超嗜熱糖苷酶突變體及其在人參皂苷ck制備中的應(yīng)用的制作方法

超嗜熱糖苷酶突變體及其在人參皂苷ck制備中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種超嗜熱糖苷酶突變體及其在人參皂苷CK制備中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)工程【技術(shù)領(lǐng)域】。超嗜熱糖苷酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述，超嗜熱糖苷酶突變體在制備稀有人參皂苷CK的應(yīng)用。超嗜熱糖苷酶突變體，具有很高的耐熱性和穩(wěn)定性，在70℃-80℃下保溫300小時(shí)以上仍能保持較高催化活力，因而運(yùn)用到生產(chǎn)中，具有儲(chǔ)運(yùn)成本低，加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)要求標(biāo)準(zhǔn)低等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，具有β-葡萄糖苷酶活性，并且可以在不破壞皂苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，水解主要二醇型人參皂苷C3位和C20位的葡萄糖苷生成稀有人參皂苷Compound K，具有高效、專(zhuān)一、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，因而可將Fpglu1a應(yīng)用到稀有人參皂苷Compound K的工業(yè)生產(chǎn)中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】超嗜熱糖苷酶突變體及其在人參皂苷CK制備中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來(lái)源于閃爍桿菌屬 (Fervidobacteium)細(xì)菌的超嗜熱糖苷酶突變基因、重組載體、生產(chǎn)突變體的基因工程菌， 以及該超嗜熱糖苷酶突變體在稀有人參皂苷CK制備中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人參（Panax ginseng)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有悠久的歷史。華夏的傳統(tǒng)醫(yī) 學(xué)認(rèn)為人參能"主補(bǔ)五臟，安精神，安魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開(kāi)心益智，久服輕身延年"。 人參皂苷是人參中的主要活性物質(zhì)，且已經(jīng)從人參中發(fā)現(xiàn)100多種天然人參皂苷產(chǎn)物，分 離40余種。各種人參皂苷的含量不同，結(jié)構(gòu)多樣，藥理活性也有很大的差別。研宄發(fā)現(xiàn)某 些在人參中含量極低的稀有人參皂苷（如Rg3、F2、Rh2、Compound K、Compound Mc等）才 具有很高的藥用價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0003] 稀有人參皂苷CK (Compound K)是人參或人參皂苷口服后在哺乳動(dòng)物血液及器官 內(nèi)的主要活性組分，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，CK具有抗炎，保肝，降糖 和抗癌等重要生物活性，中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)行CK預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎癥 的臨床試驗(yàn)。因而稀有人參皂苷CK在藥物開(kāi)發(fā)等方面具有極其重要的應(yīng)用潛力。但是人 參中并不含有或只含有痕量的人參皂苷CK，限制了其廣泛應(yīng)用。因此基于皂苷核心骨架和 化學(xué)結(jié)構(gòu)相似原理，通過(guò)水解某些含量高、藥效低的人參皂苷末端糖基來(lái)大量制備這些稀 有人參皂苷就成了目前最為可行的方法?；瘜W(xué)水解法通常選擇性較差，產(chǎn)率低，不易提純， 同時(shí)容易造成環(huán)境污染。而糖苷酶水解法則具備區(qū)域選擇性和立體選擇性高、得率高、副產(chǎn) 物少、無(wú)污染和容易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是制備稀有人參皂苷最具有潛力的方法。
[0004] 來(lái)源于嗜熱菌的嗜熱糖苷酶，由于具有較高的催化活力和熱穩(wěn)定性，日益受到人 們的關(guān)注，成為嗜熱糖苷酶基礎(chǔ)研宄和開(kāi)發(fā)新型糖苷酶制劑的熱點(diǎn)。關(guān)于嗜熱酶，自1985 年第一種嗜熱酶即Taq DNA聚合酶被成功地用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)后，生長(zhǎng)在特殊高 熱環(huán)境下的微生物正日益引起人們的重視。許多具有水解酶活性的嗜熱酶（thermophilic enZyme，55-80°C)相繼得到了開(kāi)發(fā)，并在許多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)，人們從海底熱 流的嗜熱古細(xì)菌中分離得到超級(jí)嗜熱酶（hyperthermophilic enzyme，80-113°C )，為現(xiàn)代 酶工程技術(shù)展現(xiàn)了新的應(yīng)用前景。