與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖的分子標記及其應用，屬于分子標記輔助育種領域。本發明公開了檢測與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖標記的引物對以及利用所述引物對檢測水稻品種或株系中是否含有Pi9基因的方法，包括：(1)提取待檢水稻樣品基因組DNA；(2)利用所述的引物對進行PCR擴增；(3)內切酶酶切步驟(2)的PCR擴增產物，電泳；(4)根據酶切結果判斷待檢水稻樣品是否含有Pi9基因。本發明方法能夠準確判斷被檢水稻樣品是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因為雜合或純合，還可以鑒定親本之一含Pi9基因的F1代雜交種純度，在Pi9基因輔助選育等方面具有應用前景。
【專利說明】與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記，尤其涉及與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖的分子標記，屬于分 子標記輔助育種領域。
【背景技術】
[0002] 水稻（Oryaa sativa L.)是中國重要的糧食作物，常年栽培面積三千萬公頃以上， 產量居糧食作物首位。稻瘟病是嚴重危害水稻生產的主要病害之一，經常在水稻種植區域 發生流行。稻瘟病是由Pyricularia Oryzae Cav.引起的真菌性病害，全國水稻種植區均 有發生，流行年份一般減產10 %?20 %，嚴重的達40 %?50 %以上（0u，1985)。發掘新的 抗源、選育抗性品種仍然是預防稻瘟病最經濟有效的方法。
[0003] 到目前為止，已鑒定的稻瘟病抗性基因達70多個，其中來自小粒野生稻Oryza minuta的Pi9基因對來自13個國家的43個稻瘟病小種都表現出抗性，顯示出良好抗稻瘟 病能力。2006年Qu等已成功標記并克隆了該基因。中國已有研宄所利用與Pi9基因緊密 連鎖的標記進行育種。然而目前使用的與Pi9基因緊密鎖的標記pB8在供體親本75-1-127 與H02、協青早B等親本間沒有多態性，這就給通過分子標記手段選擇Pi9基因帶來很大的 難度。亟待開發一種與Pi9基因緊密鎖的分子標記，準確判斷被檢水稻樣品是否含有Pi9 基因及含有的Pi9基因為雜合或純合。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種與Pi9基因緊密鎖的分子標記，判斷被檢 測水稻樣品是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因為雜合或純合，進而實現對Pi9基因的 輔助選育。
[0005] 本發明所要解決的上述技術問題是通過以下技術方案實現的：
[0006] 本發明針對Pi9基因功能區域設計引物，對多個品種包括供體75-1-127、Pi9基 因轉育后代N632S和N779S、其他材料93-11、日本晴、y80、f232、f254、f251、1892S的 Pi9基因功能區域進行測序，利用DNAMN軟件對獲得的序列進行比較，找出Pi9基因專 一性的差異。本發明根據Pi9基因功能區域的特有差異，設計了 3對PCR檢測引物對， 分別為引物對 I (Pi9_Af 1IIF/Pi9-Af 1IIR)、引物對 2 (Pi9-NheIF/Pi9-NheIRl)和引物對 3(Pi9-Bspl286IF/Pi9-Bspl286IR)。其中，引物對 I (Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR)其核苷酸序 列為 SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示；引物對 2(Pi9-NheIF/Pi9-NheIRl)其核苷酸序 列為 SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14 所示；引物對 3(Pi9-Bspl286IF/Pi9-Bspl286IR)其核 苷酸序列為SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示；優選的，所述引物對為核苷酸序列為SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的引物對1。
