一種血清miRNA生物標志物的應用的制作方法
【專利摘要】一種血清miRNA生物標志物的應用，涉及生物標志物。所述血清miRNA生物標志物包括miR-34c、miR-1275、miR-375、miR-410、miR-758中的至少一種。所述血清miRNA生物標志物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。所述血清miRNA生物標志物組合物包括miRNA中的至少一種以及各miRNA的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列；所述血清miRNA生物標志物組合物可在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。確定的miRNA組合與少精癥和無精癥的病例指標的密切相關性，能夠作為生物標記物對少精癥和無精癥病人進行篩查和診斷，為臨床個體化干預治療提供有效依據。
【專利說明】-種血清miRNA生物標志物的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物標志物,尤其是涉及一種血清miRNA生物標志物的應用。 技術背景
[0002] 不孕不育是全球性醫學問題，據世界衛生組織統計，全球約有5%?10%的育齡 夫妻存在不孕不育問題，其中男性原因所致不育占一半左右。有90%的男性不育癥是由生 精障礙引起，臨床上表現為無精子癥或少精子癥。少精癥是指每暈升精液中精子少于2000 萬，因為精子數量少，與卵子相遇的機會就少，導致男性不育。無精癥約占男性不育癥患者 的15%?20%。無精癥是指多次精液檢查（一般3次以上）均未發現精子。無精癥患者 必要時可做睪丸活檢、精道造影、內分泌激素放免測定等，以協助鑒別阻塞性無精子或先天 性無精子。目前相關研究大多從單個基因的角度探討少精癥和無精癥的病因，但單個基因 的改變并不能完全解釋他們的致病機制。
[0003] miRNA (microRNA)是一類長約22nt的非編碼小RNA，廣泛存在于各種生物中，調節 生物體生長、發育和凋亡等過程。由此形成的復雜遺傳學網絡，是生物體生長發育的基礎。 miRNA在人和動物睪丸發育及精子生成等過程也起著重要的調控作用。
[0004] 研究報道在成年果蠅體內去除一個miRNA(let-7)，就能導致不孕不育。因 為像let-7這樣的miRNA承擔了重要的功能，在進化中非常保守，廣泛存在于人類 和許多其他動物體內（Fagegaltier D, K5nig A, Gordon A, et al. A genome-wide survey of sexually dimorphic expression of Drosophila miRNAs identifies the steroid hormone-induced miRNA let-7as a regulator of sexual identity[J]. Genetics, 2014, 198(2) : 647-668.)。
[0005] miRNA在血清中可長期穩定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反復凍融、酸堿環境、長期 保存等各種處理方法均不會造成血清miRNA的損失，因此血清中的miRNA有潛力作為一種 有價值的篩查或者診斷的標志物，其受外來干擾因素影響小，臨床實用性強。甚至常規體檢 中就可以收集到的血液。由于血液會循環至全身所有組織，向細胞輸送營養并清除廢物，因 此血液能夠反映出整個機體的生理病理狀況，其檢測結果對人體健康具有指導意義。并且， 基于血清的檢測是無創的、非侵入的，因此可以適用于普查，為早期診斷服務。少精癥和無 精癥患者血清的miRNA檢查不僅可以輔助診斷，避免進行睪丸活檢等創傷性檢查，或者一 些無效的治療，更主要的是可以避免將這種缺陷遺傳給下一代。
[0006] 由于血清中miRNA的表達量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本低廉的檢 測方法是目前血清miRNA應用于臨床檢測亟待解決的問題，實時熒光定量PCR是目前檢測 血清miRNA的主要方法，該方法快速、便捷，精確度和靈敏度可滿足臨床需求。另外，在選擇 標志物時，應優先選擇在疾病中表達上調的血清miRNA，這樣也可提高檢測的靈敏性和特異 性。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種血清miRNA生物標志物的應用。
[0008] 所述血清miRNA生物標志物包括以下所列miRNA中的至少一種：
【權利要求】
1. 一種血清miRNA生物標志物，其特征在于包括以下所列miRNA中的至少一種： miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc； miR-1275：gugggggagaggcuguc；miR-375：uuuguucguucggcucgcguga； miR-410：agguugucugugaugaguucg； miR-758 :gaugguugaccagagagcacac〇
2. 如權利要求I所述血清miRNA生物標志物在制備少精癥和無精癥檢測試劑中應用。
3. 如權利要求2所述應用，其特征在于所述少精癥和無精癥檢測試劑用于檢測少精癥 和無精癥的方法采用莖環的反轉錄-熒光定量PCR方法，S卩SYBRGreen染料法，具體步驟 如下： 1) 血清樣本采集和臨床分組：從醫院采集血清樣本，同時系統收集患者的病理學資 料； 2) 用Qiagen公司商品化的總RNA提取試劑盒miRNeasySerum/Plasmakit(cat-no. 217184) 從受試樣本血清中提取總RNA，通過AgilentmiRNAmicroarray高通量篩選出 候選miRNA; 3) 采用實時熒光定量PCR方法篩選可用作檢測標志物的miRNA。
4. 血清miRNA生物標志物組合物，其特征在于包括miRNA中的至少一種以及各miRNA 的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列； 所述miRNA包括： miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；miR-1275：gugggggagaggcuguc； miR-375：uuuguucguucggcucgcguga； miR-410：agguugucugugaugaguucg； miR-758：gaugguugaccagagagcacac； 所述各miRNA的反轉錄引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：
5.如權利要求4所述血清miRNA生物標志物組合物在制備少精癥和無精癥檢測試劑中 應用。
【文檔編號】C12N15/113GK104450707SQ201410819428
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】曾驥孟, 李志明, 顧龍, 莊炫 申請人:廈門大學