嗜熱酶不僅具有化學(xué)催化劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如催化效 率髙和底物專(zhuān)一"性強(qiáng)，而且酶的穩(wěn)定性極好。因而它可以克服中溫酶（mesophilic enzyme， 2〇-55°C )及低溫酶（psychrophilic enzyme，-2_20°C )在應(yīng)用過(guò)程中常常出現(xiàn)的生物學(xué) 性質(zhì)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，從而使很多髙溫化學(xué)反應(yīng)過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)，這將極大地促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn) 業(yè)的發(fā)展，從而帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高。
[0005] 利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)酶制劑的制備成本降低。因?yàn)槭葻?酶的穩(wěn)定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸，并且能長(zhǎng)久地保持活性。（2)加快 了動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。隨著反應(yīng)溫度的提高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，酶催化能力加強(qiáng)。（3)對(duì)反應(yīng)器 冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低，因而減少了能耗。（4)提高了產(chǎn)物的純度。在嗜熱酶催化反應(yīng)條 件下（超過(guò)70°C)，很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染。由于嗜熱酶的 髙溫反應(yīng)活性，以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，使它在食品、醫(yī)藥、制革、石 油開(kāi)采及廢物處理等方面都有廣泛的應(yīng)用潛力。
[0006] 由于嗜熱菌人工培養(yǎng)困難，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，糖苷酶的含量很低，因此不利于直接利 用嗜熱菌來(lái)生產(chǎn)耐熱糖苷酶。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種超嗜熱糖苷酶突變體及其在人參皂苷CK制備中的應(yīng)用，以解決 嗜熱菌人工培養(yǎng)困難，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，糖苷酶的含量很低，因此不利于直接利用嗜熱菌來(lái)生 產(chǎn)耐熱糖苷酶的問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：超嗜熱糖苷酶突變基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所述。
[0009] 本發(fā)明提供由上述超嗜熱糖苷酶基因突變后構(gòu)建的重組質(zhì)粒和重組工程菌。
[0010] 本發(fā)明提供一種利用上述重組工程菌制備的超嗜熱糖苷酶突變體FpglUla ;
[0011] 本發(fā)明超嗜熱糖苷酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所述。
[0012] 本發(fā)明提供上述超嗜熱糖苷酶突變體在稀有人參皂苷CK生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0013] 我們通過(guò)野生型菌體的培養(yǎng)、全質(zhì)粒PCR，則得到本發(fā)明所述的超嗜熱糖苷酶突變 重組質(zhì)粒，我們委托鼎國(guó)生物（上海）進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO :1所述。
[0014] 將獲得的超嗜熱糖苷酶基因突變質(zhì)粒按照生物學(xué)常規(guī)方法導(dǎo)入Escherichia coli BL21(DE3)(購(gòu)自于Novagen公司）宿主中，構(gòu)建出突變體工程菌。
[0015] 以野生型及突變體工程菌為出發(fā)菌株進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)所需的野 生型及突變體酶。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目的蛋白均為胞內(nèi)酶，需通過(guò)細(xì)胞的超聲破碎方法使菌體破 裂，再通過(guò)高速離心、鎳柱親和層析純化、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法獲得高純度 的目的蛋白。
