定量檢測csrp2基因表達的引物和探針及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了定量檢測CSRP2基因表達的引物和探針及其應用。本發明提供了一種試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組成；所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。本發明提供的引物對和探針，可以用于定量檢測CSRP2基因表達水平，從而用于腫瘤細胞系的輔助鑒定或腫瘤患者的輔助診斷，將在醫學檢測領域發揮重要的作用。
【專利說明】定量檢測CSRP2基因表達的引物和探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種定量檢測CSRP2基因表達的引物和探針 及其應用。
【背景技術】
[0002] CSRP2是CSRP基因家族（該家族其他基因包括CSRP1和CSRP3)的一個成員，CSRP 基因家族編碼的蛋白是一組LIM結構域蛋白，可能參與調節器官發育和細胞分化。
[0003]CSRP2蛋白包括兩個富含半胱氨酸的氨基酸序列單元（即UM結構域），每個UM 結構域后跟著一個由12個氨基酸殘基組成的氨基酸豐富的重復序列，兩個LIM結構域之 間還有一個核定位信號。CSRP2蛋白既存在于細胞核中，也存在于細胞質基于actin的細 胞骨架中。CSRP2 -方面在細胞核可以促進平滑肌細胞的分化，在血管平滑肌的表型轉化 以及氣道平滑肌的發育中具有重要作用，另一方面在細胞漿參與細胞骨架重構。因此檢測 CSRP2蛋白的變化對于心腦血管和呼吸系統疾病具有重要意義。另外有研宄表明CSRP2蛋 白特異地表達于肝星狀細胞并與其激活有關，隨著肝星狀細胞的激活CSRP2基因也同時轉 錄激活，而在肝星狀細胞其后的轉分化為肌纖維母細胞的過程中，CSRP2又被抑制了。在平 滑肌細胞和肝星狀細胞中CSRP2基因的轉錄和蛋白的表達受到TGF-0的正向調節。
[0004] 人CSRP2基因定位于12q21.這一區域以及在12q的鄰近區域在一些腫瘤中容易 受到影響。染色體12q可能含有1個或多個腫瘤抑制基因，而CSRP2基因所在的染色體區 域是在多個實體腫瘤和血液腫瘤中觀察到缺失或破壞的區域。實體腫瘤包括惡性和良性的 間質腫瘤和性腺基質細胞腫瘤。鑒于CSRP2基因表達的抑制與纖維母細胞轉化之間的顯著 關系，以及CSRP基因家族成員在細胞生長和分化中的作用，人CSRP2基因可能是一個在腫 瘤中缺失或改變的基因。
[0005] 目前無CSRP2在腫瘤、血液惡性疾病的相關研宄。
【發明內容】
[0006] 本發明的一個目的是提供一種試劑盒。
[0007] 本發明提供的試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組 成；
[0008] 所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分 子組成；
[0009] 所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
[0010] 上述試劑盒的功能為如下1)-3)中任一種：
[0011] 1)輔助診斷腫瘤患者；
[0012] 2)輔助鑒定腫瘤細胞系；
[0013] 3)定量檢測CSRP2基因的表達量。
[0014] 上述試劑盒中，所述試劑盒還包括含有CSRP2基因或其片段的陽性對照質粒。
[0015] 上述試劑盒中，所述陽性對照質粒為含有序列表中序列7所示的CSRP2基因片段 的重組質粒。
[0016] 上述試劑盒中，所述陽性對照質粒為將PMD18-T載體與序列表中序列7所示的 CSRP2基因片段連接得到的重組質粒。
[0017] 上述試劑盒中，所述DNA分子甲中，所述序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、所 述序列表中序列2所示的單鏈DNA分子、所述探針甲的摩爾比為40:40:25。
[0018] 上述試劑盒中，所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液腫瘤；
[0019] 所述血液腫瘤患者具體為急性淋巴白血病患者，為急性淋巴白血病初診患者或難 治復發患者；
[0020] 所述淋巴腫瘤為淋巴癌，具體為套細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤或組織細胞性淋巴 瘤；套細胞淋巴瘤細胞系為Maver、多發性骨髓瘤細胞系為頂9、組織細胞性淋巴瘤細胞系 為 U937 ;
[0021] 所述血液腫瘤為急性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病急變或急性早幼粒細胞 白血病；急性淋巴細胞白血病細胞系為SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM ;慢性粒細胞白血 病急變為MEG-01或K562 ;急性早幼粒細胞白血病為HL60。
[0022] 上述試劑盒還包括DNA分子乙，所述DNA分子乙由引物對乙和探針乙組成，
[0023] 所述引物對乙由序列表中序列4所示的單鏈DNA分子和序列5所示的單鏈DNA分 子組成；
[0024] 所述探針乙為序列表中序列6所示的單鏈DNA分子。
[0025] 上述試劑盒還包括內參對照質粒，所述內參對照質粒為含有序列表中序列8所示 的ABL1基因片段的重組質粒。
