專利名稱：圓球桿菌的bioA，bioD，bioF，bioC，bioH基因的克隆、載體和轉化細胞以及生物素的制備方法
技術領域：
本發明涉及采用DNA重組體的技術，通過發酵制備生物素。
生物素對于人類，動物，植物和某些微生物來說，是一個必需的維生素。
它可從蛋黃中分離出來，并可以以游離形式或與蛋白質結合的形式存在于啤酒酵母，谷物和各種器官中。
該維生素作為皮膚代謝的調節劑，可治療脂溢性皮炎。
除了前述的各種來源外，可用某些微生物合成生物素，尤其是用桿菌屬的微生物，例如圓球桿菌合成之。
圖1表示了在這類微生物中從庚二酸開始的生物素的生物合成鏈。這種生物合成鏈包括了不同的五個酶反應，其中起作用的基因分別相繼是bioc，bioF，bioA，bioD和bioB。
對工業發酵過程中的從庚二酸開始的生產生物素的系統性的研究，已顯示出某些微生物，尤其是屬于圓球桿菌屬的微生物能夠超生產(hyperproduisent)生物素和生物素的同效維生素(人們稱“同效維生素”(“Vitamères”)是指能導致生成生物素的各種中間體)。
對于這些細菌，在一些生物素的前驅當中，DTB(脫硫生物素)代表了主導成分。它是大量地，而且比最終成分，即生物素，還要多的量被生產出來的。
實際上存在一種強烈的抑制生物素合成的轉錄控制，它取決于在培養基中生物素的量，這種阻遏出現在E.Coli(大腸桿菌)和圓球桿菌(Bacillussphaericus)中(下稱球桿菌)。
然而，在E.Coli中每一個反饋抑制都不調節生物素的合成，而且這種控制也從來沒有在球桿菌中描述過。
要對在球桿菌中從庚二酸開始的大量DTB(相對于較少量的生物素)的生產作出完整的解釋還必需進行十分重要的生物學上分子結構的研究，以及在這種細菌中生物素合成途徑的調節的研究。
初步的研究表明，某些從能生成DTB的球桿菌菌株(Souches)開始的，生物合成的提取物的和半凈制的酶，與已知的在E.Coli中的生物素的酶進行比較，并不顯示出明顯的差別。
然而，通過這種球桿菌菌株的工業發酵生產生物素(IFO3525，NCLB9370)，如果其生物素產率有所改進，則可以與現有的化學方法相匹敵。為了達到這個目的，則應使在這些菌株中所有生物合成生物素的基因都取得超表達(hyperexpression)。
當然，人們已經敘述過對去抑制的(déréprimées)E.Coli菌株的選擇，或是通過其耐生物素的類似物，如α-脫氫生物素的作用，或是通過選擇生物素的超分泌作用的突變體實施之。同樣地，也敘述過“順式支配”(“Cisdominantes”)的突變，而這種突變在使所有的生物素基因被構成雙極性操縱子的合成過程中起了多效作用。同樣也敘述過反式的突變，除了其消除生物素的基因的轉錄控制的能力外，還常常具有多效作用的性質，即能在細胞的生理學方面起反響。
如果假設在球桿菌菌株中(Souches)生物素生物合成的分子控制和生物素的基因的總結構與E.Coli中的情況相同。那么，傳統的微生物的選擇方法也將適用于能生產DTB的球桿菌菌株中。
在所有這些假設中，在大量的工業發酵中和連續的培養中采用突變體菌株時，就需要選擇一些回復突變率很小的突變體。這就造成了一個難題，即在實際上缺乏在球桿菌中的精細的基因分析方法。
另有方法可以包括克隆(Cloner)所有的能生成DTB的從球桿菌菌株開始的生物素的生物合成鏈的基因。然后，在試管內修飾控制區域中的5′以便消除轉錄控制。
而且，用已知的基因工程技術，特別采用已知在球桿菌菌株中起作用的強的啟動子，在活體外進行操作對這些基因進行克隆能探討它們的一般結構，而且能改進它們在活體內的轉錄。
能夠通過采用已知的轉化，轉導或結合遷移等技術，實施所有這些超表達(hyperexprimés)基因的再引入(réintroduct-ion)，這些基因在球桿菌原始菌株中不再受生物素控制了(但是當提高溫度或采用不太費錢的基質(Substrat)時會因此受影響而受到誘導控制)。
同樣地，可以把這些基因引入到在食品工業中可以接受的，而且能經受庚二酸影響的許多不同的微生物中去，例如，枯草桿菌，麥酒的酶母屬，或者假單胞菌屬等菌株。
正如在法國專利8412598中所敘述的那樣，可以通過質粒的自體選擇(autosélection)或者通過在染色體中的整合作用在這些微生物中實現基因信息的穩定。
日本的專利JP-A-166992/85(1985年7月29日)，JP-A-66532/86(1986年3月25日)和JP-A-95724/86(1986年4月24日)已經揭露過球桿菌的bioB基因的特征和克隆。
本發明尤其涉及為在這些細菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產的酶密碼的DNA順序-bioA基因-bioD基因-bioF基因-bioC基因-bioH基因一些據本發明的DNA順序與已予先鑒定的bioB基因相連接形成象“一組建筑組群”(“Cluster”)的組合，而該組合包括了大部分的生物素的生物合成鏈。
