一種從刀豆中提取尿素酶的方法
【專利摘要】本發明提供一種從刀豆中提取尿素酶的方法，主要解決了現有技術中工藝復雜，產品的失活率高，回收率低，不適合工業化生產。該從刀豆中提取尿素酶的方法包括以下步驟：1]提取；2]沉降；3]中和；4]微濾；5]超濾。該方法工藝簡單，易操作，可有效地降低產品的失活率，且成本低，污染小，樣品回收率高，有利于工業化生產。
【專利說明】一種從刀豆中提取尿素酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶的提取純化方法，具體涉及一種通過膜分離提取純化尿素酶的 方法。
【背景技術】
[0002] 尿素酶，又名脲酶，一種含鎳的寡聚酶，其廣泛存在于各種植物、動物、細菌、真菌 及人體中。具有絕對專一性，可催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳，將尿素轉變成可供有機 體使用的氮源。
[0003] 尿素酶易溶于水，不溶于醇、醚、丙酮等有機溶劑，常溫常壓下不穩定，對溫度、pH 和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受外界條件的影響而改變其本身的構象和 性質。
[0004] 尿素酶作為重要的生物制劑在醫學、畜牧業、環保等方面都有很廣泛的應用。如利 用尿素酶可以處理尿素廢水，臨床上可用于診斷血清中尿素氨等。隨著我國經濟、科技的迅 速發展，尿素酶的需求量也越來越大。
[0005] 查閱相關專利，國內對于從刀豆中提取純化尿素酶的專利鮮見報道，僅在中國專 利CN 85104238A中提及了一種提取尿素酶的方法，即將洋刀豆用弱酸性的磷酸鹽緩沖液 提取，但是未提及如何對其進行純化。
[0006] 國內有關尿素酶的提取方面的文獻報道較多，主要集中在從微生物中提取純化尿 素酶，如"幽門螺桿菌尿素酶的純化及其單克隆抗體的研制"。從植物中提取純化的文獻相 對較少，如下：
[0007] 1.莊一義在"從巨豆粉提取尿素酶"一文中提到了一種提取純化尿素酶的方法，將 巨豆用氯仿和丙酮脫脂，然后采用低濃度的丙酮進行提取，冷凍放置使其沉淀，沉淀經緩沖 液溶解后葡聚糖凝膠柱分離即可得到高活性的尿素酶。
[0008] 2.劉東凱等人在"大豆脲酶的提取及其影響因素研宄"一文中也提及了有關尿素 酶提取的方法并對其影響因素進行了考查，確定最佳提取方法，采用30%乙醇從大豆中提 取尿素酶，固液比為1 :10,最適PH值為7。
[0009] 3.崔有宏等人在"黃豆脲酶的提取與性質研宄"一文中采用醋酸鹽緩沖液對黃豆 粉進行提取，然后通過亞硫酸鈉鹽析，其沉淀再經磷酸鹽緩沖液溶解，透析，DEAE-纖維素柱 色譜分離，洗脫液冷凍干燥后即可得到比活為67. 15IU/mg的尿素酶產品。
[0010] 4.林麗云等人在"黃豆脲酶的提取及其活性測定"一文中對黃豆中尿素酶的提取 進行了研宄，黃豆粉碎成豆粉，經低濃度有機試劑提取，然后用乙醇分級沉淀，磷酸鹽緩沖 液溶解，葡聚糖凝膠柱層析，磷酸鹽緩沖液洗脫，冷凍干燥即可得到較純且活性相對較高的 脲酶。
[0011] 國外對于從植物中提取純化尿素酶的文獻報道相對較多，主要如下：
[0012] I. Hsien-Yi Sung 等人在 "A Procedure for Purifying Jack Bean Urease for Clinical Use"中提到了一種純化尿素酶的方法，采用20%丙酮（含ImM EDTA和ImM巰基 乙醇）進行提取，離心，清液調節丙酮濃度至31-35%，然后再經氫氧化鈉堿化，再40°C熱處 理5min，離心，清液用檸檬酸調節至等電點附近，離心收集沉淀，再用磷酸鹽緩沖液中和后 冷凍干燥即可得的活性為411IU/mg蛋白質（240IU/mg干品）。經過上述純化后尿素酶可提 高14. 7倍，活性收率63 %，原料收率0. 67 %。
