一種嗜熱鏈球菌的特異性分子標記dna序列及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的特異性分子標記DNA序列及其用途以及嗜熱鏈球菌的檢測方法。該特異性分子標記DNA序列如SEQ ID NO.6所示。該檢測方法包括步驟：(1)提取待測樣本的基因組DNA；(2)以步驟(1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.1所示的半隨機引物為擴增引物進行單引物PCR擴增；(3)對步驟(2)所得擴增產物進行克隆測序，并將測序結果與SEQ ID NO.6所示序列進行比對，若同源度大于99％，則表明待測樣本中含有嗜熱鏈球菌。
【專利說明】一種嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)的特異性分子標記DNA序列及其用途。
【背景技術】
[0002] 要對一種細菌進行分子水平的檢測需要獲知該細菌的特異性序列，而獲得一種細 菌的特異性序列，往往需要對網上大量的已知序列進行分析比對；但有些細菌已測的序列 較少，分析起來非常困難，難以得到其特異性序列。當然，也可以收集某一種細菌的所有菌 株，進行測序比對，但該方法實驗時間較長、費用高昂。
[0003] 嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)是益生菌的一種，廣泛應用于各種功 能性食品中，尤其是在乳制品的開發研宄中，日益受到重視。目前，在網上可以獲取的嗜熱 鏈球菌已經經過測序的序列較少，因而難以分析得到嗜熱鏈球菌的特異性序列，這給嗜熱 鏈球菌的分子檢測帶來不便。因此，有必要研宄開發獲知嗜熱鏈球菌的特異性序列，以方便 對其進行分子檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題就是針對目前對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)進行分子檢測不方便的現狀，而提供一種嗜熱鏈球菌的特異性分子標記 DNA序列及其用途。本發明的嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列與已經測過序的嗜熱 鏈球菌的基因同源性大于99 %，可以方便地用于對嗜熱鏈球菌進行分子檢測。此前，該分子 標記未經報道過，是一個新發現的嗜熱鏈球菌的特異性序列。
[0005] 本發明通過下述技術方案解決上述技術問題。
[0006] 本發明提供的技術方案之一是：一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus) 的特異性分子標記DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0007] 本發明提供的技術方案之二是：核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的嗜熱鏈球 菌（Streptococcus thermophilus)的特異性分子標記DNA在檢測嗜熱鏈球菌中的用途。
[0008] 核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA，是嗜熱 鏈球菌的種特異性序列，可以作為分子遺傳學標記，用于嗜熱鏈球菌的分子檢測。
[0009] 本發明提供的技術方案之三是：一種嗜熱鏈球菌的檢測方法，其包括如下步驟：
[0010] (1)提取待測樣本的基因組DNA ;
[0011] ⑵以步驟⑴所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1所示的半隨機引物為擴 增引物進行單引物PCR擴增；
[0012] (3)對步驟（2)所得擴增產物進行克隆測序，并將測序結果與SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列進行比對，若同源度大于99%，則表明待測樣本中含有嗜熱鏈球菌。
[0013] 本發明中，步驟（1)為提取待測樣本的基因組DNA。所述的提取待測樣本的基因 組DNA的方法為本領域常規，如可以采用液氮凍融-CTAB法，也可以采用溶菌酶法，還可以 使用市售的各種基因組DNA提取試劑盒進行操作。
[0014] 本發明中，步驟（2)為以步驟（1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1所 示的半隨機引物為擴增引物進行單引物PCR擴增。所述的單引物PCR擴增為本領域常規 所指的含義，即擴增體系中只加入一條擴增引物進行DNA片段的合成。較佳地，所述的單 引物PCR擴增的反應體系包括如下組分：0. 5?2. 0 μ mol/L半隨機引物，0. 2?I. Ommol/L dNTP，I. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02 ?0· IOU/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 0· 5 ?2. Ong/ μ L 基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴增的反應程序包括：①93-96°C，4-6min ;②93-96°C， 20-40s ;③ 45-58°C，20-40s ;④ 70-72°C，30-120s ;⑤ 70 ?72°C，5 ?IOmin ;其中，步驟 ②至④的循環數為25-40。更佳地，所述的單引物PCR擴增的反應體系包括如下組分： 1. 0 ymol/L 半隨機引物，0· 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/yLTaq DNA 聚合酶， 以及l.Ong/yL基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴增的反應程序包括：①95°C，5min ; ②95°C，30s ;③50°C，30s ;④72°C，2min ;⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環數為35。
[0015] 本發明中，步驟（3)為對步驟（2)所得擴增產物進行克隆測序，并將測序結果與 SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列進行比對，若同源度大于99%，則表明待測樣本中含有嗜熱 鏈球菌。其中，所述的對步驟（2)所得擴增產物進行克隆測序較佳地按下述方式進行：將步 驟（2)所得擴增產物進行電泳（優選瓊脂糖凝膠電泳，也可以是聚丙烯酰胺凝膠電泳），若 在ISOObp位置存在擴增條帶，則將該條帶進行克隆測序。
[0016] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0017] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0018] 相比于現有技術，本發明的積極進步效果在于：
[0019] 本發明中的嗜熱鏈球菌的特異性分子標記DNA序列與已經測過序的嗜熱鏈球菌 的基因同源性大于99 %，可以方便地用于對嗜熱鏈球菌進行分子檢測。本發明的檢測方法 操作簡單、方便快速、特異性強，不需要特別設計PCR引物即可對待測樣本進行檢測，成本 較低，實驗時間短，具有十分廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的篩選結果。圖中編號 "M" 為 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd. 1-4" 分別 為：Streptococcus thermophilusTA40、Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364的PCR 結果。
