大菱鲆s11單核苷酸多態性標記的檢測方法
【專利摘要】一種大菱鲆S11單核苷酸多態性標記的檢測方法，屬于分子遺傳標記研究技術，首先提取大菱鲆基因組DNA并稀釋備用；再根據高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查的方法篩選出候選SNP位點的序列，利用小片段法在其兩端設計特異引物，長度在20bp左右，目的片段在40-80bp；同時設計高低溫內標；然后進行PCR反應，變性時添加高低溫內標；將產物置于LightScanner上檢測熔解曲線并分析，獲得大菱鲆的遺傳多態性圖譜。本發明適用于大菱鲆群體遺傳標記、系譜認證、遺傳連鎖圖譜構建等檢測技術；可快捷的獲得大菱鲆的S11SNP標記的遺傳變異圖譜，方便、快捷、準確，可直觀地檢測出大菱鲆每個個體的基因型。
【專利說明】大菱鲆S11單核苷酸多態性標記的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子遺傳標記研究技術，具體涉及一種檢測大菱鲆Sll單核苷酸多態 性標記（single nucleotide polymorphism, SNP)的方法。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（SNP)分子標記是基因組中最豐富的突變類型，因它數量多，覆 蓋密度大，位點豐富，幾乎分布于整個基因組，具有片段短易于擴增、遺傳穩定性強等特點； 易于高通量、自動化分析，易于遺傳機制的研究等優勢，所以它是遺傳育種研究中的熱門領 域。
[0003] 本發明做出之前，SNP位點信息的獲得主要是通過基因組測序，伴隨序列拼接比 對而產生，但是這種方法成本較高。而對于大菱鲆沒有基因組信息，多利用已知的EST序 列自行篩選，如西班牙 Manuel Vera 等（Aquaculture2011)發表的 Validation of single nucleotide polymorphism(SNP)markers froman immune Expressed Sequence Tag(EST) turbot, Scophthalmus maximus, database，曾報道基于EST序列開發大菱鲆SNP標記的方 法，他運用基于四種可能核苷酸兩步反應法對候選SNP熒光檢測進行基因分型驗證，共篩 選出77個大菱鲆SNP標記；但是EST序列與實際序列有一定差異，所以這種方法前期準備 工作比較艱巨，開發效率比較低，覆蓋率不夠廣，目的性不夠強。高分辨率熔解曲線分析技 術（High Resolution Melting, HRM)，是近年來興起的一種SNP檢測的新工具，可以迅速的 檢測出DNA片段中堿基的突變，但在本發明之前，大菱鲆均采用非標記探針基因分型技術， 劉慶明等發表的"應用高分辨率溶解曲線（HRM)開發大菱鲆（Scophthalmus maximus) SNP 標記的研究"，但是探針設計常有誤差，而且不對稱PCR的操作復雜，成本較高，效率較低。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種大菱鲆Sll單核苷酸多態性標記的檢測 方法，該方法費用低、特異性準確性高、重復性好、操作簡便，可快速高通量地檢測大菱鲆 SllSNP 標記。
[0005] 本發明是按如下技術方案實現的：
[0006] 一種大菱鲆Sll單核苷酸多態性標記的檢測方法，包括：1)、基因組DNA提取；2)、 候選SNP篩選；3)、小片段引物設計；4)、PCR擴增；5)、數據采集和6)、基因分型；
[0007] 所述的候選SNP篩選；通過高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查：①因 為客觀上測序錯誤的存在，因而只在含有不少于20個reads的contig中尋找SNP。②從突 變頻率大于20 %的SNP位點中挑選，但當reads數大于500時，選擇突變頻率大于10 %的 3即位點。篩查出候選5115即位點，其位點所在的〇〇1^11^為(：〇111?32333_(31_8691，部分基 因序列為：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGA ccmtggttacgaatagacgaggccccattcagtggtttcaggcactgacaaaaagmtgaaaaaagaaaacagAag CTCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACT GAGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAA ATGATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下 劃線的堿基即為SllSNP位點；
[0008] 所述的小片段引物設計：利用軟件primerf.O進行引物設計，小片段法引物設計 要求：①引物長度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物內部不能包含SNP位 點；@6(：含量40%-60%，1'111值在401：-601：，兩條引物之間1'111值相差不超過21：;?引物 3'末端不能夠有連續超過4個堿基的錯配或者自身配對；⑥目的產物只含有一個待測SNP 位點。通過軟件01ig〇7.0檢查引物質量，不能有嚴重錯配、引物二聚體和發夾結構等。高 低溫內標為兩段長度50bp的DNA片段，提供獨立于PCR產物的大約68°C和88°C的熔解曲 線，有效的去除混雜變量，減少Tm值對反應體積的依賴，增加基因分型的敏感性，內標序列 分別為
[0009] F：5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3,
[0010] -CTGAGCGTCACGCAGTGCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3'；
[0011] 和 F:5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3'
[0012] R:5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3，。
[0013] 一種大菱鲆Sll單核苷酸多態性標記的檢測方法，包括：1)、基因組DNA提取；2)、 候選SNP篩選；3)、小片段引物設計；4)、PCR擴增；5)、數據采集和6)、基因分型，具體步驟 如下：
[0014] 1)基因組DNA提取：提取大菱鮮基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul ;