[0013] 2. Prem P. Sehgal 等人在 "Purification and Properties of Urease Derived from Hydrated Seeds of Jack Bean, Canavalia ensiformis (L)DC" 提到了有關尿素酶的 提取純化方法，刀豆粉經水提取（含0. 05 %巰基乙醇），丙酮沉淀，硫酸銨鹽析，再用丙酮沉 淀，然后進行DEAE-CelItlosc層析分離即可得到比活為1000-1070IU/mg蛋白質的尿素酶， 活性收率為25-30%，經過上述純化后活性提高100-130倍。
[0014] 3. Robert L. Blakeley 等人在 "Jack Bean Urease (EC 3. 5. 1. 5) · A New Purification and Reliable Rate Assay"中研宄了尿素酶的提取方法，將刀豆原料用預先 冷凍的氯仿和丙酮脫脂，然后采用30 %的丙酮（含巰基乙醇）提取，冷藏48h，然后0°C離 心，磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，離心，上清液經透析后進行葡聚糖凝膠柱分離，洗脫液再經離 子交換色譜或電泳或硫酸銨溶液進行透析，利用這種方法可對尿素酶進行純化。
[0015] 上述文獻中提到了幾種對尿素酶的提取純化方法，但是大部分都是通過柱層析的 方法，增加了提取成本，延長了整個工藝的實施時間。有的工藝中多次采用低含量丙酮，導 致回收成本大幅度提高，且造成一定的環境污染。
【發明內容】
[0016] 為了解決【背景技術】中所存在的技術問題，本發明提供一種從刀豆中提取尿素酶的 方法，該方法工藝簡單，易操作，可有效地降低產品的失活率，且成本低，污染小，樣品回收 率高，有利于工業化生產。
[0017] 本發明的技術方案：
[0018] -種從刀豆中提取尿素酶的方法，包括以下步驟：
[0019] 1]提取
[0020] 向刀豆粉中加入濃度為0. 05-0. 2M緩沖液提取0. 5-2h，離心，收集上清液；
[0021 ] 所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、BTP緩沖液或Tris-Hcl緩沖液；所述緩沖液的PH為 6. 8-7. 5 ;所述緩沖液的投料量為刀豆粉末的3-10倍量；
[0022] 2]沉降
[0023] 向步驟1所得的上清液中加入酸性試劑，調節PH至5. 8-6. 2,冷藏，離心，然后收集 上清液，繼續用同一酸性試劑調節上清液PH至4. 8-5. 2,再冷藏，收集沉淀；
[0024] 所述酸性試劑為鹽酸、檸檬酸或醋酸；
[0025] 3]中和
[0026] 向步驟2所得沉淀中加入濃度為0. 01-0. IM與步驟1相同的緩沖液中和，然后離 心處理，繼續加入同一緩沖溶液進行二次中和，離心，收集清液；
[0027] 所述緩沖液的PH為7. 2-8. 0 ;
[0028] 4]微濾
[0029] 將步驟3所得清液用陶瓷膜微濾，再加入清液0. 2-0. 4倍量的蒸餾水或濃度為 0. OlM與步驟1相同的緩沖液進行透析，收集透過液和透析液；
[0030] 所述的陶瓷膜孔徑為500-1200nm ;
[0031] 5]超濾
[0032] 將步驟4所得的透過液和透析液用截留分子量在80_200KDa的有機膜進行超濾， 同時用濃度為〇. 01-0. IM與步驟1相同的緩沖液進行等流量透析，收集濃縮液，然后冷凍干 燥，既得尿素酶；
[0033] 所述緩沖液用量為透過液和透析液總質量的2-5倍；所述有機膜為PP膜、PES膜、 PAN膜或PVDF復合膜。
[0034] 上述步驟1中，向刀豆粉末中加入8倍量的濃度為0. IM且PH為7. 0的磷酸鹽緩 沖液提取lh，離心，收集上清液；所述的磷酸鹽緩沖液包含30%的丙酮、ImM EDTA和ImM巰 基乙醇。
[0035] 上述步驟2中，向步驟1所得上清液中加入檸檬酸，調節PH至6. 0,冷藏，離心，然 后收集上清液，繼續用檸檬酸調節上清液PH至5. 0,再冷藏，收集沉淀。
