大麗輪枝菌ΔVdKu70缺陷突變體菌株及其應用的制作方法

大麗輪枝菌ΔVdKu70缺陷突變體菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了大麗輪枝菌ΔVdKu70缺陷突變體菌株及其應用。本發明構建攜帶Ku70基因同源重組DNA片段的基因敲除載體，通過農桿菌介導的大麗輪枝菌的遺傳轉化，從大量的轉化子中篩選獲得一株缺失Ku70基因的ΔVdKu70缺陷突變體菌株，其微生物保藏編號為：CGMCC No.10107。本發明獲得的大麗輪枝菌ΔVdKu70缺陷突變體菌株與野生型的形態特征和致病力基本一致，對UV處理更加敏感；采用本發明大麗輪枝菌ΔVdKu70缺陷突變體菌株作為背景菌株進行基因打靶，其打靶效率比野生型菌株提高了40％到60％。本發明為大麗輪枝菌侵染機制、與寄主共存機理以及致病關鍵靶基因等方面的研究提供了背景菌株。
CGMCC No.10107
20141202
【專利說明】大麗輪枝菌AVdKu70缺陷突變體菌株及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及大麗輪枝菌突變體菌株，尤其涉及大麗輪枝菌AVdKuTO缺陷突變體 菌株，本發明還涉及所述大麗輪枝菌AVdKuYO缺陷突變體菌株作為背景菌株在大麗輪枝 菌侵染機制、與寄主共存機理以及致病關鍵靶基因的研宄等方面中的應用，屬于大麗輪枝 菌突變體菌株的構建及應用領域。

【背景技術】
[0002] 大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)是一種真菌病害，寄主范圍非常廣泛，能 侵染棉花、番茄、亞麻、馬鈴薯、番茄、黃瓜、煙草、辣椒和茄子等兩百多種經濟作物，危害極 其嚴重且藥劑難于防治，成為作物生產發展的瓶頸。隨著大麗輪枝菌小種VdLs. 17基因 組序列的成功測序（klosterman S·，Subbarao K·，Kang S.et al. Comparative Genomics Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens. PLoS Pathogens, 2011，Vol. 7 (NO. 7))，并公布在了 Broad Institute上，對大麗輪枝菌致病基因 的研宄和入侵過程中的分子機理的研宄提供了有利的基因資源。然而，大麗輪枝菌入侵機 制的研宄還停留在初步階段，病程相關基因的研宄甚少。因此，利用"反向基因組學"研宄 大麗輪枝菌的致病機制顯得更加重要。采用"反向基因組學"研宄大麗輪枝菌致病基因的 功能，主要是通過基因打靶獲得相關基因的突變體分析基因功能。
[0003] 真菌的基因打靶已有幾十年的歷史，目前實現多數真菌內源核基因的精確打靶還 比較困難，宄其原因是真菌體細胞內同源重組頻率非常低下，遠低于非同源末端連接（二 者比例為I :10000?1 :〇〇〇)，以至于外源基因進入細胞后，絕大多數會借助非同源末端連 接途徑隨機插入基因組中。
[0004] 大麗輪枝菌野生型菌株基因打靶效率非常低，很難實現基因的精確打靶，嚴重妨 礙了大麗輪枝菌入侵機制和與寄主共存機理的研宄。因此，獲得大麗輪枝菌Ku基因的缺陷 突變體，有效提高大麗輪枝菌基因打靶效率成為亟待需要解決的問題。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一株缺失Ku70基因的大麗輪枝菌 (Verticillium dahliae) AVdKu70缺陷突變體菌株，該突變體菌株能夠顯著提高基因打靶 的效率，實現靶基因的精確打靶，應用于大麗輪枝菌侵染機制、與寄主共存機理以及致病關 鍵靶基因的研宄等方面。
[0006] 本發明所要解決的上述技術問題是通過以下技術方案實現的：
[0007] 本發明首先公開了一株缺失Ku70基因的大麗輪枝菌AVdKu70缺陷突變體菌株。 本發明采用In-Fusion克隆技術構建Ku70基因的同源重組DNA片段并克隆至pGK02載體 上，構建基因敲除載體PGKO-Hyg-Ku70,轉化農桿菌AGL-I，用于大麗輪枝菌的遺傳轉化。通 過同源重組和大量的轉化子篩選，最終從205個轉化子中篩選獲得一株敲除了 Ku70基因的 大麗輪枝菌Δ VdKu70缺陷突變體菌株，命名為Vd991 Δ Ku70-1。
