癌癥檢測方法、試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號：499662閱讀：510來源：國知局

癌癥檢測方法、試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本申請針對癌癥中的突變高發基因，提供了用于癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的試劑盒，其包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對，例如SEQ ID NO:1-22所示的11對引物。該試劑盒可用于癌癥診斷或輔助診斷、癌癥預后監測或指導癌癥治療用藥等目的。本申請還提供了相應的檢測方法。
【專利說明】癌癥檢測方法、試劑盒及其應用發明領域
[0001] 本申請大體上涉及癌癥中的突變高發基因的檢測。具體而言，本申請提供了基于多重PCR和高通量測序技術的用于癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的試劑盒和檢測方法。所提供的檢測結果例如可用于癌癥診斷或輔助診斷、癌癥預后監測或指導癌癥治療用藥等目的。
[0002] 發明背景
[0003] 癌癥是全球最主要的非傳染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病。我國每年因癌癥死亡的人數高達270萬，其中以肺癌、結直腸癌、胃癌等消化道惡性腫瘤最為嚴重。女性中以乳腺癌為首的婦科惡性腫瘤也是癌癥死亡的主要原因。據統計，我國肺癌的發病率為53. 57/10萬，死亡率高達45. 57/10萬，兩個比例均處于所有惡性腫瘤之首。胃癌次之，發病率為36. 21/10萬。乳腺癌的發病率處于女性腫瘤之首，為42. 55/10萬。
[0004] 抗腫瘤靶向藥物是目前治療癌癥較為有效的一種手段，2013年全球銷量前十大藥物近一半為抗腫瘤靶向藥物。抗腫瘤靶向藥物和其他化療藥物療效和毒副作用因人而異，這是因為從本質上講，癌癥是一種多基因突變造成的疾病。關鍵基因的突變、截短、錯位或融合等導致腫瘤發生。由于不受控的增殖，腫瘤細胞會發生更多的基因突變，導致腫瘤惡性化程度加深、轉移和抵抗治療。識別個體腫瘤特異性的驅動基因突變因此成為有效的選擇靶向藥物應用的關鍵。目前NCCN(美國國立綜合癌癥網絡）已對多種靶向藥物的使用作出規定，建議其在用于腫瘤治療前進行基因突變檢測以確定是否適合用藥，例如吉非替尼 (gefitinib)、曲妥珠單抗（Trastuzumab)等。
[0005] 隨著科技發展，抗腫瘤藥物的發展也表現出藥物使用從單一到聯合的趨勢。以前靶向藥物以單藥加化療為主，但大多數腫瘤是多基因疾病，針對單個靶點治療雖然能延長生存，但很少能根治，故目前多個靶向藥物的聯合治療研宄越來越多，其中最成功的例子就是BRAF和MEK抑制劑聯合治療黑色素瘤。能同時、快捷地檢測多個藥物靶點基因的方法就變得尤為重要，結合高通量測序的個體化基因治療也被認為是腫瘤治療最終努力的方向。
[0006] 目前常見的檢測基因突變的方法有熒光定量PCR法和Sanger測序法（一代測序）。熒光PCR法具有靈敏度高的特點，且技術已經成熟，應用廣泛，但是每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需要單獨建立一個PCR反應體系，導致樣品用量較大，且無法同時檢測太多樣品或位點。在Sanger測序法中，單對引物可檢測多個突變，具有成本低等特點，但同樣所需樣品量大，且對低頻突變的檢測不夠令人滿意。
[0007] 因此，本領域目前仍需要能夠實現癌癥驅動基因的檢測工具。
[0008] 發明概述
[0009] 第一方面，本申請提供了用于癌癥樣品或疑似癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的試劑盒，其包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對。
[0010] 在一些實施方案中，試劑盒包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中每一個的一個或多個外顯子的區域的引物對。
[0011] 本申請的試劑盒可用于癌癥診斷或輔助診斷、癌癥預后監測或指導癌癥治療用藥等目的。
[0012] 在一些實施方案中，癌癥選自肺癌、結直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤。