[0016] 分離自熱噴泉等自然極端熱環(huán)境的閃爍桿菌屬（Fervidobacterium)細(xì)菌屬于嗜 熱真細(xì)菌，從閃爍桿菌屬細(xì)菌中分離得到的嗜熱酶多具有很好的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用潛力。對(duì) 多節(jié)閃爍桿菌（Fervidobacterium pennivorans DSM9078)基因組的分析，我們發(fā)現(xiàn)在此 菌的基因組中可能包含幾個(gè)嗜熱的糖苷酶基因。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，我們對(duì)其中一個(gè)糖 苷酶基因突變體進(jìn)行了克隆和表達(dá)，表達(dá)蛋白具有與野生型相比更高的葡萄糖苷酶活 性，進(jìn)一步的酶學(xué)研宄證實(shí)，這一蛋白是一種性質(zhì)優(yōu)良的超嗜熱β-葡萄糖苷酶。
[0017] 我們對(duì)大腸桿菌工程菌表達(dá)的野生型超嗜熱糖苷酶及其突變體進(jìn)行了活力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)，證實(shí)它們對(duì)對(duì)硝基苯-β -D-葡萄糖苷和對(duì)硝基苯-β -D-半乳糖苷具有很高的水解 活性。且突變體水解對(duì)對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷的水解活力是野生型的2. 5倍。與其它 一些糖苷酶相比，超嗜熱糖苷酶突變體具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，溫度達(dá)到l〇〇°C時(shí)活力持續(xù)上 升，在70°C及80°C下保溫超過(guò)300小時(shí)仍能保持80%以上的活力，未達(dá)到半衰期；酶液在 90°C的半衰期可達(dá)到3. 5小時(shí)。因而Fpglula屬于超嗜熱酶，在應(yīng)用中具有酶制劑成本低、 具有儲(chǔ)運(yùn)成本低，加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)要求標(biāo)準(zhǔn)低，同時(shí)具有β -葡萄糖苷 酶活性，并且可以在不破壞皂苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，水解主要二醇型人參皂苷C3位和C20位的 匍萄糖昔生成稀有人參阜昔Compound Κ，具有尚效、專(zhuān)一、副廣物少、廣率尚等優(yōu)點(diǎn)，因而可 將Fpglula應(yīng)用到稀有人參皂苷Compound K的工業(yè)生產(chǎn)中，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0018] 通過(guò)對(duì)超嗜熱糖苷酶突變體轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷的研宄，該嗜熱糖苷酶能夠水解二 醇型人參皂苷Rbl，Rb2和Rc，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物利用HPLC和LC-MS進(jìn)行了準(zhǔn)確快速地鑒定，結(jié)果表 明，F(xiàn)pglula轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl，Rb2和Rc的終產(chǎn)物均為人參皂苷CK。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是超嗜熱糖苷酶野生型基因 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0020] 左道：DNA分子Marker DL5000 ;右道：超嗜熱糖苷酶野生型基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 右道在分子量IOOObp處有明顯亮帶，與預(yù)期的分子量1398bp相符，所以我們通過(guò)PCR方法 所釣取的基因即為本專(zhuān)利所述超嗜熱糖苷酶野生型基因。
[0021] 圖2是質(zhì)粒重組過(guò)程圖；
[0022] 圖3是超嗜熱糖苷酶及其突變體變性電泳分析圖，從左往右依次：蛋白質(zhì)分子量 Marker，超聲破碎粗酶和鎳柱親和層析所得的野生型酶及突變體酶；
[0023] 圖4是溫度對(duì)超嗜熱糖苷酶突變體活力影響曲線圖；
[0024] 圖5是pH對(duì)超嗜熱糖苷酶突變體活力影響曲線圖。
[0025] 圖6是超嗜熱糖苷酶突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl不同時(shí)間的HPLC圖；其中（A)八種 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，（B)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl在0小時(shí)的HPLC圖，（C)突變體 轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl在0. 5小時(shí)的HPLC圖，（D)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl在12小時(shí)的HPLC 圖；
[0026] 圖7是超嗜熱糖苷酶突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2不同時(shí)間的HPLC圖；其中（A)八 種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，（B)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2在0小時(shí)的HPLC圖，（C)突變 體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2在6小時(shí)的HPLC圖，（D)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl在36小時(shí)的HPLC 圖；
