一種動物細胞貼壁培養裝置制造方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種動物細胞貼壁培養裝置，包括錐形培養瓶，所述的培養瓶的瓶口處設置有可拆卸的瓶口內套，在錐形瓶中設置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內套上，提斗掛桿的下端設置有空載提斗；在瓶口內套上設置有用于密封瓶口內套的上蓋。本裝置經過清潔處理后高壓滅菌可反復使用，成本低廉；在工程細胞抗體制備及表達過程中，可配套CO2培養箱或細胞培養搖床進行1L-10L規模的細胞培養放大抗體制備，方法簡單便于操作；針對不同細胞種系在采用本裝置選用載體的同時，也可根據自身細胞特性，選擇其他商品化載體，大大擴展了本裝置的應用范圍，能夠為細胞生物學實驗提供有力的支持。
【專利說明】一種動物細胞貼壁培養裝置
【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及細胞工程【技術領域】，主要涉及一種動物細胞貼壁培養裝置，用于 各類貼壁生長的工程細胞，如CH0細胞、HEK293細胞及雜交瘤細胞等。
【背景技術】
[0002] 動物細胞培養的基礎是組織細胞培養技術。近來由于生物科學和技術科學相互滲 透、遺傳學和生物化學的相互結合，分子遺傳學、分子生物學和細胞工程等新型學科迅速發 展。這些新學科的形成與發展都與組織培養技術密切相關，目前的組織細胞培養技術不僅 是用于研究生命科學理論的重要技術方法，同時也日益成為生物工程、基因工程制藥的生 產工具和手段。
[0003] 貼壁培養（anchorage-dependent culture)是讓細胞貼附在某種基質上進行增殖 的培養方法，主要適用于一切貼壁細胞，也適用于兼性貼壁細胞。實際生產中具有貼壁生長 特性的細胞種類較多，如CH0細胞、BHK細胞和Vero細胞等。
[0004] 貼壁培養的主要優點是細胞可貼附于培養介質內外表面，細胞將有效的表達產 品，同時容易進行培養液的更換，容易采用灌流培養的模式，培養過程不段添加新鮮培養 液，去除代謝產物，從而使單位體積內細胞密度較高，與懸浮培養相比可維持的培養周期相 對較長。而貼壁培養的不足之處是操作比較繁瑣，需要合適的貼附材料以及足夠的貼附面 積，培養條件不均一。由于貼壁細胞的貼壁要求，提高細胞密度的有效方法就是使反應體系 中比表面積最大化。傳統的貼壁細胞培養方法包括轉瓶（roller bottle)、多層平板培養 如Nune公司、CellCube和Costar公司的細胞工廠（cell factories)，和攪拌式微栽體懸 浮培養。
[0005] 現有的貼壁細胞培養技術，存在相當多的弊端，如勞動、設備、耗材的消耗大大增 加了生產成本，如Costar公司的5L體積細胞工廠系統和GE公司的50mg規格disc碟形載 體等價值萬元的一次性耗材設備；大體積的轉瓶、細胞工廠因為清潔原因難以重復使用，為 增加其貼壁面積，體積或數量也相應增加，使得操作、污染防范變得更加困難；由于細胞貼 壁生長，在培養結束后，貼壁介質表面會附著大量的粘連蛋白和細胞碎片，使得系統的清潔 和質量控制變得更加困難，外源污染的控制又增加了額外的研發成本。所以這些因素大大 限制了貼壁細胞培養在抗體研發過程中的應用。
【發明內容】
[0006] 本實用新型的目的在于，提供一種用于動物細胞貼壁培養的裝置，可針對CH0細 胞、HEK293細胞及雜交瘤細胞等貼壁生長的動物細胞，進行中試規模的細胞培養，進行百毫 克級的目標蛋白抗體的表達，提高前期抗體藥物開發效率，降低研發成本，同時為腫瘤或組 織細胞體外大量擴增及DNA載體體外轉染等相關實驗研究提供有力的支持。
[0007] 本實用新型采用以下技術方案：
[0008] -種動物細胞貼壁培養裝置，包括錐形培養瓶，所述的培養瓶的瓶口處設置有可 拆卸的瓶口內套，在錐形瓶中設置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內套 上，提斗掛桿的下端設置有空載提斗；在瓶口內套上設置有用于密封瓶口內套的上蓋。