[0008] 本發明將獲得的敲除了 Ku70基因的大麗輪枝菌AVdKu70缺陷突變體菌株 Vd991 ΔΚιι70-1提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 10107 ;分 類命名為：大麗輪枝菌Verticillium dahliae。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心；保藏時間是2014年12月02日；保藏地址：中國北京朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研宄所。
[0009] 目前實現多數真菌內源核基因的精確打靶還比較困難，原因是真菌體細胞內同源 重組頻率非常低下，遠低于非同源末端連接（二者比例為I :10000?1 :〇〇〇)，以至于外源 基因進入細胞后，絕大多數會借助非同源末端連接途徑隨機插入基因組中；再考慮到對受 體細胞的轉化率（通常1%?5% )，借助同源重組成功打靶只得依賴大量受體細胞的使 用，這導致前期轉化和后期篩選繁重耗時，超出通常可承受范圍，阻礙基因打靶（Krappmann S.Gene targeting in filamentous fungi: the benefits of impaired repair. The Mycologist，2007,（I) :25-29.)。近年來，農桿菌介導的遺傳轉化在大麗輪枝菌中的成功應 用，極大地提高了轉化效率，為大麗輪枝菌的基因敲除奠定了基礎。
[0010] 大麗輪枝菌基因敲除主要包括載體構建、農桿菌介導轉化、轉化子篩選和分子鑒 定4個步驟，其中轉化子篩選是一個技術難點。借助同源重組成功的在野生型菌株中實 現基因打靶十分困難，因為打靶效率非常低，遠遠低于5%，比如：在米曲霉（Aspergillus so jae)和醬油曲霉（A. oryzae)中是 1 % (Takahashi T·，Masuda T·，Koyama Υ· Enhanced gene targeting frequency in ku70and ku80disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genet Genomics, 2006, 275:460-470.);在稻瘟病菌 中僅為1.18% (林春花，鄭服叢.稻瘟菌MgORPl基因敲除突變株的構建及其表型分析.微 生物學報，2008, 48 (9) : 1160-1167.)。
[0011] 本發明結果表明，借助同源重組成功的在野生型大麗輪枝菌中實現基因打靶效率 更低，僅為〇. 48%。本發明共挑取到抗潮霉素的轉化子205個，PCR檢測僅有1個轉化子沒 有擴增到Ku70基因，本發明將該沒有擴增到Ku70基因的轉化子命名為Λ VdKu70Hyg。PCR檢 測和Southern-blot雜交試驗確定，在獲得的Λ VdKu70Hyg轉化菌株中，潮霉素的表達盒已 成功的整合并取代了 VdKu70基因，表明本發明成功獲得一株敲除了 Ku70基因的大麗輪枝 菌AVdKu70缺陷突變體菌株，命名為Vd991 ΔΚιι70-1。
[0012] 表型特征分析結果表明，AVdku70缺陷突變體菌株Vd991AKu70-l在以蔗糖、木 糖、果膠質、半乳糖、淀粉為碳源的Czapek培養基上的生長能力與野生型基本一致，沒有 顯著的不同；其產孢能力與野生型相比也沒有顯著的變化，產孢量基本一致；但AVdKu70 突變體菌株Vd991 ΔΚιι70-1對UV處理更加敏感，經過UV照射的AVdku70缺陷突變體菌 株的存活孢子基本不存在。ΔΚιι70缺陷突變體菌株對UV照射變得更加敏感有可能的原 因是Ku70蛋白在真菌微生物中維持著絲粒長度起著重要的作用（Boulton S·，Jackson S.Identification of a Saccharomyces cerevisiae Ku80homologue:roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance. Nucleic Acids Research, 1996, 24:4639 - 4684.)，Δ Ku70缺陷菌株缺少Ku70蛋白導致DNAs修復機制受 到損傷而難以完成自身的修復，使其對UV照射變得更加敏感。
[0013] 致病力實驗結果表明，Δ Vdku70缺陷突變體菌株Vd991 AKU70-1的致病力與野生 型比較沒有顯著的變化，接種相同濃度AVdku70缺陷突變體菌株與野生型菌株的孢子懸 浮液后的本生煙植株的感病癥狀基本一致；而AVdku70缺陷突變體菌株與野生型菌株感 病本生煙植株中真菌生物量也沒有顯著差異，都是在根中真菌的生物量最高，其次是在莖 中（根基部往上Icm處），在葉中的生物量最低。