在這些有關的DNA順序中，應該提及為由下列基因所生產的酶密碼的DNA順序-bioB和bioD，-bioB，bioD和bioA，-bioB，bioD，bioA和bioF，在適當的載體中使用這種類型的順序能夠從生物素的許多種同效維生素出發制備所需的生物素。
如下文要敘述的那樣，以上這些也可以通過使用能表達為由下列基因所生產的酶密碼的DNA順序-bioF和bioC-bioF和bioH-bioF，bioC和bioH，以及為(除了前述的順序外)下列基因密碼的順序
-bioA-bioA和bioD，或者-bioA，bioB和bioD的載體進行發酵而制備出來。
盡管前述的DNA順序可以有不同的來源，但是最好采用來源于桿菌菌株的順序，特別是來源于球桿菌菌株的。
正如前述，這些DNA順序宜于沒有能在細菌中形成生物素的生物合成方法中的酶的轉錄控制的天然順序，以便能取消由于生物素的天然調整，以及能把這些DNA順序置于所選擇的成分的控制下，從而確保它們在宿主菌株中的有效轉錄。
本發明特別涉及在圖4至8和圖17至19中所表示的整個或部分順序，而這些順序為前面已述的基因密碼。
據本發明的DNA順序可以以各種方式加于利用。
這些有關的DNA順序最好是由一個質粒載體攜帶，而該載體可用于轉化細菌，而且還包含一個由幾個成分所組成，并能表達相應基因的組合整體。
這種質粒可以是自主型和自體復制型的，或者相反地，可以整合到宿主菌株的染色體中。
實際上，所實施的各種技術是已知的，或者將在實例中敘述到。
然而，在整合載體的情況下，它至少應包含一個出現在要轉化的菌株的基因組中的順序的同源順序，它將確保染色體的整合。它顯然可以涉及到，相應于天然的基因順序的同源順序，或者通過其他的整合的質粒載體所引入的同源順序。
當載體是自主型和自體復制型時，該載體包含一個在宿主細胞中的有效復制的起源(Origine)。
同樣地，依靠要轉化的菌株的啟動子，這些不同的質粒載體可以包含能確保選擇的成分(elements)，例如防抗菌素的基因和/或基因標志物。
在這些能起宿主菌株作用的細胞中，特別應該提及以下一些細菌埃希氏桿菌屬，桿菌屬和假單胞菌屬以及一些酵母，尤其是酵母屬的酵母。
在這些相關的宿主細胞中，尤其應該提及球桿菌，枯草桿菌和大腸埃希氏桿菌。
用于被據本發明的DNA順序所轉化的最相關的菌株應該是一些這樣的菌株即它們已經被能確保表達這生物合成過程中的其它基因的載體所轉化。也就是說，正如在本專利申請中所敘述的基因F，A，D和B。
在這種條件下，把基因bioC和bioH引入到細菌中能允許這種細菌從鏈的第一同效維生素出發，即庚二酸鹽合成生物素，這在工業方面具有重要的經濟好處。
在本發明的領域中，整合的質粒載體最好是如下文要提及的質粒PTG475，它尤其包含誘導啟動子。
當載體包含自主復制的起源時，為前述的酶密碼的DNA順序最好是伴隨有一些能確保其在宿主菌株中表達的控制成分。它尤其涉及5′-末端的一個強的啟動子，它在所述的菌株中是有效的，而且可能還涉及到其它的成分，例如當宿主菌株是酵母或是其它的需要這種順序的微生物時，是結尾順序。
本發明也涉及被本發明的質粒載體所轉化的細胞，在這些細胞中尤其應提及細菌，特別是桿菌屬，埃希氏桿菌屬或假單胞菌屬，同樣也包括酵母，尤其是酵母屬。
在這些能被這些載體所轉化的菌株中，應該提及那些已生產生物素或其同效維生素的菌株。
本發明還涉及制備生物素的方法，其中包括用前面已述的那些細胞發酵至少含有庚二酸的生長培養基或該生物素的同效維生素，這些細胞能接受庚二酸或所說的生物素的同效維生素的影響，然后回收所生成的生物素。
本發明的方法可以用不同的變種實施之。
借助于用本發明的載體所轉化的細胞，可以在原位制備同效維生素。特別是含有基因bioF，bioH和bioC的轉化菌株可以用于從庚二酸中生產KAPA，然后，用攜帶互補基因D，A和B的菌株使KAPA轉化成生物素。
如果同時使用適合的菌株，那么也可以達到相繼的發酵過程或共發酵(Co-fermentation)。
同樣地，可以達到菌株的互補作用，即使這菌株只具有部分的相關基因，或者還可以轉化已經生產生物素的菌株，以便能過多地生產。
本發明的其它特征和優點將參照如下附圖，并通過下文要敘述的實例加以說明圖1表示生物素的生物合成鏈，圖2用圖解表示質粒PTG1400，圖3用圖解表示質粒PTG47.5，圖4表示沒有在其上游密碼的順序LORFn°1，圖5表示順序LORFn°1是基因bioD，
圖6表示順序LORFn°2是基因bioA，圖7表示順序LORFn°3是基因Y，圖8表示順序LORFn°4是基因bioB，圖9用圖解表示對PTG1400互補作用的探討，圖10用圖解表示不同種質粒中間的互補作用的探討，圖11用圖解表示質粒PTG1418的結構，圖12用圖解表示PTG1418的互補作用的試驗，圖13表示在下列質粒中所用的球桿菌的插入的限制作用的圖示，圖14用圖解表示質粒PTG1418和PTG1420，圖15用圖解表示質粒PTG1422和PTG1435，圖16用圖解表示質粒PTG1436和PTG1437，圖17表示順序LORFX，圖18表示順序LORFW，圖19表示順序LORFF，圖20圖解表示質粒PTG1440，圖21表示質粒PTG1418的插入限制作用的圖示，圖22和圖23表示從用于互補作用試驗中的PTG1418所衍生的各種質粒。