[0013] 在一些實施方案中，癌癥是肺癌。
[0014] 在一些實施方案中，BRAF基因的外顯子選自外顯子11和/或15。
[0015] 在一些實施方案中，EGFR基因的外顯子選自外顯子18、19、20、21或其任意組合。
[0016] 在一些實施方案中，KRAS基因的外顯子選自外顯子2和/或3。
[0017] 在一些實施方案中，PIK3CA基因的外顯子選自外顯子9和/或20。
[0018] 在一些實施方案中，用于擴增BRAF基因的外顯子11的區域的引物對如SEQ ID NO :1和2所示。
[0019] 在一些實施方案中，用于擴增BRAF基因的外顯子15的區域的引物對如SEQ ID NO :3和4所示。
[0020] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子18的區域的引物對如SEQ ID NO :5和6所示。
[0021] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子19的區域的引物對如SEQ ID NO :7和8所示。
[0022] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO :9 和 10 和 / 或 SEQ ID NO :11 和 12 所示。
[0023] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子21的區域的引物對如SEQ ID NO : 13和14所示。
[0024] 在一些實施方案中，用于擴增KRAS基因的外顯子3的區域的引物對如SEQ ID NO : 15和16所示。
[0025] 在一些實施方案中，用于擴增KRAS基因的外顯子2的區域的引物對如SEQ ID NO : 17和18所示。
[0026] 在一些實施方案中，用于擴增PIK3CA基因的外顯子9的區域的引物對如SEQ ID NO : 19和20所示。
[0027] 在一些實施方案中，用于擴增PIK3CA基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO :21和22所示。
[0028] 在一些實施方案中，試劑盒包含如SEQ ID NO :1-22所示的11對引物。
[0029] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于從所述樣品提取基因組DNA的試劑。
[0030] 在一些實施方案中，試劑盒包含利用所述引物進行多重PCR反應的試劑。
[0031] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于處理擴增產物以使得擴增產物能用于高通量測序技術中的試劑。
[0032] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于對處理后的擴增產物進行高通量測序的試劑。
[0033] 在一些實施方案中，高通量測序選自Ion Torrent測序、Ion PGM測序、HiSeq 2000測序以及MiSeq測序。
[0034] 在一些實施方案中，高通量測序為Ion Torrent測序。
[0035] 在一些實施方案中，試劑盒包含非癌對照樣品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA 基因中的一個或多個未發生突變的癌癥對照樣品。
[0036] 第二方面，本申請提供了本申請提供了用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對在制備用于癌癥診斷或輔助診斷、或用于癌癥預后監測、或用于指導癌癥治療用藥的試劑或試劑盒中的用途。
[0037] 第三方面，本申請提供了體外檢測癌癥樣品或疑似癌癥樣品中BRAF、EGFR、KRAS 和PIK3CA基因突變的方法，包括以下步驟：
[0038] (1)獲得個體的癌癥樣品或疑似癌癥樣品的基因組DNA ;
[0039] (2)利用分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對對獲得的基因組DNA進行多重PCR ;
[0040] (3)對擴增產物進行高通量測序，優選Ion Torrent測序；以及
[0041] (4)分析測序結果，確定BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中是否發生突變。
[0042] 附圖簡要說明
[0043] 圖1顯不了癌癥驅動基因突變所在的主要彳目號通路。
