一種褐菖鲉cyp1b1基因全長序列及其克隆方法
【專利摘要】一種褐菖鲉CYP1B1基因全長序列及其克隆方法，涉及海洋生物基因工程領域。所述克隆方法：用褐鯧鲉的肝臟組織提取總RNA，進行反轉錄擴增，采用RACE獲得5’端和3’端未知序列，拼接獲得其全長cDNA序列。獲得了褐菖鲉中CYP1B亞家族唯一成員CYP1B1基因全長CDS序列，補充了褐鯧鲉P450 CYP1B基因家族的空白，可更準確指示海域污染狀況，更深入探究海洋生物在污染海域的蛋白表達等問題。通過對材料的處理與準備、RNA提取，5端和3端cDNA合成、RACE技術等獲得了CYP1B1基因，該基因cDNA全長為3056bp，基因開放閱讀框1724-2995bp，共編碼422個氨基酸。
【專利說明】-種褐菖鈾CYP1B1基因全長序列及其克隆方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及海洋生物基因工程領域，具體是涉及褐鯧鈾（Sebastiscus marmoratus)肝臟中一個新的海洋生物標志物CYP1B1基因的全長及其克隆方法，該基因可 編碼細胞色素酶P450,該酶是一類非常敏感的指標。
【背景技術】
[0002] CYP450酶系是自然界中最具有催化活性作用的生物催化劑之一，它在生物體中 具有重要的生理功能。CYP450能對各種內源性物質（如類固醇、脂肪酸等）以及外源 性物質（如除草劑、殺蟲劑、致癌物質等）進行生物轉化的第I相反應（Omura T. Forty years of cytochrome P450[J]. Biochemical and biophysical research communicatio ns，1999, 266(3) :690-698.)。目前，由于CYP450酶系同工酶活性對外源性物質的高敏感性， 可以使其作為早期評估和檢測水生生態環境系統污染的重要指標。近年來，CYP450在環境 毒理學方面受到了越來越多的關注。
[0003] 在水生生態系統中，魚類與水環境中外源性物質直接相接觸，所以利用魚類 CYP450對環境污染物進行生物監測能更直觀的反映環境污染狀況。CYP450廣泛分布于動 物、植物和微生物等不同生命體中，且在同種生物的不同器官和組織中均有其存在，但分布 具有一定的選擇性，對于不同污染物暴污后的表達也有很大差異。Nelson等根據P450分 子氨基酸序列同源性制定了其命名規則：根據P450分子氨基酸序列同源性命名規則：氨基 酸同源性大于40%視為同一家族（如CYP1、CYP2、CYP3、CYP4);氨基酸同源性大于55% 視為同一亞族（如，CYP1A、CYP1B、CYP1C) (Nelson D. R.，Koymans L.，Kamataki T.，et al.P450superfamily:update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature [J]. Pharmacogenetics and Genomics，1996, 6 (1) : 1-42.) 〇 近年來在魚體 內，關于CYPls亞族研究的最為廣泛，其中主要包括CYP1A、CYP1B1、CYP1C1、CYP1C2以及 CYP1D1 基因。（Gao K.，Brandt I.，Goldstone J.V.，et al. Cytochrome P4501A，1B，1C mRNA induction patterns in three-spined stickleback exposed to a transient and a persistent inducer[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology and Pharmacology. 2010, 154(1):42-55.)。但現在擁有的褐娼軸 CYPs 亞組 基因較少，而且沒有全長的報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種褐菖鈾CYP1B1基因全長序列及其克隆方法。
[0005] 所述褐菖鈾CYP1B1基因全長序列如下：
[0006]
【權利要求】
1. 一種褐菖鈾CYPlBl基因全長序列，其特征在于其序列為： aagcagtggtatcaacgcagagtacatgggtgggtgggtgcttgtgcaacaaaaggaaga 60 acttaaaaaacatcagctttggttttagtgatgttcagccacaagtggagtattccagag 120 gtttctatttttgtaacactgagtaatgacagacgtctaaacagcggtggtgcctaatgt 180 cacattgttggcacatattgtatctggcagtgccaacactagctgagagattctttgaga 240 ctgtgaatgtagttgtagtcagacatgtacaccttaaaggtttattgtaactctaaaggt 300 tgaggtgacaatcaaacaggacacactgaccattgacaattcactttattaatttcatat 360 atagcttattgttccactttataaagccaacacattgataacaaaatatcctctatgagg 420 aatgcttaaacattcaaggcggagaaacacatccctcgggcattgtaacatcaactcctg 480 aatgcagacgcttaaagagagtgcagtgacatccatgtagctttgaaaaagtgactttgt 540 aaacaaacatgattttaagaatgcctcatgagtgaaagatatttgcggcacatgtgggtt 600 tttttttctactggtgagaattgtgtgtttggcacggggtagctgcagtgcttgtacagt 660 