[0036] 上述步驟3中，向步驟2所得沉淀中加入濃度為0. 02M且PH 7. 5的磷酸鹽緩沖液 中和，然后離心處理，繼續加入磷酸鹽緩沖液中和，離心，收集清液。
[0037] 上述步驟4中，將步驟3所得清液用孔徑為SOOnm的陶瓷膜微濾，再加入清液0. 3 倍量的蒸餾水進行透析，收集透過液和透析液。
[0038] 上述步驟5中，將步驟4所得透過液和透析液合并后用截留分子量IOOKDa的PES 膜進行超濾，同時用濃度為〇. 02M pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液進行等流量透析，收集濃縮液，然 后冷凍干燥，既得尿素酶；所述緩沖液用量為透過液和透析液總質量的3倍。
[0039] 本發明的優點：
[0040] 1.使用膜元件進行純化，可有效地縮短整個提取純化過程，降低純化過程中活性 的降解，且產品流動性好，活性收率高。
[0041] 2.膜設備占地面積小，可節約成本，大幅度提高生產效率，且操作維護簡單，可實 現連續化工業生產。
[0042] 3.該方法中甚少使用有機試劑，避免了對環境的污染，利于環保，生產安全性高。
【具體實施方式】
[0043] 實施例1
[0044] 取刀豆粉末50Kg，加入150Kg 0· 05M ρΗ7· 5的Tris-Hcl緩沖液（包括30%丙酮和 ImM EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取2h，離心，收集上清液，用檸檬酸調至pH為6. 2， 冷藏，收集上清液，再用梓檬酸調節pH至5. 2,冷藏，離心收集沉淀。向上述沉淀中加入0. IM pH 8. OTris-Hcl緩沖液將其中和，離心，沉淀采用同樣的方式再次中和，收集兩次中和液共 39. 6Kg〇
[0045] 中和液經1200nm陶瓷膜微濾，每次加入2Kg蒸餾水進行透析，共添加原液20%的 透析液（即7. 9Kg)，得到透過液和透析液共37. 3Kg，濃縮液8. 7Kg。將上述透過液和透析液 用IOOKDa的PP膜進行超濾，同時加入186. 5Kg 0. OlM Tris-Hcl緩沖液進行等流量透析， 收集濃縮液共7. 8Kg，冷凍干燥即可得到379g尿素酶產品，比活為305. 9IU/mg，其活性收率 為 64. 2%。
[0046] 實施例2
[0047] 取刀豆粉末50敁，加入150此0.21?冊.8的^13緩沖液（包括30%丙酮和11111 EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取0.5h，離心收集上清液。用鹽酸調至pH為5. 8,冷藏， 離心，上清液再用鹽酸調節pH至4. 8,冷藏，離心收集沉淀。向上述沉淀中加入0. OlM pH 7. 2BTP緩沖液將其中和，離心，沉淀采用同樣的方式再次中和，收集兩次中和液共42. 9Kg。
[0048] 經500nm陶瓷膜進行微濾，每次加入2. IKg 0. OlM BTP緩沖液進行透析，共加入原 液40 %的透析液（即17. 2Kg)，得到透過液和透析液共47. 2Kg，濃縮液10. 3Kg。將上述透過 液和透析液合并后用80KDa的PAN膜進行超濾，同時加入94. 4Kg 0. IM BTP緩沖液進行等 流量透析，收集濃縮液共8. 2Kg，冷凍干燥即可得到387. 2g尿素酶產品，比活為310IU/mg， 其活性收率為66. 5%。
[0049] 實施例3
[0050] 取刀豆粉末50敁，加入500此0.邡？!17.0的磷酸鹽緩沖液（包括30%丙酮和11111 EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取lh，離心，收集上清液。用醋酸調至pH為6. 0,冷藏， 離心，上清液再用醋酸調節pH至5. 0,冷藏，離心收集沉淀。向上述沉淀中加入0. 02M pH7. 5 磷酸鹽緩沖液將其中和，離心，沉淀采用同樣的方式再次中和，收集兩次中和液共94. 7Kg。
