一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及其構建方法,該缺陷模型在轉染成功的表皮細胞中，兜甲蛋白基因水平的表達量為正常細胞的40％；用該細胞構建的模型，兜甲蛋白含量下降為正常模型的35％；該缺陷模型與正常模型相比，模型厚度為正常模型的60％；活細胞層數為3-4層；模型活力測定OD值維持在0.8-1.0。該屏障缺陷表皮模型的構建方法,包括兜甲蛋白基因缺陷表達的表皮細胞的制備、缺陷培養基的制備及屏障缺陷表皮模型的三維培養。本發明應用RNA干擾技術構建屏障缺陷的表皮替代模型，對于開發屏障修復性化妝品及化妝品功效性驗證有重要意義。
【專利說明】一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，涉及一種體外重組的屏障缺陷表皮模型及構建方法。
【背景技術】
[0002] 隨著體外科學的發展，體外皮膚替代模型的開發與利用取得突破性進展。目前國 外已有Epiderm、Episkin兩款表皮皮膚替代模型研發成功，并被多家實驗室和化妝品公司 購買用于化妝品皮膚安全性評價測試。
[0003] 近年來，隨著消費者對化妝品功效重視度的提高，皮膚模型不再用于單一的安全 性評價，功效性驗證成為未來的發展方向。與安全性評價相比，功效性驗證對皮膚模型的要 求更為嚴格，它更注重于模型與問題肌膚的真實擬合度。隨著年齡的變化及環境因素的影 響，人體肌膚的屏障功能逐漸下降，各種肌膚問題也會逐漸顯現。導致皮膚屏障功能下降的 因素有很多，最主要原因是表皮細胞增殖分化平衡逐漸被打破，屏障相關膜套蛋白表達量 發生改變，如LOR蛋白的含量隨著年齡的升高，顯著下降等。現有商品化的表皮模型都是模 擬健康皮膚構建而成，模型的屏障功能較強，用于功效性評價，難以做到真實、客觀。因此， 開發新的屏障功能缺陷的體外皮膚模型更為重要。
[0004] 皮膚角質層是人體發揮自身屏障，抵御外界環境的主戰場。角質層獨特的"磚灰" 結構是屏障的基石。三大脂類物質（神經酰胺、膽固醇、脂肪酸）與角質細胞膜套蛋白交聯 共同構建了磚灰結構。已有研宄證明，角質層膜套蛋白的主要成分是兜甲蛋白（Loricrin)， 其含量占膜套蛋白總含量的80%以上。并且，隨著年齡的增加，人體皮膚屏障功能逐漸降 低，角質層細胞形態發生變化，兜甲蛋白含量也逐步降低，間接說明兜甲蛋白對人體屏障功 能的發揮，具有重要作用。基于此，如果通過分子生物學方法如（RNA干擾技術）缺陷兜甲蛋 白基因（LOR)的表達，同時改變模型培養液中表皮生長因子與鈣離子的濃度，模擬老化皮 膚增殖分化的類似環境，達到實現構建表皮屏障功能缺陷模型的目的。表皮生長因子（EGF) 通過與細胞表面的受體結合，激活受體內在的酪氨酸激酶的活性，啟動信號級聯反應，促進 DNA合成和細胞的增殖。表皮鈣離子從基底層到顆粒層依次形成梯度，在顆粒層上層達到最 高水平（1.5mmol/L)。媽離子的濃度直接影響表皮細胞分化相關標記（marker)的表達，對 被月旲顆粒中脂質的有序運輸及屏障相關的蛋白的有序穩定表達至關重要。
[0005] RNA干擾技術（RNA interference，縮寫為RNAi)指一種分子生物學上由雙 鏈RNA誘發的基因沉默現象。傳統的RNA干擾方法是向細胞內轉染短的雙鏈RNA分子 (double-standed RNA, dsRNA)，但在實際應用中，存在穩定性差、可能改變其他基因正常表 達等缺陷。Stealth? RNAi是新一代的RNA干涉分子，具有更高的特異性和穩定性。其主要 流程是：1、引物設計與合成：設計3條Stealth TMsiRNA和1條陰性對照（設立陰性對照的 目的是用來檢測RNAi的特異性。陰性對照，也稱為"零亂" siRNA (scrambled siRNA)，是在 打亂特異性siRNA序列基礎上設計的），并由引物設計公司進行合成。2、將核酸導入細胞， 實現轉染；3、檢測篩選對LOR基因有顯著抑制的表皮細胞。在此基礎上利用缺陷的表皮細 胞進行模型構建，同時通過調節模型生發階段關鍵因子的濃度，模擬問題肌膚微環境，構建 屏障缺陷表皮皮膚模型，用于化妝品功效性檢測。