[0007] 本發明還公開了一種利用所述引物對檢測水稻品種或株系中是否含有Pi9基因 的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)提取待檢測水稻樣品基因組DNA ; (2)利用所述的引物對1進行PCR擴增；（3) 用AflII內切酶酶切步驟（2)的PCR擴增產物，電泳；(4)根據酶切結果判斷，如果酶切譜 帶含有371BP譜帶，則待檢測水稻樣品含有Pi9基因；如果酶切譜帶僅有447BP譜帶，則待 檢測水稻樣品不含有Pi9基因。
[0009] 其中，步驟（2)PCR 反應體系為：2XPCR buffer II 25 yL，2. Ommol/L dNTPs 5.0 μ L，10 μ mol/L SEQ ID No. 11 所示引物 2.5 μ L，10 μ mol/L SEQ ID No. 12 所示引物 2· 5 μ L，5U/ μ L LA Taq 酶 0· 5 μ L，模板 DNA 5· 0 μ L，ddH20 9· 5 μ L，總體積 50 μ L ;PCR 程 序為：94°C變性 5min 后，94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，循環 35 次，72°C延伸 10min，12°C 保溫；
[0010] 步驟（3)酶切體系為：ddH20 5· 8 μ L，IOXBuffer 2· 0 μ L，10XBSA 2· 0 μ L，IOU/ μ L內切酶0. 2 μ L，步驟（2) PCR產物10 μ L，總反應體積20 μ L ;酶切反應溫度為37°C，酶 切時間為12h。
[0011] 本發明進一步公開了一種檢測水稻品種或株系中是否含有Pi9基因以及含有的 Pi9基因為雜合或純合的試劑盒，由彼此獨立的試劑1和試劑2組成；其中，試劑1的組成 包括：2 XPCR緩沖液，dNTPs混合溶液，檢測上下游引物對，LA Taq DNA聚合酶和雙蒸水；試 劑2的組成包括：雙蒸水，IOXBuffer緩沖液，10XBSA，內切酶；其中，所述上下游引物為引 物對1 ;所述內切酶為AflII內切酶。
[0012] 本發明所述的引物對1能夠應用于Pi9基因輔助選育，包括以下步驟：
[0013] (1)利用所述的引物對1擴增待檢測水稻樣品基因組DNA ; (2) AflII內切酶酶切 擴增的產物，電泳；（3)根據酶切結果判斷，如果酶切譜帶只有371BP譜帶，則待檢測水稻樣 品是Pi9基因純合體；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢測水稻樣品是 Pi9基因雜合體；如果酶切譜帶僅有447BP譜帶，則待檢測水稻樣品不含Pi9基因。
[0014] 本發明所述的引物對1能夠應用于不育系為Pi9基因純合體且恢復系不含有Pi9 基因的雜交水稻純度鑒定中，包括以下步驟：
[0015] (1)提取待檢測水稻品種或株系基因組DNA;(2)利用所述的引物對1進行PCR擴 增；（3)步驟（2)的PCR擴增產物經Af III內切酶酶切，電泳；（3)根據酶切結果判斷，如果 酶切譜帶僅含有371BP譜帶，則待檢測水稻樣品是不育系；如果酶切譜帶僅含有447BP譜 帶，則待檢測水稻樣品是恢復系；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢測水 稻樣品是雜交水稻。
[0016] 本發明所述的引物對1還能夠應用于不育系不含有Pi9基因且恢復系為Pi9基因 純合體的雜交水稻純度鑒定中，包括以下步驟：
[0017] (1)提取待檢測水稻品種或株系基因組DNA;(2)利用所述的引物對1進行PCR擴 增；（3)步驟（2)的PCR擴增產物經Af III內切酶酶切，電泳；（3)根據酶切結果判斷，如果 酶切譜帶僅含有447BP譜帶，則待檢測水稻樣品是不育系；如果酶切譜帶僅含有371BP譜 帶，則待檢測水稻樣品是恢復系；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢測水 稻樣品是雜交水稻。
[0018] 利用引物對2 (Pi9-NheIF/Pi9-NheIRl)分別對Pi9基因純合體和不含Pi9基因品 種進行擴增，利用NheI內切酶對PCR產物進行酶切，酶切產物經4%瓊脂糖電泳分離，結果 無法區分Pi9基因有無。
[0019] 利用引物對3(Pi9-Bspl286IF/Pi9-Bspl286IR)分別對Pi9基因純合體和不含Pi9 基因品種進行擴增，利用Bspl286I內切酶對PCR產物進行酶切，同樣不能區分Pi9基因有 無。以上實驗結果說明不是所有的SNP都能用于區分Pi9基因。