為了簡化之，有關的DNA順序和質粒的結構都用附圖表示。盡管如此，它們仍應考慮是本發明說明書的組成部分。
例1球桿菌IFO3525的基因bioA和bioD的互補作用所形成的克隆以及其與bioB的關系。
a).在大腸桿菌中(E.Coli)
在37℃下用200ml的培養基PAB(抗菌素的DIFCOBacto，介質3，17.5g/l)培養球桿菌IFO352517個小時，用離心分離回收細菌，然后用Saito方法(Saito等人BBA1963年，72，619-629)從該細胞中提取總DNA，制得450μg的純DNA。
把20μg的總DNA用HindⅢ完全限制(3U/μgDNA)，被HindⅢ完全消化以后，用堿性磷酸酶處理PBR322。
在50μl含有30mM Nacl，30mM PH7.5的Tris Hcl，10mM Mgcl2，0.2mM PH8的EDTA，2mM DTT，0.5mM PH7的ATP和0.1mg/ml的反應緩沖裝置中使被HindⅢ消化的基因組的DNA(2μg)和用2個單位的連接酶T4(Boehringer Mannheim)所處理的PBR322(1μg)相混合以制取雜交的重組質粒，在14℃下保溫16個小時，把連接作用的混合組分進行轉化試驗(Cohen等人，(1972年)PNAS69，2110-2114)。其中使用了E.Coli菌株C600 r-km+k，并且選擇在介質LB中抗氨比西林的(ampicilline)(100μg/ml)菌株。
取抽4個不同的質粒DNA的“樣品”(“Pools”)，每一樣品在轉化容器中平均各是104個克隆。
用這些DNA樣品轉化E.Coli的不同的生物變種，這些轉化或是根據在介質LB中存在氨比西林的情況下(100μg/ml)，或是在該抗菌素和同時存在生物素的原始營養(Prototrophie)的情況下(介質LB+氨比西林100μg/ml+抗生物素蛋白(avidine)0.2U/ml)選擇的。
所測結果列于表1中表1E.Coli選擇氨比西林選擇在氨比西林介質+基因型轉化株/μgDNA抗生蛋白0.2U/ml轉化株/μgDNAC268＊ΔbioA，his ＞1033(樣品n°4)(每一樣品)1(樣品n°1)C173＊ΔbioD，his ＞1032(樣品n°4)(每一樣品)＊Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol 112，830。
從選擇氨比西林和抗生蛋白的克隆中分離出質粒，并用限制作用的酶分析之。3個質粒(兩個來自C268菌株，另一個來自C173菌株)都包含4.3Kb的HindⅢ插入體，它有一個BgⅢ部位和2個SphⅠ部位，而沒有BamHI，SalⅠ，PstⅠ，EcoRV，PVUⅡ，AVaⅠ部位(Site)。
在這些質粒中之一的稱作為PTG1400的質粒已在圖2中表示其限制作用的圖示。在抗氨比西林和生物素的原始營養的情況下選擇，無論是C268(ΔbioA)，C173(ΔbioD)，R877(bioD19)菌株(Cleary和Campbell，1972年)或C162(bioB)菌株都能與只用氨比西林的情況下選擇的菌株以平均頻率進行重轉化(每μg DNA超過103)。
用PTG1400不可能取得任何一個菌株R878(bioC23)或R901(ΔbioA-D)(Cleary和Campbell，1972年)的生物素的營養缺陷體(auxotrophie)的互補作用。
b)在枯草桿菌中枯草桿菌的生物突變體的互補作用是很難發生的。因為眾所周知，即在枯草桿菌所慣用的復制質粒中克隆的外來插入過程中能發生頻率很大的缺失。這就是為什么要研制出采用沒有復制的質粒進行互補作用試驗的根本原因。
如果在基因組DNA和質粒之間存在同源的區域，那么采用枯草桿菌的天然反應潛能細胞就能以足夠高的頻率(大約104轉化株/μg DNA)在枯草桿菌的基因組DNA中出現非復制質粒的整合。
第一步包括質粒PTG475，其結構已如圖3中所示，在枯草桿菌的各種生物突變體中的整合。
質粒PTG475包含為C2.3氧化酶密碼的基因XylE(Zukowski等人(1983年)PNASUSA，80，1101-1105)，它能用作色原的標志物(黃色)，它在枯草桿菌的左聚(糖)蔗糖酶的基因的誘導啟動子的控制下被表達。該質粒同樣包含用于抗氯霉素的基因CAT;基因CAT和XylE是插入到PBR322。
這質粒是整合到枯草桿菌的下列菌株的染色體中·bioA菌株JKB3173(bioA173，aroG932;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，·bioB菌株BGSCIA92(bioB141，aroG932SacA32，ArgA2;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，