[0014] 從形態學和致病力角度分析，本發明獲得的大麗輪枝菌Δν(1Κιι70缺陷突變體菌 株Vd991 AKU70-1可作為基因打靶的背景菌株應用于基因打靶。
[0015] 本發明還公開了一種利用所述大麗輪枝菌Δ VdKu70缺陷突變體菌株 Vd991 AKU70-1進行基因打靶的方法，包括以下步驟：
[0016] (1)構建攜帶靶基因同源重組DNA片段的基因敲除載體，轉化農桿菌；（2)利用農 桿菌介導法轉化所述大麗輪枝菌Δν(1Κιι70缺陷突變體菌株；(3)篩選轉化子，鑒定，即得。
[0017] 其中，步驟（1)采用In-Fusion克隆技術構建靶基因同源重組DNA片段。由于本 發明獲得的AVdKu70缺陷突變體菌株Vd991AKu70-l已經具有潮霉素的抗性，因此，在構 建靶基因的同源重組DNA片段時選擇其它抗性基因取代待敲除的靶基因，例如遺傳霉素 (neomycin)抗性基因表達盒。
[0018] AVdKu70缺陷突變體菌株Vd991 ΔΚιι70-1的基因打靶效率評估實驗結果表明，大 麗輪枝菌Λ VdKu70缺陷突變體菌株的基因打靶效率相比野生型提高了 40%到60%，顯著 提高了基因打靶的效率，精確的實現了特定靶基因的改造。
[0019] 本發明獲得的大麗輪枝菌AVdKu70缺陷突變體菌株能夠應用于大麗輪枝菌的基 因打靶、研宄大麗輪枝菌侵染機制、與寄主共存機理以及研宄大麗輪枝菌病程關鍵基因的 功能等，為利用"反向基因組學"研宄大麗輪枝菌病程關鍵基因和侵染機制提供了一株高效 基因打靶的遺傳背景菌株。
[0020] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0021] 本發明敲除了大麗輪枝菌非同源末端連接的主要蛋白一Ku70蛋白，獲得 AVdKu70缺陷突變體菌株Vd991AKu70-l，其與野生型相比形態特征和致病力基本一致， 但對UV處理變得更加敏感，顯著提高同源重組的頻率，實現了靶基因的精確打靶，為大麗 輪枝菌病程機制的研宄等提供了一株高效的基因打靶菌株。
[0022] 本發明所涉及到的術語宙義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術語"基因打靶"意指通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從 而在生物活體內研宄此基因的功能。
[0025] 術語"同源重組"意指發生在非姐妹染色單體（sister chromatin)之間或同一染 色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為VdKu70蛋白和其它已經獲得Ku蛋白缺陷的突變體的真菌的Ku70蛋白的 系統進化樹；
[0027] 圖2為利用潮霉素抗性基因表達盒構建VdKu70敲除突變體；其中，A :通過同源重 組獲得VdKu70敲除突變體的過程；B，C :PCR檢測分析VdKu70敲除突變體；其中，B :是以 Hyg-J-F/Hyg-J-R引物檢測，在野生型中沒有獲得潮霉素 I. 6kb的片段，在突變體菌株中獲 得了 I. 6kb的片段；C :利用Ku70-J-F/Ku70-J-R引物檢測，在野生型中獲得I. 8kb的VdKu70 基因的片段，在突變體沒有獲得1.8kb的VdKu70基因的片段；D，E :分別用VdKu70基因的探 針（D)和Hyg基因的探針（E)雜交突變體和野生型的基因組經Kpn I酶切后Southern-blot 雜交檢測；其中，Vd-wt為野生型菌株；Vd-AKu70為AVdKu70突變體菌株Vd991AKu70-l ;
[0028] 圖3為轉化子的篩選實驗；其中，A :獲得的轉化子；B :轉化子的PCR檢測；
[0029] 圖4為AVdKu70突變體和野生型菌株的形態學表型特征；其中，ΔΚιι70為 AVdKu70突變體菌株Vd991 ΔΚιι70-1 ;A-E : AVdKu70突變體相比較野生型在不同碳源上的 生長表型；A :果膠質，B :半乳糖，C :木糖，D :淀粉，E :蔗糖；F : Λ VdKu70突變體和野生型菌 株的產孢量比較；
[0030] 圖5為Δ VdKu70突變體菌株的UV照射實驗；其中，Δ Ku70為Δ VdKu70突變體菌 株 Vd991 ΔΚιι70-1 ;