[0006] 截止目前，曾有國外學者利用RNA干擾技術，缺陷表皮細胞保濕相關絲聚蛋白基 因（FLG)的表達，構建有保濕缺陷的表皮模型。本發明所構建的缺陷模型與該模型相比，更 接近于問題肌膚狀態，對于開發屏障修復性化妝品及化妝品功效性驗證更有意義。與本文 類似的通過改變LOR基因的表達構建屏障缺陷的表皮模型，尚未見報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是應用RNA干擾技術，構建靶向兜甲蛋白基因（LOR)的 Stealth?RNA，轉染人表皮細胞，在轉染驗證成功的基礎上，選擇含有缺陷LOR基因的表皮 細胞構建表皮模型，同時通過改變表皮培養液中生長因子（EGF)及鈣離子的濃度，調節模 型增殖分化平衡，從而構建體外重組的屏障缺陷表皮模型，適用于化妝品功效性驗證試驗。
[0008] 本發明是這樣實現的：
[0009] 本發明所提出的體外重組的屏障缺陷表皮模型，其特點在于：兜甲蛋白基因水平 的表達在轉染成功的表皮細胞中，明顯降低一表達量為正常細胞的40% ;用該細胞構建的 模型兜甲蛋白含量明顯下降一表達量為正常細胞的35%。模型形態學結構方面，缺陷模型 與正常模型相比，模型厚度變薄一為正常模型厚度的60%;活細胞層數變少一為3-4層。模 型活力測定OD值為0. 8?I. 0 (正常模型OD值在I. 0?2. 5之間）。用缺陷模型與正常模 型同時進行陽性物功效驗證實驗，結果顯示缺陷模型對活性物的作用效果更為敏感，模型 給藥前后形態學差異更為顯著。
[0010] 本發明含有缺陷屏障的表皮皮膚模型的制備方法，包括兜甲蛋白基因缺陷表達的 表皮細胞的制備、缺陷培養基的制備及屏障缺陷表皮模型的三維培養，具體步驟如下： [0011] 一.兜甲蛋白基因缺陷表達的表皮細胞的制備
[0012] 步驟一、RNA干涉分子（Stealth? RNA)的設計與合成：
[0013] 本發明人根據LOR基因序列（Gene Bank號NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA 序列設計原則，采用siRNA設計軟件設計3條siRNAs和一條scramble對照。設計3條 siRNAs的目的是通過增加平行試驗以期提高試驗的成功率。本次實驗設計的三段siRNA位 點基本上分散于mRNA的全長上，目的是分散設計可以減少實驗失敗的風險。本步驟設計的 Stealth? RNA,由Invitrogen公司代為合成。3條siRNA和scrambled對照的具體序列如 下表所示：
[0014] 表I. siRNA序列列表
[0015]
【權利要求】
1. 一種體外重組的屏障缺陷表皮模型，其特征在于： 在轉染成功的表皮細胞中，兜甲蛋白基因水平的表達量為正常細胞的40% ;用該細胞 構建的模型，兜甲蛋白含量下降為正常模型的35%;該缺陷模型與正常模型相比，模型厚度 為正常模型的60% ;活細胞層數為3-4層；模型活力測定OD值維持在0. 8-1. 0。