[0044] 圖2為本申請的檢測方法的一個實施方案的示意性流程圖。
[0045] 圖3顯示了樣品L1083的按照本申請的檢測方案和按照Sanger測序法的檢測方案的驗證結果。
[0046] 圖4顯示了樣品L738的按照本申請的檢測方案和按照Sanger測序法的檢測方案的驗證結果。
[0047] 圖5顯示了樣品L735的按照本申請的檢測方案和按照Sanger測序法的檢測方案的驗證結果。
[0048] 圖6顯示了樣品152的按照本申請的檢測方案和按照Sanger測序法的檢測方案的驗證結果。
[0049] 圖7和8顯示了樣品L1649的按照本申請的檢測方案和按照Sanger測序法的檢測方案的驗證結果。
[0050] 圖9顯不了實施例1的方法與商業平臺Ion AmpliSeq? Cancer Panel Primer Pool (Life Technologies公司）的平均測序深度的比較。左側的柱形圖組（從左側數第 1-11個）為從實施例1方法獲得的結果，右側柱形圖組（從左側數第12-22個）為從Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool 獲得的結果。
[0051] 序列簡要說明
[0052] SEQ ID NO :1和2分別為擴增BRAF基因的外顯子11的上游和下游引物；
[0053] SEQ ID NO :3和4分別為擴增BRAF基因的外顯子15的上游和下游引物；
[0054] SEQ ID NO :5和6分別為擴增EGFR基因的外顯子18的上游和下游引物；
[0055] SEQ ID NO :7和8分別為擴增EGFR基因的外顯子19的上游和下游引物；
[0056] SEQ ID NO :9和10分別為擴增EGFR基因的外顯子20的第一對上游和下游引物；
[0057] SEQ ID NO :11和12分別為擴增EGFR基因的外顯子20的第二對上游和下游引物；
[0058] SEQ ID NO : 13和14分別為擴增EGFR基因的外顯子21的上游和下游引物；
[0059] SEQ ID NO : 15和16分別為擴增KRAS基因的外顯子3的上游和下游引物；
[0060] SEQ ID NO : 17和18分別為擴增KRAS基因的外顯子2的上游和下游引物；
[0061] SEQ ID NO : 19和20分別為擴增PIK3CA基因的外顯子9的上游和下游引物；
[0062] SEQ ID NO :21和22分別為擴增PIK3CA基因的外顯子20的上游和下游引物。
[0063] 發明的詳細描述
[0064] 除非另外說明，本申請中的各個術語的含義與本領域技術人員通常理解的含義相同。
[0065] 對于癌癥驅動基因突變的研宄以及由此衍生的癌癥診斷、預后、治療的方案是目前研宄的熱點。由于腫瘤細胞的存活和增殖是腫瘤發展的重要因素，因此對于相關細胞信號通路的研宄非常重要。
[0066] 本申請的發明人通過對臨床肺癌石蠟樣品進行基因突變檢測，結果顯示，突變主要發生在MAPK信號通路及PI3K信號通路上，主要突變的致癌基因分別為EGFR(42. 1% )、卩11(3〇六(2.6%)、1(狀5(5.3%)和8狀卩(2.6%)四個基因。
[0067] 同時，發明人結合自身研宄、文獻報道與數據庫資料發現，這四個驅動基因的突變發生于多種癌癥中。例如，KRAS基因在結直腸癌中的突變發生頻率將近40%，而BRAF基因和PIK3CA基因在結直腸癌中的也有較高的突變頻率；乳腺癌病例中有26%的概率存在 PIK3CA基因突變；在黑色素瘤中，BRAF基因突變可高達50%。
[0068] 另外，通過發明人的研宄發現，在一些癌癥樣品中存在上述四個基因中的兩個或更多個同時發生突變的現象。
[0069] 由此，本申請的發明人將上述四個基因確定為本申請的目標基因。
[0070] EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)為表皮生長因子受體，屬于受體酪氨酸激酶（RTKs)家族。EGFR中的突變可直接激活細胞下游的多種信號途徑，包括與細胞存活相關的PI3K-AKT-mT0R途徑，以及與細胞增殖相關的RAS-RAF-MEK-ERK途徑。
[0071] KRAS基因編碼K-Ras蛋白。KRAS突變可導致RAS GTP酶的組成性激活，這種激活狀態不受生長因子信號的調控，這一結果導致細胞的持續增殖，并使EGFR TKI類藥物效果降低。
[0072] BRAF基因編碼B-Raf蛋白，其位于K-Ras的下游。
