯霉素抗性。將CAMR構建體中266HBV順序的一部分作為FspI-StyI片段切下來，這部分順序中在1826-1837位(包括兩頭)含有DR1順序，所切下的片段包括1804-1884位核苷酸。用一個同源的合成片段取代切下的片段，該合成片段精確地缺失了1826-1837位核苷酸，而且，其中精確地再生有FspI和StyI位點，以用于將合成片段以正確定向插入質粒構建體中。去掉1826-1837位核苷酸使構建體中缺失了DR1順序。
利用應用生物系統公司(Applied Biosystems)的L80A型合成儀通過互補鏈合成法制備FspI-StyI合成片段。利用標準方法使鏈去阻斷，并進行凝膠純化和磷酸化，最后退火。為了從產生的克隆中鑒別正確的缺失片段，用32P標記的片段原位探測重組體，該探針含有連在一起的來自DR1缺失兩端各10個堿基。在降低的溫度下(在T融解10℃以下)進行雜交，在此溫度下，探針不能與野生型HBV雜交。然后在測序凝膠上分析攜有正確缺失的陽性克隆，以隆定DR1順序的精確缺失，從而鑒別出△DR1突變體。
使攜有合成片段的CAMR重組體與XbaⅠ和HindⅢ反應，以切下含有包括△DR1區域的加入的HBV順序的大片段，以及在片段末端鄰接HindⅢ限制位點的額外的構建順序。用此片段取代pSP65中的HindⅢ-XbaI片段。在pSP65重組載體中插入來自野生型HBV二聚體的含有2143-3182位核苷酸的XbaI-EcoRI片段，以及來自野生型HBV二聚體的含有1992-2143位核苷酸的XbaI片段。以圖11所示的定向使片段連接。利用相應的標記的野生型HBV探針通過雜交法鑒別含有所有片段的陽性重組體，通過順序分析以證實定向。
從重組體中切下含有1804-3182位核苷酸的FspI-EcoRI片段。首先使此片段與野生型HBV二聚體質粒的HindⅢ-FspI消化產生的HBV5′片段連接，然后如圖11所示通過三分子反應使其插入pBR322的骨架中。pBR322骨架是如下制備的，從pBR322中切下EcoRI-HindⅢ片段以在骨架上產生EcoRI和HindⅢ的粘性末端。利用相應于兩種順序的探針，由三分子反應中鑒別含有正確的3′和5′HBV順序的重組體。通過如下方式使△DR1基因組二聚化，即用EcoRI部分消化重組單體，然后插入第二個EcoRI-EcoRI片段，它相應于來自另一個單體的第二個△DR1基因組。通過微量質粒DNA制備和瓊脂糖凝膠分離鑒別二聚體質粒，并利用限制性分析證實正確的結構定向。
從完整的二聚體上切下ClaI-SalI片段，該片段位于二聚體中串聯的△DR1之外并且不干擾它。用含有細菌新霉素抗性基因的ClaI-SalI片段取代此片段，該基因在SV40啟動子的調控下。含有受SV40啟動子調控的細菌抗生素抗性基因的質粒源是可以得到并眾所周知的。參見例如Southern和Berg，1982，J.Mol.Applied Genet.1327。產生的載體命名為pHBV△DR1Neo。
當然，通過已知方法可以制備其他載體，這些載體包括缺陷性病毒基因組二聚體和選擇標記。載體pHBV△DR1Neo在這兒只是作為一個合適載體的例子進行了描述。
8.2人包裝細胞系的生產和分析為了說明本發明包裝細胞系的生成，用質粒pHBV△DR1Neo轉染永久性人肝癌細胞系HepG2。