·bio112菌株JKB3112(bio112;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，上述整合是通過反應潛能細胞的轉化技術實施的(R.J.Boyland(1972年)，J.Bacteriol.110，281-290)，選用TBAB(DIFCOBlood色氨糖(tryptose)瓊脂基質)和氯霉素3μg/ml。
在轉化克隆中實施各種的控制當用蔗糖誘導時它們就變黃色，而且對菌株bioA，bioB和bio112進行Southern的雜交控制時能顯示出在左聚蔗糖酶的基因啟動子中的簡單重組作用能使PTG475發生整合作用。這些枯草桿菌的轉化菌株叫作bioATG1，bioBTG2和bio112TG3。質粒PTG475攜帶了在枯草桿菌的基因組中的順序PBR322，它由此能夠通過同源重組作用整合所有的包含相同順序的外來質粒。
第二步驟，在E.Coli中通過互補作用予先克隆過的質粒PTG1400被用作轉化枯草桿菌的菌株bioATG1，bioBTG2和bio112TG3。選用了介質LB+抗生物素蛋白0.2U/ml+氯霉素10μg/ml的條件。
在這里能夠發現，有可能通過菌株bioATG1和bioBTG2，而不是通過菌株bio112TG3選擇到極高頻率的生物素的原始營養體轉化株，而PTG1400卻不能互補bio112突變。
C).PTG1400的HindⅢ插入的最終特征為了檢測在球桿菌IFO3525的基因組DNA中的相同HindⅢ片段，進行了Southern的雜交試驗，即PTG1400的插入。
在極端的雜交條件下(50%的甲酰胺，0.6%的Denhardt溶液，0.1%SDS，3×SSC，42℃)，使用通過在活體外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而標記為32P的質粒PTG1400(“切口轉譯”“nick translation”)(2.5×107Cpm/μgDNA)，經過在-80℃下的6個小時放射自顯影，能產生在球桿菌IFO3525的基因組DNA中的4.3Kb的HindⅢ單帶(Seule bande)。人們可以證實，在這種雜交條件下PBR322沒有與球桿菌IFO3525的基因組DNA進行雜交反應。在相同的條件下，不可能用作為探查物(Sonde)的PTG1400檢測出在被HindⅢ處理過的枯草桿菌BGSCIA289的基因組DNA中和用HindⅢ處理過的E.Coli C600的基因組DNA中的每一個陽性反應。
用“Shotgun”方法分析了4.3Kb的HindⅢ片段的總DNA順序，也就是說用聲處理所得的片段的系統克隆，與低核苷酸-先導物的延伸或“氣旋缺失”(“délétionsCyclones”)。
在“Shorgun”方法中，通過超聲波處理切斷質粒PTG1400。用噬菌體T4的DNA的聚合酶處理DNA片段以后，這些具有自由端的片段移行到低熔點的瓊脂凝膠上，而那些大約300Pb的片段被分離出來。
在用SmaⅠ消化并且用磷酸酶處理的載體M13中實現了這些片段的克隆。
那些沒有與PBR322進行交叉雜交的空白區域(Plages)被挑選出來，并且順序了100個克隆。用數字電子計算機分析其結果。
用于取得一組交選克隆(氣旋(Cyclone)體系)的新近方法已經被用于DNA的順序(R、M、K.Dale，B、A、McClure，J.P.Houchins(1985)Plasmid13，31-40)。這種方法已經與“Shorgun”方法進行比較，以便證實所得的結果，而且這種方法生產包含有生物基因組或者孤立的生物基因的限定缺失的質粒。
PTG1400的HindⅢ片段的完整順序已如圖4，5，6，7和8中所示。
通過用數字電子計算機分析這種順序顯示出這片段具有為四個長范圍的讀碼(Lecture)密碼的能力(LORF)這些可能的轉譯的起始部位以及Shine和Dalgarno區域都在其下部劃著重線予以強調。在順序的3′末端處用下部著重線強調了回文區域(règionPalindromique)，它能顯示轉錄的終止部位。
詳細的互補作用的分析顯示出第一個區域LORF(圖5)(具有3個可能的轉譯起始部位)是基因bioD。
名叫“超長細胞”(“maxicellules”)的已知試驗已用E.Coli CSR603菌株加以實現(recAl，phr-1，UvrA6，thr-1，leu-6，thi-1，argE3，lacY1，galk2，ara14，xy115，mt11，ProA2，Str-31，tsx-33，SupE44，F-，Lambda-);這些試驗顯示出這個區域為其分子量大約是25Kd的多肽密碼。
第二個區域LORF(圖6)(具有3個可能的轉譯的起始部位)是基因bioA，E.ColiCSR603的“超長細胞”試驗顯示出其分子量大約是40Kd的多肽，這個多肽是基因bioA的產物。