[0027] 圖8 :超嗜熱糖苷酶突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc不同時(shí)間的HPLC圖；其中（A)八種人 參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，（B)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc在0小時(shí)的HPLC圖，（C)突變體轉(zhuǎn)化 人參皂苷Rc在8小時(shí)的HPLC圖，（D)突變體轉(zhuǎn)化人參皂苷Rc在36小時(shí)的HPLC圖；
[0028] 圖9是Rc轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1的電噴霧離子質(zhì)譜圖；
[0029] 圖10是Rc轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1的質(zhì)譜串聯(lián)棒狀圖；

【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1嗜熱細(xì)菌糖苷酶工程菌的構(gòu)建及其酶的表達(dá)
[0031] (1)嗜熱細(xì)菌 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的培養(yǎng)及其染色體 DNA 的提取
[0032] 嗜熱細(xì)菌 Fervidobacterium pennivorans DSM 9〇78 購(gòu)自 DSMZ (德國(guó)）培 養(yǎng)條件是根據(jù) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)提供的培養(yǎng)基配 方，每升 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的培養(yǎng)基組成成分如下：NH4Cl, 0. 5g ；MgS04X 7H20? 0. 16g ；KH2P04? I. 6g ；Na2HP04X H20? I. Og ；CaCl2 X 2H20? 0. 06g ；trace mineral solution，10ml ;Vitamin solution，10ml ;yeast extract，2g ;trypticase， 2g ；resazurin, 0. 5mg ；glucose,3g ；Cysteine-HCl XH20,0. 3g ；Na2SX9H20,0. 3g〇 其中每 升 trace mineral solution 的組成如下 mitrilotriacetic acid, I. 5g ；MgS04X 7H20, 3g ;MnS04 · H20,0. 5g ;NaCl，I. Og ;FeS04 · 7H20,0. Ig ;C〇S04 · 7H20,0. 18g ;CaCl2 · 2H20， 0· Ig ;ZnS04X7H20,0. 18g ;CuS04X5H20,0. Olg ;KA1 (SO4)2X 12H20,0. 02g ;H3B03,0. Olg ; Na2MoO4 · 2H20,0. Olg ;NiCl2X6H20,0. 03g ;Na2Se03X 5H20,0. 3g。每升 Vitamin solution 的配方如下：Biotin，2mg ;Folic acid，2mg ;Pyridoxine_HCl，IOmg ;Thiamine_HCl X 2H20， 5mg ；Riboflavin,5mg ；Nicotinic acid，5mg ;D_Ca-pantothenate，5mg;Vitamin B12， 0. Img ；p-Aminobenzoic acid, 5mg ；Lipoic acid，5mg〇 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 (菌種保藏號(hào)DSM9078)的干細(xì)胞加入Iml上述培養(yǎng)基，重懸后轉(zhuǎn)移至裝有IOmL新 鮮上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，稍微旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管以混勻；通入氮?dú)?分鐘以除盡培養(yǎng)管內(nèi)的氧 氣，之后置于高溫培養(yǎng)箱中65°C靜止培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)移至裝有IOOrnl上述培養(yǎng)基的厭氧 培養(yǎng)瓶中65°C靜止培養(yǎng)2天，8000rpm離心20分鐘收集上述嗜熱菌體，-40°C保存菌體備用
[0033] 取上述收集的菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自杭州維特潔生物公司） 按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA，用0.8%的DNA凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度，并于-20°C保 存?zhèn)溆谩?br> [0034] (2)來(lái)源于 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的野生型葡萄糖苷酶基因 的克隆及表達(dá)。
[0035] 根據(jù)序列（序列號(hào)X74163)設(shè)計(jì)引物，