在轉染之前，將培養的HepG2細胞以2×106個細胞接種在10cm培養皿上，其中含有Dulbecco氏修飾的Eagle氏培養基(DMEMF12)(Gibco，Grand Island，New York)及10%小牛血清。用此培養基作為HepG2系的正常載體。轉染前的早晨更換培養基，通過磷酸鈣沉淀法進行轉染。在3個10cm的培養皿中，每個用8μg質粒DNA轉染，在8小時后更換培養基。轉染兩天后，從匯合平皿上胰酶消化下細胞，然后以每平板350，000細胞，每平板175，000細胞和每平板75，000細胞的密度接種在含有750μg/ml G418的培養基(GibcoGrand Island，New York)中。每3-4天用含有新鮮藥物的培養基飼喂細胞3周，3周以后，只有存活的細胞以分離的集落存在。然后從培養基中去掉G418再飼喂細胞一周，一周以后，用克隆環挑出集落，并在含有5mMEDTA的PBS中于37℃下保溫幾分鐘。然后將細胞轉移至24孔微量滴定板上，其中含有DMEMF12及10%小牛血清，細胞每3-4天飼喂一次。
為了篩選轉染細胞以生產乙肝表面抗原，使微量滴定板孔中的細胞持續生長，直到足以產生呈酸性的培養基，表明達到了合適的細胞密度。然后收集細胞培養基以檢測其中的乙肝表面抗原，并用新鮮的培養基取代。利用市售可得的固相放射免疫檢測藥盒(Connaught Laboratories)基本上按照商品說明進行培養基的乙肝表面抗原檢測。通過放射免疫檢測法分析了大約200個不同孔中的轉染子，鑒別出了5個陽性克隆，它們的計數兩倍于本底之上。然后，進一步檢測陽性克隆生產乙肝“e”抗原(前核心蛋白;“HBeAg”)的能力。
測試孔中對乙肝表面抗原呈陽性的培養基，用抗eAg抗體夾層法(Abbott Laboratories Diagnostic Kit-Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.)檢測HBeAg。在5個檢測為HBsAg陽性的克隆中，只有一個克隆表現產生HBeAg的強烈陽性。這個克隆定名為HepB1-2，通過再克隆進行擴增。再次測定HepB1-2產生HBsAg和HBeAg的能力時都呈現強烈陽性。
對HepB1-2細胞系進行分析以進一步對該細胞系定性，包括培養上清的免疫熒光分析、電鏡分析及核酸分析。
HBsAg的免疫熒光染色分析在固定的HepB1-2細胞上進行。用同樣的方法檢測HepG2細胞作為對照。在每一種情況中，細胞用95%冷乙醇/5%冰醋酸固定在玻片上。平板于-20℃置于固定溶液中兩天，然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌并風干。然后，使玻片與山羊多克隆抗HB表面抗原(DAKO，Santa Barbara，Cal.)溶液于37℃保溫2小時，用PBS洗滌，然后與熒光素偶聯的兔抗山羊抗血清(DAKO)于37℃保溫2小時。然后用表面熒光顯微鏡檢查細胞。在所有測試的細胞中，HepB1-2細胞都呈現一致的胞質免疫熒光圖型，表明HepB1-2克隆擴增的所有細胞都是來自同一個原始克隆。作為對照的HepG2細胞檢測不出熒光。
由于HepB1-2細胞中同時存在有HBsAg和HbeAg，因此通過電鏡檢查細胞是否產生Dane顆粒。如圖12所見，HepB1-2細胞薄切片的電鏡檢查表明，細胞表面存在有可見的突出的包膜顆粒。顆粒直徑(大約40nm)正如相當于Dane顆粒的直徑。對HepG2親本細胞作類似檢查時，未觀察到類似的突出顆粒。
利用密度梯度離心法檢測HepB1-2細胞的培養上清，看是否存在有顆粒。為了制備來自HepB1-2細胞的培養基以進行分析，40ml來自匯合培養液的培養基樣品與氯化銫(1g/3ml)合并，置于頂部密封的梯度管中，然后在Ti50.2轉子(Beckman Ⅰnstruments)中以49，000rpm離心60小時。從離心管頂部系列收集組分(1.4ml)，用20μl樣品和折光儀(Bausch和Lomb)通過折光指數來測定每一組分的密度。然后利用放射免疫檢測法檢測每一組分樣品的HBsAg。在CsCL密度梯度中，在大約1.20g/ml密度處檢測到一個抗原峰，它相應于所期望的Dane顆粒的沉降密度。如Sells等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.USA841005所述，通過電鏡分析1.20密度的組分，結果表明存在有包膜顆粒，它們基本上類似于圖12所示的HepB1-2細胞的突出。在其他的鄰接的密度組分中未觀察到顆粒。