[0021] 圖2為不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結果。圖中編號"Μ" 為 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1-6" 分別為： Streptococcus thermophiIusCICC20379> Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophilusCICC20364、Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 結果。
[0022] 圖3為嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結果。圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分別 為：Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 結果〇
[0023] 圖4為嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取結果。圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分別 為：Streptococcus thermophilusCICC20379、 Streptococcus thermophilusCICC6222、 Streptococcus thermophilusCICC6072、Streptococcus thermophiIusCICC20378λ Streptococcus thermophiIusCICC20364λ Streptococcus thermophiIusCICC20389λ Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 結果〇
[0024] 圖5為不同半隨機引物的效果比較。圖中"M"為DL2,000DNA(Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd)，編號 "1-3" 為半隨機引物 "AP2-AP4" 分別對應的 PCR 結 果，編號4為半隨機引物APl對應的PCR結果，編號5為半隨機引物AP5對應的PCR結果。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0026] 下述實施例中，如非特別說明，所用試劑和材料均為常規市售可得。
[0027] 下述實施例中，下述實驗材料的來源為：
[0028] 嗜熱鏈球菌：
[0029] Streptococcus thermophiles TA40 購自丹尼斯克有限公司；
[0030] Streptococcus thermophilus St-body 3 購自丹尼斯克有限公司；
[0031] Streptococcus thermophiles CICC20174購自上海北諾生物科技有限公司；
[0032] Streptococcus thermophilus CICC20364購自上海北諾生物科技有限公司；
[0033] Streptococcus thermophiles CICC20379購自北京北納凱創生物技術有限公司；
[0034] Streptococcus thermophiles CICC6222購自北京北納凱創生物技術有限公司；
[0035] Streptococcus thermophiles CICC6072購自北京北納凱創生物技術有限公司；
[0036] Streptococcus thermophiles CICC20378購自北京北納凱創生物技術有限公司；
[0037] Streptococcus thermophiles CICC20364購自北京北納凱創生物技術有限公司；
[0038] Streptococcus thermophiles CICC20389購自北京北納凱創生物技術有限公司D
[0039] 實施例1不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的篩選 [0040] (1)模板制備
[0041] 將各菌株活化分離培養，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養基，37°C 厭氧培養24小時，離心獲得菌體。提取細菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0 (Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.) 〇
[0042] (2) PCR 擴增
[0043] PCR擴增的體系組成為：lumol/L半隨機引物（其序列如SEQ ID N0.1所示）， 0.5mmol/L dNTP，1.5mmol/L 的 Mg2+，0.05U/uLTaq DNA 聚合酶，以及 Ing/uL 基因組 DNA 模 板，總體積50 μ L。
[0044] PCR 擴增的程序為：① 95 °C，5min ;② 95 °C，30s ;③ 50 °C，30s ;④ 72 °C，2min ; ⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環數為35。
[0045] (3)特異性條帶的獲得
[0046] 將PCR產物進行電泳，結果見圖1，圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co,Ltd·。 "1-4" 分別為〖Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、 Streptococcus thermophiIus CICC20364 的 PCR 結果。
[0047] 將泳道1-4中共有的位置大約在1800bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆 測序，測序結果如SEQ ID NO. 6所示。
[0048] 實施例2不同嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0049] (1)模板制備
[0050] 將各菌株活化分離培養，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養基，37°C 厭氧培養24小時，離心獲得菌體。提取細菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0051] (2) PCR 擴增
[0052] PCR擴增的體系組成為：2 μπιοΙ/L半隨機引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， lmmol/L dNTP，2.5mmol/L 的 Mg2+，0.10U/yLTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/yL 基因組 DNA 模 板，總體積50 μ L。
[0053] PCR 擴增的程序為：① 95 °C，4min ;② 95 °C，20s ;③ 50 °C，20s ;④ 72 °C，60s ; ⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環數為40。
[0054] (3)特異性條帶的獲得
[0055] 將PCR產物進行電泳，結果見圖2,圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1_6"分別為〖Streptococcus thermophilusCICC20379、 Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophilusCICC20364、 Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 結果。
[0056] 將泳道1-6中共有的位置大約在1800bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆 測序，測序結果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0057] 實施例3嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0058] (1)模板制備