目前尚不能確定第三個順序LORF基因Y(圖7)的作用。但是它的極大的疏水性和在密碼區域中存在有可能的順序符號顯示出這個LORF如果被轉錄和轉譯時，能夠為與膜相互作用的蛋白質密碼。事實上，這基因Y是與其它的基因bioA，bioD和bioB組成“簇”(“Cluster”)。從而顯示出它能為包含在生物素的新陳代謝中的其它功能密碼。
第四個區域LORF(圖8)(具有三個可能的轉譯的起始部位)已經被鑒定了，它涉及為基因bioB密碼的區域、在這里證實了這個基因是與基因bioA和bioD相連接成“簇”。
用含有PTG1400的4.3KbHindⅢ插入的亞-克隆(Sous-Clonées)區域的質粒的互補作用的分析清楚地顯示出如同圖9中所示，第一區域LORF是基因D的產物;而第二區域LORF是基因A的產物。
例2用球桿菌IFO3525的基因bioF的互補作用進行克隆用前述的方法采用前述的球桿菌IFO3525的HindⅢDNA基因組庫(banque)轉化E.Coli的突變體bioF12。
結果列于表2中
表2E.Coli菌株的選用氨必西林選用氨必西林介質+抗生基因型轉化株/μgDNA物素蛋白0.2U/ml轉化株/μgDNAR874＊bioF12，his ＞1042(樣品n°1)(每個樣品)2(樣品n°3)4(樣品n°4)＊Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol.112，830把質粒從選用含有氨必西林和抗生物素蛋白的介質的克隆中分離出來，并用限制酶進行分析。
其中的兩個質粒包含有大約4.5Kb和0.6Kb的HindⅢ插入，并分別具有SphⅠ，KpnⅠ，HpaⅠ，NdeⅠ，AvaⅠ，ClaⅠ，BgⅠ，XmnⅠ，PvuⅡ，ScaⅠ，StuⅠ部位，而不含有BgⅢ，XbaⅠ，SmaⅠ，PstⅠ，SalⅠ，NruⅠ，BamHⅠ，PvuⅠ，ECORⅠ，HindⅡ，ECoRV，FspⅠ，ApaⅠ，BalⅠ，AatⅡ部位。
其中的一個質粒，PTG1418，在選用抗氨必西林和生物素的原始營養時它可以重轉化E.Coli的874菌株(bioF12，his)，它的轉化時的平均頻率與選用氨必西林時的克隆選擇的頻率相仿(超過104/μg DNA)。
通過亞-克隆試驗顯示出只有4.5Kb的HindⅢ片段才為KAPA合成酶功能密碼，以確保E.Coli的R874菌株的bioF12突變體的互補作用。
為了檢測在球桿菌IFO3525的DNA基因組中的4.5Kb HindⅢ片段，并與PTG1418的4.5Kb插入相比較，進行了“Southern”試驗。其中采用了極嚴厲的雜交條件(50%甲酰胺，3×SSC，0.1%SDS，0.6%的Denhart溶液，42℃)，并采用了2×106Cpm/μg DNA M13TG1425(含有通過活體外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而被標記為32P的4.5Kb HindⅢ插入的噬菌體M13)，經過在-80℃的7個小時放射自顯影以后，在球桿菌IFO3525的DNA基因組中能顯示出大約4.5Kb的HindⅢ帶。
在同樣的條件下，無論在用HindⅢ處理過的枯草桿菌BGSCIA289的DNA基因組上，或在用HindⅢ處理過的E.ColiC600的DNA基因組中都沒有檢測到任何一個陽性反應。
無論用交迭PTG1400的末端3′的PTG1406的8.3Kb的SphⅠ片段，或用交迭PTG1400的末端5′的PSBOI的8.2Kb的MboⅠ片段，都不能在PTG1400插入和PTG1418插入之間檢測出交叉反應(見圖10)。
已經分析出PTG1418插入的限制圖并顯示于圖11中。
通過“Southern”分析和對互補作用的研究，證實了球桿菌IFO3525的bioF基因并沒有與同一微生物的基因bioA，bioD和bioB相結合(見圖12)。
例3通過與PTG1418及其各種衍生物的整合轉化作用進行枯草桿菌的突變體bio112TG3(由JKB3112，bioC/F-112aroG932衍生出來)的互補作用。
枯草桿菌的突變體bio112已通過營養試驗加以鑒別，而且在bioF或bioC功能中受影響(C.H、Pai，1975年，J.Bacterial121，1-8)。在這個突變體中，質粒PTG475已經通過前述的方法被整合到SacR-SacB位點上，由此而獲得的新菌株被稱為bio112TG3。
用各種質粒(如圖13-16所示的PTG1418，1420，1422，1435，1436和1437)實施對菌株bio112TG3的轉化作用。其中選用了LB介質+氯霉素10μg/ml+抗生物素蛋白500U/l，互補作用的結果列于表3。其結果是如同用E.Coli的突變體R874(bioF，his)的交叉試驗所得的結果枯草桿菌的bio112突變體很可能在基因bioF中受影響，通過對根據所用質粒所取得的互補作用的分析，有可能把基因bioF以限定于限制部位XmnⅠ和NcoⅠ之間的片段確定置于PTG1418的插入上(見圖21-23)。