[0020] 為了將Pi9基因轉入具有優異的性狀水稻材料，用優良水稻品系與含有Pi9基因 的材料雜交并回交，利用引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR擴增各雜交（回交）世代單株Pi9 基因位點，并對擴增的PCR產物用AfIII酶切，根據酶切結果，判斷Pi9基因的存在與否，從 而輔助選育含有Pi9基因且農藝性狀優良的單株。
[0021] 根據引物對Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR對自交分離群體單株的擴增產物酶切譜帶 的差異，判別受檢單株是否含有Pi9基因，以及Pi9基因是否為純合類型。利用Pi9-AflIIF/ Pi9-AflIIR引物擴增，經AflII酶切，結果只有371BP譜帶的為含有Pi9基因純合體，只有 447BP譜帶的為不含有Pi9基因，含有447BP和371BP兩條譜帶的單株為含有Pi9基因的 雜合株。因此，當對自交分離群體進行鑒定時，利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物擴增，經 AflII酶切，結果只有371BP譜帶的為含有Pi9基因純合體。
[0022] 對于不育系含有Pi9基因（純合）、恢復系不含有Pi9基因的雜交水稻純度鑒定， 根據標記Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在水稻不育系、恢復系和雜交種中擴增產物酶切結果的 差異，判別受檢雜交稻種中是否存在不育系或恢復系（或其它親本，是指不含Pi9基因的其 它水稻株系或其它品種）單株混雜。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物擴增，PCR產物經 Af III酶切，不育系酶切譜帶僅含有371BP譜帶，恢復系酶切譜帶僅含有447BP譜帶，雜交種 酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶。因此，當不育系進行純度鑒定時，凡是未酶切出大 小371bp單一譜帶的單株，都判定為混雜株；當對雜交水稻進行純度鑒定時，凡是僅酶切出 大小為371bp單一譜帶的，判定為不育系混雜，凡是僅酶切出大小為447bp單一譜帶的，都 判定為恢復系（或其它親本，指不含Pi9基因的其它水稻株系或其它品種）混雜。
[0023] 對于不育系不含有Pi9基因、恢復系含有Pi9基因（純合）的雜交水稻純度鑒定， 根據標記Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在水稻不育系、恢復系和雜交種中擴增產物酶切結果的 差異，判別受檢雜交稻種中是否存在不育系（或其它親本，指不含Pi9基因的其它水稻株 系或其它品種）或恢復系單株混雜。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR引物擴增，PCR產物經 Af III酶切，不育系酶切譜帶僅含有447BP譜帶，恢復系酶切譜帶僅含有371BP譜帶，雜交種 酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶。因此，當對雜交水稻進行純度鑒定時，凡是僅酶切 出大小為447bp單一譜帶的，判定為不育系混雜（或其它親本，指不含Pi9基因的其它水稻 株系或其它品種），凡是僅酶切出大小為371bp單一譜帶的，都判定為恢復系混雜。
[0024] 水稻樣品純度檢驗結果按以下公式計算：
[0025] P (%) =^z-^-XlOO0Zo TVr
[0026] 式中：
[0027] P-樣品純度；
[0028] Nt-為供檢種子粒數（幼苗數、株數）；
[0029] Nd-為判定為混雜株的種子粒數（幼苗數、株數）。
[0030] 本發明利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR標記鑒別母本含Pi9基因、父本不含Pi9基 因雜交種純度，結果表明，43株雜種Fl代中，5株為母本混雜，1株為父本混雜，雜交種純度 為86. 04%。利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR標記鑒別母本不含Pi9基因、父本含Pi9基因雜 交種純度，結果表明，在45株雜種Fl代中，1株為母本混雜，6株為父本混雜，雜交種純度為 84. 44%。