[0009] 進一步地，所述的提斗掛桿包括彎桿，彎桿由相互平行的上段桿和下段桿以及連 接上段桿和下段桿的連接桿組成，為一體式結構；上段桿的長度大于下段桿的長度，上段 桿的頂端固結有寬度大于上段桿直徑的卡片，在下段桿上加工有用于安裝空載提斗的外螺 紋。
[0010] 進一步地，提斗掛桿安裝在瓶口內套上時，提斗掛桿和空載提斗的下端均不與培 養瓶底面接觸。
[0011] 進一步地，所述的空載提斗為空心的矩形體結構，在空載提斗的側壁上均勻分布 有多個穿透側壁的圓孔，空載提斗通過其上部的上緊固螺母和下部的下緊固螺母安裝在提 斗掛桿的下段桿上。
[0012] 進一步地，所述的瓶口內套包括環形套和與環形套同軸心線固結的套筒，環形套 的內徑與套筒的內徑相同，套筒的外徑小于培養瓶瓶口的內徑，環形套的外徑大于培養瓶 瓶口的外徑。
[0013] 進一步地，在環形套和套筒的內壁上沿軸向加工有用于安裝提斗掛桿的卡槽，卡 槽長度小于瓶口內套的軸向長度。
[0014] 進一步地，所述的空載提斗中裝有載體，空載提斗位于培養瓶的中下部位置。
[0015] 進一步地，所述的空載提斗在培養瓶中設置1?4個。
[0016] 本實用新型的技術優點：
[0017] 1)本裝置可應用于動物細胞貼壁培養，在細胞生物學及細胞工程領域，有廣泛的 應用價值，適用于細胞增殖培養或工程細胞培養抗體制備等相關實驗研究；
[0018] 2)本裝置可對振蕩器旋轉速率、提斗掛桿類型、貼壁載體類別進行選、擇調整，以 優化培養系統的細胞貼附能力，增加細胞培養周期，提高細胞密度及產物產量；
[0019] 3)本裝置操作簡便、成本低廉，提斗及培養瓶可經過堿液處理清潔后高壓后重復 使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1是本裝置的整體結構示意圖；
[0021] 圖2是提斗掛桿部分的正視圖；
[0022] 圖3是提斗掛桿部分的側視圖；
[0023] 圖4是瓶口內套的軸向剖視圖；
[0024] 圖5是瓶口內套的俯視圖；
[0025] 圖6是三種細胞方瓶及本裝置貼壁培養密度對比；
[0026] 圖7是三種細胞硼酸鹽玻璃纖維貼壁培養顯微觀察；
[0027] 圖8是293T細胞錐形瓶內貼壁轉染eGFP-Nl質粒綠色熒光蛋白表達；
[0028] 圖9是對比實例3的H18嵌合抗體表達制備對比圖；
[0029] 圖10是對比實例4的CypA抗體表達制備對比圖；
[0030] 圖11是對比實例5的H18嵌合抗體表達制備對比圖；
[0031] 圖中標號代表：1 一上蓋，2-套筒，3-培養瓶，4一上段桿，5-連接桿，6-上緊固 螺母，7-蓋體，8-空載提斗，9-下段桿，10-下緊固螺母，11-環形套，12-卡槽，13-卡 片；
[0032] 以下結合附圖和發明人給出的【具體實施方式】對本發明進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0033] 遵從上述技術方案，如圖1至圖3所示，一種動物細胞貼壁培養裝置，包括錐形培 養瓶3,所述的培養瓶3的瓶口處設置有可拆卸的瓶口內套，在錐形瓶中設置有提斗掛桿， 提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內套上，提斗掛桿的下端設置有空載提斗8 ;在瓶口 內套上設置有用于密封瓶口內套的上蓋1。
[0034] 本裝置的主體結構為透明的錐形培養瓶3,培養瓶3的瓶口上設置有瓶口內套。如 圖4所示，瓶口內套包括環形套11和與環形套11同軸心線固結的套筒2,環形套11的內徑 與套筒2的內徑相同，套筒2的外徑小于培養瓶3瓶口的內徑，環形套11的外徑大于培養 瓶3瓶口的外徑，使用時將瓶口內套塞在培養瓶3的瓶口上，用來安裝提斗掛桿。為了保證 培養瓶3的密封性，套筒2的外徑宜略小于瓶口的內徑。
[0035] 瓶口內套上設置有上蓋1，上蓋1的縱向截面為倒梯形，當瓶口內套裝在培養瓶3 的瓶口上時，將上蓋1用以密封瓶口內套。