表3枯草桿菌的bio112TG3菌株的整合轉化作用在介質LB+500U/L抗生物素質粒插入蛋白+10μg/ml氯霉素的互補作用PTG14185.1Kb的HindⅢ插入++PTG1422含有bioF和部分LORFW的3.1Kb的ClaⅠ插入++TG1420含有X和部分LORFW的2KbClaⅠ-HindⅢ插入-
表3(續)PTG1436含有基因bioF的1.3Kb的XmnⅠ-NcoⅠ的插入++PTG1437含有基因bioF的1.3Kb的NcoⅠ-XmnⅠ插入++PTG1435含有LORFx的0.6Kb的HpaⅠ-PVUⅡ插入-例4質粒PTG1418的4.53Kb的HindⅢ插入的核苷酸順序在多連鎖子(Polylinker)的部位上把HindⅢ插入克隆到M13TG131中。把所謂的“氣旋”(“Cyclone”)方法實施于質粒M13TG1425上，并用數字電子計算機分析其結果。憑借特種的低核苷酸可以把在順序中的兩股互補的小片段之間的讀碼(lecture)的某些區別加以澄清。
圖17-19已詳細圖解這順序。顯然，這種插入包含讀碼的三個開口的范圍(Cadre)，分別為其分子量是18462，28048和42940道爾頓(daltons)的蛋白質(亞單位基)密碼。從讀碼的含義上來說，最后一個基因是置于被鑒別為bioF的區域中。其中的枯草桿菌的這種蛋白質的分子量是和E.Coli的合成酶KAPA的分子量處于同一個數量級上(M.A.Eisenberg1973年，adv.Enzymol.38，317-372)。
讀碼的三個開口范圍的并置，如同在質粒PTG1400的插入情況一樣，可以具有操縱子的結構。這里需要指出，人們可以鑒別出在第一個基因的上游，有一個15個堿基對的順序(在圖17中用下部著重線表示之)同樣出現在質粒PTG1400的插入的第一個基因(bioD)的上游。這種鮮明特征可以顯示出球桿菌的這兩組生物素基因至少是接受共同的調節。這個可以是生物素(或是其衍生物)的控制，如同已述的球桿菌的KAPA合成酶(bioF)的情況一樣(y.yzumi，K.Sato，y.Tani和K.Ogata，1973年，Agric.Biolchem37，1335)。
從順序插入的最后一個基因的3′側，可以鑒別出一個顯示轉錄終止子(terminateur)特征的順序(在圖18中用下部著重線表示之)。
例5分別借助于質粒PTG1418(1433)和PTG1440的E.Coli突變體R878(bioC，his)和C261(ΔbioFCD，his)的互補作用用質粒PTG1418及其各種衍生物實施E.Coli的生物突變體的互補作用的慣用方法。
用質粒PTG1418和PTG1433(見表4)使E.Coli突變體R878(bioc，his)的有能力的細胞轉化，并接著在介質LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l上攤開之，經過36個小時在37℃溫度下的培養，就能檢測出生長情況。在這種介質中的轉化克隆的出現頻率與在介質LB+氨必西林100μg/ml上所測得的出現頻率是處于同一個數量線上。
表4E.Coli突變體R878bio的轉化作用.
每μgDNA的轉化株數量質粒選用介質LB+氨必西選用介質LB+氨比西林100μg林(100μg/ml)/ml+抗生物素蛋白(200U/l)PTG1418 103103PetitsPTG1433 103103PetitsPBR322 1030(在36個小時在37℃下培養后)在介質LC+氨必西林中的正常轉化克隆的生長在沒有生物素的情況下會減弱(介質LB+氨必西林+抗生物素蛋白;最少量的酪蛋白氨基酸，沒有生物素)。當它在沒有生物素的介質中被各種由PBR322衍生的質粒所轉化時，由于完全不存在這同一種突變體的生長，因此，這種突變體R878bioC的生物素的營養缺陷型的互補作用是非常意味深長的。
把質粒PTG1400和PTG1418的插入克隆到PBR322中，以便得到質粒PTG1440(圖20)。當把這種質粒PTG1440引入到E.Coli突變體C261(ΔbioFCD，his)時，就可以選用在介質LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l中的克隆。所得的這種轉化頻率與在介質LB+氨必西林中所得的頻率完全地相類似。此外，在介質LB+氨必西林中的正常轉化克隆的生長在沒有生物素的情況下會減弱的。根據這兩種結果(突變體bioC和bioΔFCD的生物素營養缺陷型的互補作用)，就能得出清楚的結論質粒PTG1418的插入同樣包含有球桿菌的基因bioC。而這些各種由PTG1418的插入衍生的亞-克隆(圖21-23)并不能得到E.Coli的突變體bioC的互補作用。只有含有這三個基因的插入(inserts)才能給與E.Coli的突變體bioC的有效互補作用。
例6E.Coli突變體bioH(PA505MAΔ108，argH，metA，bioH，malA，Strr)的互補作用。