[0031] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0032] 本發明開發的Pi9基因緊密鎖的分子標記能夠準確判斷被檢水稻樣品是否含有 Pi9基因、快速判斷Pi9基因純合體以及鑒定親本之一含有Pi9基因的Fl代雜交種純度，能 夠應用于Pi9基因輔助選育。
[0033] 本發明所涉及到的術語宙義
[0034] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0035] "不育系"包括"三系不育系"和"兩系不育系"。三系不育系意指將選擇到的雄性 不育單株與可育的個體雜交再經連續回交培育而成的具有雄性不育特征且整齊一致的品 質。兩系不育系意指光溫敏不育系，其育性轉換與日照長短和溫度高低有密切關系，在長日 高溫條件下，它表現雄性不育；在短日平溫條件下，恢復雄性可育。
[0036] "恢復系"意指某一品系與不育系雜交后可使子代恢復雄性可育特征。
[0037] "保持系"意指當作為父本與不育系雜交時，能使Fl保持雄性不育性的植物品系。
[0038] "分子標記"有廣義和狹義之分，廣義的"分子標記"意指可遺傳的并可檢測的DNA 序列或蛋白質；狹義"分子標記"意指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性 DNA片段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1為Pi9基因序列比較、標記引物及酶切位點在序列中的位置；
[0040] 圖2為引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR在部分水稻品種中擴增酶切結果；其中，M: 標準分子量；1為75-1-127 ;2為N779S ;3為N632S ;4為93-11 ;5為日本晴；6為f232 ;7為 f251 ;8 為 f254 ;9 為 1892S ;
[0041] 圖3為引物Pi9-NheIF/Pi9-NheIRl在部分水稻品種中擴增酶切結果；其中，M :標 準分子量；1為75-1-127 ;2為N779S ;3為N632S ;4為93-11 ;5為日本晴；6為f232 ;7為 f251 ;8 為 f254 ;9 為 1892S ;
[0042] 圖4為引物Pi9-Bspl286I F/Pi9-Bspl286I R在部分水稻品種中擴增酶切結果； 其中，M為標準分子量；1為75-1-127 ;2為N779S ;3為N632S ;4為93-11 ;5為日本晴；6為 f232 ;7 為 f251 ;8 為 f254 ;9 為 1892S ;
[0043] 圖5為利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR標記區分Pi9基因雜合體；其中，M :標準分 子量Marker ;1 :廣占63S (不含Pi9基因兩系不育系）；2:93-11(不含Pi9基因恢復系）； 3:N632S (含Pi9基因兩系不育系）；4:SE2(含Pi9基因恢復系）；5,6:廣占63S/SE2F1代 雜交種（Pi9基因雜合體）；7,8:N632S/93-llFl代雜交種（Pi9基因雜合體）；
[0044] 圖6為Pi9基因分子輔助選育流程圖；
[0045] 圖7為引物Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR對含Pi9基因分離世代（BC2F4)的輔助選育； 其中，M為標準分子量；1為Pi9基因供體75-1-127 ;2為廣占63S ;6，10，12，19為？19基因 純合體；4, 5, 7,8,11，13,15,16,18為Pi9基因雜合體；其余為不含Pi9基因單株；
[0046] 圖8為利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR標記鑒別母本含Pi9基因、父本不含Pi9 基因雜交種純度；其中，Μ:標準分子量Marker ;1 :WH26(父本，不含Pi9基因恢復系）；2 : 呢325(母本，含？丨9基因兩系不育系）；3-45:雜種？1代（其中3,4，16,31，36為母本混雜； 22為父本混雜）；
[0047] 圖9為利用Pi9-AflIIF/Pi9-AflIIR標記鑒別母本不含Pi9基因、父本含Pi9基因 雜交種純度；其中，M :標準分子量Marker ; I :SE2 (父本，含Pi9基因恢復系）；2 :1892S (母 本，不含Pi9基因兩系不育系）；3-47 :雜種Fl代（其中4、18、21、25、27和41為父本混雜； 35為母本混雜）。
