一種編碼紅肉桃myb10轉錄因子的dna序列及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物基因工程領域，提供了一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，該DNA序列與質粒所構建的重組表達載體、經上述重組表達載體轉化的宿主細胞。本發明通過RACE-PCR技術克隆紅肉桃花青苷生物合成的轉錄因子PpMYB10基因，為桃優異基因資源的保存提供保證，為利用基因工程手段培育富含花青苷的新型水果品種提供基石。本發明對培育紅色水果新品種具有重要意義，也為建立以花青素基因作為報告基因的植物轉基因可視化跟蹤表達系統奠定技術基礎和基因資源。
【專利說明】一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA序列及應用 【【技術領域】】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】，具體地說是一種編碼紅肉桃MYBlO轉錄因子的 DNA序列及應用。 【【背景技術】】
[0002] 桃（Prunus persica(L. )Batsch)起源于中國，已有4000多年的栽培歷史（汪祖華 和莊恩及，2001)。我國桃資源豐富，桃果肉顏色可分為白色、黃色和紅色及其各種過渡色。 目前國內外栽培桃幾乎都是白肉和黃肉類型。而紅肉桃因為口味較酸等一直未受重視。紅 肉桃是一類數量稀少的桃種質資源，具有重要的生產價值和育種價值。紅肉桃中花青素和 多酚含量明顯高于白肉和黃肉桃品種，其抗氧化能力遠遠高于后兩種桃。目前，具有生物活 性物質的紅色水果已成為當前功能性水果開發研宄的熱點之一，頗具市場魅力。因此，積極 研宄紅肉桃著色機理對保護我國基因資源、推動桃品質改良具有重要意義。
[0003] 紅肉桃果實的紅色來自于花青苷。花青苷的顏色主要由花青素結構決定。花青 素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，它是由一系列附著于細胞膜和內質網膜上 的酶催化合成，然后運輸并積累在維管植物液泡中。在自然界中最常見的花青苷為矢車菊 素-3-葡萄糖苷。
[0004] 許多研宄表明，花青苷在疾病預防和抑制腫瘤發育方面有顯著療效。近年來，為了 滿足消費者對桃的果品類型需求多樣化和營養科學的要求，果樹育種者致力于培育綜合品 質優良的紅肉品種，發揮果實的營養保健作用。
[0005] 隨著分子生物學、基因工程技術的不斷發展，進一步闡明花青素合成的調控網絡， 對于研宄花青素的生物學功能，利用基因工程技術改變花青素含量具有重要意義。
[0006] MYB是一類廣泛存在的保守的轉錄因子，是植物轉錄因子中最大的家族之一，廣泛 參與各種生命活動。包括三個不完全的重復，根據重復序列的數目，分為R1MYB、R2R3MYB和 R1R2R3MYB三類。在擬南芥中已發現130多種MYB類轉錄因子，根據其功能分為24個亞類， 其中第10亞類主要參與花青素的代謝調節。MYBlO基因組序列較為保守，通常含兩個內含 子，第二個內含子的長度在不同物種中差異較大。如蘋果第二內含子為2995bp，擬南芥則為 89bp。擬南芥存在TT2、PAP1/PAP2等多種MYBlO基因，它們均特異調控花色素合成途徑的 結構基因的時空表達模式和表達強度。
[0007] 目前對紅肉桃的呈色機理及其遺傳特性的研宄很少，紅肉桃果實花青苷生物合成 相關基因在紅肉桃中也尚未克隆。因此，深入系統研宄果實著色機理對園藝產品品質改良 具有普遍意義，這對提高我國水果市場競爭力和提高果實綜合品質具有特殊意義。 【
【發明內容】
】
[0008] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種編碼紅肉桃MYB轉錄因子的 DNA序列。
[0009] 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，或與核苷酸序列如SEQ ID NO. 12互補的核 苷酸序列。
[0010] 本發明的第二個目的在于提供含有所述紅肉桃MYBlO轉錄因子基因的重組表達 載體。
[0011] 本發明的第三個目的在于提供質粒，所述質粒為PBI121。
[0012] 本發明的第四個目的在于提供含有所述紅肉桃MYBlO轉錄因子基因的宿主細胞。
[0013] 本發明的第五個目的在于提供一種編碼紅肉桃MYBlO轉錄因子的DNA序列的應 用。
[0014] 為實現上述第二及第三個目的，本發明采取的技術方案是：一種重組表達載體， 所述的載體是由如上所述的DNA序列與質粒或病毒所構建的重組表達載體，所述的質粒是 pBI121。所述的載體是通過下列步驟構建的：a)把如上所述的DNA序列連入載體pMD 19-T， 得到載體pMD 19-T-PpMYB10;b)以重組載體pMD 19-T-PpMYB10 為模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17所示的DNA序列為引物擴增得到含有BamH I和Sac I酶切位點的ΡρΜΥΒΙΟ 基因片段，用BamH I和Sac I雙酶切后與BamH I和Sac I雙酶切pBI121回收的大片段連 接，獲得載體 PB 1121 -PpMYB 10。
[0015] 為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是：一種基因工程化的宿主細胞， 所述的宿主細胞是用如上任一所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞。 所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代。所 述的宿主細胞是農桿菌細胞。
[0016] 為實現上述第五個目的，本發明采取的技術方案是：一種轉基因煙草愈傷組織和 植株呈現紫紅色的方法，所述的方法包括以下步驟：(a)構建如上所述的重組表達載體； (b)利用步驟（a)所述的重組表達載體轉化感受態農桿菌細胞，獲得工程菌；(c)利用步驟 (b)獲得的工程菌轉化煙草植株。所述的煙草植株是"Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN"煙草植株。