這種突變體起初是描寫成bioB(D.Hatfield，M.Hofnung和M.Schwartz，1969年，J.Bactoriol.98？559-567)。后來又顯示出不排出任何同效維生素的特征，而且能夠在含有KAPA，DAPA，DTB或者生物素的礦物介質中生長。后來Eisenberg(1985年，AnnalsNewyorkAcademyofScience447，335-349)建議這種基因為庚二酰-COA-合成酶的亞單位(Sous-unité)(bioH)密碼。要注意到能過多地生產生物素的E.Coli的突變體(或者用能生長E.Coli的營養缺陷型bioB的維生素的排泄水平而選擇的，或者用抗α-脫氫生物素而選擇的)已經全部進行基因鑒別，而且在bioR位點上受影響。這位點為多功能的蛋白質密碼(操縱子bioABFCD的信息核糖核酸(RNA)的合成阻遏物(répresseur)和能把生物素固定在具有羧基酶功能的各種脫輔基酶蛋白的細胞溶素殘基上的合成酶的全酶)。
所有的至今被鑒別的能過多生產生物素的E.Coli的突變體被放置于為反式活性阻遏物密碼的基因中，而不是被放置于操縱子bioABFCD的操縱基因中，假設生物素的生物合成的另一個基因在這個調節下。根據文準竊兀騜ioH是較好的上述基因。
PTG1418的插入包含球桿菌的基因bioF和bioC，人們已研究出第三個基因是bioH。
采用質粒PTG1433能有效地取得E.Coli的突變體bioH的互補作用。另外，在這介質中所得到的生長是緩慢的，然而與對照相比較是非常的有意義的(見表5)。
表5E.Coli突變體bioHPA505MAΔ108的轉化作用每μgDNA的轉化株數目質粒選用介質LB+(100μg選用介質LB+(100μg/ml)/ml)氨必西林氨必西林+(200U/l)抗生物素蛋白PBR322 1040PTG1433 103103Petits(在37℃下培養36個小時以后)如同突變體bioC的互補作用一樣，突變體biOH的互補作用所需要的足夠條件，是在引入到菌中的質粒上同時存在三個PTG1418插入的基因(圖21-23)。
與能夠被球桿菌的單獨基因所互補的枯草桿菌和E.Coli的突變體bioF相反，在沒有生物素的情況下，當引入PTG1418的HindⅢ插入的三個基因的運載的重組質粒的時候，才能得到E.Coli的突變體bioC和bioH。由此能夠反映出，其中在球桿菌的庚二酰-COA-合成酶和E.Coli的相對應的酶之間的酶性質上的區別(對于底物的親和關系的區別，特別是多酶結構)，或者在E.Coli中球桿菌的庚二酰-COA-合成酶的還原合成(Synthéseréduite)，它限制了向KAPA的庚二酸鹽的代謝通量。
例7bioFCH基因的功能試驗借助于從來源于球桿菌的被分離的4.5KbHindⅢ片段衍生出來的插入的運載重組質粒，通過試驗能夠證明在bioF，bioH和bioC的DNA上存在有E.Coli的突變體bioF，bioH和bioC的互補作用。
然而，有必要通過從球桿菌的這些克隆基因的產物的活性試驗使信息趨于完整化。E.Coli的bioF基因已經顯出對由庚二酰-COA向KAPA轉化作用的催化特征(Eisenberg，1968年)。目前，兩個基因bioC和bioH的產物尚未能清楚地鑒別出來，在一個文獻中(Eisenberg，1985年)有人假設，它們是為包含在庚二酰-COA的生物合成中的蛋白質編碼的。人們已經作試驗以確證順序bioF，C，H是否有效地保證從庚二酸鹽向KAPA的轉化作用。
球桿菌的FCH密碼部分的運載插入(以連接到PTG1436的SphⅠ-SphⅠ片段的PTG1434的ECORV-SphⅠ片段的相組合的形式加于回收)已經融合到抗四環素的PBR322基因啟動子中以產生質粒PTG1446，以便能獲得與基因bioF，C，H有關的蛋白質有意義的表達。
接著把這個質粒引入到與E.Coli的bioH菌株匹配的細胞中。接著把這個重組菌株在加有100μg/ml氨必西林和0.5mg/ml的PH7.5的庚二酸鹽的GP培養基中(每一升中20g甘油，30g
蛋白胨，5g不含維生素的酪蛋白氨基酸，1gK2HPO4，0.5gKcl，0.5gMgSO4-5H2O，0.01gFeSO4-7H2O，0.001g PH6.8-7的MnSO4-4H2O，20μg鹽酸硫胺素)在37℃下，培養48個小時。
接著把5μl的殘存試樣在硅石板上進行色層分離(色譜溶劑是正丁醇(60)，醋酸(15)，水(25)，容積/容積，溶劑的遷移10cm)以便分離同效維生素和生物素這兩個產物。
在對每個同效維生素進行遷移以后，采用其保存號為ATCC7754的麥酒酵母屬的菌株，估算出KAPA的生物劑量數。
在這些跫攏嗣悄芄徊饉慍鱸諉縨l的殘存培養物中KAPA的繁殖量是85μg(用生物素當量表示之)。
在同樣條件下，進行含有質粒PBR322的同樣菌株的培養的對照試驗。在這種情況下，沒有任何一個突出的KAPA能被檢測出來。
然而，在這里顯示出PTG1418的插入是為在由庚二酸鹽轉化為KAPA中的足夠的和必需的一些酶功能編碼的，即基因bioC，H和F的產物。
