一種從水體中高效濃縮病毒的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從水體中高效濃縮病毒的方法。它是將待測水樣去除雜質不溶物后，在其中加入足量的Mg2+和PO43+，以形成絮凝物沉淀待測水樣中的病毒，然后再經負壓抽濾過混合纖維濾膜，取下濾膜，用pH值3.5～4.5的溶液沖洗并溶解濾膜上的凝固物，得到洗滌液，洗滌液再經超濾濃縮，得到病毒濃縮液。本發明的方法除了能高濃縮效率的特點外，還有如下優點：一是快速：絮凝快，洗脫也快；二是比較簡便：目前正電荷膜全部依靠進口，材料不易獲得，應用本發明的方法，使用任何一種普通的微孔濾膜均可；三是可用于現場快速濃縮病毒：在現場采樣時，不需要采取大量水樣回到實驗室進行檢測，只需待水樣絮凝靜止沉降后，即可獲得小體積的初步濃縮樣品。
【專利說明】一種從水體中高效濃縮病毒的方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于病毒濃縮領域，具體涉及一種從水體中高效濃縮病毒的方法。
【背景技術】：
[0002] 病毒感染性疾病的傳播途徑多種多樣，但在許多病毒性疾病發生和流行過程中， 水是病毒傳播的一種重要媒介。許多病毒可以長期存活于水或污水中，并隨水流動四處傳 播。水或污水中的病毒可以通過污染飲用水或食物而被人體攝入、或通過接觸粘膜或傷口 進入人體、也可以借助氣溶膠被人體吸入導致感染。近年來，全球范圍內由病毒污染水源引 起疾病暴發事件不斷發生。據報道，排入環境水體中的病毒多于140種，它們對消毒劑耐受 力強、存活時間長、感染劑量低，易于穿透污水及供水處理屏障，進入各種環境水體甚至飲 用水系統，威脅人體健康和自然生態系統。近年來，經由地表水和飲用水傳播病毒各類疾病 的報道很多，水源性傳播病毒成為一個嚴重的公共安全問題。
[0003] 由于環境水體中可能存在的病毒量少，因而必須通過濃縮數升至數千升的水樣至 數毫升，提高其中病毒的濃度后再加以檢測。但水樣中的雜質也一同被濃集，并將干擾后續 的檢測結果，如濃縮液中的有毒物質可毒害細胞使之死亡而無法感染病毒，其中的腐殖酸 等有機物質可干擾PCR使模板無法擴增，因而使檢測出現假陰性或假陽性結果。因此，采用 有效的前處理方法，濃集病毒并去除干擾雜質是水中病毒檢測的關鍵。
[0004] 水中病毒的濃縮與細菌不同。細菌的濃縮可完全依靠機械阻留于膜上，而病毒因 顆粒直徑很小。一般多基于吸附、相分離、強離心沉淀、電泳及免疫化學等作用。已有報告 的方法有二類：（1)吸附洗脫法。包括膜吸附法、可沉淀的鹽類、氧化鐵，聚電電解質吸附方 法、氫氧化鋁和植物絮凝吸附法和玻璃粉吸附法、相分離法等。（2)以病毒物理學特征為基 礎的方法，如超速離心法、反滲透法、電滲析法和脫水透析法等。在上述方法中一般認為超 速離心及電滲析法等不僅需要一定的設備條件，而且檢水量有限，作為輔助手段用于病毒 再濃縮是可行的，但在大量水中病毒的濃縮檢驗中未能廣泛應用。聚合物兩相分離法適用 于定量檢驗或分離小量渾濁水中的病毒。膜吸附法因操作簡單，可檢驗相當大量的水樣，而 且隨著濾材研宄的發展，效能不斷提高，研宄與應用比較廣泛。目前水病毒的濃縮主要采用 吸附洗脫法，如陽電膜過濾法，氯化鋁沉淀法等，這些方法的回收率都不太高，前者在60 % 左右，后者〈50%。此外，兩種方法在洗脫時均需要耗費較長的時間，而且正電荷濾膜需要進 口，材料不易獲得。特別是在用分子方法進行后續檢測時，還存在有機洗脫液可能會分子反 應過程產生抑制作用的現象。
【發明內容】
：
[0005] 本發明的目的是提供一種成本低廉，能夠簡便高效濃縮病毒的從水體中高效濃縮 病毒的方法。
[0006] 本發明的從水體中高效濃縮病毒的方法，其特征在于，將待測水樣去除雜質不溶 物后，在其中加入足量的Mg 2+和PO 43+，以形成絮凝物沉淀待測水樣中的病毒，然后再經負壓 抽濾過混合纖維濾膜，取下濾膜，用pH值3. 5?4. 5的溶液沖洗并溶解濾膜上的凝固物，得 到洗滌液，洗滌液再經超濾濃縮，得到病毒濃縮液。
[0007] 所述的將待測水樣去除雜質不溶物，其可以為離心，優選步驟為：待檢測水樣在 3000r/min轉速下離心，取上清。