[0036] 引物 1 :5' -CAGCAGCATATGTTTCCAAAGTCATTTATG-3' (下劃線處為 NdeI 的酶切位 點(diǎn)）；
[0037] 引物 2 :5' -CGAGCCCTCGAGTTAGAATTTCATCAAATTG-3' (下劃線處為 XhoI 的酶切位 點(diǎn)）。
[0038] 兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET28a的NdeI和XhoI相匹配，適合于在 大腸桿菌中高效表達(dá)。
[0039] PCR 反應(yīng)：在 50 μ 1 反應(yīng)體系中含 0· 5 μ I Ex-Taq DNA 聚合酶，5 μ I Ex-Taq DNA 聚合酶緩沖液，1 μ 1基因組DNA，1. 5 μ I dNTP混合物（每種核苷酸濃度25nmol/L)，1 μ 1 上游引物，1 μ 1下游引物，40 μ 1無(wú)菌超純水。每循環(huán)中94°C變性1分鐘，61. 8°C退火1分 鐘，72°C延伸1分鐘，最后一次循環(huán)延至10min，共30個(gè)循環(huán)。用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)PCR產(chǎn)物，分子量與預(yù)期的（1398) -致，如圖1所示。
[0040] 使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Bay Gene公司生產(chǎn)的PCR Clean-up Kit,步驟如下： 向PCR溶液中加入三倍體積的Buffer PCR-A，混勻；將上述溶液加入到DNA-prep柱子中， 12000rpm 離心 30 秒；向 DNA-prep 柱子中加入 500 μ IBuffer W2,12000rpm 離心 1 分鐘，再 重復(fù)一次；把DNA-prep柱子轉(zhuǎn)移到干凈的I. 5ml microfuge tube，加入30 μ 1滅菌的去離 子水，室溫放置一分鐘后12000rpm離心1分鐘即得到純化的PCR產(chǎn)物）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純 化，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0041] 將純化的PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI酶切（20ul反應(yīng)體系：IOul上述PCR產(chǎn) 物，5ul去離子水，2ul NEBuffer 4緩沖液，Iul NdeI酶），37°C下保溫1小時(shí)后，直接加入 1 μ I Xhol，再在37°C下保溫1小時(shí)。酶切完畢，在1. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用DNA凝 膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的DNA片段。1. 0%的瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè)凝膠回收的DNA 片段大小約1398bp，與目的DNA片段1398bp大小相符，說(shuō)明所得DNA為目的DNA。
[0042] 將pET_28a載體（大腸桿菌表達(dá)載體，含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子、C/N-末端組氨酸標(biāo)簽以 及卡那霉素抗性基因等）用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI酶切（20ul反應(yīng)體系：10ul pET-28a載體， 5ul去離子水，2ul NEBuffer 4緩沖液，Iul NdeI酶），37°C下保溫1小時(shí)后，直接加入Ιμ? XhoI，再在37°C下保溫1小時(shí)。酶切完畢，再用堿性去磷酸化酶（CIAP)處理，在0.8%瓊脂 糖凝膠中檢測(cè)線性載體并提純酶切后的載體。在16°C應(yīng)用T4DNA連接酶來(lái)連接已酶切的糖 苷酶基因片段和載體片段，得重組載體（構(gòu)建過(guò)程如圖2)。
[0043] (3)來(lái)源于 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的葡萄糖苷酶突變基因的 克隆及表達(dá)。設(shè)計(jì)突變引物，具體是
[0044] 引物 1 :5,-GATACTCCT GCG GAATTTGCAAAATAC-3' ；
[0045] 引物 2 :5, -TGCAAATTC CGC AGGAGTATCATCAC-3, 〇
[0046] 全質(zhì)粒PCR反應(yīng)：在50 μ 1反應(yīng)體系中含1 μ I Ex-Taq DNA聚合酶，5 μ I Ex-Taq DNA聚合酶緩沖液，1 μ 1基因組DNA，4 μ I dNTP混合物（每種核苷酸濃度25nmol/L)，1 μ 1 上游引物，1 μ 1下游引物，37 μ 1無(wú)菌超純水。每循環(huán)中95°C變性40秒，62°C退火1分鐘， 68°C延伸8分鐘，最后一次循環(huán)延至lOmin，共30個(gè)循環(huán)。用0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物，分子量與預(yù)期的（6000bp) -致。