[0051] 中和液經800nm陶瓷膜微濾，每次加入4. 7Kg蒸餾水進行透析，共加入原液30% 的透析液（即28. 4Kg)，得到透過液和透析液共101. 3Kg，濃縮液共16. 3Kg。將上述透過液 和透析液經200KDa PVDF膜超濾，使用202.6Kg 0.02M磷酸鹽緩沖液進行等流量透析，得到 濃縮液共8. 9Kg，冷凍干燥即可得到379. 3g尿素酶產品，比活為312. 7IU/mg，其活性收率為 65. 7%〇
[0052] 實施例4
[0053] 取刀豆粉末50敁，加入400此0.邡？!17.0的磷酸鹽緩沖液（包括30%丙酮和11111 EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取lh，離心，收集上清液。向原酶液中加入檸檬酸調至 pH為6. 0,冷藏，離心，向其上清液中繼續加入一定量的梓檬酸調節pH至5. 0,冷藏，離心收 集沉淀。向上述沉淀中加入0.02M pH 7. 5磷酸鹽緩沖液將其中和，沉淀進行二次中和，收 集兩次中和液共llOKg。
[0054] 上述中和液經800nm陶瓷膜進行微濾，每次加入5. 5Kg蒸餾水進行透析，共添加原 液30%的透析液（即33敁)，得到透過液和透析液共121.5此，濃縮液15.7敁。將上述透過 液和透析液用IOOKDa的PES膜進行超濾，同時加入364. 5Kg 0. 02M磷酸鹽緩沖液進行等流 量透析，收集濃縮液共7. 2Kg，冷凍干燥即可得到396g尿素酶產品，比活為325. lIU/mg，其 活性收率為71. 3%。
[0055] 實施例5
[0056] 取刀豆粉末50敁，加入400此0.邡？!17.0的磷酸鹽緩沖液（包括30%丙酮和11111 EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取lh，離心，收集上清液。用檸檬酸調至pH為6.0,冷藏 后離心，上清液再用檸檬酸調節pH至5. 0,冷藏，離心收集沉淀。向上述沉淀中加入0. 02M pH7. 5磷酸鹽緩沖液將其中和，離心，沉淀進行二次中和，合并兩次中和液共118. 3Kg。
[0057] 中和液經800nm陶瓷膜微濾，每次加入5. 9Kg蒸餾水進行透析，共加入原液30 %的 透析液（即35. 5Kg)，得到透過液和透析液共124. 7Kg，濃縮液共21Kg。將上述透過液和透 析液合并后經80KDa PES膜超濾，使用374. IKgO. 02M磷酸鹽緩沖液進行等流量透析，得到 濃縮液共8. lKg，冷凍干燥即可得到400. 2g尿素酶產品，比活為302. 3IU/mg，其活性收率為 67%〇
[0058] 實施例6
[0059] 取刀豆粉末50敁，加入400此0.邡？!17.0的磷酸鹽緩沖液（包括30%丙酮和11111 EDTA及ImM巰基乙醇）常溫攪拌提取lh，離心，收集上清液。用檸檬酸調至pH為6.0,冷藏 后離心，上清液再用檸檬酸調節pH至5. 0,冷藏，離心收集沉淀。向上述沉淀中加入0. 02M pH 7. 5磷酸鹽緩沖液將其中和，離心，沉淀進行二次中和，收集兩次中和液共108. 7Kg。
[0060] 中和液經1200nm陶瓷膜微濾，加入32. 6Kg蒸餾水進行透析，分6次加入，每次 加入5. 4Kg，共得到透過液和透析液120. 3Kg，濃縮液15. 3Kg。將上述透過液和透析液用 IOOKDa的PES膜進行超濾，同時加入360. 9Kg 0. 02M磷酸鹽緩沖液進行等流量透析，收集 濃縮液共8. 5Kg，冷凍干燥即可得到403. 9g尿素酶產品，比活為304. 7IU/mg，其活性收率為 68. 2%〇
[0061] 用陶瓷膜微濾后，當進行透析時，必須保證料液中磷酸鹽的濃度在0. OlM以上。