[0015] 2)候選SNP篩選；通過高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查：①因為客 觀上測序錯誤的存在，因而只在含有不少于20個reads的contig中尋找SNP ;②從突變頻 率大于20%的SNP位點中挑選，但當reads數大于500時，選擇突變頻率大于10%的SNP 位點；
[0016] 篩查出候選5115即位點，其位點所在的(：〇1^11^為(3〇1即32333_(31_8691，部分基因 序列為：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACC AATGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAG AAGC TCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTG AGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAA TGATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下劃 線的堿基即為SllSNP位點；
[0017] 3)小片段引物設計：利用軟件primerf. 0進行引物設計，小片段法引物設計要求： ①引物長度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物內部不能包含SNP位點；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，兩條引物之間Tm值相差不超過2°C ;⑤引物3'末端 不能夠有連續超過4個堿基的錯配或者自身配對；⑥目的產物只含有一個待測SNP位點。通 過軟件01ig〇7. 0檢查引物質量，不能有嚴重錯配、引物二聚體和發夾結構等。高低溫內標 為兩段長度50bp的DNA片段，提供獨立于PCR產物的大約68°C和88°C的熔解曲線，有效的 去除混雜變量，減少Tm值對反應體積的依賴，增加基因分型的敏感性；內標序列分別為F : 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3，R : 5, -CTGAGCGTCACGCAGT GCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3，；和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTT GGCATTAATAATTTCATTTT-3,，R : 5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCA CGAT-3，。
[0018] 4)PCR 擴增：PCR 反應 IOii I 體系，包括 4. 5 ii I 2XES Taq Master Mix，其中包 括熱啟動酶，Mg2+，buffer及其它組分；0.5 ill IOii M上游引物；0.5 ill IOii M下游引物； I. 0 ill 40ng/ UlDNA模板；3. 5 ill 7jC ;每個樣品孔內力口 15礦物油，離心去除氣泡并使礦物 油置于樣品上層；PCR反應程序為：95°C預變性5min ;94°C變性30s，復性溫度Tm值44°C， 退火30s，72°C延伸30s，共35個循環；最后72°C延伸7min，4°C保存；反應結束后，進行變 性，變性的反應體系為：高溫內標和低溫內標的正負向引物各加0. 25 iil，LC Green染料加 入I. 0 ;變性反應程序：95°C 5min ;在PCR前每個樣品孔內加15礦物油，離心去除氣泡 并使礦物油置于樣品上層；
[0019] 5)數據采集：將PCR產物置于Light Scanner分析儀上進行高分辨率熔解曲線采 集，采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個點，升溫速度為0. 1°C /s ;
[0020] 6)基因分型：數據的檢索和分析運用Light Scanner分析軟件，確定每個個體的 基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態性圖譜。
[0021] 本發明與現有技術相比的有益效果：
[0022] 本發明通過高通量測序的方法獲得大量候選SNP位點，人工篩查位點，開發準確 度及效率較高，覆蓋率廣，目的性強;而且小片段溶解的基因分型方法，設計引物時，引物長 度在20bp左右，使目的片段盡可能的小，在40_80bp，有效避免了內含子的出現，以及提供 更好的純合子檢測，因此小片段基因分型發比目前使用較多的非標記探針基因分型技術更 加簡單、高效。
[0023] 本發明應用高分辨率熔解曲線分析快速檢測大菱鲆每個個體在SNP位點的遺傳 變異情況，可快捷獲得該引物對大菱鲆多態性圖譜，所得結果可直觀地檢測出大菱鲆每個 個體的基因型，以期找到與該SNP位點連鎖的性狀，為以后與傳統方法結合進行育種工作 奠定基礎。
[0024] 本發明運用的是新一代高通量測序技術獲得大量SNP位點，人工篩查位點，開發 準確度及效率較高，覆蓋率廣，目的性強，而且運用高分辨率熔解曲線技術以及小片段溶解 分型方法進行SNP基因分型，操作更加簡單，而且避免了內含子的出現造成的假陽性現象， 同時也提供了純合子檢測，效率更高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 下面通過實施例結合附圖詳細敘述本發明高通量轉錄組測序獲得SNP，人工篩選 后，通過高分辨率溶解曲線技術進行小片段溶解分型方法，檢測大菱鲆SllSNP遺傳標記的 方法。
[0026] 圖I :S11SNP引物對大菱鲆96個個體高分辨率熔解曲線圖譜：
[0027] A :SIISNP引物對大菱鲆96個個體標準化的熔解曲線圖；
[0028] B =SllSNP弓丨物對大菱鲆96個個體衍生的基因分型峰圖；
【具體實施方式】
[0029] -種大菱鲆Sll單核苷酸多態性標記的檢測方法，包括：1)基因組DNA提取；2)候 選SNP篩選；3)小片段引物設計；4) PCR擴增；5)數據采集；6)基因分型，
[0030] 具體步驟如下：
[0031] 1)基因組DNA提取：