[0031] 圖6為AVdKu70突變體和野生型菌株侵染本生煙實驗；其中，Vd-wt為野生型菌 株；VdAKu70為Δ VdKu70突變體菌株Vd991 ΔΚιι70-1 ;A :蘸根法接種Δ VdKu70突變體和 野生型菌株的本生煙病程曲線；B :本生煙植株被侵染12天以后，25ng的本生煙DNA中的大 麗輪枝菌DNA的實時定量分析。

【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0033] 1、菌株和質粒
[0034] 大麗輪枝菌Vd991 (中國農業科學院植物保護研宄所簡桂良惠贈）；
[0035] 根癌農桿菌AGL1、質粒pGK02、pUC-Hyg、pCAM_neo (中國農業科學院農產品加工研 宄所戴小楓惠贈）。
[0036] 2、培養基
[0037] LB用于大腸桿菌培養；YEB用于農桿菌液體培養；CM、PDA、Czapek培養基用于 大_輪枝菌的培養；MM 和 IM(Hooykaas P，Roobol C，Schilperoort R.Regulation of the transfer of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Microbiology,1979, 110(1) :99-109.)用于轉化農桿菌的培養。
[0038] 實施例1大麗輪枝菌Δ VdKu70缺陷突變體的獲得與鑒定
[0039] 1、實驗方法
[0040] I. 1基因敲除質粒pGK0-Hyg-Ku70的構建
[0041] Ku70 基因的同源重組 DNA 片段構建米用 In-Fusion (Frandsen R.，Frandsen M, Giese H. Targeted gene replacement in fungal pathogens via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[M]//Plant Fungal Pathogens. Humana Press, 2012:17-45.)克隆技術。以質粒pUC-Hyg為模板，以Hyg-F/Hyg-R為引物（引物 名稱和序列見表1)，擴增長度為I. 8kb的潮霉素抗性基因盒。以大麗輪枝菌基因組為模 板，分別以 Ku70-5F/Ku70-5R 和 Ku70-3F/Ku70-3R 為引物，引物 Ku70-5R/Ku70-3F 5' 端的 16bp含有與Hyg-F/R互為反向互補的接頭，引物Ku70-5F/Ku70-3R 5'端的16bp含有與 pGK02(經EcoR I和Hind III線性化的片段）兩段互為反向互補的接頭，PCR擴增長度分 別為 0. 8kb 和 I. Ikb 的 Ku70 基因（VDAG_10247. IBroad Institute)上下游 DNA 片段，獲得 末端含有相應互為反向互補序列的3個PCR產物。通過In-Fusion" HD Cloning Kit User Manual(Clontech，USA)將3個片段整合到pGK02載體上，構建載體pGK0-Hyg-Ku70。I. 2農 桿菌介導的大麗輪枝菌的轉化
[0042] 電擊法將基因敲除質粒pGK0-Hyg-Ku70轉化到農桿菌AGL-I中，用于大 麗輪枝菌的遺傳轉化。轉化方法參照Mullins等（Mullins E.，Chen X，Romaine P, et al.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopatholo gy, 2001，91 (2) : 173-180.)的方法進行。
[0043] I. 3轉化子篩選
[0044] 挑取轉化子，放在含有潮霉素抗性的PDA培養基中再次篩選培養。將生長出的轉 化子轉入液體CM中培養震蕩7d (25°C，200r/min)，收集菌絲，提取總基因組DNA。使用引物 Ku70-J-F/Ku70-J-R 進行 PCR 篩選驗證。
[0045] 1. 4 Δ VdKu70缺陷突變體的確定
[0046] 最初篩選到的突變體在含有潮霉素抗性的PDA培養基繼代培養3代以后，轉 入液體CM中培養震蕩7d (25 °C，200r/min)，收集菌絲，提取總基因組DNA。使用引物 Ku7〇-J_F/Ku7〇-J-R 進行 PCR 驗證；然后進行 Southern 分析驗證（Tzima A.，Paplomatas E.,Tsitsigiannis D.,et al.The G protein β subunit controls virulence and multiple growth-and development-related traits in Verticillium dahliae. Fungal Genetics and Biology, 2012, 49 (4) : 271-283.)。大約 20 μ g 的單個突變體的 DNA 經 KpnI 酶切后，轉移到尼龍膜上，利用地高辛（DIG)標記的900bp的探針[利用DIG-dUTPs(DIG Labeling and Detection kit, Roche)，引物Ku70H-up/Ku70H-dn 或 Hyg H-up/Hyg H_dn，以 野生型大麗輪枝菌的基因組或質粒PUC-Hyg為模板進行PCR擴增獲得]進行雜交。
