專利名稱：高純度治療上有用的人類白細胞干擾素的工業規模制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備人白細胞干擾素的方法，其包括由血液中分離白細胞、從中除去紅細胞、將白細胞懸浮于合適的營養液中，用干擾素預處理、用適當誘導物誘導、由細胞中分離出含干擾素的液體、并結合使用可控制的微孔玻璃層析法及醇分級分離法純化干擾素粗品。
人白細胞干擾素(下文簡稱為IFN)，是一類具有抗病毒活性及某些其他生物學效應的蛋白質。干擾素抑制細胞增殖、激活天然殺傷細胞并可影響免疫系統的功能。基于這些性質，人白細胞干擾素適于有效的治療應用。
治療上有用的IFN以及制備IFN的適宜方法，必須符合這樣幾個特殊的要求即IFN不應含有細菌內毒素;制造過程應保證沒有病毒污染，并能產生最廣的生物學活性亞型譜以及具有滿意的產率。
有許多方法已用于制備有適宜純度的IFN，如使用交聯葡聚糖凝膠(Sephadex)G-100或G-150〔G.BodoMethodsEnzymol.78，69(1981)〕、UltragelAcA54〔J.E.Whitmann等;J.InterferonRes.1，305(1981)〕、磺丙基葡聚糖凝膠〔P.J.Bridgen等，J.Biol.Chem.252，6585(1977)〕或苯基瓊脂糖凝膠〔J.E.Whitmann等，J.InterferonRes.1，305(1981)〕的層析法;或使用銅螯合劑〔K.Berg等，J.Immunol.11，489(1980)〕;或使用CPG層析法〔K.C.ChandaJ.InterferonRes.2，229(1082)〕。
雖然聯合使用上述方法能夠制得均質IFN產品，但是產率卻很低，而且有些方法并不適于大規模工業生產。
迄今所發展的用于大量制備治療上有用之IFN的方法如下所述。
Cantell等人曾詳細描述了一種純化方法〔Methods Enzymol.78，499(1981)〕，其包括一系列控制PH的沉淀步驟，可產生一種具有比活性為2×106IU/mg的蛋白質產品，其產率為50%。PH3.5時用異硫氰酸鉀沉淀白細胞IFN粗品，然后溶解于含酸乙醇中，逐漸增加PH到5.3，然后再增加到5.8而選擇性地沉淀出雜質。經將乙醇溶液的PH值增加到8.0，沉淀出IFN，然后重新溶解于含有0.5M異硫氰酸鉀的0.1M磷酸鹽緩沖液中。再將PH降至5.2而使污染物沉淀下來。溶解的IFN則于PH3.0時沉淀。然后，將該沉淀物溶解于0.1M磷酸鹽緩沖液(PH8.0)中并對PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)透析。
Wellcome研究實驗室研究了另一種純化由Namalva細胞產生之IFN的方法〔S.Rouveny等，Ann.Virol.13，191(1982)〕，由此可得到平均比活性為6×107IU/mg的蛋白質。根據該方法，用0.5%三氯乙酸溶液沉淀類淋巴母細胞IFN粗品，然后在PH3.5時用94%乙醇提取沉淀物。再經逐步提高PH值而純化乙醇提取物。可使用多克隆抗體-親和層析法進一步純化如此制得的干擾素。
紐約血液中心的B.Horowitz等人建立了一種制備高純度IFN的兩步驟層析法〔MethodsEnzymol.119，39(1986)〕。即將IFN粗品吸附在CPG-10775柱上并用含50%乙二醇的緩沖液洗脫。使用單克隆抗體親和層析法(NKZ-Sepharose柱，Celltech)進一步純化洗脫物，得到比活性為3.6×108IU/mg蛋白的產品，其產率為50%。
使用本發明的方法，能夠得到一種可在很大程度上滿足上述要求的產品。所得產品的純度高，其內毒素含量很低。由于采取了某些工藝步驟，使得最終進入產品中的病毒都是被失活了的。所獲產品含有很寬的IFN亞型譜，包含一高比例的酸不穩定性組分。產率很高，所以生產的經濟效宜很好。
本發明涉及制備一種具有高滴度的IFN粗產品，以及結合使用可控制的微孔玻璃層析法及醇分級分離和膜分離技術以純化IFN。方法的各個步驟一起確保了產品的有利性質。
本發明的方法中以氯化銨誘導溶血作用破壞紅細胞從中純化出人血白細胞。根據痙⒚鞣椒ǖ撓叛∈凳┓槳福苧饔檬前炊椒ǎ ～5℃下使用緩沖到PH值為7.2～7.4的0.83%氯化銨溶液完成的。第一步中，細胞懸浮液對氯化銨的比例為1∶3，第二步比例為1∶9。以1000～2000×g離心，由溶血介質中沉淀出白細胞。將所得白細胞懸浮液懸浮在合適的營養液(Eagle MSH、RPMI、MSKD等)中，細胞濃度為1～1.3×107細胞/ml。營養液還含有0.5～2.5mg/ml無γ球蛋白人血清。
首先，將細胞培養物與100～200IU/ml人IFN在37℃下共同保溫1.5～3小時。然后用100～200HA單位/ml仙臺病毒誘導IFN產生。
誘導后1～3小時，適當改變保溫條件(PH、鹽濃度、溫度、添加過氧化氫)，繼續保溫15～25小時，然后經離心由營養液中回收白細胞，得到IFN粗制品。