[0047] 使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Bay Gene公司生產(chǎn)的PCR Clean-up Kit)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行純化，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0048] 將純化的PCR產(chǎn)物用Dpnl酶進(jìn)行消化（50ul反應(yīng)體系：30ul上述PCR產(chǎn)物，14ul 去離子水，5ul IOXT Buffer 4緩沖液，Iul Dpnl酶），37°C下保溫1小時(shí)后用于轉(zhuǎn)化。
[0049] (4)野生型及突變體的表達(dá)及純化
[0050] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行平板初步篩選。挑取 單菌落，在5ml LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，對(duì)目的基因進(jìn)行基因 測(cè)序，并證明準(zhǔn)確無(wú)誤。為了表達(dá)目的蛋白，將連接成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3)CodonPlus感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。LB培養(yǎng)基組成如下：Bacto-Tryptone，L 0%; Bacto-Yeast Extract，。. 5% ;NaCl，0. 5%。
[0051] 重組菌按2%的接種量接種于5ml含100 μ g/ml卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，震 蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按同樣的接種量接200ml LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)直至0D_達(dá)到I. 0左右 時(shí)，加入終濃度為ImM的誘導(dǎo)劑IPTG，30°C下誘導(dǎo)過(guò)夜，經(jīng)8000rpm離心20分鐘之后，收集 得到菌體，于-20°C冰箱中保存，用于提取目的蛋白。
[0052] 本專(zhuān)利使用磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH7. 0)緩沖液作為制備粗酶液的重懸緩沖液。 菌體（5g)按l:6(w/v)加入30ml 20mM磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH7.0)緩沖液，超聲破碎約 1小時(shí)（3sX3s)后，即溶液變得清亮，IOOOOrpm離心20分鐘，收集上清得重組酶的粗酶液。
[0053] 粗酶液使用鎳親和層析的方法對(duì)重組糖苷酶進(jìn)行分離和純化，用150mM的咪唑溶 液洗脫與層析柱結(jié)合得到的純的嗜熱酶，應(yīng)用SDS-PAGE(10% )電泳檢測(cè)重組蛋白的純度， 結(jié)果如圖1所示，從左往右依次為蛋白質(zhì)分子量Marker，超聲破碎粗酶和鎳柱親和層析所 得的野生型酶及突變體酶，由此可見(jiàn)野生型及突變體酶蛋白均在33000Da附近出現(xiàn)一單一 電泳條帶。
[0054] 實(shí)施例2超嗜熱重組糖苷酶突變體的特性
[0055] (1)野生型及突變體糖苷酶的底物特異性
[0056] 稱(chēng)取各種對(duì)硝基苯酚糖苷底物，參照（1)所述糖苷酶測(cè)定條件進(jìn)行酶活力測(cè)定。
[0057] 由表1可知，嗜熱糖苷酶及其突變體對(duì)系列對(duì)硝基苯酚糖苷底物表現(xiàn)出不同的水 解活力，其中水解對(duì)硝基苯-β -D-葡萄糖苷的活力最高，且突變體水解對(duì)硝基苯-β -D-葡 萄糖苷的活力是野生型的2. 5倍左右。
[0058] 表1野生型超嗜熱糖苷酶及其突變體底物選擇性
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種超嗜熱糖苷酶突變基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所述。
2. -種由權(quán)利要求1所述的超嗜熱糖苷酶突變基因構(gòu)成的重組表達(dá)載體，其特征在 于：與表達(dá)載體pET-lla、pET-28a或pET-20b進(jìn)行重組。
3. 如權(quán)利要求2所述的超嗜熱糖苷酶突變基因構(gòu)成的重組表達(dá)載體，其特征在于：表 達(dá)載體為pET-28a。
4. 一種導(dǎo)入由權(quán)利要求2或3所述的重組表達(dá)載體得到的重組工程菌，其特征 在于：將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlus宿主細(xì)胞中或 Escherichia coli BL21(DE3)宿主細(xì)胞，得到重組工程菌。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組工程菌，其特征在于：宿主細(xì)胞為Escherichia coli BL21(DE3) 〇
6. -種超嗜熱糖苷酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所述。
7. 權(quán)利要求6所述的超嗜熱糖苷酶突變體在制備稀有人參皂苷CK中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104480127SQ201410766484
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月14日
【發(fā)明者】于珊珊, 劉淑瑩, 李晶, 鄭飛, 許春春 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)