[0008] 優選，所述的Mg2+和PO 43+的加入量相同，其終濃度為0. 002?0. Olmol/L，所述的 pH值3. 5?4. 5的溶液優選為pH值4. 0的溶液。
[0009] 所述的加入Mg2+和PO 43+，優選是分別以lmol/L MgCljP lmol/L Na 2即04的形式加 入，Mg2+和PO 43+的終濃度都為0. 002mol/L，所述的pH值4. 0的溶液優選為pH值4. 0的檸 檬酸緩沖液。
[0010] 利用本發明的方法能有效地濃縮病毒，其中以f2噬菌體為例，其平均回收率分別 達到88. 64%，而用正電荷濾膜法的回收率分別只有58. 74%，因此本專利的方法顯著高于 通常所用的正電荷濾膜法，也高于目前國內外的報道。與其它方法相比，本發明的方法除了 能高濃縮效率的特點外，還有如下優點：一是快速：絮凝快，洗脫也快；二是比較簡便：目前 正電荷膜全部依靠進口，材料不易獲得，應用本發明的方法，使用任何一種普通的微孔濾膜 均可；三是可用于現場快速濃縮病毒：在現場采樣時，不需要采取大量水樣回到實驗室進 行檢測，只需待水樣絮凝靜止沉降后，即可獲得小體積的初步濃縮樣品。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0011] 圖1是經本發明的方法濃縮處理后的諾如病毒檢測結果，M :DNA marker，N :陰 性對照，1 :未經濃縮處理的陽性對照，2: KT2稀釋度IOOul樣品，3: KT2稀釋度50ul樣品， 4:10_3稀釋度IOOul樣品，5 :10_3稀釋度50ul樣品，6:10 _4稀釋度IOOul樣品，7:10 _4稀釋 度50ul樣品，8-9: KT5稀釋度各IOOul和50ul樣品；
[0012] 圖2是經正電荷濾膜法濃縮處理后的諾如病毒檢測結果，M :DNA marker，N :陰性 對照，I: KT1稀釋度IOOul樣品；2:10 _2稀釋度IOOul樣品，3:10 _2稀釋度50ul樣品，4:10 _3 稀釋度IOOul樣品，5 :10_3稀釋度50ul樣品，6:10 _4稀釋度IOOul樣品；
[0013] 圖3是經本發明的方法濃縮處理后的輪狀病毒檢測結果，M :DNA marker，N :陰性 對照，I: KT2稀釋度IOOul樣品，2:10 _3稀釋度IOOul樣品，3:10 _3稀釋度50ul樣品，4:10 _4 稀釋度IOOul樣品，5 :10_4稀釋度50ul樣品，6:10 _5稀釋度IOOul樣品；
[0014] 圖4是經正電荷濾膜法濃縮處理后的輪狀病毒檢測結果，M :DNA marker，N :陰性 對照，I: KT2稀釋度IOOul樣品，2:10 _3稀釋度IOOul樣品，3:10 _3稀釋度50ul樣品，4:10 _4 稀釋度IOOul樣品，5 :10_4稀釋度50ul樣品。
【具體實施方式】：
[0015] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0016] 實施例1 :
[0017] 1材料和方法
[0018] I. 1實驗材料
[0019] f2噬菌體和大腸桿菌（Escherichia coli)285J2噬菌體原液的效價約為IO9Pfu/ HlLo
[0020] I. 2鎂離子絮凝法
[0021] L 2.1樣品制備
[0022] 取f2噬菌體原液用無菌蒸餾水按體積比1:10梯度稀釋至10_4,取ImL稀釋液添 加到IL滅菌的純凈水中（作為待檢測水樣），取樣測定f2噬斑數，作為濃縮前的樣品f2噬 斑數。
[0023] L 2. 2f2噬菌體濃縮
[0024] 待檢水樣在3000r/min轉速下離心lOmin，取上清。① IL上清水樣中加入2mL MgCl2溶液（lmol/L)，再加入2mL Na2HPO4溶液（lmol/L)，充分攪拌均勻；②負壓抽濾，過普 通混合纖維濾膜（孔徑〇· 45 μπι，直徑50mm);③取下濾膜，用約4mL 0· 3mol/L ρΗ4· 5的梓 檬酸緩沖液沖洗并溶解濾膜上的凝固物；④超濾：用15mL超濾管在7500r/min下離心lh， 最后得到約為100 μ L的濃縮液，即得濃縮10000倍的病毒濃縮液。