[0032] 本實驗樣品來源于煙臺天源水產有限公司8個家系10個不同性狀群體的42個個 體，運用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，TIANGEN)法提取DNA。a、取新鮮 樣品的肌肉組織20mg，放入裝有200 ii LGA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15s。b、加入20 ii L 蛋白酶K(20mg/ml)溶液，渦旋混勻，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。在56°C放置，直至組 織完全溶解，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。c、加入200 y L緩沖液GB，充分顛倒混勻， 70°C放置lOmin，溶液變得清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。d、加入200iiL無水乙 醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。e、將所得 溶液和絮狀沉淀均加入吸附柱CB3中，（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，倒掉 廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500 ii L緩沖液⑶，12000rpm離 心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。g、向吸附柱CB3中加入700 ii L漂洗液PW， 12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。h、向吸附柱CB3中加入500ul 漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液。i、將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心 2min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。j、 將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60 y L洗脫緩沖液 TE，室溫放置4min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，將其定量稀釋成20ng/ul 備用。
[0033] 2)候選SNP篩選通過高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查：①因為客 觀上測序錯誤的存在，因而只在含有不少于20個reads的contig中尋找SNP。②從突變頻 率大于20%的SNP位點中挑選，但當reads數大于500時，選擇突變頻率大于10%的SNP 位點。篩查出候選SllSNP位點，其位點所在的conting為comp32333_cl_seql，部分基因序 列為：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAA TGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAG AAGCTC AGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAG AAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATG ATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下劃線 的堿基即為SllSNP位點；
[0034] 3)小片段引物設計：利用軟件primerf. 0進行引物設計，小片段法引物設計要求： ①引物長度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物內部不能包含SNP位點；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，兩條引物之間Tm值相差不超過2°C ;⑤引物3'末端 不能夠有連續超過4個堿基的錯配或者自身配對；⑥目的產物只含有一個待測SNP位點。 通過軟件01ig〇7. 0檢查引物質量，不能有嚴重錯配、引物二聚體和發夾結構等。高低溫內 標為兩段長度50bp的DNA片段，提供獨立于PCR產物的大約68°C和88°C的熔解曲線，有效 的去除混雜變量，減少Tm值對反應體積的依賴，增加基因分型的敏感性。內標序列分別為 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3 和 5，-ATCGTGATTTCTATAG TTATCTAAGTAGITGGCATTAATAATITCAITIT-3，及各自的反向互補序列。
[0035] 4)PCR 擴增：PCR 反應 IOii 1 體系，包括 4. 5 ii I 2XES Taq Master Mix (包括熱 啟動酶，Mg2+，buffer及其它組分）；0.5iil上游引物（IOiiM) ;0.5iil下游引物（IOiiM); LOiil DNA模板（40ng/yl) ;3.5iil水。為防止樣品在PCR擴增過程中揮發，在PCR前每 個樣品孔內加15礦物油，離心去除氣泡并使礦物油置于樣品上層。PCR反應程序為：95°C 預變性5min ;94°C變性30s，復性溫度Tm值44°C，退火30s，72°C延伸30s，共35個循環；最 后72 °C延伸7min，4°C保存。反應結束后，進行變性，變性的反應體系為：高溫內標和低溫內 標的正負向引物各加〇. 25iU，LC Green染料加入I. OiU。變性反應程序：95°C 5min。在 PCR前每個樣品孔內加15礦物油，離心去除氣泡并使礦物油置于樣品上層。
[0036] 5)數據采集：將PCR產物置于Light Scanner分析儀上進行高分辨率熔解曲線采 集，采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個點，升溫速度為0. 1°C /s ;
[0037] 6)基因分型：數據的檢索和分析運用Light Scanner分析軟件，確定每個個體的 基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態性圖譜。
【權利要求】