2. -種體外重組的屏障缺陷表皮模型的構建方法，其特征在于，包括兜甲蛋白基因缺 陷表達的表皮細胞的制備、缺陷培養基的制備及屏障缺陷模型的三維培養，具體方法步驟 如下： 1) 兜甲蛋白基因缺陷表達的表皮細胞的制備 步驟一、RNA干涉分子（Stealth?RNA)的設計與合成： 根據LOR基因序列（Gene Bank號NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA序列設計原則， 采用siRNA設計軟件設計3條siRNAs和一條scramble對照； 步驟二、RNA干涉分子（Stealth?RNA)的細胞轉染及轉染后鑒定分析： 本步驟中所選用的表皮細胞取自有細胞庫中凍存的表皮第二代細胞，復蘇后，傳代至 第4代或第5代備用，隨后，進行轉染前試劑準備工作和轉染操作，具體步驟如下： (1) 表皮細胞接種：按照IX 104-1. 5 X 104個細胞/cm2的接種密度接種細胞，37°C， C02培養箱培養24-48小時，待細胞鋪板率達到30?50%時進行轉染； (2) 轉染液的制備及細胞轉染：在轉染操作前，根據試劑盒說明書制備轉染液。轉染液 制備具體步驟及孔板每孔轉染試劑，具體用量如下： ① 稀釋Lipofectamine?2000 Regent :使用前遵照說明書，輕搖混勻 Li pofectamine?20()() Regent，然后吸取 6-15 jiLLi pofectamine?2000 Regent 在 150. L Opt i-MEM?低血清培養基中稀釋待用； ② 稀釋siRNA:根據siRNA的制備濃度，吸取總量為14yg的siRNA于 700yLOpU-MEM?低血清培養基稀釋待用； ③ 脂質體-S iRNA混合物的制備：各吸取步驟①和②配置的液體150 y L，按照體積比 1:1，混勻，室溫靜置5分鐘； ④ 細胞轉染：按照每孔250 yL的加樣量將步驟③配置的脂質體-S iRNA混合物添加至 含有2ml表皮培養液的細胞孔中，進行轉染； ⑤ 觀察分析轉染細胞：將步驟④進行轉染操作的細胞置于37°C，C02培養箱孵育 24-72h，然后顯微觀察并檢測LOR基因的表達； 2) 缺陷培養基的制備 步驟三、屏障缺陷的表皮皮膚模型的制備： ① 表皮細胞接種：將步驟二轉染后經過PCR鑒定，LOR基因抑制率最高的SiRNAl轉染 組細胞作為接種對象，按照7E5-lE6/cm2的接種密度接種于培養小室； ② 模型培養液的制備：根據人體表皮的生發特點，模型培養液根據模型生發特點分 為兩種，液下培養液和氣液面培養液：液下培養液的主要成分及含量具體如下：基礎培 養液 FAD 1L，氫化可的松 0. 4-0. 6 y g/mL，胰島素 1-1. 5 y g/mL，腺嘌呤 2. 2-2. 4 y g/ mL，EGF 0.05-0. 15ng/mL;氣液面培養液的主要成分及含量如下：基礎液FAD 1L，氯化鈣 0? 47-0. 6mmol/L，氫化可的松 0? 2-0. 4 y g/mL，胰島素 1-1. 5 y g/mL,腺嗓呤 2. 2-2. 4 y g/ mL, VC 20-30ng/mL ； ③模型培養：表皮模型培養液根據小室與培養液的接觸程度分為液下培養液和氣液面 培養液兩種；模型生發期總計l〇d，在模型接種后1-2天采用液下培養液培養，培養液添加 量為：小室內部200 yL，孔板內添加量為I. 5mL。模型生發3-10天，培養液更換為氣液面培 養液，培養液添加量為：小室內部不添加，孔板內添加量為I. 5mL，48h換液一次。模型總計 培養IOd后出廠。
【文檔編號】C12N15/88GK104498437SQ201410803937
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月19日 優先權日:2014年12月19日
【發明者】張艷云, 盧永波 申請人:陜西博溪生物科技有限公司