[0073] ?11(30六基因編碼？11〇€[蛋白，其為組成磷脂酰-3-激酶（?131()的催化亞基之一。 PI3K可參與激活下游的某些重要的信號蛋白，如AKT等。有研宄認為PIK3CA的激活突變可能和癌細胞對EGFR TKI類藥物產生抗性有關。
[0074] 上述四個基因在信號通路中的關系例如可參見圖1。
[0075] 隨后，本申請的發明人在獲得的腫瘤突變的篩選結果基礎上，又整理了多個數據庫（COSMIC，clinVar，my cancer genome)和 Pubmed 文獻數據庫目前所報道的 EGFR、BRAF、 PIK3CA和KRAS基因的藥物作用突變位點，最終確定了 115個主要基因突變位點（例如可參見表1)。
[0076] 在以上工作的基礎上，為了開發適用于多基因、多位點突變檢測的工具和方法，本申請的發明人結合多重PCR和高通量測序技術進行了研發。
[0077] 多重PCR和高通量測序技術的聯合使用能夠高效且等效率地擴增目標基因片段并檢測多個樣品中多個基因中的多處突變。目前，多重PCR技術在多基因多位點的突變檢測方面已有應用，其相比于普通PCR具有高效、可對模板定量或定性等優點，但其體系構建的成功與否取決于多個因素，例如目標序列的同源性和大小、引物動力學、PCR反應條件優化等。例如，目標序列的長度范圍太大可能導致擴增效率不均勻，引物濃度配比不當或者引物間形成易形成二聚體均可影響總體擴增效率或者擴增均勻性。因此，在技術上成功地實現多重PCR，以及使產物能夠良好地適用于測序技術也是該領域的研宄重點之一。
[0078] 綜合以上，本申請的各項發明具有以下一種或多種優勢：
[0079] 第一，檢測速度快、通量高；
[0080] 第二，突變位點覆蓋廣，靈敏性較高，漏檢可能性低；
[0081] 第三，具有較高的準確性；
[0082] 第四，配合使用的多重PCR引物對能夠擴增出足夠量的擴增產物，并且能夠保證擴增產物的量的平均分布，從而保證后續高通量測序的實施。
[0083] 第一方面，本申請提供了用于癌癥樣品或疑似癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的試劑盒，其包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對。
[0084] 在一些實施方案中，試劑盒包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中每一個的一個或多個外顯子的區域的引物對。
[0085] 應當理解，本申請的試劑盒可用于癌癥診斷或輔助診斷、癌癥預后監測或指導癌癥治療用藥等目的。例如，對于性質未知的樣品或疑似癌癥的樣品而言，檢測到上述基因的突變則有助于進行癌癥的診斷或提示患癌癥的風險度較高。此外，對于癌癥樣品而言，檢測到上述基因的突變有利于判斷和預估患者的預后，例如，NCCN(美國國立綜合癌癥網絡）報道，攜帶BRAF V600E突變的轉移性結直腸癌（mCRC)患者的預后要差于BRAF野生型的患者。同樣，對于癌癥樣品而言，檢測到上述基因的突變能夠指導臨床用藥方案。例如，為肺癌EGFR靶向藥物（例如厄洛替尼、吉非替尼）、BRAF靶向藥物（例如維羅非尼、達拉非尼）、 EGFR&HER2雙靶點藥物（例如達沙替尼）和MEK靶點藥物的用藥選擇提供指導和依據。
[0086] 還應當理解，本申請的多基因、多位點突變檢測的意義不僅在于提供提高覆蓋度，減少漏檢率，還在于對單個個體中雙基因/位點或多基因/位點突變的檢測，例如，可以為臨床用藥方案提供更準確的指導。示例性的實施方案可參見實施例3。
[0087] 在一些實施方案中，癌癥選自肺癌、結直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤。在一些實施方案中，癌癥是肺癌。根據本申請發明人的研宄，BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因突變在肺癌中的發生率比較高，本申請提供的多對引物特別適合于肺癌中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA 基因的外顯子的突變的檢測。但是，同時應當理解，本申請的工具和方法的適用范圍并不局限于肺癌，因為上述四個驅動基因的突變還存在于其他癌癥中。示例性的實施方案可參見實施例4。
[0088] 本申請所用的"癌癥樣品"是指包含癌細胞的樣品，"疑似癌癥樣品"是指可能包含癌細胞的樣品。示例性的樣品包括但不限于，癌組織活檢、病理切片等。在一些情況下，樣品也可以是血液樣品。
[0089] 在一些實施方案中，BRAF基因的外顯子選自外顯子11和/或15。