[0059] 將菌株活化分離培養，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養基，37°C 厭氧培養24小時，離心獲得菌體。提取細菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0060] (? PCR 擴增
[0061] PCR擴增的體系組成為：0. 5 μ mol/L半隨機引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 2mmol/L dNTP，I. Ommol/L 的 Mg2+，0· 02U/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 0· 5ng/ μ L 基因組 DNA 模板，總體積50 μ L。
[0062] PCR 擴增的程序為：① 96°C，4min ;② 93°C，40s ;③ 45°C，40s ;④ 70°C，120s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步驟②至④的循環數為25。
[0063] (3)特異性條帶的獲得
[0064] 將PCR產物進行電泳，結果見圖3,圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1_2"分別為〖Streptococcus thermophilusCICC20174、 Streptococcus thermophiIus CICC20364 的 PCR 結果。
[0065] 將泳道中共有的位置大約在ISOObp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測序， 測序結果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0066] 實施例4嗜熱鏈球菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0067] (1)模板制備
[0068] 將菌株活化分離培養，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養基，37°C 厭氧培養24小時，離心獲得菌體。提取細菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0069] (2) PCR 擴增
[0070] PCR擴增的體系組成為：1 μπιοΙ/L半隨機引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/ μ L 基因組DNA模 板，總體積50 μ L。
[0071] PCR 擴增的程序為：① 93 °C，6min ;② 96 °C，20s ;③ 58 °C，30s ;④ 72 °C，30s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步驟②至④的循環數為35。
[0072] (3)特異性條帶的獲得
[0073] 將PCR產物進行電泳，結果見圖4,圖中編號"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co，Ltd·。 "1-10" 分別為：Streptococcus thermophiIusCICC20379> Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophiIusCICC20364> Streptococcus thermophiIusCICC20389> Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 結果。
[0074] 將泳道中共有的位置大約在1800bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測序， 測序結果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0075] 實施例5序列特異性驗證
[0076] 將實施例1?4所獲得的特異性序列（如SEQ ID NO. 6所示）在NCBI網站進行 BLAST，結果顯示獲得的特異性序列與嗜熱鏈球菌的基因同源性大于99%，與其它物種的同 源性都不高，或者極低，具體結果參見表1，由此確定所得的序列為嗜熱鏈球菌的特異性序 列。
[0077]表 1 [0078]
【權利要求】
1. 一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)的特異性分子標記DNA，其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。 2?核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus) 的特異性分子標記DNA在檢測嗜熱鏈球菌中的用途。
3. -種嗜熱鏈球菌的檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟： (1) 提取待測樣本的基因組DNA; (2) 以步驟⑴所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1所示的半隨機引物為擴增引 物進行單引物PCR擴增； (3) 對步驟（2)所得擴增產物進行克隆測序，并將測序結果與SEQ ID NO. 6所示的核苷 酸序列進行比對，若同源度大于99%，則表明待測樣本中含有嗜熱鏈球菌。
4. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的提取待測樣本的基因組DNA的方 法為液氮凍融-CTAB法或溶菌酶法。
5. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴增的反應體系包 括如下組分：〇. 5 ?2. 0 y mol/L 半隨機引物，0. 2 ?1. Ommol/L dNTP，1. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0? 02 ?0? 10U/ y LTaq DNA 聚合酶，以及 0? 5 ?2. Ong/ y L 基因組 DNA 模板。
6. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴增的反應程序包 括：① 93-96 °C，4-6min ;② 93-96 °C，20-40s ;③ 45-58 °C，20-40s ;④ 70-72 °C，30-120s ; ⑤70?72°C，5?lOmin ;其中，步驟②至④的循環數為25-40。
7. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴增的反應體系包括 如下組分：1. 0 y mol/L 半隨機引物，0? 5mmol/L dNTP，1. 5mmol/L 的 Mg2+，0? 05U/ y LTaq DNA 聚合酶，以及1. 〇ng/ y L基因組DNA模板。
8. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴增的反應程序包 括：① 95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ;⑤ 72°C，5min ;其中，步驟②至 ④的循環數為35。
9. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的對步驟（2)所得擴增產物進行克 隆測序按下述方式進行：將步驟（2)所得擴增產物進行電泳，若在1800bp位置存在擴增條 帶，則將該條帶進行克隆測序。
10. 如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498491SQ201410838715
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月26日 優先權日:2014年12月26日
【發明者】張紅發, 任婧, 郭本恒, 劉振民 申請人:光明乳業股份有限公司