用EcoRⅠ、SacⅠ、HindⅢ和PstⅠ消化后對HepB1-2基因組DNA進行Southern印跡雜交分析，結果表明，這些細胞含有完整單拷貝的△DR1HBV二聚體順序，并且整合進了染色體DNA中。圖13顯示了整合質粒在細胞DNA順序中的構型。
用各種方法分析由HepB1-2細胞系產生的顆粒，以確定顆粒中是否含有傳染性HBVDNA。可以預測，顆粒中不應含有傳染性DNA，因為HepB1-2細胞系只含有包裝基因組(△DR)，它缺乏重要的順式作用的復制區。如前面的6.4節所述，△DR1包裝基因組轉染到HuH7細胞中不能產生松環DNA，但如圖3泳道5所示，顯然能產生少量但可測量的單股負鏈DNA。少量可檢測的ssDNA可能是由于第一DNA鏈合成的異常啟動造成的。可以期望，由于在用于制備包裝細胞系HepB1-2的質粒DNA中存在的DR1重復區的相似突變，由包裝細胞系產生的顆粒將主要由不能完成dsDNA復制的前基因組RNA分子組成。
為了分析包裝細胞系上清中存在的顆粒的核酸含量，使上清液在氯化銫梯度中分級分離。然后從不同級分中分離出核酸，方法是用15mMEDTA，0.5%十二烷基硫酸鈉和200μg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)在51℃處理90分鐘。然后使各級分進行苯酚萃取和乙醇沉淀。利用缺口轉譯的野生型HBV探針，通過印跡雜交法分析不同的級分。如圖14所示，在所有檢測的級分中，都未測出大小相應于HBV基因組的3.0kb分子。在1.18-1.25g/ml和1.26-1.32g/ml的級分中，檢測出了輕度雜交的大約3.5kb和5kb的分子，在1.33-1.42g/ml密度級分中觀察到一個沿3.5kb向下延伸的大拖尾。這些分子的特性還有待確定，它們由于含量少而很難進行分析。它們很可能代表了轉錄至HepB1-2細胞中的△DR1RNA的反轉錄產物，因此應當含有啟動反轉錄的異常位點。它們幾乎肯定是缺陷性的。8.3包裝細胞系提供反式功能以互補轉染至包裝細胞系中的顆粒缺陷性基因組根據△DR1突變的特性及HepB1-2細胞系產生可測的胞質病毒抗原的能力(上述8.2節)，可以期望，該細胞系將能夠提供反式包裝功能，以從導入該細胞中的第二缺陷性HBV基因組包裝和反轉錄RNA。例如，包裝細胞系應當完全反式互補所有顆粒缺陷性HBV基因組所需的病毒功能。將顆粒缺陷性基因組轉染至包裝細胞系中，應當導致產生可在細胞上清中回收的包裝的顆粒缺陷性基因組。
為了轉染HepB1-2包裝細胞系，再產生一個顆粒缺陷性二聚體基因組。缺陷性基因組用X-表示，它是用XhoI消化野生型HBV基因組而產生的，此酶在129位核苷酸處切斷基因組。用Klenow片段填平通過XhoI消化產生的粘性末端，將含有SalⅠ限制位點的10bp合成連接子平頭連接在XhoⅠ位點上。如前面所述，將產生的X-缺陷性基因組二聚化在pSP65質粒骨架中。
然后，通過兩種不同的方法用X-二聚體質粒轉染HepG2細胞。在第一個方法中利用磷酸鈣沉淀法，在轉染前一夜接種細胞，用20μg質粒DNA進行轉染。在轉染后的3，4和5天，由轉染細胞收集培養基以進行分析。