[0036] 提斗掛桿包括彎桿，彎桿由相互平行的上段桿4和下段桿9以及連接上段桿4和 下段桿9的連接桿5組成，為一體式結構；上段桿4的長度大于下段桿9的長度，上段桿4 的頂端固結有寬度大于上段桿4直徑的卡片13,卡片13的作用是卡在瓶口內套中的卡槽 12中；在下段桿9上加工有用于安裝空載提斗8的外螺紋。提斗掛桿安裝在瓶口內套上時， 提斗掛桿和空載提斗8的下端均不與培養瓶3底面接觸，保持一定的距離。
[0037] 空載提斗8為空心的矩形體結構，其上部有蓋體7,在空載提斗8的側壁上均勻分 布有多個穿透側壁的圓孔，空載提斗8的上端和下端分別設置有上緊固螺母6和下緊固螺 母10,通過兩個螺母將其緊固安裝在提斗掛桿的下段桿9上，并可以進行拆卸。
[0038] 在瓶口內套的內壁上，即環形套11和套筒2的內壁上，沿其軸向加工有用于安裝 提斗掛桿的卡槽12,如圖5所示；卡槽12長度小于瓶口內套的軸向長度，即卡槽12相對 于瓶口內套的軸向是未通透的，將提斗掛桿的卡片13沿卡槽12的延伸方向放置在卡槽12 中，即可用于掛載空載提斗8 ;而將提斗掛桿從卡槽12中提出，即可實現提斗掛桿與瓶口內 套的分離。空載提斗8優選在培養瓶3中設置1?4個。
[0039] 瓶口內套、提斗掛桿、空載提斗8及上緊固螺母6、下緊固螺母10均采用316L不銹 鋼制作，瓶口內套、提斗掛桿與空載提斗8內外表面均經過拋光處理。
[0040] 本裝置采用懸掛設計將不銹鋼空載提斗8懸掛于培養瓶3的中下部，可通過過變 更掛桿類型調節空載提斗8距離錐形瓶中心的距離，從而調整液流湍動程度。
[0041] 在空載提斗8中的載體在高壓滅菌前進行清潔與填充，載體為硼酸鹽玻璃纖維 絲，使用多聚賴氨酸進行表面處理，增加細胞貼附力度，同時本裝置可選擇填裝巨載體、碟 形載體等直徑大于2mm的商品化載體。
[0042] 本裝置的清潔及安裝
[0043] 1)使用5 % DeC〇n90清洗液浸泡培養瓶3、載體及各個部件過夜；
[0044] 2)分別使用自來水及純水充分沖洗瓶體、載體及各個部件；
[0045] 3)以當日純水pH為標準，使用pH試紙檢測各部件殘水pH值，直至與純水pH相 等；
[0046] 4)稱取適量載體（硼酸鹽玻璃纖維或商品化載體），打開空載提斗8的蓋體7,將 載體裝入空載提斗8中；將空載提斗8的蓋體7由下端穿入提斗掛桿中，連接提斗掛桿與下 緊固螺母10,封閉空載提斗8,旋緊提斗掛桿上方的上緊固螺母6 ;
[0047] 5)將安裝完成的空載提斗8依次緩慢垂直放入錐形培養瓶3中；
[0048] 6)將瓶口內套套裝入錐形培養瓶3中，將提斗掛桿上端卡口裝卡
[0049] 入瓶口內套的卡槽12內，蓋上錐形培養瓶3上蓋1 ;
[0050] 7)放入高壓滅菌器中，將錐形培養瓶3上蓋1旋開1/3,開始高壓滅菌，121 °C高壓 30min ；
[0051] 8)高壓滅菌完成后，封閉錐形培養瓶3的上蓋1，待用。
[0052] 硼酸鹽玻璃纖維載體處理
[0053] 通過多聚賴氨酸處理可提高硼酸鹽玻璃纖維的細胞貼附能力，實驗發現除雜交瘤 細胞及Vero細胞外，腫瘤細胞、CH0細胞、HEK293細胞及BHK21細胞對硼酸鹽玻璃纖維有良 好的貼附能力。所以，可根據具體培養情況選擇是否進行多聚賴氨酸處理。
[0054] 1)使用PBS配制100 μ g/ml多聚賴氨酸溶液,0. 22 μ m濾器過濾除菌；
[0055] 2)無菌PBS稀釋至25 μ g/ml，加入本裝置的無菌錐形培養瓶3中，液體應浸沒空 載提斗8的上部；
[0056] 3)室溫過夜，PBS沖洗3遍后，待用；
[0057] 細胞培養生長實例1
[0058] 1.細胞接種
[0059] 將約IX 107cells數量的CH〇-kl、HEK293T、H18雜交瘤細胞接種至分別加裝玻璃 纖維及GE公司商品化disc碟形載體的錐形培養瓶3中，補加1640添加10%胎牛血清培養 基至500ml，放置于細胞搖床中；
[0060] 1)培養觀察
[0061] 每日顯微鏡觀察上清液中細胞懸浮狀況；
[0062] 2)細胞計數
[0063] 培養5天后，棄去上清液，50ml胰酶消化各提斗中細胞，血細胞計數器進行細胞計 數；
[0064] 3)實驗結果