【具體實施方式】
[0048] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0049] 1、實驗材料
[0050] 水稻品種Pi9基因供體75-1-127、Pi9基因轉育后代N632S和N779S、其他材料 f232、f254、f251、1892S。
[0051] 其中，75-l-127、N779S和N632S為Pi9基因純合體，其余水稻品種不含Pi9基因。
[0052] 75-1-127為a minuta/IR31917回交后代（來源于國際水稻研宄所IRRI);
[0053] N632S 為廣占 63S/6G241BC3F4 代（6G241 :75-l-123/CBB23F8 代）；N779S 為 1892S/7J278BC3F5 代（7J278 :75-l-123/CBB23F9 代）；f232、f254、f251 為 93-11/WH26F6 代、1892S為培矮64S變異株；均為安徽省農業科學院水稻研宄所選育；
[0054] WH26 (中秈2707與秈粳交優質稻209512雜交育成高產中秈品種）， SE2 (93-11/75-1-127回交后代選育的抗病株系）。
[0055] 實施例1與Pi9基因緊密鎖的分子標記的開發
[0056] 1、實驗方法
[0057] I. I CTAB法提取水稻基因組DNA
[0058] 剪取Pi9基因供體75-l-127、Pi9基因轉育后代N632S和N779S、其他材料93-11、 日本晴、€232、€251、€254、18925材料幼嫩葉片100-20011^，移入2.011^離心管中，向離心管 中加液氮用玻棒充分研磨至粉末狀，再加入700 μ L 65°C預熱的DNA提取液（81. 7g NaCl 和 20g CTAB 充分溶于適量水中，然后加入 lmol/L Tris-HCl 100mL，(X5mol/L EDTA 40mL， 定容至1000mL，4°C貯存），65°C孵育lh，每隔15min顛倒混勻一次；加入等體積氯仿/異戊 醇，輕緩混勾，室溫靜置15min ;12, OOOrpm離心15min，吸取上清移至另一支I. 5mL離心管 中，再加入等體積異丙醇混勾，置于-20°C 30min，4°C、12, OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入 200 μ L70 %乙醇洗滌沉淀；12, OOOrpm離心IOmin后棄去乙醇，室溫干燥后加入50 μ L滅菌 水，充分溶解后備用。
[0059] I. 2 Pi9基因功能區域序列測定
[0060] I. 2. I Pi9基因功能區域DNA測序引物序列
[0061] 設計引物對多個品種的pi9基因功能區域進行測序，引物序列如下：
[0062] Pi9Fl:GTATATCAAAGATGAGCTAAAAACA
[0063] Pi9Rl:TTCCAATCATGTAAAATCCATAGAT
[0064] Pi9F2:AAGGAGAAGAGGTACTTTGTTATTC
[0065] Pi9R2:GACAAGTCTTAATTTTTCCTGCTAT
[0066] Pi9F3:CAAAGGTTGGGATGACGACTAAGGA
[0067] Pi9R3:ACCTTCACACCGAATGATTCAGACC
[0068] P i 9F4:TATGCCTGCCTAAAGTATTCACACC
[0069] Pi9R4:TTTGAATACTAGCTTCTCCCCAAGG
[0070] Pi9F5:AGAGATGCCTAACTGGATTGAGCAG
[0071] Pi9R5:CTATCGTTCGTCGTCAACGTGATCA
[0072] 1.2.2 PCR 擴增
[0073] 利用測序引物對水稻基因組DNA進行擴增，擴增體系中各組分配制如下：
[0074]
【權利要求】
1. 一種檢測與稻瘟病Pi9基因緊密連鎖標記的引物對，其特征在于，選自下述3對引 物對中的任意一對：SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的引物對1 ;SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的引物對2 ;SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的引物對3。
