專利名稱：溶菌酶生產方法
技術領域：
本發(fā)明是涉及溶菌酶的生產方法，對現(xiàn)有技術的改進。溶菌酶是專門溶解細菌的酶類。目前，溶菌酶的制備采用雞蛋清為原料，在生產過程中采用鹽析法或酒精沉淀除去蛋白，或用樹脂層析純化技術。因此，增加了脫鹽工序及在洗脫過程中將蛋清大量稀釋，使干燥時耗費能源。
本發(fā)明以柞蠶蛹為原料，蠶蛹經人工誘導提高溶菌酶的活力;加熱除蛋白，DEAE-纖維素層析分離，甲殼質包裹的纖維素層析純化，真空干燥而成。溶菌酶得率高，工藝簡單，成本低廉，纖維素層析可半自動化調控，纖維素可再生使用。柞蠶蛹除提取溶菌酶外，還可生產大量有經濟價值的產品，如蛹油、蛹蛋白等，其工藝互相銜接。
生產流程如框
圖1生產流程的實施一、柞蠶蛹的收集用活蛹繅絲后的蠶蛹，剔除死、破蛹體后供用;削繭蛹應保持蛹體完好，受傷或損破者棄去。
二、人工誘導誘導方法有三種。
1、注射大腸桿菌菌種分別為E.coli K12D31或HB101，劑量為108菌/ml，每蛹注射50μl，注射后在25℃放置72小時以上供用。
2、熱空氣誘導將活蛹置50℃～55℃熱空氣箱中處理30～60分鐘，處理后在25℃放置48～72小時供用。
3、超聲波誘導將活蛹浸入流水中，用超聲波發(fā)生器處理，頻率20仟赫茲，功率150瓦，時間5-10分鐘。處理后在25℃放置72～96小時供用。
三、收集蛹血用刺輥將蛹體刺破，投入籃式離心機中，3000轉/分離心，收集蛹血，殘余蛹體供綜合利用。
四、蛹血除蛋白加入苯基硫脲0.02%～0.05%，水浴中快速拌攪加熱至60℃，并速冷至室溫，離心除去蛋白沉淀，收集清液即溶菌酶組分。剩余的蛹血殘渣供綜合利用。
五、調整pH溶菌酶組分加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻后進行柱層析。
六、DEAE-纖維素柱層析DEAE-纖維素離子交換層析，按常規(guī)活化，裝柱。柱直徑與高比例為1∶10～12，柱內先用堿性緩沖液使柱內充分飽和，可選用0.1M，pH8.0磷酸鹽，將上述溶菌酶組分注入柱內作離子交換，控制流速2ml/cm2·分鐘，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分。DEAE-纖維素柱回收蛹血蛋白后再生供用。
七、甲殼質包裹纖維素柱層析甲殼質包裹纖維素活化后裝柱，先用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液將柱內充分飽和后，再用無離子水洗至微堿性，將DEAE-纖維素柱層析后洗脫的溶菌酶組分注入甲殼質包裹纖維素柱內作親和層析，控制流速2ml/cm2·分鐘，待充分親和吸附后，用0.1M，pH2～2.5乙酸緩沖液洗脫溶菌酶組分，甲殼質包裹纖維素再生供用。
八、真空濃縮、透析及干燥收集溶菌酶組分，在60℃600mmHg下用真空薄膜濃縮器濃縮到粘稠狀，移入透析袋中，在4℃下流水透析除去鹽分，內容物在60℃600mmHg下真空干燥，即為溶菌酶制品。
實例一活柞蠶蛹1kg作原料，將大腸桿菌K12D31接種于液體LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，加水至1升，pH7.2)中，37℃振蕩培養(yǎng)過液，達到108菌/ml的水平，每蛹注射50μl，放置于25℃72小時。
蠶蛹穿刺后離心取蛹血，籃式離心機3000轉/分鐘，離心10分鐘，收集蛹血約150ml。加入0.02%苯基硫脲，在水浴中攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心3000轉/分鐘。10分鐘以除去蛋白，清液為溶菌酶組分。
溶菌酶組分中加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，用DEAE-纖維素柱層析，收集流出的溶菌酶組分，約250ml，用甲殼質包裹纖維素作親和層析，柱內用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液飽和。吸附層析后，用0.1M，pH2.0～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫的溶菌酶組分，約150ml。