[0026] 上述試劑盒中，所述陽性對照質粒為將PMD18-T載體與序列表中序列8所示的 ABL1基因片段連接得到的重組質粒。
[0027] 上述試劑盒中，所述DNA分子乙中，所述序列表中序列4所示的單鏈DNA分子、所 述序列表中序列5所示的單鏈DNA分子、所述探針乙的摩爾比為40:40:25。
[0028] 上述DNA分子甲在制備試劑盒中的應用也是本發明保護的范圍。
[0029] 上述DNA分子甲和上述陽性對照質粒在制備試劑盒中的應用也是本發明保護的 范圍。
[0030] 上述試劑盒的功能為如下1)-3)中任一種：
[0031] 1)輔助診斷腫瘤患者；
[0032] 2)輔助鑒定腫瘤細胞系；
[0033] 3)定量檢測CSRP2基因的表達量；
[0034] 所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液腫瘤；
[0035] 所述血液腫瘤患者具體為急性淋巴白血病患者，為急性淋巴白血病初診患者或難 治復發患者；
[0036] 所述淋巴腫瘤為淋巴癌，具體為套細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤或組織細胞性淋巴 瘤；套細胞淋巴瘤細胞系為Maver、多發性骨髓瘤細胞系為頂9、組織細胞性淋巴瘤細胞系 為 U937 ;
[0037] 所述血液腫瘤為急性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病急變或急性早幼粒細胞 白血病；急性淋巴細胞白血病細胞系為SUP-B15、Molt4、Jurkat、6T-CEM ;慢性粒細胞白血 病急變為MEG-01或K562 ;急性早幼粒細胞白血病為HL60或NB4。
[0038] 本發明提供的引物對和探針，可以用于定量檢測CSRP2基因表達水平，從而用于 腫瘤細胞系的輔助鑒定或腫瘤患者的輔助診斷，將在醫學檢測領域發揮重要的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1為陽性對照質粒的RQ-PCR熒光標準曲線
[0040] 圖2為引物和探針檢測細胞系的結果
[0041] 圖3為引物和探針檢測急性淋巴血病患者的結果
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] 實施例1、檢測CSRP2表達的特異引物和探針設計
[0045] 針對CSRP2基因（NCBI基因庫序列號：NM_001321. 1，提交時間是2013. 4. 17,序列 7)的設計特異性引物對甲（由上游引物CSRP2-FP和下游引物CSRP2-RP組成，擴增產物為 76bp)和探針甲（探針 CSRP2-probe):
[0046] 上游引物 CSRP2-FP(序列 1) :5' -GTGATGGCAGGAGCTTCCA-3' ；
[0047] 下游引物 CSRP2-RP(序列 2) :5' -GCCACTGTTGTGCTATCTAAAITITT-3' ；
[0048] 探針 CSRP2-probe: FAM-CGCTGCTGCTITCTCTGCATGGITT-BHQ (序列 3)〇
[0049] 針對ABL1基因（內參基因；NCBI基因庫序列號：NM_005157)設計的特異性引物 對乙（由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R組成，擴增產物為124bp)和探針乙（探針 ABLl-T-probe)：
[0050] 上游引物 ABL1-F (序列表的序列 4) :5' -TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3' ；
[0051] 下游引物 ABL1-R(序列表的序列 5) :5' -GATGTAGITGCTTGGGACCCA-3' ；
[0052] 探針 ABLl-T-probe (5, - 3'）：
[0053] FAM-CCAITITTGGITTGGGCTTCACACCAIT-TAMRA(核苷酸序列為序列表的序列 6)。
[0054] 分別合成特異性引物對甲、探針甲、特異性引物對乙和探針乙。
[0055] 實施例2、引物檢測陽性對照質粒的靈敏度檢測
[0056] -、相關質粒的制備
[0057] 1、陽性對照質粒（含有CSRP2基因片段的質粒）的制備
[0058] 陽性對照質粒為將序列表中序列7所示的CSRP2基因插入pMD18-T質粒的EC0RV 酶切位點間得到的載體。
[0059] 2、內參對照質粒（含有ABL基因片段的質粒）的制備
[0060] 內參對照質粒為將序列8所示的ABL基因插入PMD18-T質粒的EC0RV酶切位點間 得到的載體。
[0061] 3、陰性對照質粒
[0062] pMD18-T 質粒。
[0063] 二、檢測陽性對照質粒的靈敏度檢測
[0064] 將上述一得到的陽性對照質粒用滅菌雙蒸注射用水進行10倍梯度稀釋得到各個 稀釋液（每微升分別含有1〇 6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2、1〇 1、1〇°個拷貝的〇51^2基因片段）；將上 述一得到的內參對照質粒用滅菌雙蒸注射用水進行10倍梯度稀釋得到各個稀釋液（每微 升分別含有1〇 6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2、10 1、10°個拷貝的ABL基因片段）；通過測定吸光度值計算 CSRP2基因片段或ABL基因片段的拷貝數）。