2. -種利用權利要求1所述引物對檢測水稻品種或株系中是否含有Pi9基因的方法， 其特征在于，包括以下步驟： (1)提取待檢測水稻樣品基因組DNA ; (2)利用權利要求1所述的引物對1進行PCR擴 增；（3)用Aflll內切酶酶切步驟⑵的PCR擴增產物，電泳；(4)根據酶切結果判斷，如果 酶切譜帶含有371BP譜帶，則待檢測水稻樣品含有Pi9基因；如果酶切譜帶僅有447BP譜 帶，則待檢測水稻樣品不含有Pi9基因。
3. 按照權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2) PCR反應體系為： 2父卩〇?1311打61'1125卩1，2.0臟〇1/1(1見138 5.0卩1，10卩111〇1/15￡0 10吣.11所示引 物 2. 5yL，10ymol/L SEQ ID No. 12 所示引物 2. 5yL，5U/yL LA Taq 酶 0? 5yL，模板 DNA 5. 0 y L，ddH20 9. 5 y L，總體積 50 y L ;PCR 程序為：94°C變性 5min 后，94°C lmin，55°C lmin， 72°C lmin，循環 35 次，72°C延伸 lOmin，12°C保溫； 步驟（3)酶切體系為：ddH20 5.8 yL，10XBuffer 2.0yL，10XBSA2.0yL，10U/yLR 切酶0. 2 y L，步驟（2) PCR產物10 y L，總反應體積20 y L ;酶切反應溫度為37°C，酶切時間 為 12h〇
4. 一種檢測水稻品種或株系中是否含有Pi9基因以及含有的Pi9基因為雜合或純合 的試劑盒，由彼此獨立的試劑1和試劑2組成；其中，試劑1的組成包括：2XPCR緩沖液， dNTPs混合溶液，檢測上下游引物對，LA Taq DNA聚合酶和雙蒸水；試劑2的組成包括：雙 蒸水，lOXBuffer緩沖液，10XBSA，內切酶；其特征在于：所述上下游引物為權利要求1所 述的引物對1 ;所述內切酶為Aflll內切酶。
5. 權利要求1所述的引物對在Pi9基因輔助選育中的應用。
6. 按照權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟： (1)利用權利要求1所述的引物對1擴增待檢測水稻樣品基因組DNA ; (2)Aflll內切 酶酶切擴增的產物，電泳；（3)根據酶切結果判斷，如果酶切譜帶只有371BP譜帶，則待檢測 水稻樣品是Pi9基因純合體；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢測水稻樣 品是Pi9基因雜合體；如果酶切譜帶僅有447BP譜帶，則待檢測水稻樣品不含Pi9基因。
7. 權利要求1所述的引物對在不育系為Pi9基因純合體且恢復系不含Pi9基因的雜交 水稻純度鑒定中的應用。
8. 按照權利要求7所述的應用，其特征在于，包括以下步驟： (1)提取待檢測水稻品種或株系基因組DNA ; (2)利用權利要求1所述的引物對1進行 PCR擴增；(3)步驟（2)的PCR擴增產物經Aflll內切酶酶切，電泳；（3)根據酶切結果判斷， 如果酶切譜帶僅含有371BP譜帶，則待檢測水稻樣品是不育系；如果酶切譜帶僅含有447BP 譜帶，則待檢測水稻樣品是恢復系；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢測 水稻樣品是雜交水稻。
9. 權利要求1所述的引物對在不育系不含Pi9基因且恢復系為Pi9基因純合體的雜交 水稻純度鑒定中的應用。
10. 按照權利要求9所述的應用，其特征在于，包括以下步驟： (1)提取待檢水稻品種或株系基因組DNA ; (2)利用權利要求1所述的引物對1進行PCR 擴增；（3)步驟（2)的PCR擴增產物經Af III內切酶酶切，電泳；（3)根據酶切結果判斷，如 果酶切譜帶僅含有447BP譜帶，則待檢水稻樣品是不育系；如果酶切譜帶僅含有371BP譜 帶，則待檢水稻樣品是恢復系；如果酶切譜帶含有447BP和371BP兩條譜帶，則待檢水稻樣 品是雜交水稻。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498612SQ201410817285
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月24日 優先權日:2014年12月24日
【發明者】倪大虎, 楊劍波, 宋豐順, 倪金龍, 李莉 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所