在第二個方法中涉及脂轉染(lipofection)，以低密度接種細胞，并使其生長幾天直至差不多匯合。如下所述，使用Lipofectin(Bethesda Research Laboratories;Gaithersburg，MD)在細胞中平均導入5μg質粒DNA，在不同的一個實驗中，導入1μg質粒DNA。質粒DNA在聚苯乙烯管中與150μl水混合。然后加入150μlLipofectin，輕輕搖動試管以混合DNA。受體細胞用粒DMEM(較低血清)洗滌兩次。在每個平皿中加入9ml含有巰基乙醇的Optimem(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD)。室溫下15分鐘后，DNA混合物變為輕度混濁，此時將其滴加到細胞中。使DNA混合物在細胞上停留24小時，然后用PBS洗滌細胞5次，然后在DMEM加10%小牛血清中培養。第二天再用PBS洗滌細胞5次，再過一天后，再用PBS洗滌3次。然后，在轉染后第4，5和6天收集培養基，回收的培養基在4℃下冷卻。
由轉染的HepB1-2細胞上清中回收的基質在氯化銫梯度上分級分離，并如前述分離核酸。采用隨機缺口轉譯的HBV探針，通過Southern印跡雜交法分析核酸。
圖15顯示了用X-二聚體質粒轉染兩次的HepB1-2細胞上清的Southern印跡雜交結果。在一次轉染中，采用了5μg質粒DNA，在第二次轉染中，采用了1μg質粒DNA。通過氯化銫分級分離來自轉染子的培養上清，并如8.2節所述處理每一級分以分離核酸。圖15顯示，在兩個轉染子上清中，在1.20g/ml密度級分中都存在有3.0kb的可雜交分子，它相當于Dane顆粒中攜帶的HBV基因組的期望大小。觀察到一個比3.0kb片段遷移稍快的分子，它可能代表閉環形式的HBV基因組。在9kb大小和更大處觀察到的其他分子代表輸入的質粒DNA的殘缺片段。在整個密度梯度中都觀察到這些較大的分子，限制性分析證實了它們的特性。
為了確定3.0kb片段的性質，將3.0kb片段從低熔點瓊脂糖凝膠(Seakem，FMC)中切下，使凝膠片段在65℃下熔化4分鐘，然后在1μg載體小鼠DNA的存在下，用SalI和NcoI于37℃消化2小時。用缺口轉譯的HBV探針對消化產物進行Southern雜交分析。正如從包裝的突變X-基因組所期望的那樣，觀察到了1900bp和1200bp的雜交片段。
根據本發明，生產細胞系可通過用一個以上的缺陷性肝炎病毒基因組轉染永久性細胞系如HepG2來制備。例如，如果包裝細胞系HepB1-2進一步用顆粒缺陷性基因組(如X-)穩定轉染，產生的細胞系可能是包裝形式的缺陷性基因組的永久性生產者。以這樣的方式，轉染群體中的每個細胞都變為顆粒缺陷性基因組的生產者，而在暫時表達系統中，可得到的共轉染子的百分比很低。以這樣的方式，無需進行重復的轉染步驟，即可回收到更大滴度的缺陷性肝炎病毒顆粒。
9.微生物的寄存下列攜帶所示質粒的大腸桿菌已于1988年7月12日寄存在Agricultural Research Culture Collection(NRRL)，Peoria，IL大腸桿菌 質粒 寄存登記號HB101 pSP65DHBV5.2Ca1×2 B-18383(野生物DHBV)HB101 pSP65DHBVRV-B-183842650×2(core-DHBV)HB101 pSP65DHBVKpn-Sph-B-18385×2(pol-env-core-DHBV)HB101 pSP65DHBV△DR1×2 B-18386(DR1-DHBV)本發明不限于這些已寄存的微生物，因為它們只是用來具體闡明本發明的，而具有同等功能的其他微生物或病毒亦應落入本發明的范圍之內。對本文描述的內容的改進是本領域內普通技術人員很容易作到的，這樣的改進亦應是本發明之權利要求范圍之內的。
還應明確的是，所述核苷酸的所有堿基對大小只是約近值，并只為了便于描述之目的。
權利要求