[0090] 在一些實施方案中，EGFR基因的外顯子選自外顯子18、19、20、21或其任意組合。
[0091] 在一些實施方案中，KRAS基因的外顯子選自外顯子2和/或3。
[0092] 在一些實施方案中，PIK3CA基因的外顯子選自外顯子9和/或20。
[0093] 應當理解，所要擴增的目標外顯子區域可以是各個外顯子的全長部分，也可以是各個外顯子中包含了突變位點的片段，所述突變位點例如可以是表1中所示的突變位點。
[0094] 在一些實施方案中，用于擴增BRAF基因的外顯子11的區域的引物對如SEQ ID NO :1和2所示。
[0095] 在一些實施方案中，用于擴增BRAF基因的外顯子15的區域的引物對如SEQ ID NO :3和4所示。
[0096] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子18的區域的引物對如SEQ ID NO :5和6所示。
[0097] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子19的區域的引物對如SEQ ID NO :7和8所示。
[0098] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO :9 和 10 和 / 或 SEQ ID NO :11 和 12 所示。
[0099] 在一些實施方案中，用于擴增EGFR基因的外顯子21的區域的引物對如SEQ ID NO : 13和14所示。
[0100] 在一些實施方案中，用于擴增KRAS基因的外顯子3的區域的引物對如SEQ ID NO : 15和16所示。
[0101] 在一些實施方案中，用于擴增KRAS基因的外顯子2的區域的引物對如SEQ ID NO : 17和18所示。
[0102] 在一些實施方案中，用于擴增PIK3CA基因的外顯子9的區域的引物對如SEQ ID NO : 19和20所示。
[0103] 在一些實施方案中，用于擴增PIK3CA基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO :21和22所示。
[0104] 在一些實施方案中，試劑盒包含如SEQ ID NO :1-22所示的11對引物。SEQ ID NO : 1-22所示的11對引物所用于擴增的目標外顯子以及引物的具體序列如下文的表1和2和序列表所示。
[0105] 例如，本申請的試劑盒中的多個引物對可用于多重PCR以及隨后的高通量測序。本領域技術人員能夠理解的是，在多重PCR中，引物對的設計對于擴增產物的質量也有一定的影響，例如，擴增產物的量是否足夠用于高通量測序以及擴增產物的量是否平衡分布等。本申請所提供的SEQ ID NO :1-22所示的11對引物能夠良好地滿足多重PCR以及隨后的高通量測序的要求，這也是本申請的優勢之一。
[0106] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于從所述樣品提取基因組DNA的試劑。從組織樣品中提取基因組DNA是本領域的常規技術，并且目前市場上有很多成熟完善的商品化試劑可供選擇。例如，基因組DNA的提取可包括組織包埋、提取DNA、質量控制以及定量等步驟。本申請的實施例也提供了示例性的方法。
[0107] 在一些實施方案中，試劑盒包含利用所述引物進行多重PCR反應的試劑。多重 PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR，是指在一個PCR反應體系中加入兩對或更多對的引物，從而同時擴增多個不同核酸片段的反應，其基本原理與常規的PCR相同。多重PCR是本領域中已知的技術，主要的反應組分包括模板（上文所述的基因組DNA)、引物（SEQ ID NO: 1-22)、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液等。多重PCR反應所使用的設備以及反應參數也是本領域技術人員所知曉的或能夠容易地確定的。本申請的實施例也提供了示例性的多重PCR方法。
[0108] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于處理擴增產物以使得擴增產物能用于高通量測序技術中的試劑。根據上文所得到的多重PCR產物一般無法直接用于高通量測序，還需要進行處理，例如，末端修復，連接接頭和標簽、純化、修復缺口等。對于掌握高通量測序的普通技術人員而言，上述處理步驟和所需要的試劑是容易理解的。本申請的實施例也提供了示例性的處理方法。