[0065] 將各個陽性對照質粒稀釋液采用實施例1得到的特異性引物對甲和探針甲在熒 光實時定量PCR儀（美國ABI公司7500-FAST型）上進行RQ-PCR。將各個內參對照質粒采用 實施例1得到的特異性引物對乙和探針乙在熒光實時定量PCR儀（美國ABI公司7500-FAST 型）上進行RQ-PCR。
[0066] PCR反應體系（10 y1):上游引物0?4y M，下游引物0?4y M，探針0?25y M， 2XTaqMan通用PCR公共體系5y1(ABI公司，美國），質粒1y1 ;其余為去離子水。
[0067] PCR反應條件：50°C2min，1個循環；95°ClOmin，1個循環；95°C15s，60°Clmin，50 個循環。
[0068] 內參對照質粒RQ-PCR熒光標準曲線（閾值為0. 082)函數為loglOABLl= (Ct-38. 47)/-3. 22,相關系數均達到0. 99以上，檢測內參基因的靈敏度達10個拷貝。
[0069] 陽性對照質粒的RQ-PCR熒光標準曲線見圖1 (閾值為0.082)，函數為loglOCSRP2 =(Ct-36. 985)/-3. 418,相關系數均達到0. 99以上，檢測CSRP2基因片段的靈敏度至少為 10個拷貝。
[0070] 實施例3、檢測細胞系及白血病患者
[0071] -、試劑盒的組裝
[0072] 試劑盒由如下組件組成：實施例1制備的針對CSRP2基因的特異性引物對甲和探 針甲、針對ABL1基因的特異性引物對乙和探針乙；實施例2制備的陽性對照質粒和內參對 照質粒。
[0073] 二、應用步驟一的試劑盒檢測細胞系
[0074] 分別檢測各個細胞系中的CSRP2基因的表達水平。每個細胞系樣本皆重復檢測3 次。步驟如下：
[0075] 1、提取各個細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0076] 2、以cDNA為模板，用特異性引物對甲和探針甲在熒光實時定量PCR儀（美國ABI 公司7500-FAST型）上進行RQ-PCR;以cDNA為模板，用特異性引物對乙和探針乙在熒光實 時定量PCR儀（美國ABI公司7500-FAST型）上進行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR結果時閾 值均固定為閾值為0.082。
[0077] PCR反應體系和PCR反應條件同實施例2。
[0078] 分別用陽性對照質粒和內參對照質粒制作標準曲線。對照標準曲線得到各細胞系 中CSRP2基因和ABL1基因的拷貝數。以CSRP2基因的拷貝數與ABL1基因的拷貝數的比值 表示CSRP2基因的相對表達水平（％ )。結果見表1和圖2, CSRP2在健康人基因表達水平 為〇,在除伯基特淋巴瘤Raji細胞和急性早幼粒細胞白血病NB4細胞系外的其他淋巴腫瘤 細胞和血液腫瘤細胞系中均表達或高表達。
[0079] 表1血液腫瘤細胞系中CSRP2基因的表達水平
[0080]
【權利要求】
1. 一種試劑盒，包括DNA分子甲，所述DNA分子甲由引物對甲和探針甲組成； 所述引物對甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組 成； 所述探針甲為序列表中序列3所示的單鏈DNA分子。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的功能為如下1) _3)中任 一種： 1) 輔助診斷腫瘤患者； 2) 輔助鑒定腫瘤細胞系； 3) 定量檢測CSRP2基因的表達量。
3. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括含有CSRP2基 因或其片段的陽性對照質粒。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述陽性對照質粒為含有序列表中序 列7所示的CSRP2基因片段的重組質粒。
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述陽性對照質粒為將pMD18-T載體 與序列表中序列7所示的CSRP2基因片段連接得到的重組質粒。
6. 根據權利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于：所述DNA分子甲中，所述序列表中序 列1所示的單鏈DNA分子、所述序列表中序列2所示的單鏈DNA分子、所述探針甲的摩爾比 為 40:40:25。
7. 根據權利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液 腫瘤。
8. 權利要求1-7中任一所述DNA分子甲在制備試劑盒中的應用。
9. 權利要求1-7中任一所述DNA分子甲和權利要求3-7中任一所述陽性對照質粒在制 備試劑盒中的應用。
10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述試劑盒的功能為如下1)-3)中 任一種： 1) 輔助診斷腫瘤患者； 2) 輔助鑒定腫瘤細胞系； 3) 定量檢測CSRP2基因的表達量； 所述腫瘤為淋巴腫瘤或血液腫瘤。
【文檔編號】C12N15/11GK104450927SQ201410795885
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月18日 優先權日:2014年12月18日
【發明者】阮國瑞, 黃曉軍, 劉開彥, 姚秋妹, 李金蘭, 王衛敏, 李玲娣, 周嬌 申請人:北京大學人民醫院