1.一個不能提供肝炎病毒復制所需之肝炎病毒功能的DNA順序，該DNA順序可轉錄成能夠(a)包裝到肝炎病毒顆粒中并(b)反轉錄成DNA的RNA。
2.根據權利要求1的DNA順序，其包括選自pol、env、和core之肝炎病毒基因的突變。
3.根據權利要求2的DNA順序，其包括pol、env和core的突變。
4.根據權利要求2的DNA順序，其包括pol和env的突變。
5.根據權利要求2的DNA順序，其中突變包括缺失。
6.根據權利要求2的DNA順序，其編碼經過剪切的肝炎病毒表面抗原。
7.根據權利要求1的DNA順序，其包含一個異源基因順序。
8.根據權利要求2的DNA順序，其還包括一個異源基因順序。
9.根據權利要求5的DNA順序，其還包含一個異源基因順序。
10.根據權利要求7的DNA順序，其中異源基因順序包含編碼免疫原抗原決定基的順序。
11.根據權利要求8的DNA順序，其中異源基因順序包含編碼免疫原抗原決定基的順序。
12.根據權利要求9的DNA順序，其中異源基因順序包含編碼免疫原抗原決定基的順序。
13.根據權利要求7、8或9的DNA順序，其中異源基因順序包含編碼酶的順序。
14.一種包含權利要求1之DNA順序的核酸載體。
15.一種包含權利要求2之DNA順序的核酸載體。
16.一種包含權利要求7之DNA順序的核酸載體。
17.一種包含權利要求10之DNA順序的核酸載體。
18.一種包含權利要求14、15、16、或17之核酸載體的細胞。
19.一種DNA順序，其特征在于該順序(a)能被轉錄成RNA，所說的RNA不能(ⅰ)被包裝到病毒顆粒內，或(ⅱ)反向轉錄成雙股肝炎病毒基因組DNA;(b)能被轉錄成編碼一種或多種蛋白質的信使RNA，所說的蛋白質可反過來為(ⅰ)將第二種RNA包裝到肝炎病毒顆粒內，或(ⅱ)使第二種RNA轉錄成DNA提供必要的功能。
20.根據權利要求19的DNA順序，其包括在選自DR1和DR2直接重復區域內的突變。
21.根據權利要求19的DNA順序，其包括DR1和DR2中的突變。
22.根據權利要求20的DNA順序，其中突變包括缺失。
23.根據權利要求21的DNA順序，其中突變包括缺失。
24.一種包含權利要求19之DNA順序的核酸載體。
25.一種包含權利要求20之DNA順序的核酸載體。
26.一種包含權利要求24或25之核酸載體的細胞。
27.一種復制缺陷性肝炎病毒，其包含只能在由其基因組表達而產生者以外的肝炎病毒蛋白存在下才能復制的肝炎病毒，其基因組DNA可被轉錄成能夠(a)包裝到病毒顆粒內，并且(b)能轉入成DNA的RNA。
28.根據權利要求27的肝炎病毒，其中基因組DNA包括選自pol、env和core之基因的突變。
29.根據權利要求28的肝炎病毒，其中基因組DNA包括pol、env和core的突變。
30.根據權利要求28的肝炎病毒，其中基因組DNA包括pol和env的突變。
31.根據權利要求28的肝炎病毒，其中突變包括缺失。
32.根據權利要求28的肝炎病毒，其產生經過剪切的表面抗原。
33.根據權利要求28的肝炎病毒，其產生經過剪切的核心抗原。
34.根據權利要求27的肝炎病毒，其中基因組DNA包含異源基因順序。
35.根據權利要求28的肝炎病毒，其中基因組DNA還包含另一個異源基因順序。
36.根據權利要求31的肝炎病毒，其中基因組DNA包含另一個異源基因順序。
37.根據權利要求34的肝炎病毒，其中異源基因順序包含一編碼免疫原抗原決定基的順序。
38.根據權利要求35的肝炎病毒，其中異源基因順序包含一編碼免疫原抗原決定基的順序。
39.根據權利要求36的肝炎病毒，其中異源基因順序包含一編碼免疫原抗原決定基的順序。
40.根據權利要求34、35或36的肝炎病毒，其中異源基因順序包含一編碼酶的順序。
41.根據權利要求27、28或31的基因組DNA。