[0065] 接種24h后，細胞均貼附于載體中，上清取樣觀察基本無細胞懸浮，48_72h間可觀 察到上清液逐漸變黃，72h后上清液中脫落細胞及碎片逐漸增加；回收消化計數結果見圖 6,結果顯示應用本裝置可實現細胞貼壁培養大量擴增，商品化載體disc貼壁載體培養效 果略優于硼酸鹽玻璃纖維載體，玻璃纖維載體顯微圖片見圖7。
[0066] 質粒DNA轉染實例2
[0067] 1)細胞接種
[0068] 將約IX 107cells數量HEK293T接種至加裝硼酸鹽玻璃纖維錐形培養瓶3中，補 加1640添加10%胎牛血清培養基至450ml，放置于細胞搖床中過夜培養；
[0069] 2)質粒轉染
[0070] i.按照PEI (sigma)使用說明書，以PEI/DNA1:2比例混勻eGFP-Nl質粒DNA與PEI 溶液，質粒DNA實驗濃度2ug/ml，室溫放置lOmin ;
[0071] ii.棄去培養瓶3內血清培養基，使用無菌PBS溶液輕輕沖洗1-2次，加入 450ml 1640 培養基；
[0072] iii.將質粒DNA與PEI共聚物溶液加入培養瓶3中，放入細胞搖床中培養4h后， 加入10 %胎牛血清，繼續培養；
[0073] 3)熒光蛋白表達觀察
[0074] 24h后，取出玻璃纖維載體，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達狀況；
[0075] 4)實驗結果
[0076] 如圖8顯示，24h后293T細胞貼壁狀態良好，轉染eGFP-Nl質粒后，綠色熒光蛋白 正常表達，且具有較高的熒光強度。
[0077] H18抗體表達制備對比實例3
[0078] 1)細胞接種
[0079] i.將約lX107cells數量的H18雜交瘤細胞接種至培養瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補加1640添加10%胎牛血清培養基至500ml ;
[0080] ii.將培養瓶3放置于C02培養搖床中，旋轉振蕩，設置轉速50rpm/min，觀察培 養；
[0081] ^丨.4811后細胞工廠補加11^1640添加10%胎牛血清培養基，培養瓶3逐步調節振 蕩器轉速至80rpm/min ;
[0082] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統純化目標抗體
[0083] 2)制備檢測
[0084] 經過5天培養，細胞工廠回收上清約1.9L，獲得抗體85.8mg，得率為45. 16mg/ L ;本裝置回收上清0. 85L，獲得抗體38. 6mg，得率為45. 4mg/L，產量無明顯差別；經過 SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖9所示。
[0085] CypA抗體表達制備對比實例4
[0086] 1)細胞接種
[0087] i.將約lX107cells數量的H18雜交瘤細胞接種至培養瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補加1640添加10%胎牛血清培養基至500ml ;
[0088] ii.將培養瓶3放置于C02培養搖床中，旋轉振蕩，設置轉速60rpm/min，觀察培 養；
[0089] iii. 48h后培養瓶3逐步調節振蕩器轉速至100rpm/min ;
[0090] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統純化目標抗體。
[0091] 2)制備檢測
[0092] 經過5天培養，Ge公司disc載體回收上清0. 45L，獲得抗體5. 15mg，得率為 11. 4mg/L ;玻璃纖維載體回收上清0. 45L，獲得抗體4. 28mg，得率為9. 5mg/L，產量無明顯差 另IJ ;經過SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖10所示。
[0093] H18嵌合抗體表達制備對比實例5
[0094] 1)細胞接種