aaaactaaaccctgggtgcataaagtttgtgaagcgttcacggttcatggcaatgtctct 720 tcttcatcctttaagccgtgatggatgtctccttgatgaaagacttcctccttcacaaac 780 atgccagcctttttttcctccactttgatcagcattctctgtttaatgtgttcatatgct 840 cggagtacagtagatagtgaaatacattattacatttattgtcatacctgaaatatgaaa 900 ttataaaaaaatattttgtaactgctttttttacgtggcaaaggttaaatatattcttac 960 atattacaaatgagaacaagaagtcatcgagtgactttataacattcacaagcatttcat 1020 gtacagttatattagtttaaattgacatttaagggatgtagctatttcctgcaaacacat 1080 catacatgtacatgcgcaatagtggaccta, aaacaactcagaattatgtacacaatctga 1140 tcaagtatgaagtgtttagtgaagcagaaaatgaataccttttgcactgattccaacagt 1200 ccacaaccttgaattctacctgtagctaatattacatctttgacatcatattctcaatcc 1260 cgcaccaacaataattcaaatacagaccgtgttaagatacccattaaatatcattattaa 1320 ataggaaaatcatacaacagtaggatttagtgcaggtatgttgatactcactgttaaatg 1380 tcattggggggaaaagtgtttgctggcctcgagtcacagtattgggacgtgctgttcatg 1440 ccggggaaactaagccgagcagctttcccctgagcttggcgttcacacagagtcggaggg 1500 gcttcagcgtgagcccgtaggagcagtcaagagtgaggggctcagaggggtcgctctcaa 1560 agctgcactggtgcagcatgaccgctgtgaataaaaacacttccaccttggcgatctggt 1620 cgccgatgcagcgtcttttacctgttgaaaaaatcatcacaccgttggttatgtccttgt 1680 tgagggccccgttttcatcaaggaagcgcgaggggtcaaaaatgtgagggtccttccact 1740 tcaaggggtcatggttgacggaccactggttgatgaagacgaccgtgtctttggggatgt 1800 ggagaccctcgatggtgacatctgaagtcgtggagtgcgggatgggggatggtgacgggg 1860 acgaagctggtgaagcgcatggtctcgtagatgaaggcgtccaggtacgccaggctgctc 1920 ctgtcctcgattgatggcagtctgtcttggcctaccactttgtcgatgagctcctgcagt 1980 ttggcttgcatgtccgggtgtttgaccaggagcatgaggatccactgcatgatggtcgat 2040 accgtgtcttgacctgcgccaatcagatctgtgacggtcgcttcgacgaactctttcgtc 2100 agcccgctgtcctgtctgtgctcgatcacgttgatgatggcgtcgctcatgtcccgggtc 2160 acatcggggttgaaggactttctatgctgtcccactttgtctttcacaaaggcgaaaaac 2220 tcctcgttgaggtttttgaagttttcatagacactgcggactgggtttgggaaggactta 2280 agccagggcatgacatctaccaagctacctgctcctaccgtctccccaaacttgtccagc 2340 ttcttcaacatggtcctgaactccaggtcatcatgtccatatcgcctcccaaagcagaga 2400 gcgcacatgatgttagcagcagctactgtaaattcattagcagggtcaaagtaccgtcca 2460 tcagtgctctggcgcaaaaatacctgcaccagttccatggcctcggccatgatgtgctgc 2520 tcaaaggcttttttggtctcactgttcgcagaggaaaaggctctgaggctagactgggct 2580 attttcctgtgcgccttccactgtttgctgtaattagtaaatgtcatactcctgcctccg 2640 gagatcatctggaaagagacaaagttgggtctgcctgcaaactctttgctgtgctgtatg 2700 agagcctcacgtatcgcactgtctccgttcagaaccacaatgtcgctgcagcccagccgt 2760 atctgatacacgttgccgtatttcttggccagcttggcgaaggtgatgtgaggcatctgg 2820 cccagctgcatggcgttgcccaccactggccaggcgaagggtcctggcagtcttctcttg 2880 agcctgaggttcctgacccacagacaggcttccagacagaagaggaaaacgaaggaggcg 2940 accagagcgggatggacctgtccgctccattccctgatgatgctgctgcccttcacacca 3000 aactctgagtccagtgccattgtgacaaaaaattctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 3056 所獲得的全長cDNA全長序列的編碼區從第1724個核苷酸到2995個核苷酸。