將溶菌酶組分在60℃600mmHg真空濃縮至粘稠狀，用半透膜透析去鹽，內容物在60℃，600mmHg下抽干，即為成品，約100mg，酶活力達到20000單位/mg蛋白水平。
實例二活柞蠶蛹1kg作原料，將蠶蛹置52℃烘箱內處理30分鐘，置25℃48小時。
蠶蛹穿刺后離心取蛹血，收集蛹血約150ml，加入0.02%苯基硫脲，在水溶中攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心3000轉/分，10分鐘以除去蛋白，清液為溶菌酶組分。
溶菌酶組分中加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，用DEAE-纖維素離子交換柱層析，收集流出的溶菌酶組分，約250ml。
市售甲殼質50g，用40%NaOH液充分浸泡，搗碎，37℃浸漬3小時，用水沖洗，抽濾以除去余堿，使轉化為去乙酰甲殼質。在堿性(pH10)條件下，加入100g纖維素，充分拌攪，然后用冰乙酸調至酸性，使甲殼質沉淀，水洗去余酸，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液浸泡，裝柱后將DEAE-纖維素洗脫的溶菌酶組分注入其中進行親和層析，最后用0.1MpH2～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分，約收集150ml。
將溶菌酶組分在60℃600mmHg真空濃縮至粘稠狀，用半透膜透析去鹽，內容物在60℃600mmHg下抽干，即為成品，約得85mg，酶活力達到18000單位/mg，蛋白水平。
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權利要求
1.溶菌酶的生產方法其特征在于以削繭后完好的蠶蛹為原料，于蠶蛹中注射大腸桿菌E·ColiK12D31或HB101，劑量為108菌/ml，50μl/頭，在25℃下放置72小時以上，或將蠶蛹置50～55℃熱空氣箱內30～60分鐘，在25℃下放置48～72小時，或將蠶蛹浸入流水中，用頻率20～22仟赫茲，功率150瓦超聲波處理5～10分鐘，于25℃放置72-96小時，將人工誘導后的蠶蛹刺破收集蛹血，蛹血中加入0.02～0.05%苯基硫脲，在水浴中快速攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心除蛋白，上清液即溶菌酶組分，用0.1M磷酸鹽調整至pH8.0，將溶菌酶組分注入經用堿性溶液充分飽和后的DEAF-纖維素柱內作層析分離，離子交換完成后，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分并注入經用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液充分飽和后，再用無離子水洗至微堿性(pH7.2)的甲殼質包裹纖維素柱內作親和層析，用0.1M，pH2～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分，洗脫后的溶菌酶組分真空濃縮、干燥。
2.根據(jù)權利要求1所說的溶菌酶生產方法，其特征在于所說的DEAE-纖維素柱，其園柱直徑與高度比例為1∶10～12，溶菌酶組分在園柱內流速為2ml/cm2·分鐘。
3.根據(jù)權利要求1和2所說的溶菌酶生產方法，其特征在于所說的溶菌酶濃縮條件，在60℃600mmHg下用真空薄膜濃縮器濃縮至粘稠狀，移入透析袋中，在4℃下用流水透析除去鹽分，內容物在60℃600mmHg真空干燥。
全文摘要
一種以柞蠶蛹為原料生產溶菌酶的生產方法。柞蠶蛹含有豐富的溶菌酶，經人工誘導后提高酶活力10倍以上。收集蛹血、加熱、直接用DEAE—纖維素及甲殼質包裹纖維素柱層析，洗脫后真空濃縮，透析，真空干燥而得到產品，酶的回收率高。有關纖維素可再生使用，本方法的工藝可與蠶蛹綜合利用的其他工藝(如提取蛹蛋白等)相銜接。
文檔編號C12N9/00GK1043740SQ8910880
公開日1990年7月11日 申請日期1989年11月22日 優(yōu)先權日1989年11月22日
發(fā)明者黃自然, 陳夙珍, 姚汝華, 呂建秋 申請人:華南農業(yè)大學