[0062] 通過上述實施案例的數據說明，與先前專利中的工藝進行對比，結果如下所示：
[0063]
【權利要求】
1. 一種從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1] 提取 向刀豆粉中加入濃度為0. 05-0. 2M緩沖液提取0. 5-2h，離心，收集上清液； 所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、BTP緩沖液或Tris-Hcl緩沖液；所述緩沖液的PH為 6. 8-7. 5 ;所述緩沖液的投料量為刀豆粉末的3-10倍量； 2] 沉降 向步驟1所得的上清液中加入酸性試劑，調節PH至5. 8-6. 2,冷藏，離心，然后收集上清 液，繼續用同一酸性試劑調節上清液PH至4. 8-5. 2,再冷藏，收集沉淀； 所述酸性試劑為鹽酸、檸檬酸或醋酸； 3] 中和 向步驟2所得沉淀中加入濃度為0. 01-0. 1M與步驟1相同的緩沖液中和，然后離心處 理，繼續加入同一緩沖溶液進行二次中和，離心，收集清液； 所述緩沖液的PH為7. 2-8. 0 ; 4] 微濾 將步驟3所得清液用陶瓷膜微濾，再加入清液0. 2-0. 4倍量的蒸餾水或濃度為0. 01M 與步驟1相同的緩沖液進行透析，收集透過液和透析液； 所述的陶瓷膜孔徑為500-1200nm ; 5] 超濾 將步驟4所得的透過液和透析液用截留分子量在80-200KDa的有機膜進行超濾，同時 用濃度為〇. 01-0. 1M與步驟1相同的緩沖液進行等流量透析，收集濃縮液，然后冷凍干燥， 既得尿素酶； 所述緩沖液用量為透過液和透析液總質量的2-5倍；所述有機膜為PP膜、PES膜、PAN 膜或PVDF復合膜。
2. 根據權利要求1所述的從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步驟1中，向 刀豆粉末中加入8倍量的濃度為0. 1M且PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液提取lh，離心，收集上清 液；所述的磷酸鹽緩沖液包含30%的丙酮、ImM EDTA和ImM巰基乙醇。
3. 根據權利要求2所述的從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步驟2中，向 步驟1所得上清液中加入檸檬酸，調節PH至6. 0,冷藏，離心，然后收集上清液，繼續用檸檬 酸調節上清液PH至5. 0,再冷藏，收集沉淀。
4. 根據權利要求3所述的從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步驟3中，向 步驟2所得沉淀中加入濃度為0. 02M且PH 7. 5的磷酸鹽緩沖液中和，然后離心處理，繼續 加入磷酸鹽緩沖液中和，離心，收集清液。
5. 根據權利要求4所述的從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步驟4中，將 步驟3所得清液用孔徑為800nm的陶瓷膜微濾，再加入清液0. 3倍量的蒸餾水進行透析，收 集透過液和透析液。
6. 根據權利要求5所述的從刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步驟5中，將 步驟4所得透過液和透析液合并后用截留分子量lOOKDa的PES膜進行超濾，同時用濃度為 0.02M pH 7.0的磷酸鹽緩沖液進行等流量透析，收集濃縮液，然后冷凍干燥，既得尿素酶； 所述緩沖液用量為透過液和透析液總質量的3倍。
【文檔編號】C12N9/80GK104480092SQ201410816320
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月24日 優先權日:2014年12月24日
【發明者】張瑜, 肖紅, 王曉瑩, 王春德 申請人:陜西嘉禾植物化工有限責任公司