1. 一種大菱鲆si 1單核苷酸多態性標記的檢測方法，包括：1)、基因組DNA提取；2)、候 選SNP篩選；3)、小片段引物設計；4)、PCR擴增；5)、數據采集和6)、基因分型；其特征在于 所述的候選SNP篩選，通過高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查：①只在含有不 少于20個reads的contig中尋找SNP ;②從突變頻率大于20%的SNP位點中挑選，但當 reads數大于500時，選擇突變頻率大于10%的SNP位點； 篩查出候選S11SNP位點，其位點所在的conting為comp32333_cl_seql，部分基因序列 為：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAAT GGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAAGCTCAG AAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAA GGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGAT CTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下劃線的 堿基即為S11SNP位點； 所述的小片段引物設計：利用軟件primer5. 0進行引物設計，小片段法引物設計要求： ①引物長度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物內部不能包含SNP位點；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，兩條引物之間Tm值相差不超過2°C ;⑤引物3'末端 不能夠有連續超過4個堿基的錯配或者自身配對；⑥目的產物只含有一個待測SNP位點，通 過軟件01ig〇7.0檢查引物質量，不能有嚴重錯配、引物二聚體和發夾結構等；高低溫內標 為兩段長度50bp的DNA片段，提供獨立于PCR產物的大約68°C和88°C的熔解曲線，有效的 去除混雜變量，減少Tm值對反應體積的依賴，增加基因分型的敏感性，內標序列分別為 F：5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3, -CTGAGCGTCACGCAGTGCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3/ ； 和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3' R:5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3'。
2. 根據權利要求1所述的一種大菱鲆SI 1單核苷酸多態性標記的檢測方法，包括：1)、 基因組DNA提取；2)、候選SNP篩選；3)、小片段引物設計；4)、PCR擴增；5)、數據采集和6)、 基因分型，其特征在于它的具體步驟如下： 1) 基因組DNA提取：提取大菱鲆基因組DNA，將其稀釋為20ng/ul ; 2) 候選SNP篩選；通過高通量轉錄組測序獲得SNP位點，采用人工篩查：①因為客觀上 測序錯誤的存在，因而只在含有不少于20個reads的contig中尋找SNP ;②從突變頻率大 于20 %的SNP位點中挑選，但當reads數大于500時，選擇突變頻率大于10 %的SNP位點； 篩查出候選S11SNP位點，其位點所在的conting為comp32333_cl_seql，部分基因序列為： AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAATGGTT ACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAAGCTCAGAAAC CATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAAGGGT CATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGATCTGC GACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下劃線的堿基 即為S11SNP位點； 3) 小片段引物設計：利用軟件primerf. 0進行引物設計，小片段法引物設計要求：①引 物長度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物內部不能包含SNP位點；④GC含 量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，兩條引物之間Tm值相差不超過2°C ;⑤引物3'末端不 能夠有連續超過4個堿基的錯配或者自身配對；⑥目的產物只含有一個待測SNP位點通過 軟件01ig〇7.0檢查引物質量，不能有嚴重錯配、引物二聚體和發夾結構等；高低溫內標為 兩段長度50bp的DNA片段，提供獨立于PCR產物的大約68°C和88°C的熔解曲線，有效的 去除混雜變量，減少Tm值對反應體積的依賴，增加基因分型的敏感性；內標序列分別為F : 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3，R : 5, -CTGAGCGTCACGCAGT GCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3，；和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTT GGCATTAATAATTTCATTTT-3,，R : 5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCA CGAT-3，； 4. PCR擴增：PCR反應10ia體系，包括4?5ia2XESTaqMasterMix，其中包括熱啟 動酶，Mg2+，buffer及其它組分；0.5iU 10iiM上游引物；0.5iU 10iiM下游引物；l.Oiil 40ng/iil DNA模板；3. 5 ill水；每個樣品孔內加15礦物油，離心去除氣泡并使礦物油置 于樣品上層；PCR反應程序為：95°C預變性5min ;94°C變性30s，復性溫度Tm值44°C，退火 30s，72°C延伸30s，共35個循環；最后72°C延伸7min，4°C保存；反應結束后，進行變性， 變性的反應體系為：高溫內標和低溫內標的正負向引物各加〇. 25 iil，LC Green染料加入
1. 〇以1 ;變性反應程序：95°C 5min ;在PCR前每個樣品孔內力口 15礦物油，離心去除氣泡并使 礦物油置于樣品上層； 5) 數據采集：將PCR產物置于Light Scanner分析儀上進行高分辨率熔解曲線采集， 采集曲線的溫度范圍為45°C至97°C，每攝氏度獲得10個點，升溫速度為0. 1°C /s ; 6) 基因分型：數據的檢索和分析運用Light Scanner分析軟件，確定每個個體的基因 型，并獲得大菱鲆的遺傳多態性圖譜。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450947SQ201410850337
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】馬愛軍, 王婷, 黃智慧, 王新安, 馬得友, 楊志, 曲江波 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所