[0109] 在一些實施方案中，試劑盒包含用于對處理后的擴增產物進行高通量測序的試劑。高通量測序通常是在微孔芯片上進行的。目前，商業化的芯片和反應試劑容易購得，例如可購自 Life Technologies Inc. 〇
[0110] 可使用的高通量測序包括但不限于Ion Torrent測序、Ion PGM測序、HiSeq 2000 測序以及MiSeq測序。在一些實施方案中，高通量測序為Ion Torrent測序。
[0111] Ion Torrent測序技術也被本領域技術人員稱為二代測序技術，其是基于DNA合成過程所產生的化學變化。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，按堿基互補原理，合成互補的 DNA鏈。DNA鏈每延伸一個堿基時，就會釋放一個質子，導致局部pH變化。Ion Torrent半導體測序芯片的每個微孔里的微球表面含有約100萬個DNA分子拷貝。測序時核苷酸分子連續流過芯片微孔。如果一個核苷酸與某個微孔中的DNA分子互補，則該核苷酸被合成到 DNA分子中，并且釋放質子，該微孔中溶液的pH發生變化。離子傳感器檢測到pH變化后，將該化學信息轉變為數字電子信息。如果DNA鏈含有兩個相同的堿基，則記錄電壓信號是雙倍的。如果堿基不匹配，則無質子釋放，也就沒有電壓信號的變化。Ion Torrent測序技術屬于直接檢測DNA的合成，S卩，邊合成邊檢測，這特別適合于多重PCR中多種不同擴增產物的測序。另外，Ion Torrent測序技術不需要CCD掃描、焚光激發等環節，幾秒鐘就可檢測合成插入的堿基，大大縮短了運行時間，從而提高了檢測效率。
[0112] 本領域技術人員能夠理解，高通量測序領域已經開發出了多個適合于對多重PCR 產物進行測序的系統和平臺，并且各個系統和平臺對于擴增產物的處理方式也不盡相同。本領域技術人員可以按照本申請的方法進行多重PCR擴增，然后按照生產商的指導對擴增產物進行處理和測序。
[0113] 出于對測序進行質量控制的目的，在一些實施方案中，試劑盒包含非癌對照樣品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中的一個或多個未發生突變的癌癥對照樣品。
[0114] 第二方面，本申請提供了本申請提供了用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對在制備用于癌癥診斷或輔助診斷、或用于癌癥預后監測、或用于指導癌癥治療用藥的試劑或試劑盒中的用途。
[0115] 第三方面，本申請提供了體外檢測個體的癌癥樣品或疑似癌癥樣品中BRAF、EGFR、 KRAS和PIK3CA基因突變的方法，包括以下步驟：
[0116] (1)獲得個體的癌癥樣品或疑似癌癥樣品的基因組DNA ;
[0117] (2)利用分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對對獲得的基因組DNA進行多重PCR ;
[0118] (3)對擴增產物進行高通量測序，優選Ion Torrent測序；以及
[0119] (4)分析測序結果，確定BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中是否發生突變。
[0120] 關于步驟（1)-(3)，可參照上文第一方面的相關描述。步驟（4)涉及對于測序結果的分析，目前市場上已經提供有商業化測序數據分析軟件，例如Torrent Suite Software v4. 2的自帶插件"variantCaller"。本領域技術人員可根據實際需要來設計分析參數，例如，突變質控參數等。本申請的實施例也提供了示例性的測序結果分析方法。示例性的方法可參見圖2的流程圖。
[0121] 在不發生沖突的情況下，第一方面所闡述的實施方案和技術特征也適用于第二和第三方面。
[0122] 應當理解，以上詳細描述僅為了使本領域技術人員更清楚地了解本申請的內容，而并非意圖在任何方面加以限制。本領域技術人員能夠對所述實施方案進行各種改動和變化。
[0123]
【權利要求】
1. 用于癌癥樣品或疑似癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的試劑盒，其包含分別用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其中所述癌癥選自肺癌、結直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤，優選地，所述癌癥為肺癌。