[0017] 本發明通過遺傳轉化，將紅肉桃MYB10轉錄因子基因 PpMYB 10轉入煙草中，通過調 控代謝途徑，在煙草中合成花青苷。本發明的基因對培育紅色水果新品種具有重要意義，也 為建立以花青素基因作為報告基因的植物轉基因可視化跟蹤表達系統奠定技術基礎和基 因資源。 【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0018] 圖1紅肉桃MYBlO轉錄因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ的PCR擴增電泳圖（Ml :Marker ;M2 : IOObp DNA Ladder ;A:PpMYB10 片段擴增產物；B :5' RACE Inner PCR 擴增產物；C : 5' RACE Outer PCR 擴增產物；D :3' RACE Outer PCR 擴增產物；E :3' RACE Inner PCR 擴增產物；F :PpMYB10全長擴增產物）；
[0019] 圖2表達載體pBim-PpMYBlO構建示意圖；
[0020] 圖3表達載體PBim-PpMYBlO的T-DNA結構圖；
[0021] 圖4轉基因煙草的ΡρΜΥΒΙΟ基因的PCR檢測電泳圖（M3 :2-Log DNA Ladder(0. 1-10. Okb) ;1 :陽性對照；2 :空白對照；3 :未轉化植株；Rl?R13 :轉化植株）；
[0022] 圖5紅肉桃MYB10轉錄因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ在煙草愈傷組織和植株中的表達結 果（Α :轉化ρΒΙ121的煙草愈傷組織；B :轉化pBim-PpMYBlO的煙草愈傷組織；C :轉化 PBI121的煙草植株；D :轉化pBI121-PpMYB10的煙草植株）。 【【具體實施方式】】
[0023] 以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。
[0024] 實施材料：
[0025] 培養基：（I)LB培養基：配方為酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，pH 7. 2,固 體培養基加入瓊脂15g/100L。（2) YEB培養基，配方為牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L，蛋白胨 5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4 · 7H20 4g/L，pH 7. 4,固體培養基加入瓊脂15g/L。（3)MS培養基配 置見表1，培養基Hp H2、成配方如表2所不。
[0026] 表I MS培養基母液的配置
[0027]
【權利要求】
1. 一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA序列，其特征在于：DNA序列包括： (a) SEQ ID NO. 12所述的核苷酸序列，或 (b) 與（a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2. 含有權利要求1所述基因的重組表達載體，所述重組表達載體由所述DNA序列與質 粒或病毒所構建的重組表達載體。
3. 根據權利要求2所述基因的重組表達載體，其特征在于：所述的質粒是pBI 121。
4. 根據權利要求2所述基因的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體是通過 下列步驟構建的： (1) 將所述DNA序列連入載體pMD 19-T，得到載體pMD19 T-PpMYB10; (2) 以 pMD19 T-PpMYB10 為模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17 所示的 DNA 序列 為引物擴增得到含有BamH I和Sac I酶切位點的PpMYBlO基因片段，用BamH I和Sac I 雙酶切后回收再與BamH I、Sac I雙酶切pBI121回收的大片段連接，獲得重組表達載體 pBI121-PpMYB10。
5. 含有權利要求1所述基因的宿主細胞，所述的宿主細胞是用權利要求2-4任一所述 的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞。
6. 根據權利要求5所述基因的宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為細菌細胞、真菌 細胞、植物細胞、動物細胞中的任意一種或者其宿主細胞的后代。
7. 根據權利要求5所述基因的宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為農桿菌細胞。
8. 根據權利要求1所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA序列的應用，其特征 在于：通過轉基因技術，獲得含有編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA的煙草轉化植株，包括 以下步驟： (a) 構建如權利要求4所述的重組表達載體； (b) 利用步驟（a)所述的重組表達載體轉化感受態農桿菌，獲得工程菌； (c) 利用步驟（b)獲得的工程菌轉化煙草植株。
9. 根據權利要求8所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA序列的應用，其特征 在于，所述的煙草植株是"Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NN"煙草植株。
10. 根據權利要求8或9所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉錄因子的DNA序列的應用，其 特征是在于：所述DNA序列在煙草中表達，能有效地調控煙草花青素代謝途徑，獲得紫紅色 愈傷組織和紫紅色煙草植株。
【文檔編號】C12N1/15GK104498506SQ201410798349
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月15日 優先權日:2014年12月15日
【發明者】樊連梅, 劉更森, 原永兵 申請人:青島農業大學