42.根據權利要求34的基因組DNA。
43.根據權利要求36的基因組DNA。
44.一種在細胞內共表達權利要求1的DNA順序和權利要求19的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
45.一種在細胞內共表達權利要求2的DNA順序和權利要求19的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
46.一種在細胞內共表達權利要求1的DNA順序和權利要求20的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
47.一種在細胞內共表達權利要求2的DNA順序和權利要求20的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
48.一種在細胞內共表達權利要求7的DNA順序和權利要求19的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
49.一種在細胞內共表達權利要求8的DNA順序和權利要求19的DNA順序而產生的復制缺陷性肝炎病毒。
50.一種包含權利要求19之DNA順序的細胞。
51.一種治療肝炎病毒感染之病人的方法，其包括給病人使用權利要求27的肝炎病毒。
52.一種治療肝炎病毒感染之病人的方法，其包括給病人使用權利要求28的肝炎病毒。
53.一種治療肝炎病毒感染之病人的方法，其包括給病人使用權利要求30的肝炎病毒。
54.一種治聞肝炎病毒感染之病人的方法，其包括給病人使用權利要求32的肝炎病毒。
55.一種治療肝炎病毒感染之病人的方法，其包括給病人使用權利要求33的肝炎病毒。
56.一種永久性肝癌細胞系，其特征在于它基本上能持續生產缺陷性肝炎病毒顆粒。
57.根據權利要求56的細胞系，其中所述的肝癌細胞系是人細胞系。
58.根據權利要求56的細胞系，它是通過在所述的永久性肝癌細胞系中穩定導入至少一種缺陷性肝炎病毒基因組而制備。
59.根據權利要求58的細胞系，其中的缺陷性肝炎病毒基因組包含在一個載體中，用此載體轉染所述的永久性細胞系。
60.一種DNA載體，它包括一個缺陷性肝炎病毒基因組和一個選擇標記。
61.一種DNA載體，它包括權利要求1、19或27的DNA順序和一個選擇標記。
62.DNA載體pHBVDR1Neo。
63.一種永久性肝癌細胞系，其特征在于其細胞內穩定地存在有權利要求19的DNA順序。
64.權利要求63的永久性肝癌細胞系，其進一步的特征在于，該細胞能夠將所述的DNA順序轉錄成RNA，并能夠反式表達(ⅰ)將第二RNA包裝至肝炎病毒顆粒;或(ⅱ)將第二RNA反轉錄成DNA所必需的功能。
65.人肝癌細胞系HepB1-2。
66.權利要求64或65的細胞系，進一步包括一個第二缺陷性肝炎病毒基因組。
67.權利要求66的細胞系，其中所述的第二缺陷性肝炎病毒基因組是顆粒缺陷性基因組。
全文摘要
本發明涉及兩種類型的復制缺陷性肝炎病毒基因組(1)顆粒缺陷性基因組，其不能適當地復制，但可產生能被包裝和/或逆轉錄的前基因組RNA；和(2)包裝基因組，其可產生不能被包裝和/或逆轉錄的前基因組RNA，但可編碼包裝所需的基因產物。本發明還提供(1)缺陷性肝炎病毒基因組及其重組衍生物的治療應用，包括基因治療和疫苗制劑；和(2)可產生傳染性缺陷性肝炎病毒顆粒的穩定轉染的永久性肝細胞系。
文檔編號C12N15/51GK1050044SQ9010107
公開日1991年3月20日 申請日期1990年3月1日 優先權日1989年8月16日
發明者阿瑟·路易斯·霍維奇, 杰西·威廉姆·薩默斯 申請人:耶魯大學, 福克恩·蔡斯腫瘤中心