[0025] L 2. 3f2噬菌體濃縮
[0026] 將上一步驟病毒濃縮液用無菌蒸餾水復原至1L，測定噬斑數，即為濃縮后樣品回 復的噬斑數，該噬斑數與濃縮前噬斑數之百分比即為回收率。
[0027] I. 3f2噬菌體噬斑數測定方法
[0028] 把融化的營養瓊脂（瓊脂含量1.5% )12mL-15mL傾入無菌平皿內作為底層， 待凝固后加入被檢樣品lmL，再加入0.4mL培養至對數生長期的大腸桿菌（Escherichia coli) 285,然后覆蓋一層半固體營養瓊脂（瓊脂含量0. 8%，約5mL-8mL)，輕度平面搖勻， 37°C培養18h - 24h，計數噬斑數量。
[0029] 1. 4洗脫液的pH值對鎂離子絮凝法效果的影響
[0030] 以f2噬菌體為模型進行研宄。
[0031] 首先配制不同pH值的檸檬酸緩沖液。取檸檬酸溶液及磷酸溶液各100mL(每種都 相當于IOOmL lmol/L的NaOH溶液），加入3. 54g原硼酸及343mL的lmol/L的NaOH溶液， 加水至1L。從中取20mL，用一定量的0. lmol/L的HCl溶液調節pH值，加蒸餾水至100mL， 分別得到pH值為3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5的檸檬酸緩沖液。
[0032] 然后和之前的方法一樣，對f2噬菌體進行添加回收試驗，只是其中的檸檬酸緩沖 液的pH值分別為3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5,同時用4mL 0. lmol/L HCl作對照研宄。比較不同 PH值緩沖液對鎂離子絮凝法效果的影響，確定優化的鎂離子絮凝法條件。
[0033] 1.5正電荷膜過濾法
[0034] 水樣添毒方法如前所述。取IL待測水樣通過一陽電濾膜（Zetapore，孔徑 0. 45 μπι，直徑47mm)，然后用4mL含有1%小牛血清的甘氨酸緩沖液（50mmol/L，pH 9. 5)洗 脫30min，再用20 μ L的HCl調節pH至8. 0,最后超濾濃縮至100 μ L。
[0035] 2 結果
[0036] 2. 1鎂離子絮凝法對f2噬菌體濃縮效果的觀察
[0037] f2噬菌體的添加回收試驗進行了 9次（用的是pH4. 5的檸檬酸緩沖液洗脫），添 加回收試驗的結果如表1所示。
[0038] 表1鎂離子絮凝法濃縮水中f2噬菌體效果觀察
[0039]
【權利要求】
1. 一種從水體中高效濃縮病毒的方法，其特征在于，將待測水樣去除雜質不溶物后，在 其中加入足量的Mg2+和P0/+，以形成絮凝物沉淀待測水樣中的病毒，然后再經負壓抽濾過 混合纖維濾膜，取下濾膜，用pH值3. 5?4. 5的溶液沖洗并溶解濾膜上的凝固物，得到洗滌 液，洗滌液再經超濾濃縮，得到病毒濃縮液。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的將待測水樣去除雜質不溶物，步驟 為：待檢測水樣在3000r/min轉速下離心，取上清。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Mg2+和P0 43+的加入量相同，其 終濃度為〇? 002?0? Olmol/L，所述的pH值3. 5?4. 5的溶液為pH值4. 0的溶液。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的加入Mg2+和P0 43+，其是分別以 lmol/L MgCl# lmol/L Na2HP04的形式加入，Mg2+和 P0/+的終濃度都為 0.002mol/L，所述 的pH值4. 0的溶液為pH值4. 0的檸檬酸緩沖液。
【文檔編號】C12N7/02GK104498445SQ201410790113
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月17日 優先權日:2014年12月17日
【發明者】寇曉霞, 吳清平, 薛亮, 蔡偉程, 張菊梅 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環凱微生物科技有限公司