[0095] i.將約lX107cells數量的H18雜交瘤細胞接種至培養瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補加1640添加10%胎牛血清培養基至500ml ;
[0096] ii.將培養瓶3放置于C02培養搖床中，旋轉振蕩，設置轉速60rpm/min，觀察培 養；
[0097] iii. 48h后培養瓶3逐步調節振蕩器轉速至100rpm/min ;
[0098] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統純化目標抗體
[0099] 2)制備檢測
[0100] 經過5天培養，Ge公司disc載體回收上清0. 45L，獲得抗體37. 26mg，得率為 82. 8mg/L ;玻璃纖維載體回收上清0. 45L，獲得抗體39. 42mg，得率為87. 6mg/L，產量無明顯 差別；經過SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖11所示。
【權利要求】
1. 一種動物細胞貼壁培養裝置，包括錐形培養瓶（3)，其特征在于，所述的培養瓶（3) 的瓶口處設置有可拆卸的瓶口內套，在錐形瓶中設置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸 地安裝在瓶口內套上，提斗掛桿的下端設置有空載提斗（8);在瓶口內套上設置有用于密 封瓶口內套的上蓋（1)。
2. 如權利要求1所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，所述的提斗掛桿包括彎 桿，彎桿由相互平行的上段桿（4)和下段桿（9)以及連接上段桿（4)和下段桿（9)的連接桿 (5)組成，為一體式結構；上段桿（4)的長度大于下段桿（9)的長度，上段桿（4)的頂端固 結有寬度大于上段桿（4)直徑的卡片（13)，在下段桿（9)上加工有用于安裝空載提斗（8) 的外螺紋。
3. 如權利要求1所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，提斗掛桿安裝在瓶口內 套上時，提斗掛桿和空載提斗（8)的下端均不與培養瓶（3)底面接觸。
4. 如權利要求2所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)為空 心的矩形體結構，在空載提斗（8)的側壁上均勻分布有多個穿透側壁的圓孔，空載提斗（8) 通過其上部的上緊固螺母（6)和下部的下緊固螺母（10)安裝在提斗掛桿的下段桿（9)上。
5. 如權利要求1所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，所述的瓶口內套包括環 形套（11)和與環形套（11)同軸心線固結的套筒（2)，環形套（11)的內徑與套筒（2)的內 徑相同，套筒（2)的外徑小于培養瓶（3)瓶口的內徑，環形套（11)的外徑大于培養瓶（3) 瓶口的外徑。
6. 如權利要求5所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，在環形套（11)和套筒 (2)的內壁上沿軸向加工有用于安裝提斗掛桿的卡槽（12)，卡槽（12)長度小于瓶口內套的 軸向長度。
7. 如權利要求1所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)中裝 有載體，空載提斗（8)位于培養瓶（3)的中下部位置。
8. 如權利要求1所述的動物細胞貼壁培養裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)在培 養瓶⑶中設置1?4個。
【文檔編號】C12M3/04GK203999636SQ201420408859
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】陳志南, 張陽, 王彬, 張征, 南剛, 孫秀璇, 馮飛, 王曄, 徐力清, 姚西英 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學