3. 如權利要求1或2所述的試劑盒，其中BRAF基因的外顯子選自外顯子11和/或15 ; EGFR基因的外顯子選自外顯子18、19、20、21或其任意組合；KRAS基因的外顯子選自外顯子 2和/或3 ;PIK3CA基因的外顯子選自外顯子9和/或20。
4. 如權利要求3所述的試劑盒，其中用于擴增BRAF基因的外顯子11的區域的引物對如SEQ ID NO:l和2所示；用于擴增BRAF基因的外顯子15的區域的引物對如SEQ ID NO:3和4所示；用于擴增EGFR基因的外顯子18的區域的引物對如SEQ ID NO:5和6所示；用于擴增EGFR基因的外顯子19的區域的引物對如SEQ ID NO:7和8所示；用于擴增EGFR基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO: 9和10和/或SEQ ID NO: 11和12所示；用于擴增EGFR基因的外顯子21的區域的引物對如SEQ ID NO: 13和14所示；用于擴增KRAS基因的外顯子3的區域的引物對如SEQ ID NO: 15和16所示；用于擴增KRAS基因的外顯子2的區域的引物對如SEQ ID NO: 17和18所示；用于擴增PIK3CA基因的外顯子9的區域的引物對如SEQ ID NO: 19和20所示；或用于擴增PIK3CA基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO: 21和22所示。
5. 如權利要求4所述的試劑盒，其包含如SEQ ID NO: 1-22所示的11對引物。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的試劑盒，還包含以下一種或多種試劑：用于從所述樣品提取基因組DNA的試劑；利用所述引物進行多重PCR反應的試劑；用于處理擴增產物以使得擴增產物能用于高通量測序技術中的試劑；以及用于對處理后的擴增產物進行高通量測序的試劑。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其中所述高通量測序選自Ion Torrent測序、Ion PGM 測序、HiSeq 2000測序以及MiSeq測序，優選為Ion Torrent測序。
8. 如權利要求1-7中任一項所述的試劑盒，還包含非癌對照樣品、和/或BRAF、EGFR、 KRAS和PIK3CA基因中的一個或多個未發生突變的癌癥對照樣品。
9. 用于擴增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意兩個、三個或全部的一個或多個外顯子的區域的引物對在制備用于癌癥診斷或輔助診斷、或用于癌癥預后監測、或用于指導癌癥治療用藥的試劑或試劑盒中的用途。
10. 如權利要求9所述的用途，其中BRAF基因的外顯子選自外顯子11和/或15 ;EGFR 基因的外顯子選自外顯子18、19、20、21或其任意組合；KRAS基因的外顯子選自外顯子2和 /或3 ;PIK3CA基因的外顯子選自外顯子9和/或20，優選地，用于擴增BRAF基因的外顯子11的區域的引物對如SEQ ID N0:1和2所示；用于擴增BRAF基因的外顯子15的區域的引物對如SEQ ID N0:3和4所示；用于擴增EGFR基因的外顯子18的區域的引物對如SEQ ID N0:5和6所示；用于擴增EGFR基因的外顯子19的區域的引物對如SEQ ID N0:7和8所示；用于擴增EGFR基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID N0:9和10和/或SEQ ID NO: 11和12所示；用于擴增EGFR基因的外顯子21的區域的引物對如SEQ ID NO: 13和14所示；用于擴增KRAS基因的外顯子3的區域的引物對如SEQ ID NO: 15和16所示；用于擴增KRAS基因的外顯子2的區域的引物對如SEQ ID NO: 17和18所示；用于擴增PIK3CA基因的外顯子9的區域的引物對如SEQ ID NO: 19和20所示；或用于擴增PIK3CA基因的外顯子20的區域的引物對如SEQ ID NO: 21和22所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450948SQ201410851883
【公開日】2015年3月25日申請日期:2014年12月31日優先權日:2014年12月31日
【發明者】唐川寧申請人:北京圣谷同創科技發展有限公司

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