本發明的代表菌株的儲藏E.ColiC600PTG1400和R874PTG1418的菌株，于1986年9月26日，以寄存號為n°1-608和1-609儲藏在巴斯德(Pasteur)研究院的國家微生物培養保藏中心，其地址是法國，巴黎，28rueduDocteur-Roux-75724ParisCédex15。
權利要求
1.為在細菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產的酶編碼的DNA順序，bioA基因；bioD基因；bioF基因；bioC基因；bioH基因。
2.據權利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioB和bioD所生產的酶編碼。
3.據權利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioD，bioA和bioB所生產的酶編碼。
4.據權利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioD，bioA，bioB和bioF所生產的酶編碼。
5.為在細菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產的酶編碼的DNA順序，·bioF和bioC，·bioF和bioH，·bioF bioC和bioH。
6.據權利要求5的DNA順序，其特征是它還至少為下列基因中之一所生產的酶編碼，·bioA;bioA和bioD。
7.據權利要求5或6中之一的DNA順序，其特征是它為由基因bioD，bioA和bioB所生產的酶編碼。
8.據權利要求1至7中之一的DNA順序，其特征是它沒有天然的順序，而該順序是確保在原始細菌中生物素的生物合成方法中的酶的轉錄控制。
9.DNA順序，它是在圖4至8和圖17至19中所述的整個或部分順序。
10.據權利要求1至9中之一的DNA順序，其特征是它來源于桿菌菌株(Souche)。
11.據權利要求10的DNA順序，其特征是它來源于球桿菌菌株。
12.至少包含一個據權利要求1至11的順序的質粒載體。
13.據權利要求12的載體，其特征它是包含能整合到宿主菌株的染色體中的DNA順序。
14.據權利要求13的載體涮卣魎遼侔桓齟嬖謨諞木甑幕蜃櫓械模⒛芙姓獻饔玫乃承虻耐此承頡
15.據權利要求14的載體，其特征該同源順序是天然的基因組的順序。
16.據權利要求14的載體，其特征該同源順序是一個依靠整合的質粒載體而已被整合到基因組中的順序。
17.據權利要求16的載體，其特征是該特定的質粒載體至少包含一個防抗生素的基因和一個從屬于欲轉化的菌株的啟動子的基因標志物。
18.據權利要求17的載體，其特征是該啟動子是誘導啟動子。
19.據權利要求18的載體，其特征是該整合的質粒載體是質粒PTG475。
20.據權利要求12的載體，其特征是它包含自主復制的起源(Origine)。
21.據權利要求20的載體，其特征是它是一個桿菌菌株，或是大腸埃希氏菌菌株的自主復制起源。
22.據權利要求20或21中之一的載體，其特征是為生物素的生物合成鏈的酶密碼的DNA順序是伴陪有能在宿主菌株中表達的成分(element)。
23.據權利要求22的載體，其特征是在這些能表達的成分中包括了在宿主菌株中有效的啟動子和終止密碼子。
24.被據權利要求12至23中之一的載體所轉化的細胞。
25.據權利要求24的細胞，其特征它是選自桿菌屬，埃希氏菌屬或假單胞菌屬的細菌。
26.據權利要求24的細胞，其特征它是酵母菌屬的酵母。
27.據權利要求25的細胞，其特征它是選自球桿菌，枯草桿菌和大腸埃希氏桿菌。
28.據權利要求24至27中之一的細胞，其特征該轉化細胞是生產生物素或其同效維生素的細胞。
29.制備生物素的方法，其特征把至少含有庚二酸或該生物素的同效維生素的培養基用據權利要求24至28中之一的，并能接受庚二酸或所說的同效維生素影響的細胞進行發酵，并由此回收所生成的生物素。
30.據權利要求29的方法，其特征該生物素的同效維生素是通過用生產該同效維生素的據權利要求24至28中之一的細胞對至少含有庚二酸的培養基進行發酵而制得的。
31.據權利要求30的方法，其特征是實施據權利要求24至28中之一的兩個細胞菌株的共發酵(co-fermentation)，其中之一是用于從庚二酸出發生產生物素的同效維生素，另一個是用于發酵該同效維生素以制備生物素。
全文摘要
本發明涉及DNA(脫氧核糖核酸)順序，它是下列的在細菌中的生物素的生物合成鏈的基因之一bioA，bioD，bioF，bioC和bioH基因。
文檔編號C12N1/21GK1031111SQ8710780
公開日1989年2月15日 申請日期1987年9月28日 優先權日1986年9月30日
發明者里米·格洛克霍爾姆, 迪尼斯·斯彼克, 維斯·利莫恩 申請人:特朗斯吉恩有限公司