[0047] 1. 5表型特征分析
[0048] Λ VdKu70缺陷菌株的生長和形態學特征分析主要從菌落的直徑和產孢量兩個方 面分析。
[0049] 菌落的直徑的測量：制備2 X IO6孢子/mL的野生型菌株與AVdKu70突變體菌株 的孢子懸浮液，各吸取2ul的孢子懸浮液滴在不同的碳源[蔗糖（30g/L)、木糖（10g/L)、果 膠質（lOg/U、半乳糖（lOg/U、淀粉（17g/L) ] (Tzima A. et al.，2011)的 Czapek 真菌培養 基中心位置，培養到3天、6天、9天、12天、15天時，測量其菌落的大小和觀察其形態區別與 變化。
[0050] 產孢量的測定：制備2 X IO6孢子/mL的野生型菌株與AVdKu70突變體菌株的孢 子懸浮液，取2. 0 μ L滴加于PDA培養基中心位置，封口并置于恒溫培養箱25°C培養7天后， 統計孢子數（Tzima A. et al.，2012)。
[0051] 1.6UV-照射試驗
[0052] 制備IO3孢子/mL的野生型菌株與Δ VdKu70突變體菌株的孢子懸浮液，吸取40ul 均勻的涂在PDA培養基上，分別暴露于紫外燈照射10秒、15秒、20秒、25秒、30秒，封口并 置于恒溫培養箱25 °C培養5天后，統計菌落數。
[0053] 1. 7致病性試驗和qPCR確定植物體內真菌的生物量
[0054] 將滅菌處理的煙草種子栽培在無菌的環境下，待幼苗長至五到七片真葉時，用已 準備好的IO 6孢子/ml的Λ VdKu70缺陷突變體菌株與野生型菌株孢子懸浮液各自接種兩 組煙草幼苗，每組設置三小組（十棵幼苗）重復，十二天以后觀察植株的感病狀況并統計植 株的病情指數。
[0055] 分析寄主內大麗輪枝菌的生物量的變化，用被接菌并感病的本生煙植株的根、莖、 葉作為qPCR真菌生物量檢測的材料，提取DNA，以本生煙的actin (引物見表1)基因作為內 參，真菌的histones 3 (引物見表1)基因作為真菌生物量的檢測基因，檢測感病本生煙中 真菌的生物量（Tzima A. et al.，2012) 〇
[0056] 表1引物名稱及序列
[0057]

【權利要求】
1. 一株大麗輪枝菌（Verticillium dahliae) A VdKu70缺陷突變體菌株，其特征在于， 其微生物保藏編號為：CGMCC No. 10107。
2. 權利要求1所述的大麗輪枝菌AVclKuTO缺陷突變體菌株作為背景菌株在基因打靶 中的用途。
3. 權利要求1所述的大麗輪枝菌AVclKuTO缺陷突變體菌株在研宄大麗輪枝菌侵染機 制中的用途。
4. 權利要求1所述的大麗輪枝菌AVclKuTO缺陷突變體菌株在研宄大麗輪枝菌與寄主 共存機理中的用途。
5. 權利要求1所述的大麗輪枝菌AVclKuTO缺陷突變體菌株在研宄大麗輪枝菌病程關 鍵基因功能中的用途。
6. -種利用權利要求1所述的大麗輪枝菌AVclKi^O缺陷突變體菌株進行基因打靶的 方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)構建攜帶靶基因同源重組DNA片段的基因敲除載體，轉化農桿菌；（2)利用農桿菌 介導法轉化權利要求1所述的大麗輪枝菌△ VdKu70缺陷突變體菌株；（3)篩選轉化子，鑒 定，即得。
7. 按照權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟（1)采用In-Fusion克隆技術構建 靶基因同源重組DNA片段。
【文檔編號】C12N1/15GK104498374SQ201410844647
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月30日 優先權日:2014年12月30日
【發明者】程紅梅, 齊希梁, 蘇曉峰, 郭惠明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所