2.如權利要求1所述一種褐菖鈾CYPlBl基因全長序列，其特征在于所述褐菖鈾CYPlBl基因的氨基酸序列為： MetAlaLeuAspSerGluPheGlyValLysGlySerSerHelieArg 15 10 15 Glu Trp Ser Gly Gln Val His Pro Ala Leu Val Ala Ser Phe Val Phe20 25 30 Leu Phe Cys Leu Glu Ala Cys Leu Trp Val Arg Asn Leu Arg Leu Lys35 40 45 Arg Arg Leu Pro Gly F^ro Phe Ala Trp Pro Val Val Gly Asn Ala Met50 55 60 Gln Leu Gly Gln Met Pro His He Thr Phe Ala Lys Leu Ala Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Gly Asn Val Tyr Gln He Arg Leu Gly Cys Ser Asp He Val Val 85 90 95 Leu Asn Gly Asp Ser Ala He Arg Glu Ala Leu He Gln His Ser Lys100 105 HO Glu Phe Ala Gly Arg Pro Asn Phe Val Ser Phe Gln Met He Ser Gly115 120 125 Gly Arg Ser Met Thr Phe Thr Asn Tyr Ser Lys Gln Trp Lys Ala His130 135 140 Arg Lys Tie Ala Gin Ser Ser Leu Arg Ala Phe Ser Ser Alh Asn Ser145 150 155 160 Glu Thr Lys Lys Ala Phe Glu Gln His He Met Ala Glu Ala Met Glu165 170 175 Leu Val Gln Val Phe Leu Arg Gln Ser Thr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp180 185 190 Pro Ala Asn Glu Phe Thr Val Ala Ala Ala Asn He Met Cys Ala Leu195 200 205 Cys Phe Gly Arg Arg Tyr Gly His Asp Asp Leu Glu Phe Arg Thr Met。10 215 220 Leu Lys Lys Leu Asp Lys Phe Gly Glu Thr Val Gly Ala Gly Ser Leu225 230 235 240 ValAspValMetProTrpLeuLysSerPheProAsnProValArgSer245 250 255 ValTyrGluAsnPheLysAsnLeuAsnGluGluPhePheAlaPheVal260 265 270 LysAspLysValGlyGlnHisArgLysSerPheAsnProAspValThr275 280 285 ArgAspMetSerAspAlaHeHeAsnValHeGluHisArgGlnAsp290 295 300 SerGlyLeuThrLysGluPheValGluAlaThrValThrAspLeuHe305 310 315 320 GlyAlaGlyGlnAspThrValSerThrHeMetGlnTrpHeLeuMet325 330 335 LeuLeuValLysHisProAspMetGlnAlaLysLeuGlnGluLeuHe340 345 350 AspLysValValGlyGlnAspArgLeuProSerlieGluAspArgSer355 360 365 SerLeuAlaTyrLeuAspAlaPheHeTyrGluThrMetArgPheThr370 375 380 SerPheValProValThrHeProHisProAlaLeuHisAspPheArR385 390 395 400 CysHisHisArgGlySerProHisProGlnArgHisGlyArgLeuHis405 410 415 GlnProYalValArgGln420。
3. 如權利要求I所述褐菖鈾CYPlBl基因全長序列的克隆方法，其特征在于其具體步驟 如下： 用褐鯧鈾的肝臟組織提取總RNA，進行反轉錄擴增，采用RACE技術，獲得5'端和3'端 未知序列，拼接獲得其全長cDNA序列。
4. 如權利要求3所述褐菖鈾CYPlBl基因全長序列的克隆方法，其特征在于所述擴增的 特異性引物為： Sm-CYPlBl-3'-Fl:5' -CTCTTTCGTCAGCCCGCTGTCCT-3' Sm-CYPlBl-3' -F2 :5' -ACTGCGGACTGGGTTTGGGAAGG-3'Sm-CYPlBl-5'-Fl:5' -CCGGCATGAACAGCACGTCCCAATA-3' Sm-CYPlBl-5'-Fl:5' -CGTCCCAATACTGTGACTCGAGGCC-3'。
【文檔編號】C12N15/53GK104450751SQ201410815726
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月24日 優先權日:2014年12月24日
【發明者】陳榮, 李珍珍, 陳曄, 王重剛, 左正宏 申請人:廈門大學