過濾除去IFN粗品中的浮動雜質和細胞碎片，然后加壓通過CPG10/15柱進行層析。先用PBS，然后用含有0.05～0.1MTris-HCl和1.5M氯化鈉的溶液(PH8.0)進行梯度洗脫。
PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)的組成如下mg/mlNaCl8800KCl220Na2HPO4·12H2O 3500NaH2PO4·H2O 224pH7.2～7.4Tris緩沖液含有三(羥甲基)-氨基甲烷，它不會使IFN失活，但可大大改善洗脫效率。當然也可以使用其他伯、仲或叔胺。
用55～75%乙醇于-20℃下處理含IFN的洗脫物。用離心法除去沉淀的蛋白質。用超濾膜將含有IFN的乙醇上清液濃縮10至20倍，然后用適當緩沖液通過透濾或透析置換乙醇。或者可再次吸附存在于醇上清液中的IFN。可將如此得到的高純度IFN溶液直接冷凍干燥。
一方面進行層析，另一方面用55～75%乙醇，可確保沒有病毒。因為內毒素可被乙醇沉淀，所以用乙醇處理即可除去任何最后存在的內毒素。
對酸不穩定的IFN亞型不會丟失其活性，因為本發明的方法中沒有包括任何于低PH條件完成的步驟。
下列非限定性實施例旨在進一步闡明本發明的方法。
實施例1得自人血的血沉棕黃層(富含白細胞的血液部分)，在冷卻(置于0至4℃冰上)條件下與3倍體積的0.85%氯化銨溶液一同攪拌10分鐘。10分鐘后，以1500xg，4℃離心而由混合物中沉淀出白細胞。將白細胞懸浮于PBS中，并用9倍體積的0.83%氯化銨溶液再次處理之。10分鐘后，依上述相似方法離心沉淀細胞并以1.0×107細胞/ml的濃度懸浮于Eagle MEC營養液中。營養液中還含有1mg/ml無γ球蛋白人血清。向細胞培養物內加入150IU/ml人IFN，然后在37℃恒溫槽中攪拌2小時。繼之加入100HA單位/ml仙臺病毒并于37℃保溫15至20小時以誘導IFN產生。所得營養溶液即為IFN粗品，其比活性為200，000IU/mg蛋白質。
IFN粗品以100ml/mlCPG的比例壓入裝有CPG10/75的、預先用PBS平衡的柱內。用PBS洗柱直到其中沒有蛋白質，然后用Tris-緩沖的1.5M氯化鈉溶液洗脫IFN。洗脫物的比活性為10，000，000IU/mg蛋白質。洗脫物于-20℃下與保持-20℃的乙醇混合，使乙醇終濃度達到75%。醇混合物于-20℃放置24小時，然后離心。
傾去沉淀物后，上清于-20℃通過超濾膜而濃縮。經透濾法除去乙醇，同時用適當緩沖溶液置換之。將所得產品分裝到安瓶內并冷凍干燥。
實施例2
按實施例1中所述的方法制備IFN粗品并進行繼后的CPG層析。
亦可用沉淀法從含有IFN的75%乙醇溶液中分離出干擾素。含IFN的乙醇溶液于-10℃下對含30%乙醇的0.05M檸檬酸鹽緩沖液(PH5)透析。離心分離沉淀的蛋白質并重新溶解于相應量的PBS中。所得產品可直接凍干。
實施例3與實施例2所述方法相似，不同的是使用超濾膜濃縮IFN的75%乙醇溶液，然后對含有20%乙醇的0.05M檸檬酸鹽緩沖液(PH5)透析。接下來則按實施例2中所述方法處理沉淀的蛋白質。
權利要求
1.一種制備人干擾素的方法，其包括分離血液中的白細胞、除去紅細胞、將白細胞懸浮于營養溶液中、用干擾素預處理、用誘導劑誘導、將含有干擾素的液體與細胞分離開及純化干擾素粗制品等步驟，特征在于使用氯化銨溶液除去紅細胞、營養溶液中添加人血清、將白細胞以0.5×107至1.5×107細胞/ml的濃度懸浮于營養溶液中進行誘導，并聯合使用可控制的微孔玻璃層析法及乙醇分級分離法進行純化。
2.根據權利要求1的方法，其包括使用可控制的微孔玻璃10/75柱進行純化。
3.根據權利要求1或2的方法，其中包括每1ml柱體積加50至200ml干擾素粗品。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其包括用0.1至1.5M伯、仲、叔胺或季銨溶液進行洗脫。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其包括用終濃度為55至75%的乙醇處理洗脫液。
6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其包括于0°～40℃下用乙醇處理。
7.根據權利要求1至6中任一項的方法，其包括用已緩沖到PH6至7.5的0.83%氯化銨溶液除去紅細胞。
8.根據權利要求1至7中任一項的方法，其包括在營養溶液中添加0.5至2.5mg/ml用可控制的微孔玻璃柱層析法純化的無γ球蛋白人血清。
全文摘要
本發明涉及一種制備人干擾素的新方法，其包括分離血液白細胞、除去紅細胞、將白細胞懸浮于營養溶液中、用干擾素預處理并用誘導劑誘導、由細胞中分離含干擾素的液體并純化粗制干擾素，其特征在于使用氯化銨溶液除去紅細胞、用人血清補充營養溶液、將白細胞以0.5×10
文檔編號C12P21/00GK1036961SQ89102018
公開日1989年11月8日 申請日期1989年3月4日 優先權日1988年3月4日
發明者費倫斯·皮特菲, 拉茨羅·貝利, 佐特·帕來 申請人:埃吉斯藥物工廠